甘草黃酮類(lèi)提取物用于制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種甘草黃酮類(lèi)提取物在治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。通過(guò)利用甘草黃酮類(lèi)提取物在用于治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物方面的新應(yīng)用，甘草黃酮類(lèi)提取物相比陽(yáng)性對(duì)照藥物柳氮磺吡啶對(duì)乙酸致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)出更好的治療作用，以期在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中具有現(xiàn)實(shí)的價(jià)值，甘草黃酮類(lèi)提取物中甘草脂溶性黃酮類(lèi)提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎疾病藥物得到良好的應(yīng)用效果，甘草類(lèi)黃酮提取物中的查耳酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)于治療潰瘍性結(jié)腸炎療效明顯顯著。該甘草黃酮類(lèi)提取物既可以從甘草中提取獲得，也可從提取過(guò)甘草酸殘留的渣中提取獲得，不僅能更充分的利用甘草資源，而且還有利于將甘草廢渣資源開(kāi)發(fā)利用起來(lái)，變廢為寶，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】甘草黃酮類(lèi)提取物用于制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)，本發(fā)明具體涉及甘草黃酮類(lèi)提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，更進(jìn)一步講，本發(fā)明具體涉及利用常見(jiàn)甘草黃酮類(lèi)化合物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)在自然界廣泛分布的多酚類(lèi)物質(zhì)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種不同類(lèi)型的黃酮類(lèi)化合物具有廣泛的生物活性和藥理活性。大量研究表明，黃酮類(lèi)化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化、降血糖等功能。隨著工業(yè)的發(fā)展與消費(fèi)觀念的改變，天然活性成分的保健食品成為現(xiàn)代人追逐的目標(biāo)，其中黃酮類(lèi)化合物以純天然、高活性、見(jiàn)效快、作用廣泛等特點(diǎn)日益受到人們的關(guān)注。
[0003]黃酮類(lèi)化合物為一類(lèi)低分子量的廣泛分布于植物界的天然植物成分，為植物多酚類(lèi)的代謝物，大多有顏色。黃酮類(lèi)化合物又名生物類(lèi)黃酮化合物，是色原酮或色原烷的衍生物，黃酮類(lèi)化合物是自然界中以C6-C3-C6的方式構(gòu)成的三環(huán)天然有機(jī)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中C3部分可以是脂鏈，或與C6部分形成六元或五元環(huán)，黃酮類(lèi)化合物泛指這種兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)中央三碳鏈相互連接而成的一系列化合物。一般黃酮類(lèi)化合物可根據(jù)母核基本結(jié)構(gòu)的不同進(jìn)行分類(lèi)，主要有黃酮醇、黃酮、黃烷酮、黃烷醇、花色素、異黃酮、二氫黃酮醇以及查爾酮等8類(lèi)。另外，還有一些其他類(lèi)型的類(lèi)黃酮，如香豆素等。類(lèi)黃酮可以是配基和糖苷型，也可以是甲脂衍生物。黃酮醇以及黃酮化合物是最為常見(jiàn)的類(lèi)黃酮，而黃烷酮、黃烷醇類(lèi)、二氫黃酮以及二氫查爾酮類(lèi)化合物被認(rèn)為是一類(lèi)微量類(lèi)黃酮，因?yàn)楹笳咴谧匀唤绶植枷鄬?duì)有限。
