包含單一可變域和甲磺酸卡莫司他(cm)的組合物的制作方法
【專利說明】包含單一可變域和甲磺酸卡莫司他（CM)的組合物
【背景技術(shù)】
[0001] 絕大多數(shù)生物藥物（尤其是治療性抗體及其片段）通過胃腸外途徑（例如靜脈或 皮下注射）進行給藥。這些給藥途徑通常是不方便且痛苦的，這降低了患者的順應(yīng)性，尤其 是當(dāng)需要每日多次注射時。對于保健醫(yī)療提供者而言，在工作人員的時間、儲存和設(shè)備方 面，這些生物藥物也是花費巨大的。
[0002] 口服給藥生物藥物將克服許多的這些缺點，但也具有其自身的問題。具體地，這些 分子易在胃和腸的蛋白酶富集的環(huán)境中發(fā)生蛋白降解。
[0003] 重點是，對治療胃腸（GI)道疾病的口服藥物存在需求。尤其是對以低劑量使用的 藥物存在需求，以降低系統(tǒng)毒性的風(fēng)險。
[0004] 因此，迫切地需要穩(wěn)定蛋白以便使它們抵御胃腸道的蛋白酶富集的環(huán)境，從而促 成成功口服給藥生物藥物。
[0005] 發(fā)明概沐
[0006] 本發(fā)明提供了組合物（任選地藥物組合物），其包含甲磺酸卡莫司他（camostat mesylate)和單一可變域。
[0007] 提供了用作藥物的本發(fā)明的組合物。還提供了本發(fā)明的組合物在制備藥物中的用 途。尤其是所述組合物是口服給藥的。
[0008] 本發(fā)明提供了治療胃腸道病癥的方法，其包括以下步驟：向有此需要的患者給藥 (任選地口服給藥）本發(fā)明的組合物。
[0009] 本發(fā)明還提供了穩(wěn)定在蛋白酶富集的溶液中的單一可變域的方法，其包括將該單 一可變域配制于包含甲磺酸卡莫司他的組合物中，在該組合物暴露于蛋白酶富集的溶液之 刖。
【附圖說明】
[0010] 圖1顯示了在模擬腸液（SIF)中培養(yǎng)的一組具有不同轉(zhuǎn)變中點（transition midpoint) (Tm)的 dAb(TM)的半衰期。
[0011] 圖2顯示了在SIF中培養(yǎng)的一組高Tm的dAb(TM)的半衰期。
[0012] 圖3顯示了在存在或不存在CM的模擬腸液（SIF)中培養(yǎng)的一組具有不同轉(zhuǎn)變中 點（Tm)的dAb(TM)的半衰期。
[0013] 圖4顯示了在存在或不存在CM的SIF中培養(yǎng)的一組高Tm的dAb(TM)的半衰期。
[0014] 圖5顯示了具有相同的預(yù)期胰蛋白酶切割位點但是不同Tm的兩個dAb(TM)的半衰 期。將該dAb(TM)用存在和不存在CM時的胰蛋白酶培養(yǎng)。
[0015] 圖6顯示了在不存在（a)和存在（b)CM的十二指腸內(nèi)給藥后的不同時間點，從腸 組織回收的dAb(TM)D0M101的量。結(jié)果表示為納克/克組織。
[0016] 圖7顯示了在存在和不存在CM的結(jié)腸內(nèi)給藥后，從大腸回收的dAb(tm)D0M101的 量。結(jié)果表示為納克/克組織。
[0017] 發(fā)明詳沐
[0018] 本發(fā)明提供了對上述問題的解決方法。本發(fā)明提供了穩(wěn)定單一可變域的方法。提 供了包含單一可變域和甲磺酸卡莫司他的組合物（尤其是藥物組合物），以及所述組合物 作為藥物和在治療方法中的用途。本文的實施例表明，甲磺酸卡莫司他（CM)可用于在禁食 的模擬腸液以及在小腸和大腸中穩(wěn)定單一可變域（例如域抗體(TM)或dAb (TM))，并因此支持 了 CM在口服遞送生物藥物以局部治療GI病癥（例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎）以及直接 作用于腸黏膜免疫系統(tǒng)中的用途。
[0019] 甲磺酸卡莫司他（CAS號：59721-29-8)的化學(xué)名為4-[[4_[(氨基亞氨基甲基） 氨基]苯甲?；鵠氧基]苯乙酸2-(二甲基氨基）-2-氧代乙基酯甲磺酸鹽且其可從例 如Sequoia Research Products獲得。甲磺酸卡莫司他（CM)是有口服活性的絲氨酸蛋 白酶抑制劑，其在日本和韓國被批準用于治療胰腺炎和術(shù)后食道反流（Foipan Product information sheet ；Takasugi 等人，Digestion 1982,24:36 - 41 ;Kono 等人，Am J Surg. 2005S印，190(3) :412-7)。CM具有廣譜抑制，包括胰蛋白酶、凝血酶、激肽釋放酶和纖 溶酶（Tamura 等人，1977, Biochimica et Biophysica Acta 484,417 - 422)。CM 在腸內(nèi)的 代謝尚不明確，但是CM的代謝產(chǎn)物GBPA本身是有活性的（Beckh等人，Res Exp Med，1987， 187:401-406)。
