NA、RNA片段。
[0134]最后將實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈瓣置于無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中清洗3次，每次5分鐘。
[0135]上述無(wú)菌生理鹽水或無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中均含有青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)ο
[0136]將制備好的去細(xì)胞瓣膜進(jìn)行下一步相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)去細(xì)胞效果。
[0137]3.2去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣支架的生物學(xué)及力學(xué)性能驗(yàn)證
[0138](I)瓣膜蘇木素-伊紅(HE)染色、MASSON染色
[0139]將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組瓣膜分別用4%多聚甲醛固定24小時(shí)后，用石蠟進(jìn)行包埋，按照5 μ m的厚度進(jìn)行切片，然后按照HE、MASS0N染色試劑盒操作說(shuō)明，進(jìn)行HE、MASS0N染色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察和評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組瓣膜的細(xì)胞及細(xì)胞碎片殘留、瓣膜結(jié)構(gòu)、纖維走形等情況。
[0140](2) _膜掃描電子顯微鏡觀察
[0141]對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組瓣膜經(jīng)3%戊二醛4°C固定24小時(shí)，采用系列濃度梯度的乙醇(75%乙醇-85%乙醇-95%乙醇-100%乙醇)進(jìn)行脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，離子濺射噴金后，于場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組瓣膜的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性。
[0142](3)瓣膜DNA含量的測(cè)定
[0143]參考動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒的相應(yīng)說(shuō)明，稱(chēng)取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組瓣膜組織，于1.5毫升EP管中碾碎后，置于56°C水浴振蕩下裂解3小時(shí)。然后按照動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明，使用試劑盒中的試劑提取DNA。最后于生物核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA的具體含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0144](4)瓣膜含水量的測(cè)定
[0145]取各組瓣膜(每組6片)，用濾紙盡量吸干瓣膜表面的水分，準(zhǔn)確稱(chēng)量后置凍干管中(記為mQ)，在冷凍干燥機(jī)-56°C條件下預(yù)凍3小時(shí)，再經(jīng)真空干燥20小時(shí)，之后準(zhǔn)確稱(chēng)量?jī)龈珊蟮母鹘M瓣膜質(zhì)量(記為Hi1)。用以下公式計(jì)算各瓣膜組含水量:
[0146]各瓣膜組含水量(％) = (Hi0-1ii1)Zm0X 100%
[0147](5)瓣膜膠原蛋白含量的測(cè)定
[0148]稱(chēng)取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組瓣膜組織，用液氮迅速冷凍，于碎冰上融化后加入磷酸鹽緩沖液，充分勻漿，再將其于4°C、2500r/min，離心20min，收集上清液，按照豬膠原蛋白ELISA試劑盒的相應(yīng)操作，測(cè)定膠原蛋白含量。
[0149](6)瓣膜彈性蛋白含量的測(cè)定
[0150]稱(chēng)取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組瓣膜組織，用液氮迅速冷凍，于碎冰上融化后加入磷酸鹽緩沖液，充分勻漿，再將其于4°C、2500r/min，離心20min，收集上清液，按照豬彈性蛋白ELISA試劑盒的相應(yīng)操作，測(cè)定彈性蛋白含量。
[0151](7)瓣膜細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0152]根據(jù)GB/T 16886.5-2003標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的主動(dòng)脈瓣毒性由臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的相對(duì)增值率來(lái)評(píng)價(jià)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0153]用添加10%胎牛血清的RPMI 1640的細(xì)胞培養(yǎng)基在37°C、5% 0)2和95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。各組瓣膜浸提液的制備:將各組瓣膜(酒精消毒)按IcmX Icm大小放入含1mL細(xì)胞培養(yǎng)液的試管中，在37°C無(wú)菌條件下孵育24小時(shí)，經(jīng)孔徑為0.22 μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌。
