至 250g (+/-5g)的純凈水中，直至得到澄清溶液。
[0051] 胰酶溶液是通過(guò)如下制備的：將2. lg(+/-〇. 2g)的胰酶粉加至150g(+/-3g)的純 凈水中。使用攪拌器，并小心處理以將泡沫減至最少。一旦得到均勻混合物，則將該溶液以 3500rpm離心20分鐘，然后將上清液在冰上儲(chǔ)存。
[0052] 小腸電解質(zhì)溶液（SIES)25% (濃縮的）是通過(guò)如下制成的：將純凈水加至 250g(+/-5g)氯化鈉、30g(+/-0. 5g)氯化鉀和15g(+/-0. 3g)無(wú)水氯化鈣中，從而制成2174g 的總量。一旦所述鹽溶解了，用IM氫氧化鈉將pH調(diào)整至pH7. 0 (+/-0. 5)。
[0053] 然后制備稀釋的SIES :使用濃的43. 5 (+/-lg) SIES，加至純凈水中，使總重為 1000 g0
[0054] 胰蛋白酶溶液是通過(guò)如下制備的：將200mg(+/-5mg)胰蛋白酶溶于100g(+/-2g) 稀釋的SIES中。然后將這個(gè)溶液吸取至L 5ml微量離心管（印pendorf tubes)中（每管 Iml)并在-20 °C冷凍。
[0055] 然后制備所述SIF :將25g(+/-0· 3g)的膽汁溶液、12. 5g(+/-0· 3g)胰酶溶液和 12. 5g (+/-0. 5g)的稀釋的SIES (膽汁/胰酶/稀釋的SIES的比例為2:1:1)混合。然后在 即將使用該溶液前加入1ml的胰蛋白酶溶液。
[0056] 域抗體M的制各
[0057] 使用Vivaspin(?)5003kD MWCO柱將研宄中的域抗體（?) (dAb(?))濃縮至約20mg/ ml。該柱在使用前用PBS進(jìn)行預(yù)清洗，從而將樣品回收最大化。濃度通過(guò)Nanodrop?確 定，其使用的是摩爾消光系數(shù)和分子量選項(xiàng)。
[0058] 反應(yīng)組成
[0059] dAb?在SIF中的培養(yǎng)是在250 μ 1的最終體積中進(jìn)行的。摻入該混合物中的dAb ? 的體積使得到lmg/ml的最終濃度。
[0060] 立即取出25 μ 1的等份，并將其儲(chǔ)存于干冰中（在0小時(shí)時(shí)間點(diǎn)）。將反應(yīng)混合 物在37°C培養(yǎng)，并振蕩（IOOrpm)。隨后在以下時(shí)間點(diǎn)取出25 μ 1的等份：0. 25小時(shí)、0. 5小 時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)及過(guò)夜。將樣品在干冰中急凍并在分析前儲(chǔ)存于-80°C。
[0061] SDS-PAGE 分析
[0062] 在各時(shí)間點(diǎn)，殘留于SIF中的dAb(TM)的量是通過(guò)SDS-PAGE和光密度測(cè)定法測(cè)量 的。簡(jiǎn)而言之，將樣品在水和加樣緩沖液混合物中稀釋至1/10并加熱至80°C，持續(xù)5min。 將樣品迅速冷卻，然后將10 μ 1該樣品連同制備好的標(biāo)準(zhǔn)品（dAb(TM)的水溶液）和分子量 標(biāo)記物一起加樣至4-12% Novex(?)bis-tris凝膠。將該凝膠以恒定150V在lx MES緩沖 液中運(yùn)行45分鐘，并用Instant Blue(TM)染色過(guò)夜，將該蛋白條帶可視化。使用Odyssey Li-Cor(TM)凝膠成像系統(tǒng)和相對(duì)于Oh時(shí)間點(diǎn)的條帶的密度（起始量）計(jì)算的dAb (TM)的存在 量，進(jìn)行所得條帶的光密度測(cè)定。制成時(shí)間與dAb(TM)起始量的百分比的指數(shù)曲線，并將50% 的dAb(TM)起始量出現(xiàn)的時(shí)間設(shè)定為其半衰期。
[0063] 使用上述方法，將一組具有不同轉(zhuǎn)變中點(diǎn)（Tm)的dAb(TM)(如表1所示）在SIF中 培養(yǎng)并用SDS-PAGE和光密度測(cè)定法分析。對(duì)于這些實(shí)施例，高Tm dAb(TM)是指具有彡66°C 的Tm的dAb(?)，而低Tm dAb(?)是指具有彡56°C的Tm的dAb (TM)。
[0064] 表1 :具有不同Tm的ClAblal組
[0065]
[0066] 結(jié)果如圖1所示。這個(gè)圖是在三個(gè)單獨(dú)天中進(jìn)行的SIF研宄的組合。具有最高Tm 的dAb(TM)的D0M4顯然比所研宄的其他dAb (TM)穩(wěn)定得多。為了驗(yàn)證是否這是一種趨勢(shì)，使 用上述方法研宄了另外4種高Tm dAb(TM)，如表2所示。