[0004]甘草{Glycyrrhizae radix, GR)又名甜草根、粉草、靈通、國(guó)老等,為豆科甘草屬多年生草本植物。甘草株高4(T80cm，根莖粗壯，具有地下匐枝,主根圓柱形,長(zhǎng)達(dá)f 2m，外皮紅褐色至暗褐色，橫斷面莖內(nèi)部淡黃色或黃色，有甜味，莖直立，密被白色短毛及刺毛狀腺體，羽狀復(fù)葉，具小葉疒17片，卵形、圓形，長(zhǎng)1-3cm，寬1- 2.5cm，總狀花序腋生，花密集:花冠蝶形，淡藍(lán)紫或紫紅色，長(zhǎng)14-25_。莢果條狀長(zhǎng)圓形、鐮刀形或彎曲成環(huán)狀，褐色，外面密被刺狀腺體及短毛，種子為2-8粒，扁圓形或腎形，黑色，花期6-7月，果期7-9月。我國(guó)藥典記載藥用甘草為烏拉爾甘草、脹果甘草、光果甘草的干燥根及根莖。甘草歸心、肺、脾、胃經(jīng)，從古至今，廣為藥用。
[0005]人類(lèi)應(yīng)用甘草有近2400年的歷史，我國(guó)醫(yī)籍文獻(xiàn)記載甘草最早見(jiàn)于《神農(nóng)百草經(jīng)》，列為上品，稱(chēng)有強(qiáng)堅(jiān)筋骨、長(zhǎng)肌肉、倍力氣和解毒之功，能治五臟腹寒、熱邪氣及金瘡腫，東漢醫(yī)圣張仲景(公元2世紀(jì))在其《傷寒論》中使用處方74%有甘草。梁朝名醫(yī)陶弘景(公元5世紀(jì))編著 的《名醫(yī)別錄》中稱(chēng)其為“美草、蜜甘、國(guó)老”，并冠以“眾藥之王”的稱(chēng)號(hào)。明朝李時(shí)珍在其《本草綱目》中把甘草放于1074種中藥的第一味，收錄于12卷之首。清朝吳其俊在他的《植物名實(shí)圖考》中，對(duì)甘草亦有較詳細(xì)的考證?！侗静菡分袑?xiě)道“甘草得中和之性，有調(diào)補(bǔ)之功，故毒藥得之解其毒，剛藥得之和其性，表藥得之助其外，下藥得之緩其速。隨氣藥入氣，隨血藥入血，無(wú)往不可，故稱(chēng)“國(guó)老”。種植甘草中的甘草酸及黃酮提取純化工藝研究甘草經(jīng)我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐驗(yàn)證，確認(rèn)其有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效，可用于治療脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸氣短、咳嗽多痰、腹腔和四肢疼痛、癰腫瘡毒等癥，并用之緩解其它藥的毒性。甘草還具有抗寒、耐熱、耐旱、抗鹽堿、喜光等優(yōu)良特性，適生性強(qiáng)、生命力旺盛，為干早地區(qū)的植物資源之一。50年代以后，各國(guó)學(xué)者對(duì)甘草進(jìn)行了較為深入的研究，隨著研究的深入和新技術(shù)的不斷應(yīng)用，人們對(duì)甘草的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用也愈來(lái)愈廣泛。
[0006]甘草作為常用大宗藥材，藥食兼用品種，年需要量約6萬(wàn)噸左右，位列諸藥前列，被醫(yī)藥界譽(yù)為“國(guó)老、藥王、軟黃金”，有“十方九草”之美譽(yù)，被大量用于臨床藥物配方，甘草提取物還被應(yīng)用于日用化工領(lǐng)域，并有大量的出口。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為，甘草具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，潤(rùn)肺止咳等功效，并具有調(diào)和諸藥的作用。用于脾胃虛寒，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，四肢痙攣疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性等。現(xiàn)代藥理研究表明，甘草所含的三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)和多糖類(lèi)為甘草中的主要活性成分，這三類(lèi)成分具有多種藥用價(jià)值，其中三萜類(lèi)成分具有解毒、止咳平喘、抗炎及抗過(guò)敏、抗多種病毒、抗心律失常、抗腫瘤、抗肝損傷及降低膽固醇等作用，其中的甘草酸在甘草中含量最高，應(yīng)用最廣，主要用于制藥、化工和功能性甜味劑等；甘草黃酮具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化、抗心律失常等作用，主要用于制藥，化妝品等；甘草多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等作用，主要用于制藥和食品等領(lǐng)域。
[0007]在甘草中己發(fā)現(xiàn)和確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物類(lèi)型有三萜皂苷、黃酮、香豆素、甾醇、生物堿、揮發(fā)油、有機(jī)酸、糖類(lèi)、氨基酸等，其中三萜皂苷類(lèi)和黃酮類(lèi)是其主要成分。黃酮類(lèi)的代表化合物有甘草素{Liquihtigenin，LG)、異甘草素 <Jsoliquiritigmin,l\J^)