[0154]將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞制備成密度為5X103/ml的細(xì)胞懸液，參照TransDetect? Cell Counting Kit說(shuō)明書(shū)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔種植100 μ I上述細(xì)胞，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁良好后(12-24小時(shí))，各實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入對(duì)應(yīng)的瓣膜浸提液10ul，對(duì)照組每孔加入1ul細(xì)胞培養(yǎng)液，置于上述培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，小心向每孔加入11 μ I CCK溶液，再將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處各孔的吸光度值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率(RGR):RGR(% )=實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值。
[0155](8)瓣膜溶血實(shí)驗(yàn)
[0156]根據(jù)GB/T 16886.4-2003標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)瓣膜的血液相容性，分別測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的主動(dòng)脈瓣的血液相容性，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0157]先將各瓣膜組的瓣膜(IcmX Icm)放入含1ml磷酸鹽緩沖液的離心管中并在37°C下平衡I小時(shí)，再將稀釋的兔血(8ml血液用1ml磷酸鹽緩沖液稀釋)0.2ml加入試管中，繼續(xù)在37°C下孵育I小時(shí)，分別以三蒸水作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液作為陰性對(duì)照，然后將離心管以1500rpm離心lOmin，取上清液，并在波長(zhǎng)545nm處測(cè)定其吸光度值。溶血率(HR)通過(guò)下列公式計(jì)算:
[0158]HR = (AS-AN) / (AP-AN)
[0159]式中AS、AN、AP分別代表各瓣膜組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組上清液的吸光度值。
[0160](9)瓣膜力學(xué)性能測(cè)試
[0161]各瓣膜組的相關(guān)力學(xué)性能由電腦伺服式拉力試驗(yàn)機(jī)沿圓周和徑向方向測(cè)得，如圖6所示，各組瓣膜沿圓周方向(見(jiàn)圖6A)剪成15X5mm的條形，沿徑向方向(見(jiàn)圖6B)剪成10X5mm的條形，游標(biāo)卡尺測(cè)量辧膜厚度后固定在拉力試驗(yàn)機(jī)夾鉗之間。最后以10毫米/分鐘的速度進(jìn)行拉伸試驗(yàn)，直至瓣膜斷裂。各瓣膜延圓周和徑向的最大拉伸強(qiáng)度、斷裂強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率和彈性模量由電腦伺服式拉力試驗(yàn)機(jī)輸出。本實(shí)驗(yàn)分別從圓周和徑向2個(gè)方向?qū)Ρ热ゼ?xì)胞組瓣膜與正常瓣膜是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，從而評(píng)價(jià)去細(xì)胞瓣膜的力學(xué)性能。
[0162]本實(shí)驗(yàn)瓣膜的分組采用隨機(jī)分組方式，通過(guò)生物學(xué)性能測(cè)試和力學(xué)性能測(cè)試驗(yàn)證其去細(xì)胞效果。生物學(xué)性能檢測(cè)包括蘇木素-伊紅(HE)染色、MASSON染色，掃描電子顯微鏡觀察瓣膜去細(xì)胞情況，測(cè)定瓣膜DNA含量、含水量、膠原蛋白含量、彈性蛋白含量，細(xì)胞毒性以及瓣膜溶血實(shí)驗(yàn)；力學(xué)性能測(cè)試包括最大拉伸強(qiáng)度、斷裂強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率和彈性模量的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的統(tǒng)計(jì)差異采用單因素方差分析，當(dāng)P < 0.05提示實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0163]其表征結(jié)果如下:
[0164](I)瓣膜蘇木素-伊紅(HE)染色、MASSON染色
[0165]對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組HE染色和MASSON染色結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的染色情況可以看出，實(shí)驗(yàn)組瓣膜去細(xì)胞完全，未見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，瓣膜纖維呈疏松狀、波浪狀排列，保持相對(duì)完整，見(jiàn)圖3B和圖4B。
[0166](2) _膜掃描電子顯微鏡觀察
[0167]對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈瓣掃描電子顯微鏡見(jiàn)圖5。各瓣膜組按照掃描電子顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)制樣，在場(chǎng)發(fā)射掃面電鏡下觀察各瓣膜組去細(xì)胞情況。瓣膜鏡下結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈瓣去細(xì)胞后膠原纖維呈疏松多孔條索狀，排列整齊，未見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖5B。
