細胞和卵巢細胞的來源過程與實施例1基本相同。
[0110] 實施例3
[0111] 本實施例提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑，包括W下成分，且各成分在細胞 制劑中的濃度如下：
[0112] 羊膜間充質干細胞5 X IO5個/ml;
[0113] 卵巢細胞8 X 1〇5個/ml;
[0114] 20ng/ml 肝納素；
[0115] 20ng/ml 白介素-6;
[om] 20ng/ml 白介素-3;
[0117] 70ng/ml干細胞生長因子；
[011引 150ng/ml FMS樣酪氨酸激酶3配體；
[0119] 5%血紅蛋白生理鹽水注射液；
[0120] lOng/ml成纖維細胞生長因子；
[0121] 20ng/ml 殼聚糖；
[0122] 300000單位/ml青霉素，體積30iU ;
[0123] 300000單位/ml鏈霉素，體積30iU ;
[0124] 其中，羊膜間充質干細胞和卵巢細胞的來源過程與實施例1基本相同。
[0125] 為進一步驗證本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑的顯著效果，通過W下 實驗及實驗數(shù)據(jù)進行具體說明。
[01%]實驗動物分組和模型構建
[0127] SPF級8-10周齡雌性巧7B6/L小鼠（體重20-22g)，分為由南京大學模式動物中屯、提 供。小鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學實驗動物中屯、，光照12h，自由進食飲水，環(huán)境溫度23±2°C，濕 度45-55%，適應性飼養(yǎng)1周穩(wěn)定后進行后續(xù)實驗。
[0128] 將小鼠固定于尾靜脈注射架上，酒精消毒小鼠鼠尾，找到鼠尾兩側的尾靜脈，Iml 注射器小屯、進針回抽見血后，緩緩將0.7ml本發(fā)明實施例1-3制備的細胞制劑分別緩慢推入 各個小鼠體內(nèi)。注射過程中密切觀察小鼠呼吸、精神狀態(tài)及有無粹死癥狀，設置對照組1小 鼠，僅對其注射等量卵巢細胞制劑;對照組2小鼠，僅對其注射等量羊膜間充質干細胞；W及 小鼠卵巢功能正常的空白對照組。
[0129] 取8周齡雌性巧7B6/L小鼠全部接受4Gy全身照射，分別在照射后8周稱重處死，留 取相關血液、卵巢及其他臟器等標本W(wǎng)作后續(xù)試驗。
[0130] -、檢測性激素水平
[0131] W化ISA法檢測小鼠血清內(nèi)用于反應卵巢功能的指標，包括FSH(促卵泡激素）、E2 (雌二醇）、AMH(抗苗勒管激素)濃度，按照試劑盒說明進行操作，檢測結果見下表一：
[0132] 表一
[0134] 由表一可知，經(jīng)注射實施例1 -3提供的細胞制劑的小鼠相對于對照組1 -2，F(xiàn)SH濃度 低于對照組1-2，E2濃度高于對照組1-2 ,AM田農(nóng)度高于對照組1-2;而實施例1-3組中，F(xiàn)甜、E2 和AMH的濃度值均接近于空白對照組，即接近正常卵巢功能的指標值，由此說明，本發(fā)明提 供的細胞制劑能夠很好的修復卵巢功能，使卵巢功能恢復正常。
[0135] 二、MTT 檢測
[0136] 取96孔板，每塊96孔板WSXlO^孔的密度將小鼠卵巢活細胞懸液中的細胞各接 種于5個孔中，單純干細胞懸液作為對照，各巧L，置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗組和 對照組每S天換液一次。此后每天同一時間，隨機抽取一板，測定光吸收(OD)值。測量時每 孔加入MTT溶液巧mg/ml)20化，繼續(xù)在37°C，5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時后，小屯、吸棄孔內(nèi)液 體，每孔內(nèi)加入15化L DMS0。將96孔板放置在酶聯(lián)免疫檢測儀上震蕩20分鐘，采用雙波長測 定法，酶聯(lián)免疫測定儀設定檢測波長492nm，參比波長630nm，現(xiàn)憶OD值，現(xiàn)聯(lián)結果見下表二；
[0137]表二
[0139] 由表二可知，實施例1-3組中的OD值均大于對照組，且隨著培養(yǎng)時間的累積，OD值 逐漸增大；由此說明，實施例1-3組中的活細胞數(shù)量較多，細胞活性較強，通過本發(fā)明提供的 細胞制劑提高了卵巢細胞的數(shù)量及活性，進而達到修復卵巢細胞功能的目的。
[0140] 綜上所述，本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑，通過采用羊膜間充質干 細胞結合卵巢細胞共同制成細胞制劑，W及用于防止羊膜間充質干細胞多向分化和促進羊 膜間充質干細胞和卵巢細胞活性和正常生長增殖的輔助性成分，同時，結合卵巢細胞，使得 羊膜間充質干細胞能夠長期維持其干細胞特性，進而通過其分泌的細胞因子結合卵巢細胞 共同作用于卵巢，W達到即時、徹底修復卵巢功能的目的；避免單一細胞制成的細胞制劑 中，細胞性質不穩(wěn)定，造成卵巢功能修復效果不穩(wěn)定，修復效果差，無法徹底修復卵巢等缺 陷。
