合成用于綠膿桿菌疫苗的低聚糖的制作方法
【專利說明】合成用于綠賊桿菌疫苗的低聚糖
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求享有2013年7月3日提交的美國臨時專利申請?zhí)枮?1/842,474的權(quán)益， 該專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在本申請中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及免疫原性和免疫保護的組合物W及用于制備和使用同源合成的綠脈 桿菌脂多糖(P.aeruginosa IipooligosaccharideKLOS)-基的低聚糖，共輛物及其衍生的 抗體的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了合成的低聚糖Ia或者化：
[0006]其中每個Ri和R2各自獨立地為H、一種單醋或者一種寡糖，X是H、一種連接基團、或 者一種保護基團；L是一種連接基團并且Y是一種載體。在某些實施方案中，Ri和R2每個獨立 地為H、a-加a-、a-Glca-2)-a-化a-、(6-QuiNAca-3)-a-化a-、(6-FucNAca-3)-a-化a-、a-化日[2，3，4-OAc ] -、0-如iNAc (1 -3)-日-化 a [ 2，4-OAc ]-、或者P-FucNAc (1 -3) -a-化a [ 2，4，-OAc]-。在某些實施方案中，Ri和R2選自在下表中所述的組合：
[000引本發(fā)明還包括組合物，其含有一種抗原Ia和/或化W及一種藥物學可接受的載體。 優(yōu)選地組合物含有一種單一抗原或者一種公知的、定義的抗原混合物。
[0009] 本發(fā)明進一步提供了疫苗組合物，包括免疫原性和免疫保護的組合物，包括抗原 Ia和/或化W及一種藥學上可接受的載體。運些疫苗組合物可任選地包括一種藥學上可接 受的佐劑。優(yōu)選地，所述疫苗組合物是無內(nèi)毒素的。所述的疫苗組合物可W是一、二、=、或 者四價。
[0010] 本發(fā)明進一步提供了一種用于人工合成低聚糖Ia和抗原化。
[0011 ]本發(fā)明進一步提供了用于診斷、治療和預防由P. aeruginosa引起的感染。 具體實施方案
[0012] 定義
[0013] 為了提供一種對說明書和權(quán)利要求書的清楚和一致的理解，提供了一下術(shù)語的定 義。
[0014] 單位、前綴和符號可W它們的SI形式表示。在運里所限定的數(shù)字范圍包括限定范 圍的邊界數(shù)，并且包括所限定范圍內(nèi)的所有數(shù)。除非另有說明，術(shù)語"一個(a)"或者"一個 (an)"可W解釋為"至少其中一個"的意義加W理解。在此所使用的段落標題僅用于組織的 目的，而不理解為多所述的主題的限定。在本申請中所引用的所有的文獻，或者文獻的部 分，包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍W及論文，其所有或部分作為參考均完整的通 過引用結(jié)合到本文中。
[0015] 正如在運里所使用的，"低聚糖"設(shè)及一種化合物，其含有兩個或多個單糖單元。低 聚糖被認為是具有還原端W及非還原端，無論是否在還原端上的所述單糖單元實際上是一 種還原糖。根據(jù)本領(lǐng)域所接受的術(shù)語，低聚糖在運里所指出的是具有在左側(cè)的非還原端W 及在右側(cè)的還原端。在運里所描述的低聚糖是用針對非還原單糖(例如，Gal)的命名或者縮 寫進行描述的，加上糖巧鍵(a或者e)、換件、在減重所設(shè)及的還原單糖的換位置的結(jié)構(gòu)的前 綴，并且之后是所述還原單糖(例如，GlcNAc)的名稱或者縮寫。在兩種糖之間的連接鍵可W 表示為，例如，2，3、2^3、或者2-3。每種單糖是化喃糖或者巧喃糖。