苷 iLiquiritin，\J^)、異甘草苷{(diào)Isoliquiritin, ILN);甘草酸(又名草甜素，acid, GA)和甘草次酸{Glycyrrhetinic acid, 則是職類(lèi)的代表化合物。
[0008]當(dāng)前甘草黃酮 類(lèi)化合物的藥理學(xué)大量研究顯示，黃酮類(lèi)化物具有抗菌、抗病毒、抗發(fā)炎、抗過(guò)敏以及抗血管舒張等作用；另外，它還能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、血小板凝聚、毛細(xì)管滲透性以及脆性；黃酮類(lèi)化合物的此類(lèi)效果都與它的抗氧化性相關(guān)。甘草屬植物中的黃酮類(lèi)成分具有抑菌、抗真菌、抗腫瘤、抗誘變、抗病毒等廣泛的藥理作用。
[0009]一是抗腫瘤作用。藥理學(xué)研究表明，甘草中異黃酮類(lèi)物質(zhì)具有植物雌激素活性，可以抑制乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞的增殖，而其他的黃酮類(lèi)物質(zhì)如甘草黃酮?jiǎng)t不具有這類(lèi)雌激素活性。甘草查爾酮也可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。也有研究顯示，二甲苯并蒽(DMB)類(lèi)甘草黃酮可以消除致癌物質(zhì)，從而達(dá)到預(yù)防癌癥的功效。我國(guó)學(xué)者馬靖等報(bào)道了甘草提取物通過(guò)P53非依賴(lài)途徑誘導(dǎo)胃癌MGC — 803細(xì)胞凋亡；其作用機(jī)制是鈣池排空操縱的外鈣內(nèi)流在甘草誘導(dǎo)MGC — 803細(xì)胞凋亡之中發(fā)揮了決定性的作用。馬靖等還報(bào)道甘草提取物除可誘導(dǎo)胃癌MGC — 803細(xì)胞凋亡之外，還可選擇性誘導(dǎo)肝癌H印G2、肺癌NSCLC與宮頸癌Hela等幾種人腫瘤細(xì)胞凋亡。
[0010]二是抗HIV病毒。日本人奧田拓男教授與宮本寬治助教報(bào)道，甘草中有3種黃酮成分對(duì)艾滋病病毒的增殖抑制能力為甘草甜素的25倍?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘草素與異甘草素的抗HIV病毒的能力更高，引起國(guó)內(nèi)外廣泛注意。甘草吡喃香豆素等多種甘草黃酮類(lèi)成分可抑制HIV誘導(dǎo)的巨細(xì)胞形成，未見(jiàn)細(xì)胞毒性；甘草查爾酮A在濃度為20mg ?1時(shí)，能抑制HIV誘導(dǎo)的巨細(xì)胞形成。
[0011]三是抗病原微生物作用。甘草黃酮類(lèi)化合物中抗菌成分較多，作用較強(qiáng)。甘草根中最常見(jiàn)的單體成分甘草苷、甘草素、異甘草苷和異甘草素對(duì)新城艾滋病毒有抑制作用。另外，甘草黃酮還有抗心率失常作用；最近，我國(guó)學(xué)者胡小鷹等研究結(jié)果表明，甘草總黃酮具有抗心率失常作用。
[0012]四是抗氧化作用。甘草中黃酮類(lèi)成分普遍具有抗氧化活性，可以作為自由基清除劑。甘草黃酮類(lèi)物質(zhì)可以防止低密度脂蛋白(LDL)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，降低病人血漿中的低密度脂蛋白被氧化的易感系數(shù)，提高血漿中低密度脂蛋白的抗氧化、抗凝集、抗滯留的能力，可以用來(lái)治療各種由于血脂高、脂質(zhì)氧化所引起的疾病。甘草查爾酮B、D強(qiáng)烈地抑制過(guò)氧化陰離子，并顯示了對(duì)DPPH自由基的清除活性。甘草黃酮類(lèi)化合物中的查爾酮和二氫黃酮，均為含有酚羥基的化合物，其對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)的生成具有明顯抑制作用，對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基有明顯的清除作用。甘草總黃酮對(duì)Fenton反應(yīng)生成的羥自由基具有較強(qiáng)的直接清除作用，效果明顯優(yōu)于甘露醇，其清除羥自由基的IC50是甘露醇的1/255，其抑制羥自由基生成的IC50是甘露醇的1/139。