[0141] W上結合對本發(fā)明的實施例進行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實施 方式，上述的【具體實施方式】僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領域的普通技術人員在本 發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權利要求所保護的范圍情況下，還可做出很多形式， 運些均屬于本發(fā)明的保護之內(nèi)。
【主權項】
1. 一種用于修復卵巢功能的細胞制劑，其特征在于，包括羊膜間充質干細胞和卵巢細 胞。2. 根據(jù)權利要求1所述的用于修復卵巢功能的細胞制劑，其特征在于，所述細胞制劑 中，所述羊膜間充質干細胞的濃度為（1~5) X 105個/ml，所述卵巢細胞的濃度為(4~8) X l〇MVml〇3. 根據(jù)權利要求1所述的用于修復卵巢功能的細胞制劑，其特征在于，所述細胞制劑中 還包括肝素鈉、白介素-6、白介素_3、干細胞因子、FMS樣酪氨酸激酶3配體、血紅蛋白和成纖 維細胞生長因子。4. 根據(jù)權利要求3所述的用于修復卵巢功能的細胞制劑，其特征在于，所述細胞制劑 中，肝素鈉的濃度為15_20ng/ml，白介素-6的濃度為10-20ng/ml、白介素-3的濃度為10-20ng/ml、干細胞因子的濃度為30~70ng/ml、FMS樣酪氨酸激酶3配體的濃度為10-150ng/ ml、血紅蛋白的質量分數(shù)為1 %~5%和成纖維細胞生長因子的濃度為l-10ng/ml。5. 根據(jù)權利要求1或3所述的用于修復卵巢功能的細胞制劑，其特征在于，所述細胞制 劑還包括殼聚糖、青霉素和鏈霉素。6. 根據(jù)權利要求1所述的用于修復卵巢功能的細胞制劑，其特征在于，所述羊膜間充質 干細胞的來源過程包括以下步驟： 無菌環(huán)境下取羊膜組織，清洗后加入胰酶細胞消化液，水浴處理，離心后棄上清，獲得 羊膜上皮細胞;用標準培養(yǎng)基重懸羊膜上皮細胞后進行培養(yǎng)，每周換液1~3次;經(jīng)胰酶細胞 消化液消化后清洗并濾干，再次消化，離心并用所述標準培養(yǎng)基重懸細胞后進行培養(yǎng)，每周 換液1~3次，當細胞融合度達到70%以上時，進行傳代培養(yǎng)。7. 根據(jù)權利要求6所述的用于修復卵巢功能的細胞制劑，其特征在于，所述標準培養(yǎng)基 為5~20 %體積分數(shù)的FBS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基。8. 根據(jù)權利要求1所述的用于修復卵巢功能的細胞制劑，其特征在于， 所述卵巢細胞的來源過程包括以下步驟： 取卵巢組織去除紅細胞，加入膠原酶消化，吹打至組織塊充分溶解，加入培養(yǎng)基A充分 混勻，離心棄上清，重懸細胞后過濾，對濾液再次離心棄上清，加入培養(yǎng)基B進行培養(yǎng)，每2~ 3天換液一次，待細胞融合度至80 %以上時，停止傳代，棄除培養(yǎng)基，清洗細胞，加入胰酶消 化，待細胞變圓變亮后，加入培養(yǎng)基A停止消化，并獲得細胞懸液，離心棄上清，重懸細胞后， 加入培養(yǎng)基B進行傳代培養(yǎng)。9. 根據(jù)權利要求8所述的用于修復卵巢功能的細胞制劑，其特征在于，所述培養(yǎng)基A中 添加有胎牛血清、青霉素和鏈霉素。10. 根據(jù)權利要求8所述的用于修復卵巢功能的細胞制劑，其特征在于，所述培養(yǎng)基B中 添加有血清替代物、非必需氨基酸、谷氨酰胺、β-二硫基乙醇、β-FGF以及青霉素和鏈霉素。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于修復卵巢功能的細胞制劑，包括羊膜間充質干細胞和卵巢細胞。通過采用羊膜間充質干細胞結合卵巢細胞共同制成細胞制劑，以及用于防止羊膜間充質干細胞多向分化和促進羊膜間充質干細胞和卵巢細胞活性和正常生長增殖的輔助性成分，同時，結合卵巢細胞，使得羊膜間充質干細胞能夠長期維持其干細胞特性，進而通過其分泌的細胞因子結合卵巢細胞共同作用于卵巢，以達到即時、徹底修復卵巢功能的目的；避免單一細胞制成的細胞制劑中，細胞性質不穩(wěn)定，造成卵巢功能修復效果不穩(wěn)定，修復效果差，無法徹底修復卵巢等缺陷。
【IPC分類】A61K31/727, A61K35/54, A61K38/18, A61K31/722, A61K38/20, A61K45/06, A61K31/43, A61P15/08, A61K31/7036, A61K38/42, A61K35/28
【公開號】CN105663168
【申請?zhí)枴緾N201610055268
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫(yī)學科技有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年1月27日