[0016] 正如在運里所使用的，"單糖"或者"單糖單元"設(shè)及在低聚糖中的單個的糖殘基， 包括其衍生物。在上下文的低聚糖中，各單體單元是單糖，其是(或者可W是)通過徑基基團 連接到另一個單糖上。
[0017] 正如在運里所使用的，"無內(nèi)毒素"指的是一種不含有通常存在于分離的細菌糖類 或者多糖類中的內(nèi)毒素或者內(nèi)毒素成分的低聚糖。
[0018] 正如在運里所使用的，"合成物"指的是一種材料，其基本上或者大體上不含有一 些成分，例如內(nèi)毒素、糖脂類、不相關(guān)的低聚糖等等，當其被分離時其通常伴隨有一種化合 物。典型的，合成的化合物有至少大約90%的純度，通常為至少大約95%，并且優(yōu)選為至少 大約99%的純度。純度可W用本領(lǐng)域所熟知的多種方式進行測定。優(yōu)選地，純度是通過HPLC 進行測定。合成的材料的標識是通過質(zhì)樸分析和/或NMR波譜法進行確定。
[0019]正如在運里所使用的，術(shù)語"連接物"指的是鍵或者基團，根據(jù)本發(fā)明所述，其表現(xiàn) 出在末端進入到與載體的反應功能基團共價連接的種類，例如，氨基、硫醇或者簇基基團， 并且在另一個末端同樣地一種能夠進入到與低聚糖的徑基或者氨基基團共價連接的種類。 在運里的連接分子的兩個功能基團之間是合適長度的生物相容性橋接分子，例如取代或者 未被取代的雜烷基、芳烷基、締控基、亞締基或者(寡)亞烷基二醇基團。連接物優(yōu)選包括一 種取代的或者未被取代的（Ci-CiO)亞烷基基團或者一種取代的或者未被取代的（C2-C10)亞 締基基團。
[0020] 正如在運里所使用的，術(shù)語"載體"指的是蛋白質(zhì)、膚、脂質(zhì)、聚合物、樹枝狀聚合 物、病毒顆粒、病毒類似物顆粒(VLP)，或者它們的組合，其被連接到低聚糖上從而將所得到 的低聚糖-載體共輛物的免疫原性增強至比單獨的低聚糖更高的水平。
[0021] 正如在運里所使用的，"蛋白質(zhì)載體"指的是一種蛋白質(zhì)、膚或其片段，其被連接或 者共輛到低聚糖上從而將所得到的低聚糖-蛋白質(zhì)載體共輛物的免疫原性增強至比單獨的 低聚糖更高的水平。例如，當使用一種載體時，蛋白質(zhì)載體可起到T-依賴抗原的作用，所述 T-依賴抗原能夠激活并且召集T細胞從而由此增強T細胞依賴性的抗體產(chǎn)生。
[0022] 正如在運里所使用的，"共輛"指的是一種化學交聯(lián)，不論是共價的還是非共價的， 其最接近地將低聚糖與一種載體相關(guān)聯(lián)從而所述低聚糖共輛物具有相對于非共輛的低聚 糖而言增強的免疫原性。
[0023] 正如在運里所使用的，"共輛物"值得是通過鍵和/或交聯(lián)劑與一種載體化學結(jié)合 的低聚糖。
[0024] 正如在運里所使用的，"被動免疫"指的是將抗體給藥于受試者，其中所述抗體是 在不同的受試者中產(chǎn)生的(包括相同或者不同種類的受試者），從而所述抗體附著在細菌表 面上，并造成細胞被吞隧。
[0025] 正如在運里所使用的，"保護性免疫"指的是給藥于動物的疫苗或者免疫接種程序 表，誘導一種免疫應答，從而預防、阻礙疾病的嚴重程度的發(fā)展，或者降低疾病的嚴重程度， 所述疾病是由病原體引起的，或者減少或完全消除疾病的癥狀。保護性免疫也可W在合適 的動物攻擊模型中基于血清抗體被預測用于激活補體介導的殺菌活性或者給予被動保護 抵抗細菌感染。
[00%]正如在運里所使用的，"免疫保護性組合物"指的是一種制備用于在宿主中提供保 護性免疫的組合物。
[0027] 正如在運里所使用的，-種足W誘發(fā)免疫應答的量"或者-種刺激免疫應 答的有效劑量"（例如，為了存在于制劑中的表位)指的是在給藥一種具體的抗原制劑之前 W及在給藥一種具體的抗原制劑之后測量的免疫應答指示之間具有一種可檢測的差異。免 疫應答指示包括，但不限于:抗體滴度或特異性，如通過一種分析所檢測到的，例如酶聯(lián)免 疫分析法化LISA)、細菌測定（例如，用于測定血清殺菌抗體）、流式細胞儀、免疫沉淀、 Ouchter-Lowry免疫擴散;例如光點、蛋白質(zhì)印記或者抗原陣列的結(jié)合檢測測試;細胞毒性 測試等等。
