一種提取側(cè)柏葉中黃酮類物質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黃酮類物質(zhì)的提取方法，具體涉及一種從側(cè)柏葉中提取黃酮類物 質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，由于自由基生命科學(xué)的進(jìn)展，使具有很強的抗氧化和消除自由基作用的 黃酮類物質(zhì)受到空前的重視。其抗氧化作用比VE強50倍，比VC強20倍，而且能通過血腦 屏障到達(dá)腦部，防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，尤其對皮膚的保養(yǎng)、年輕化及血管抗炎作用特別 顯著。目前，從銀杏葉、紫蘇葉、龍柏葉、槐花、香椿嫩葉中提取黃酮類化合物報道較多。但 是從側(cè)柏葉中提取黃酮類物質(zhì)并不多見。
[0003] 側(cè)柏葉是側(cè)柏的干燥嫩枝梢及葉，含有類黃酮、鞣質(zhì)、精油等多種天然活性成分， 具有涼血止血、化痰止咳、祛風(fēng)降濕、生發(fā)烏發(fā)、消腫散毒的功效，側(cè)柏葉中黃酮類物質(zhì)是其 最重要的成分之一。因而，側(cè)柏葉中黃酮類化合物的提取對于食品科學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展有很 重要的影響。
[0004] 目前應(yīng)用于側(cè)柏葉黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有：有機溶劑萃取法、酶提取法、超 聲提取法、微波提取法。其中，有機溶劑提取法是國內(nèi)外采用的最為廣泛的方法，但這種方 法周期長、步驟多、產(chǎn)率低，且產(chǎn)品中會有有機溶劑的殘留，對提取后產(chǎn)品質(zhì)量有影響；酶提 取法必須要保持最佳溫度、最佳pH值，對整個反應(yīng)的條件控制要求比較高；超聲波提取技 術(shù)大大的提高了提取效率、縮短了提取時間、節(jié)約溶劑，并且免去了高溫對提取成分的破 壞，但大量提取時效率低；微波提取法，具有快速、溶劑用量少、提取率高、成本低和質(zhì)量好 等許多優(yōu)點，但其成品的組成不是非常穩(wěn)定；顯而易見，無論是何種提取技術(shù)都有自身的不 足和局限性，而本項發(fā)明采用凍融與超聲波技術(shù)聯(lián)合提取，凍融技術(shù)的特點是：細(xì)胞可在形 成冰粒和增高剩余胞液鹽濃度的同時，發(fā)生溶脹、破碎，使黃酮類物質(zhì)得以充分釋放，并且 還保持活性。該技術(shù)是一種高效、環(huán)保的提取方法。目前還未見應(yīng)用凍融技術(shù)提取側(cè)柏葉 黃酮類物質(zhì)的報道。實驗證明采用凍融與超聲波技術(shù)聯(lián)合提取高效且環(huán)保。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對上述黃酮類物質(zhì)的提取方法的不足之處，本發(fā)明提供了一種高效、 環(huán)保的提取方法。
[0006] 技術(shù)方案：本方法按以下步驟進(jìn)行：
[0007] ⑴將側(cè)柏葉洗凈、烘干、粉碎，過40目篩，得到側(cè)柏葉粉，然后加入水，均勻混合； 所加入的水與側(cè)柏葉的質(zhì)量比約為5 :1。
[0008] (2)將步驟（1)得到的混合液在-40?-20°c的溫度下冰凍10?24小時，室溫下 放置直至其融化；重復(fù)冰凍-融化步驟2?3次；如此，細(xì)胞可在形成冰粒和增高剩余胞液 鹽濃度的同時，發(fā)生溶脹、破碎。使黃酮類物質(zhì)得以充分釋放，并且還保持活性。
[0009] (3)向步驟（2)所得混合液中加入乙醇充分混勻，乙醇與混合液的體積比約為1 : 1，浸泡1?3h后，進(jìn)行超聲波提取，超聲功率為60?100W;超聲溫度為40?80°C;超聲時 間為20?60min;超聲的空化作用對細(xì)胞膜的破壞有助于黃酮類化合物的釋放與溶出，超 聲波使提取液不斷震蕩，有助于溶質(zhì)擴散。因此，超聲波法大大縮短了提取時間，提高了有 效成分的提出率，原料的利用率。超聲結(jié)束后進(jìn)行離心分離，取上清液，凍干，得到粗品。
[0010] ⑷將粗品配制成濃度為1?3mg/mL的溶液，滴加到大孔樹脂柱中進(jìn)行飽和吸附， 吸附后用水洗脫除去雜質(zhì)，再用60?80%乙醇作為洗脫劑，對洗脫劑進(jìn)行回收溶劑和濃縮 處理，最后進(jìn)行凍干，即得到黃酮類物質(zhì)。所述的大孔樹脂為D-101、AB-8或DM-130。所述 溶液的滴加量為柱體積的1. 5倍；水及乙醇的用量為柱體積的5倍。