[0013]五是保肝作用。甘草黃酮可緩解CC14引起的小鼠血清中血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)及乳酸脫氫酶(LDH)活性的增高。CC14經(jīng)肝微粒體酶細(xì)胞色素P450激活后生成.CC13 ；CC13可攻擊肝細(xì)胞膜上磷脂分子，引起脂質(zhì)過(guò)氧化或與肝微粒體脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，損傷肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性，從而使胞漿內(nèi)可溶性酶滲入血液中。甘草黃酮可能由于保護(hù)了 CC14所致的肝細(xì)胞損傷，減少了 GPT及LDH滲入血液，從而降低CC14中毒小鼠血清GPT及LDH活性。研究表明甘草黃酮可以明顯抑制小鼠肝臟MDA增高和還原性谷胱甘肽的耗竭，其作用呈一定的量效關(guān)系，電鏡檢驗(yàn)表明甘草黃酮可保護(hù)乙醇所致的肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷；并且能抑制肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化、提高小鼠肝臟SOD活性，減少肝組織脂褐素形成，這一作用與甘草黃酮清除由酒精激活產(chǎn)生的氧自由基有關(guān)。 [0014]目前，甘草有效成分提取純化技術(shù)已見(jiàn)成熟。黃酮類(lèi)化合物種類(lèi)很多，多數(shù)以甙元的形式存在，少數(shù)以游離形式存在。一般情況下，游離的黃酮類(lèi)化合物難溶于水，而黃酮甙易溶于熱水，兩者都能溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。易溶水的要由帶糖苷鍵的黃酮苷類(lèi)及花色苷組成，而溶于乙醇的要在黃酮苷元類(lèi)化合物。甘草中黃酮類(lèi)物質(zhì)主要以甙類(lèi)的形式存在，其中主要是糖甙形式。游離甙元含量較低，故甘草黃酮即可用熱水提取，亦可用醇提取。目前用于甘草黃酮的提取方法主要有溶劑浸提法、堿提酸析法、酶輔助提取法、超聲波輔助法、微波提取法、超臨界流體萃取法等，以及多種方法的復(fù)合提取法。
[0015]有關(guān)于單一提取甘草中的甘草酸或甘草黃酮、甘草多糖成分的方法專(zhuān)利較多，如專(zhuān)利 CN1450081A、1210865A、1070197A、1524870A、85104970A、101759757A 等用于制備甘草酸或其鹽的方法；專(zhuān)利 CN102050851A、01518542A、101289480A、102010313A、1827613A 等用于制備黃酮類(lèi)成分的一種或總黃酮的方法；專(zhuān)利CN1343729A、101492510A、101525391A等用于制備甘草多糖的方法。有關(guān)甘草黃酮類(lèi)提取方面已在國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了深入的研究，如新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所前期已有獲得授權(quán)專(zhuān)利CN102204950B，提供從甘草廢渣中提取黃酮類(lèi)物質(zhì)的方法，CN101073595B專(zhuān)利提供了甘草黃酮和總皂苷提取物及其制備方法，可見(jiàn)甘草黃酮類(lèi)提取物、化合物及相應(yīng)的提取制備方法國(guó)內(nèi)外已有大量報(bào)道。
[0016]潰瘍性結(jié)腸炎{Ulcerative colitis, ViC)發(fā)生于結(jié)腸部位,是一種原因不明的慢性非特異性自身免疫性疾病，與遺傳、免疫、感染、環(huán)境等多種因素有關(guān)，其主要癥狀為腹瀉、粘液膿血便、腹痛和里急后重等，主要病理特點(diǎn)為結(jié)腸粘膜慢性炎癥及潰瘍形成。其病理改變?yōu)閺浡慕M織反應(yīng)，包括潰瘍形成、隱窩膿腫、小血管炎癥、杯狀細(xì)胞減少以及各種類(lèi)型炎細(xì)胞浸潤(rùn)等非特異性表現(xiàn)。病程遷延不愈長(zhǎng)達(dá)十幾年，甚至幾十年并有癌變的可能。潰瘍性結(jié)腸炎在歐美國(guó)家的發(fā)病率很高，在我國(guó)的發(fā)病率也呈逐年增高的趨勢(shì)。潰瘍性結(jié)腸炎的病因及發(fā)病機(jī)理至今尚不清楚。近年來(lái)在感染因子的作用、遺傳易感性的影響和免疫調(diào)節(jié)異常等方面的研究均有一定進(jìn)展。腸道感染可能作為始動(dòng)因子破壞粘膜屏障，使固有膜內(nèi)粘膜相關(guān)淋巴組織暴露。腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)可能作為恒定的刺激引起免疫反應(yīng)性炎癥。近年來(lái)隨著生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，UC在我國(guó)的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。由于UC病程長(zhǎng)，病變范圍廣，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且長(zhǎng)期患者中有5 -10%發(fā)生癌變，臨床上至今尚無(wú)有效的治療措施，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。