[0168](3)瓣膜DNA含量的測(cè)定
[0169]測(cè)定結(jié)果表明對(duì)照組主動(dòng)脈瓣DNA含量為336.938 ± 9.329ng/mg，經(jīng)去細(xì)胞處理的實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈瓣DNA含量為4.998±0.115ng/mg，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著的差異(P
<0.05)，證實(shí)本發(fā)明的去細(xì)胞方法能將主動(dòng)脈瓣上的細(xì)胞基本去除完全，與染色效果一致。
[0170](4)瓣膜含水量的測(cè)定
[0171]測(cè)定結(jié)果表明，對(duì)照組主動(dòng)脈瓣的含水量為91.34±0.4%，實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈瓣的含水量為88.51 ±0.29%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見(jiàn)明顯差異(P > 0.05)。
[0172](5)瓣膜膠原蛋白含量的測(cè)定
[0173]豬膠原蛋白ELISA試劑盒測(cè)定結(jié)果表明，對(duì)照組主動(dòng)脈瓣的膠原蛋白含量為5.311 ±0.828%，實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈瓣的膠原蛋白含量為5.221 ±0.514%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見(jiàn)明顯的差異(P > 0.05)。
[0174](6)瓣膜彈性蛋白含量的測(cè)定
[0175]豬彈性蛋白ELISA試劑盒測(cè)定結(jié)果表明，對(duì)照組主動(dòng)脈瓣的彈性蛋白含量為0.326 ±0.044ng/mg，實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈瓣的彈性蛋白含量為0.169 ±0.049ng/mg，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有差異(P < 0.05)。
[0176](7)瓣膜細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0177]對(duì)照組主動(dòng)脈瓣的相對(duì)增值率為97.42±3.41 %，細(xì)胞毒性級(jí)別為I級(jí)，而實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈瓣的相對(duì)增值率為101.05±2.16%，細(xì)胞毒性級(jí)別為O級(jí)，各組相對(duì)增值率在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中未見(jiàn)明顯的差異(P > 0.05)。由此證實(shí)，本發(fā)明所制備的去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。
[0178](8)瓣膜溶血實(shí)驗(yàn)
[0179]對(duì)照組主動(dòng)脈瓣的溶血率為0.5±0.001 %,實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈瓣的溶血率為
0.1±0.002%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著的差異(P < 0.05)，證實(shí)本發(fā)明的去細(xì)胞方法血液相容性良好。
[0180](9)瓣膜力學(xué)性能測(cè)試
[0181]I)最大拉伸強(qiáng)度測(cè)定:
[0182]由電腦伺服式拉力試驗(yàn)機(jī)輸出最大拉伸強(qiáng)度為:
[0183]圓周方向:實(shí)驗(yàn)組4.88±0.58MPa，對(duì)照組5.16±0.55MPa，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見(jiàn)明顯差異(P > 0.05)。
[0184]徑向方向:實(shí)驗(yàn)組0.84±0.13MPa，對(duì)照組0.69±0.17MPa，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見(jiàn)明顯差異(P > 0.05)。
[0185]2)斷裂強(qiáng)度測(cè)定。
[0186]由電腦伺服式拉力試驗(yàn)機(jī)輸出斷裂強(qiáng)度為:
[0187]圓周方向:實(shí)驗(yàn)組3.31±0.56MPa，對(duì)照組3.61±0.32MPa，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見(jiàn)明顯差異(P > 0.05)。
[0188]徑向方向:實(shí)驗(yàn)組0.49±0.08MPa，對(duì)照組0.47±0.23MPa，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見(jiàn)明顯差異(P > 0.05)。
[0189]3)斷裂伸長(zhǎng)率測(cè)定
[0190]由電腦伺服式拉力試驗(yàn)機(jī)輸出斷裂伸長(zhǎng)率為:
[0191]圓周方向:實(shí)驗(yàn)組67.60±13.58%，對(duì)照組52.13± 11.69 %，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見(jiàn)明顯差異(P > 0.05)。
[0192]徑向方向:實(shí)驗(yàn)組48.56±12.88%，對(duì)照組44.11±25.35%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見(jiàn)明顯差異(P > 0.05)。