[0028] 正如在運里所使用的，"抗體"包含多可龍和單克隆抗體制劑，W及與抗體的母體 分子顯示免疫結(jié)合性質(zhì)的包括雜交抗體、改造抗體、F(ab'） 2片段、F(ab)分子、Fv片段、在隧 菌體上顯示的單鏈可變片段(SCFv)、單結(jié)構(gòu)域抗體、嵌合抗體、人源化抗體、及其功能性片 段。
[0029] 正如在運里所使用的，"單克隆抗體"指的是一種具有基本同質(zhì)的抗體群體的抗體 組合物。所述術(shù)語并不受氣制備的方式限制。該術(shù)語涵蓋完整的免疫球蛋白分子，W及與抗 體的母體分子顯示免疫結(jié)合性質(zhì)的F(ab'） 2片段、F(ab)分子、Fv片段、在隧菌體上顯示的單 鏈可變片段(scFv)、W及其他分子。
[0030]正如在運里所使用的，"特異性結(jié)合抗體"或者"特異性免疫反應"，當設(shè)及一種低 聚糖、蛋白質(zhì)或膚時，指的是一種連接反應，其是基于和/或是在樣品中存在抗原的證明，其 還可能包括其他分子的特異性群體。因此，在設(shè)定的免疫測定條件下，特定的抗體(或者抗 體)結(jié)合在樣品中的特定的抗原（或抗原）上，并且不會W-種顯著的量與存在于樣品中的 其他分子結(jié)合。在運種條件下雨抗體的特異性結(jié)合可能要根據(jù)其對特定抗原(或抗原）的特 異性來選擇的抗體或者抗血清。
[0031 ]正如在運里所使用的，"抗原"指的是可W被抗體分子特異性結(jié)合的任何物質(zhì)。
[0032] 正如在運里所使用的，"免疫原"和"免疫原性組合物"指的是抗原組合物，其能夠 啟動淋己細胞活化從而導致抗原-特異性免疫應答。
[0033] 正如在運里所使用的，"表位"設(shè)及針對其特異性B細胞和/或T小應答的抗原上的 位點。所述術(shù)語頁可W與"抗原決定簇"或者"抗原決定位點"互換使用。在蛋白質(zhì)、低聚糖或 者其他生物聚合物上的B細胞表位位點可W由來自大分子的不同部分的基團組成，所述大 分子通過折疊聚集在一起。運種類型的表位被稱為構(gòu)想的或者非連續(xù)的表位，因為該位點 是由聚合物的片段構(gòu)成的，其在線性序列中是不連續(xù)的，但是在折疊構(gòu)象中時連續(xù)的。有生 物聚合物或其他分子的單個片段構(gòu)成的位點被稱為連續(xù)或線性位點。T細胞位點通常被限 制為線性膚。在一個簡單的免疫測定中可W鑒定出識別相同表位的抗體，表明一種抗體阻 斷另一種抗體與祀體抗原結(jié)合的能力。
[0034] 術(shù)語Ac指的是乙酷(-C(O)CHs)。
[0035] 術(shù)語TBS指的是叔下基二甲基娃。
[0036] 術(shù)語Troc指的是2，2，2-S氯乙氧基幾基。
[0037] 術(shù)語TC巧旨的是S氯乙酷亞氨酸醋。
[0038] 術(shù)語化th指的是領(lǐng)苯二甲酯基。
[0039] 術(shù)語TFA指的是S氣醋酸鹽。
[0040] 術(shù)語TCA指的是S氯醋酸鹽。
[0041] 術(shù)語Cbz指的是節(jié)氧幾基。
[0042] 術(shù)語化指的是苯甲酯。
[0043] 術(shù)語化指的是芐基。
[0044] 術(shù)語TES指的是S乙基甲娃烷基。
[0045] 術(shù)語TBDI^指的是叔-下基二苯基甲娃烷基。
[0046] 術(shù)語MCA指的是單氣醋酸鋼。
[0047] 術(shù)語Lev指的是乙酷丙酷基。
[004引術(shù)語ADMB指的是4-0-乙酷基2，2二甲基下酸醋。
[0049]術(shù)語Tr指的是S苯甲基。
[(K)加]術(shù)語DM巧旨的是二甲氧S苯甲基。
[0051] 術(shù)語FMO巧旨的是9-巧基甲基碳酸鹽。
[0052] 術(shù)語Alloc指的是締丙基氧幾基。
[0化3] 術(shù)語Nap指的是糞基。
[0化4] 術(shù)語沈t指的是甲硫基乙基。
[0055] 術(shù)語S化指的是苯硫基。