[0017]目前對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎傳統(tǒng)內(nèi)科治療常規(guī)藥物有三類(lèi):氨基水楊酸類(lèi)、類(lèi)固醇糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑，這些藥物效果都不夠理想，且副作用較大。柳氮磺胺吡啶是目前臨床最常用的藥物，適用于輕、中度及慢性UC患者，一般用法為口服，4g/d，服后大部分在小腸不吸收，而被大腸菌群代謝成磺胺吡啶(SP)與5-氨基水楊酸(5-ASA)，后者可通過(guò)干擾炎癥遞質(zhì)-前列腺素的合成而發(fā)揮對(duì)UC的治療作用。柳氮磺胺吡啶治療UC的有效率較低，服藥4g/d以?xún)?nèi)，有效率不及50 %，但副作用可達(dá)37.5%，且復(fù)發(fā)率為33 %。該藥療效及副作用與用量成正比，約有10-15%患者因皮疹、胃腸不適等副作用而停藥；免疫抑制劑主要有氨甲蝶呤、硫唑嘌呤等，該類(lèi)藥物因毒性較大而限制了其應(yīng)用。治療最新的進(jìn)展包括新合成的化合物、藥物的結(jié)腸靶向制劑和生物學(xué)療法。生物學(xué)療法如應(yīng)用腫瘤壞死因子TNF-α抗體、干擾素、細(xì)胞粘附分子抑制劑等，然其或長(zhǎng)期應(yīng)用副作用大，或效果不肯定，或價(jià)格昂貴而限制其臨床應(yīng)用。因此，研制新的安全、有效的治療藥物有著重要意義。我國(guó)傳統(tǒng)的中藥歷經(jīng)數(shù)千年臨床，為尋找有效藥物提供了豐富的藥源，因此從傳統(tǒng)中草藥中篩選治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物是可行的，通過(guò)應(yīng)用甘草黃酮類(lèi)提取物應(yīng)用制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用具有重要的意義。
[0018]現(xiàn)有技術(shù)中，利用甘草在制備治療各類(lèi)疾病藥物中的應(yīng)用基本上都利用甘草與其他中草藥配伍組分，以期達(dá)到解決治療各類(lèi)疾病的用途，未見(jiàn)利用甘草黃酮類(lèi)化合物、提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用的報(bào)道，本發(fā)明以治療潰瘍性結(jié)腸炎活性為指導(dǎo)進(jìn)行了甘草黃酮類(lèi)提取物的應(yīng)用研究，經(jīng)檢索尚未有文獻(xiàn)報(bào)道該方面的研究。本發(fā)明所述甘草黃酮類(lèi)提取物既可以從甘草中提取，又可以從甘草渣中提取得到，可以用于治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)未見(jiàn)利用甘草黃酮類(lèi)提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用的報(bào)道，本發(fā)明以治療潰瘍性結(jié)腸炎活性為指導(dǎo)進(jìn)行了甘草黃酮類(lèi)提取物的應(yīng)用研究，旨在提供甘草黃酮類(lèi)提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中應(yīng)用的技術(shù)方案，用于治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0020]本發(fā)明采用的技術(shù)方案:
鑒于甘草富含黃酮類(lèi)成分，特別是甘草藥材水提甘草酸后剩余殘?jiān)缓罅康闹苄渣S酮類(lèi)提取物現(xiàn)實(shí)情況，為了更深入、全面的開(kāi)發(fā)利用甘草資源以及富含黃酮的甘草廢渣資源，本發(fā)明通過(guò)利用甘草黃酮類(lèi)提取物在用于治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物方面的新應(yīng)用，獲得良好的應(yīng)用前景和顯著的技術(shù)效果，甘草黃酮類(lèi)提取物相比陽(yáng)性對(duì)照藥物柳氮磺吡啶對(duì)乙酸致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)出更好的治療作用，以期在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中具有現(xiàn)實(shí)的價(jià)值，有利于資源高效利用，變廢為寶，創(chuàng)造新的價(jià)值。