[0011] 更進(jìn)一步的，我們發(fā)現(xiàn)，如果在步驟（2)結(jié)束后，將所得混合液再次冰凍，然后置 于超聲環(huán)境下融解，超聲功率為60?100W;超聲時間為60?90min，由于超聲波的熱效應(yīng) 使水溫增高，對原料有水浴作用，溫度自然升高至35?40°C，不僅使得混合液快速融化，而 且可以促進(jìn)黃酮類化合物的釋放與溶出。在超聲環(huán)境下融解后，在進(jìn)行步驟（3)、（4)，此方 法所得到的產(chǎn)物提取率大大提高，測定側(cè)柏葉黃酮類物質(zhì)提取率最高達(dá)到18. 2%。
[0012] 有益效果：本發(fā)明具有以下特點：整體工藝設(shè)計簡單合理，創(chuàng)造性的結(jié)合了多種 技術(shù)，彌補了單一技術(shù)的不足，大大提高了黃酮類物質(zhì)的提取率；由于側(cè)柏葉的特殊性，本 發(fā)明提取過程中，保持了相對較低的溫度，很好的保持了側(cè)柏葉黃酮類物質(zhì)的活性，使得產(chǎn) 品非常穩(wěn)定；本發(fā)明溶劑用量小且易于回收，節(jié)約成本；提取過程中僅使用了水和乙醇兩 種溶劑，并沒有引入氯仿、乙酸乙酯等其它溶劑，對環(huán)境無污染；這些特點都極大程度上符 合了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
【具體實施方式】：
[0013] 以下通過具體的實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明：
[0014] 實施例1
[0015] 取新鮮的側(cè)柏葉，稱重、洗凈，自然陰干后于烘箱中60°C烘干作為原料；粉碎至40 目，得到側(cè)柏葉粉；準(zhǔn)確稱量20g側(cè)柏葉粉，加入100mL水，制成側(cè)柏葉混合液；將側(cè)柏葉混 合液在-20°C下進(jìn)行冰凍，24h后取出室溫融化，如此反復(fù)三次；加入無水乙醇100mL，充分 混勻，浸泡2h后，進(jìn)行超聲波提?。撼暪β?0W;超聲時間20min;超聲溫度40°C;離心分 離，取上清液。將上清液放置于凍干機中進(jìn)行凍干處理，得到粗品；將粗品準(zhǔn)確配制濃度為 lmg/mL的溶液，滴加到AB-8大孔樹脂柱中進(jìn)行飽和吸附，最大上樣量為1. 5倍柱體積，先用 5倍柱體積的水洗脫除去雜質(zhì)，再用5倍柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液、濃縮、凍干， 得側(cè)柏葉黃酮類物質(zhì)樣品2. 42g。
[0016]測定：采用紫外分光光度法，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)對照品，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定側(cè) 柏葉黃酮類物質(zhì)的含量。
[0017] (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0018] 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1.Omg，用濃度為50%的乙醇定容至25.OmL。
[0019] 準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（48yg/mL)0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5.OmL于 6 支比色管中， 分別用50 %的乙醇至5.OmL，0. 1M三氯化鋁溶液3.OmL和1M醋酸鉀溶液5.OmL，搖勻，同法 制成空白對照；放置40min，待反應(yīng)完全，于415nm波長處測定吸光度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃 度（C)為橫坐標(biāo)，吸光度（A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020] (2)偵啪葉黃酮類物質(zhì)提取率的測定
[0021] 提取率Y%=m/n^XlOO%
[0022] 式中：得到側(cè)柏葉黃酮類物質(zhì)樣品的質(zhì)量（g);
[0023] 1112為使用側(cè)柏葉粉的質(zhì)量（g)。
[0024] (3)側(cè)柏葉提取物中黃酮類物質(zhì)含量的測定
[0025] 稱取5mg提取物置于25mL容量瓶中，按上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法配制溶液，并 測其吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取物中的黃酮類物質(zhì)含量。
[0026]含量P%=CVDXl(r3/mX100%
[0027] 式中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出的待測試液的黃酮類物質(zhì)濃度（mg/mL);
[0028] V為待測樣品溶液總體積（mL);
[0029] D為待測試液的稀釋倍數(shù)；
[0030] m為稱取的提取物質(zhì)量（mg