Jam-a蛋白在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及連接黏附分子A(Junct1nal Adhes1n Molecules A, JAM-A)蛋白在人體免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平和生理功能；涉及連接粘附分子A對外周血淋巴細(xì)胞迀移活動的調(diào)節(jié)及其在小鼠膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)模型和在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以慢性滑膜炎癥為主要表現(xiàn)，最終導(dǎo)致軟骨吸收、骨破壞和骨纖維化的自身免疫功能紊亂疾病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在全世界的患病率為0.42-0.54%，在我國25個省的疾病流行病學(xué)調(diào)查中顯示我國的患病率為0.32-0.36%，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是引起青壯年勞動力喪失最主要的原因之一。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有易復(fù)發(fā)、難治愈的特點，在關(guān)節(jié)炎中它是致殘率較高的疾病。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎還常常伴有關(guān)節(jié)外的系統(tǒng)性損害，其病理特征為關(guān)節(jié)中淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤增多，滑膜被覆細(xì)胞層數(shù)和基質(zhì)成分增多以及新血管翳的形成，即主要是細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能紊亂導(dǎo)致免疫應(yīng)答反應(yīng)失衡所引起的，其中T細(xì)胞激活是炎癥的核心。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展是一個由淋巴系統(tǒng)、多種細(xì)胞因子共同參與的自身免疫過程，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前還未能完全明確，缺乏有效的臨床治療手段。目前臨床上治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的常用藥物分為四大類，即非留體抗炎藥(nonsteroidalant1-1nflammatory drugs,NSAIDs)、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和植物藥，如甲氨蝶呤(甲氨蝶呤)、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺等，但是長時間使用這些藥物會使較多患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，導(dǎo)致不能耐受而停用。
[0003]連接粘附分子家族(Junct1nal Adhes1n Molecules，JAMs)屬于免疫球蛋白超家族，主要由連接黏附分子A、連接黏附分子B (JAM-B)和連接黏附分子C (JAM-C)三種蛋白組成，其功能的發(fā)揮并不依賴鈣離子。連接黏附分子A又稱為JAMl，血小板Fll受體(platelet Fll receptor)，血小板粘附分子(Platelet Adhes1n Molecule)，主要定位于表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接(Tight Junct1n)以及T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞膜上。在血管內(nèi)皮細(xì)胞連接處的連接黏附分子A在維持血管張力，在參與宿主免疫反應(yīng)、血管生成等反應(yīng)中起著極其重要的作用。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞膜表面的連接黏附分子A蛋白可以通過遠(yuǎn)膜端的V型免疫球蛋白樣功能區(qū)域和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子(LymphocyteFunct1n-associated Antigen 1，LFA_1)等蛋白順式結(jié)合，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞迀移和血小板聚集等功能。此外，連接黏附分子A在多種疾病中出現(xiàn)功能異常后可以使緊密連接的穩(wěn)定狀態(tài)發(fā)生改變，例如參與心血管疾病、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤疾病、色素膜炎和潰瘍性結(jié)腸炎等疾病的細(xì)胞迀移過程。
[0004]類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生異常改變，導(dǎo)致細(xì)胞間的完整性降低，免疫細(xì)胞、炎性細(xì)胞因子和多種蛋白酶得以容易地穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障進(jìn)入血管外的細(xì)胞外基質(zhì)，檢測到血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接處連接黏附分子A蛋白表達(dá)下調(diào)，造成關(guān)節(jié)的滑膜和軟骨出現(xiàn)炎性細(xì)胞侵潤，出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴，氧化應(yīng)激水平過高，基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)在局部對其中的膠原蛋白、蛋白聚糖、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等進(jìn)行水解，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞和功能殘損。本發(fā)明則是分析連接黏附分子A在外周血淋巴細(xì)胞上的表達(dá)分布，探索外周血淋巴細(xì)胞上連接黏附分子A的功能以及對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的影響，旨在尋找連接黏附分子A潛在的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要研究連接黏附分子A在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病和治療過程中所起的作用，從分析健康正常人和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者連接黏附分子A在外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)分布與功能入手，然后通過小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型和細(xì)胞體外實驗驗證連接黏附分子A在關(guān)節(jié)炎發(fā)病以及治療中的作用，目的是提供連接粘附分子A在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。