[0021]本發(fā)明提供了一種甘草黃酮類(lèi)提取物在治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。從甘草或甘草渣中提取得到黃酮類(lèi)提取物，主要是甘草脂溶性黃酮類(lèi)提取物，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其藥理作用，在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎疾病藥物得到良好的應(yīng)用效果。
[0022]本發(fā)明建立了乙酸致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了甘草黃酮類(lèi)提取物具有治療潰瘍性結(jié)腸炎的顯著治療作用。通過(guò)試驗(yàn)研究表明，甘草黃酮高劑量組脾臟重量系數(shù)極顯著升高(P〈0.001)，中劑量組顯著升高(P〈0.05)，表明甘草黃酮可增加脾臟免疫器官重量，提示甘草黃酮可促進(jìn)乙酸所致潰瘍性結(jié)腸炎小鼠免疫功能的增強(qiáng)；甘草黃酮三個(gè)劑量組小鼠結(jié)腸重量系數(shù)均有極顯著降低(p〈0.001)，表明甘草黃酮對(duì)乙酸所致結(jié)腸炎癥性水腫具有良好的對(duì)抗作用，陽(yáng)性藥柳氮磺吡啶也能極顯著降低結(jié)腸濕重系數(shù)；甘草黃酮中、高劑量均能極其顯著地緩解結(jié)腸潰瘍情況(p〈0.001)，且高劑量組效果最好，陽(yáng)性藥SASP也能顯著緩解結(jié)腸潰瘍情況；甘草黃酮高劑量能極顯著減少結(jié)腸潰瘍面積(P〈0.001)，中劑量能顯著減少結(jié)腸潰瘍面積(P〈0.05)，陽(yáng)性藥無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傮w而言，甘草黃酮類(lèi)提取物具有治療潰瘍性結(jié)腸炎的顯著治療作用。
[0023]本發(fā)明甘草黃酮類(lèi)提取物采用的工藝采用將甘草或甘草渣經(jīng)粉碎、浸提、大孔樹(shù)脂柱吸附洗脫、抽濾、合并濾液、減壓蒸餾、真空干燥，獲得總黃酮類(lèi)化合物或黃酮類(lèi)提取物；大孔樹(shù)脂純化部分也可根據(jù)實(shí)際采用原料或者提取情況采用水洗或酸沉等方式得到目標(biāo)產(chǎn)物。 [0024]本發(fā)明還提出了所述甘草黃酮類(lèi)提取物的制備工藝，可以采用以下任意一種方法，或這些方法的任意組合進(jìn)行制備:(I)溶劑提取法；(2)溶劑萃取法；(3)大孔吸附樹(shù)脂法；⑷鉛鹽沉淀法；(5)超臨界流體萃取法；(6)柱色譜法；(7)液-液逆流分配色譜法；
(8)酸沉淀法；(9)水洗除雜。其中優(yōu)選的方法為大孔吸附樹(shù)脂法與聚酰胺柱色譜法聯(lián)用的方法。
[0025]在使用這些方法進(jìn)行制備時(shí)，一般包括以下幾個(gè)步驟:
(I)提取:所用溶劑可以醇類(lèi)、酮類(lèi)及酯類(lèi)溶劑，或這些溶劑與水按一定比例組合成的溶液，或由這些溶劑按一定比例組成的混合溶劑，或由這些溶劑與水、酸、堿、鹽配成的酸性或堿性溶劑；提取方法可以是煎煮、加熱回流、超聲提取、冷浸、滲漉、微波提取、高壓提取
坐寸ο
[0026]優(yōu)選的提取工藝為:甘草藥材加50%_95%乙醇，回流提取2-3次，每次提取1_3小時(shí)，溶劑用量為5-20倍量(L/kg)。
[0027](2)過(guò)濾:包括離心、抽濾、超濾、壓濾等方法，使用或不使用以下任意一種澄清劑或其組合:水、酸，醇沉劑，明膠，高嶺土，各種樹(shù)脂，聚乙二醇，聚乙三醇，殼聚糖以及天然澄清劑成品如101果汁澄清劑、ZTC+1天然澄清劑等。
[0028](3)濃縮:包括常壓或減壓條件下的薄膜蒸發(fā)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及煎煮濃縮等。
[0029](4)干燥:包括真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等。