[0020] 術(shù)語"單一可變域"是指折疊的多肽域，其包含以抗體可變域為特征的序列。因此， 其包括完整的抗體可變域（例如VH、VHH和VL)和經(jīng)修飾的抗體可變域（例如，抗體可變域 中的一個或多個環(huán)被不是以抗體可變域為特征的序列代替，或者抗體可變域已被截短或包 含N-或C-端延長），以及可變域片段，其至少保留了全長結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性和特異性。單 一可變域能夠獨立地結(jié)合不同可變區(qū)或可變域的抗原或表位。"域抗體?"或"dAb(TM) "可被 認為與"單一可變域"相同。單一可變域可為人單一可變域，但也包括源自其他物種（例如 嚙齒類動物（例如，如WO 00/29004所公開）、鉸口鯊和駱駝科動物的VHH dAb?)的單一可 變域。駱駝科動物的VHH是免疫球蛋白單一可變域，其衍生自以下物種，包括：駱駝、美洲駝 羊、羊駝、單峰駱駝和大羊駝，其產(chǎn)生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域可用的標準 技術(shù)將該VHH結(jié)構(gòu)域人源化，且這種結(jié)構(gòu)域被認為是"單一可變域"。本文所用的VH包括駱 駝科動物的VHH結(jié)構(gòu)域。
[0021] 抗祀點（anti-target)單一可變域，例如抗-TNFa單一可變域，是指結(jié)合至所述 靶點（例如TNF a)的單一可變域。所述靶點可為任意合適的靶點。在一個實施方式中，本 發(fā)明的單一可變域靶向以下的任一種：TNF a、IL-23、LAG-3、IL-6、IL-13、IL-18、TSLP、CD3 或前述任一個的受體，例如TNF a受體（例如TNFR a RI或TNFR a RH)、IL-23受體、LAG-3 受體、IL-6受體、IL-13受體、IL-18受體、TSLP受體或CD3受體。在一個實施方式中，本發(fā) 明的單一可變域靶向趨化因子或趨化因子受體，例如谷氨酸-亮氨酸-精氨酸受體，即ELR 受體（例如包含SEQ ID NO : 12和19-22所示的氨基酸序列的受體）。
[0022] 親和力是一個分子（例如本發(fā)明的單一可變域）與另一個分子（例如其靶點）在 單一結(jié)合位點處結(jié)合的力。單一可變域與其靶點的結(jié)合親和力可通過平衡方法（例如酶聯(lián) 免疫吸附測定（ELISA)或放射免疫測定（RIA))或動力學(xué)（例如BIAC0RE?分析）進行測 定。
[0023] 在一個實施方式中，所述單一可變域-靶點間的相互作用的平衡解離常數(shù)（KD)為 IOOnM或更小、IOnM或更小、2nM或更小或InM或更小?；蛘?，該KD可在5至IOnM之間；或 1至2nM之間。該KD可在IpM至500pM之間；或500pM至InM之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理 解，KD數(shù)值越小，結(jié)合越強。KD的倒數(shù)（即1/KD)為具有單位M4的平衡結(jié)合常數(shù)（KA)。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，KA數(shù)值越大，結(jié)合越強。
[0024] 解離速率常數(shù)（kd)或"解離速率（off-rate) "描述了單一可變域-靶點復(fù)合物 的穩(wěn)定性，即每秒發(fā)生衰變的復(fù)合物的比例。例如，〇. OlsH的kd等于每秒有1 %的復(fù)合物 發(fā)生衰變。在一個實施方式中，該解離速率常數(shù)（kd)為IxKT3iT1或更小、1x10 ΛΓ1或更小、 ΙχΙΟ?或更小，或1x10 Λ-1或更小。該kd可在1x10-Υ1至1x10 Λ-1之間；或1x10 ΛΓ1至 1x10 3S 1 之間。
[0025] 在整個申請中所用的術(shù)語"中和"是指，在存在本文所述的單一可變域的情況下， 靶點的生物