[0067] 表 2 :高 Tm ClAblal組
[0068]
[0069] 高Tm dAb(TM)組的結(jié)果如圖2所示。
[0070] 另一 dAb(TM)，D0M8,在SIF中極其穩(wěn)定。另外三種dAb(TM)就沒(méi)有那么穩(wěn)定了。但 是，所測(cè)試的五種高Tm dAb(TM)中的四種均比具有低于66°C Tm的dAb(TM)穩(wěn)定。兩種最穩(wěn) 定的dAb(TM) (D0M4和D0M8)均具有V κ骨架。但是，DOMll也具有V κ骨架，但是要不穩(wěn)定 得多，因此該骨架可能對(duì)于穩(wěn)定性沒(méi)那么重要。將DOMll在SIF中培養(yǎng)，該DOMll是在與其 他三種高Tm dAb(TM)不同的條件下培養(yǎng)的。
[0071] 實(shí)施例2 :使用甲磺酸卡莫司他對(duì)體外域抗體11講行穩(wěn)定
[0072] 將在實(shí)施例1中所研宄的那組dAb(TM)也在含有甲磺酸卡莫司他（CM，Sequoia Research Products)的SIF中進(jìn)行培養(yǎng)，以測(cè)定是否抑制蛋白酶將提高dAb(TM)的穩(wěn)定性。 將CM加至上文所述的電解質(zhì)溶液中，使?jié)舛葹?50mg/ml (CM是高濃度的，但低于飽和點(diǎn)）， 并溫?zé)嶂?0°C使其溶解。將CM加至該SIF/dAb(TM)中，使最終濃度為10mg/ml。所使用的時(shí) 間點(diǎn)和后續(xù)分析按實(shí)施例1所述進(jìn)行。
[0073] 該結(jié)果示于實(shí)施例1的結(jié)果旁邊，用以比較圖3和4。添加 CM至該SIF/dAb混合 物中增加了所有（除一個(gè)之外）所研宄的dAb(TM)的半衰期。該半衰期延長(zhǎng)在所有測(cè)試分子 中不是相同的，意味著dAb(TM)的固有性質(zhì)決定了它們被穩(wěn)定的能力。此外，盡管高Tm dAb(TM)具有不同的半衰期，但是它們似乎本身更易于用CM進(jìn)行穩(wěn)定，因?yàn)樗袦y(cè)試的高Tm dAb(TM)的半衰期均延長(zhǎng)至超過(guò)24小時(shí)。
[0074] 實(shí)施例3 :對(duì)dAb1?1穩(wěn)定性建樽以及.Tm對(duì)域抗體爐固有穩(wěn)定性的重要性
[0075] 編寫(xiě)perl腳本來(lái)掃描胰蛋白酶和糜蛋白酶（存在于胰酶）切割位點(diǎn)的蛋白序列。 然后將半衰期與預(yù)期切割位點(diǎn)以及與Tm相關(guān)聯(lián)。
[0076] 在Tm和半衰期之間觀察到微弱的正相關(guān)（Spearman，0. 58 ;Pearson，0. 31)。但是， 當(dāng)存在CM時(shí)，使用這兩種相關(guān)測(cè)量，在Tm和半衰期之間觀察到很強(qiáng)的正相關(guān)（Spearman， 0.78;Pearson，(X90)。這表明，Tm越高，該dAb(TM)越易于用CM進(jìn)行穩(wěn)定。存在或不存在CM 時(shí)，在預(yù)期切割位點(diǎn)和半衰期之間未觀測(cè)到明顯的相關(guān)性。
[0077] 在建模過(guò)程中，觀察到兩種V κ骨架dAb(TM)均具有相同的預(yù)期胰蛋白酶切割位點(diǎn)， 但是在SIF中具有不同的半衰期和不同的Tm。它們是D0M4(半衰期6. 1小時(shí)，Tm 72. 8°C ) 和DOMl (半衰期0. 1小時(shí)，Tm 55°C )。將這兩種dAb(TM)用胰蛋白酶進(jìn)行培養(yǎng)，該胰蛋白酶 的濃度與在SIF中所使用的濃度相同，但是不含膽鹽或胰酶。然后將任何可見(jiàn)的半衰期的 不同均歸因于Tm。也將CM添加至該胰蛋白酶/dAb(TM)混合物中。按前述計(jì)算半衰期，且結(jié) 果如圖5所示。
[0078] 在僅存在胰蛋白酶的情況下，D0M4的半衰期比DOMl的半衰期要長(zhǎng)得多。在這種 情況下，Tm的差異有可能解釋了該分子穩(wěn)定性的增加。
[0079] 實(shí)施例4 :伸用甲磺酸卡草司他來(lái)穩(wěn)宙TNFRl特異件dAb^DOMioi (SEQ ID N0:6)， 其言接給藥至禁畬的Han Wistar大鼠的十二指腸中
[0080] 向Han Wistar大鼠給藥Img D0M101 (含有或不含IOOmg CM)，以測(cè)定在胃腸道中 CM是否能保留dAb(TM)。將