[0030]本發(fā)明中，采用的醇提后采用樹(shù)脂純化或者直接酸沉，酸沉?xí)r不使用碳酸鈉溶液溶解除雜。[0031]本發(fā)明中，在采用溶劑萃取法進(jìn)行制備時(shí)，一般先將提取物混懸于水中，然后用低極性的酯類(lèi)、烷烴類(lèi)或醚類(lèi)溶劑如石油醚、乙醚、己烷、汽油等萃取除去脂溶性雜質(zhì)，然后用合適極性的溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是這些溶劑的混合物，萃取獲得甘草黃酮類(lèi)提取物。
[0032]本發(fā)明采用以柚皮苷為對(duì)照，利用黃酮類(lèi)物質(zhì)在堿性條件下的轉(zhuǎn)化和在波長(zhǎng)415nm處有較大穩(wěn)定吸收，測(cè)定其吸光度值，對(duì)照柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得總黃酮的含量。
[0033]本發(fā)明采用急性潰瘍性結(jié)腸炎的小鼠乙酸性結(jié)腸炎模型進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了本發(fā)明甘草黃酮提取物可使?jié)冃越Y(jié)腸炎小鼠體重恢復(fù)；增加脾臟免疫器官重量，促進(jìn)乙酸所致潰瘍性結(jié)腸炎小鼠免疫功能增強(qiáng)；降低小鼠結(jié)腸重量系數(shù)，對(duì)乙酸所致結(jié)腸炎癥性水腫具有良好的對(duì)抗作用；極其顯著地緩解結(jié)腸潰瘍情況；極顯著減少結(jié)腸潰瘍面積。高劑量組甘草黃酮類(lèi)提取物相比陽(yáng)性對(duì)照藥物柳氮磺吡啶對(duì)乙酸致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)出更好的治療作用。由此說(shuō)明甘草黃酮提取物具有確切的治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用，因此可以用于制備治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物。
[0034]現(xiàn)有技術(shù)中，盡管有文獻(xiàn)報(bào)道甘草中具有抗?jié)冏饔玫狞S酮單體主要為甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素等。本發(fā)明所述甘草黃酮類(lèi)提取物是脂溶性黃酮類(lèi)成分，現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)尚未有見(jiàn)到甘草中該類(lèi)成分抗?jié)兓钚缘膱?bào)道。并且，本發(fā)明通過(guò)HPLC成分分析表明，采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案中所述甘草黃酮類(lèi)提取物中已經(jīng)檢測(cè)不到甘草苷、異甘草素、甘草素等甘草中常見(jiàn)且含量較高的黃酮類(lèi)化合物，而且甘草苷、異甘草苷、異甘草素都是可溶于水的，這與本發(fā)明所述脂溶性黃酮類(lèi)不同。因此，本發(fā)明所述甘草黃酮類(lèi)提取物是不同于已有現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的黃酮類(lèi)化合物在潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。
[0035]現(xiàn)有技術(shù)中，有記載李仁等人從提取甘草膏剩下的藥渣中得到富黃酮組分，制備的藥物為安胃瘍膠囊，主治胃及十二指腸球部潰瘍。本領(lǐng)域熟知，胃腸道疾病種類(lèi)眾多，復(fù)雜的內(nèi)外因共同導(dǎo)致多種類(lèi)的胃腸道疾病的發(fā)生，且潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病原因及機(jī)理等各方面都不同于胃潰瘍及十二指腸球部潰瘍:胃酸-胃蛋白酶的侵襲作用增強(qiáng)和或胃粘膜防護(hù)機(jī)制的削弱是胃潰瘍及十二指腸球部潰瘍的根本環(huán)節(jié)，而潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病主要與免疫調(diào)節(jié)紊亂、遺傳易感性、感染、環(huán)境及精神因素等有關(guān)，所以本發(fā)明提供的技術(shù)方案中所述甘草黃酮類(lèi)提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，現(xiàn)有技術(shù)未能也不可能帶來(lái)啟發(fā)和啟示，進(jìn)而不需要經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)即可獲得本發(fā)明提供的技術(shù)方案。