[0006]首先，檢測連接黏附分子A蛋白在健康正常人和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)分布。對37例健康正常人和48例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的外周血淋巴細(xì)胞膜表面的連接黏附分子A表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示連接黏附分子A蛋白在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的淋巴細(xì)胞膜上的表達(dá)水平比健康人高，而T淋巴細(xì)胞上的增高是引起這一現(xiàn)象的原因。但是與健康人相比，未接受規(guī)范藥物治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的淋巴細(xì)胞膜上的連接黏附分子A蛋白表達(dá)水平并無明顯改變。進(jìn)一步根據(jù)治療用藥情況將類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者分為若干組并與未治療組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲氨蝶呤(MTX)治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞膜上連接黏附分子A的表達(dá)升高，而評判類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動程度的指標(biāo)(DAS28/ESR、DAS28/CRP和SDAI)均下降，且外周血淋巴細(xì)胞膜上表達(dá)的連接黏附分子A與這些指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，表明外周血淋巴細(xì)胞膜上的連接黏附分子A的表達(dá)升高能減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。
[0007]其次，在小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型中驗證連接黏附分子A與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病和治療的關(guān)系。將C57BL/6小鼠購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)I周后隨機(jī)分為三組，每組小鼠數(shù)量為8只:⑴正常對照組(control group，CON)，每隔3天使用滅菌蒸饋水對小鼠灌胃I次，共5次；⑵膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型組(collagen induced arthritis group, CIA)，每隔3天使用滅菌蒸餾水對小鼠灌胃I次，共5次，隨后使用牛II型膠原蛋白進(jìn)行動物免疫建立關(guān)節(jié)炎模型；⑶甲氨噪呤治療關(guān)節(jié)炎組(MTX treatment group，MTX+CIA)，每隔3天使用甲氨喋呤藥物對小鼠灌胃I次，共5次，隨后使用牛II型膠原蛋白進(jìn)行動物免疫誘發(fā)關(guān)節(jié)炎模型。在實驗第O天(Day 0)進(jìn)行首次灌胃前對小鼠采集血樣進(jìn)行第一次流式細(xì)胞學(xué)檢測，另外，在實驗第6天(Day 6)、第15天(Day 15)、第16天(Day 16，即進(jìn)行牛II型膠原蛋白免疫后的第二天)，第24天(Day 24)和第30天(Day 30)采集小鼠血液進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠外周血淋巴細(xì)胞膜表面的連接黏附分子A蛋白表達(dá)水平與正常組比較無差異，但是膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠經(jīng)過甲氨蝶呤治療后，小鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度減輕而且外周血淋巴細(xì)胞膜表面的連接黏附分子A表達(dá)蛋白表達(dá)水平升高。進(jìn)一步表明外周血淋巴細(xì)胞膜上連接黏附分子A的表達(dá)升高能夠減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病程度而起到很好的治療作用。
[0008]最后，體外細(xì)胞學(xué)驗證連接黏附分子A在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的功能。采集30例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和15例健康正常人的外周血并分離淋巴細(xì)胞，采用0.01 μ g/mL濃度的甲氨蝶呤處理5天后采用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞迀移實驗分析連接黏附分子A表達(dá)的變化和淋巴細(xì)胞迀移能力的變化。結(jié)果顯示，0.0l μ g/mL濃度的甲氨蝶呤對人淋巴細(xì)胞的連接黏附分子A基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)水平具有上調(diào)的作用，而類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的淋巴細(xì)胞的迀移能力也隨之減弱，采用J10.4抗體拮抗連接黏附分子A后，甲氨蝶呤抑制淋巴細(xì)胞迀移的作用被部分抵消，說明高表達(dá)的連接黏附分子A能抑制淋巴細(xì)胞迀移能力，從而減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病，這對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療有著極其重要的意義。
【附圖說明】
[0009]圖1.連接黏附分子A在健康正常人和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人、健康正常人和未接受正規(guī)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人外周血淋巴細(xì)胞膜表面的表達(dá)分布。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組的總淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞中分別有12.75%和8.87%的細(xì)胞表達(dá)連接黏附分子A，而健康正常人的這一數(shù)值為5.16%和2.95%，說明健康正常人和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的連接黏附分子A表達(dá)水平差異顯著(P〈0.01);而兩組間B淋巴細(xì)胞膜上的連接黏附分子A蛋白表達(dá)水平并無明顯差異(P>0.05)(圖1A)。但是健康正常人和未接受正規(guī)治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的總淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞膜上的連接黏附分子A蛋白與健康對照組相比均無明顯變化(P>0.05)(圖1C)。為排除流式細(xì)胞術(shù)分析時由淋巴細(xì)胞數(shù)目不同而導(dǎo)致的誤差，所以對健康對照組和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組、健康對照組和未接受正規(guī)