[0036]現(xiàn)有技術(shù)普通技術(shù)人員熟知，來(lái)源于甘草葉的富黃酮組分是較為完全的提取出了甘草中的黃酮，若不包括去除極性大的成分的步驟，則其應(yīng)包含比較完整的甘草中黃酮類(lèi)物質(zhì)，主要包含甘草苷、甘草素、異甘草苷等可溶解于水的黃酮成分。而本發(fā)明提供的技術(shù)方案中所述甘草黃酮類(lèi)提取物來(lái)源于甘草則需經(jīng)過(guò)除雜和精制去除極性偏大的黃酮類(lèi)成分，最終提取物是以脂溶性黃酮為主，而甘草苷、異甘草苷、異甘草素等可溶解于水的黃酮成分則在除雜、精制過(guò)程中已經(jīng)去除，這也是本發(fā)明所述優(yōu)先選擇從甘草廢渣中得到甘草黃酮類(lèi)提取物的原因。
[0037]同時(shí)，本發(fā)明提供的技術(shù)方案中所述甘草黃酮類(lèi)提取物也可以甘草廢渣為原料進(jìn)行制備，甘草廢渣是水提取甘草酸或浸膏等殘留的殘?jiān)@一過(guò)程同時(shí)也會(huì)提取出水溶性黃酮，那么殘留在渣中的黃酮類(lèi)成分則是極性較低的脂溶性黃酮，這一點(diǎn)本發(fā)明也通過(guò)具體成分分析實(shí)驗(yàn)證明了，本發(fā)明提供的技術(shù)方案中所述黃酮從原料上就不含有現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的甘草苷、異甘草素等已知抗?jié)兓钚猿煞?。可?jiàn)，本發(fā)明提供的技術(shù)方案中所述甘草黃酮類(lèi)提取物不同于該富黃酮組分。而且，該富黃酮組分所具備的抑制胃酸分泌過(guò)多作用也與本發(fā)明所述潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病無(wú)直接相關(guān)，現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的采用FMltltl是除去甘草甜素的富黃酮類(lèi)成分，文獻(xiàn)也指出FM.抗?jié)冏饔玫闹饕煞钟懈什蒈?、甘草素、異甘草苷等，與本發(fā)明所述甘草提取物為脂溶性黃酮完全不同。
[0038]通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)本
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達(dá)到以下有益效果。
[0039](I)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了甘草中黃酮類(lèi)物質(zhì)可以應(yīng)用于治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物，豐富了甘草黃酮類(lèi)物質(zhì)的應(yīng)用領(lǐng)域。甘草黃酮類(lèi)提取物相比陽(yáng)性對(duì)照藥物柳氮磺吡啶對(duì)乙酸致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)出更好的治療作用，以期在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中具有現(xiàn)實(shí)的價(jià)值，該甘草黃酮類(lèi)提取物既可以從甘草中提取獲得，也可以從提取過(guò)甘草酸殘留的渣中提取獲得，不僅能夠更充分的利用甘草資源，而且還有利于將甘草廢渣資源開(kāi)發(fā)利用起來(lái)，變廢為寶，有利于資源高效利用，變廢為寶，創(chuàng)造新的價(jià)值。
[0040](2)本發(fā)明通過(guò)甘草黃酮類(lèi)提取物相比陽(yáng)性對(duì)照藥物柳氮磺吡啶(SASP)對(duì)乙酸致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)出更好的治療作用:中、高劑量組小鼠體重恢復(fù)明顯優(yōu)于SASP，且SASP在剛開(kāi)始給藥的時(shí)候?qū)π∈缶哂幸欢ǖ母弊饔茫w重較其它組較低。高劑量組脾臟重量系數(shù)極顯著升高(3.62±0.335 mg/g，Ρ〈0.001)，中劑量組顯著升高(3.11 + 0.586 mg/g，P〈0.05)，而SASP對(duì)脾臟重量系數(shù)的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.78±0.396 mg/g);同SASP —樣，甘草黃酮三個(gè)劑量組小鼠結(jié)腸重量系數(shù)均有極顯著降低(P〈0.001);中、高劑量均能極其顯著地緩解結(jié)腸潰瘍情況(分別為2.21 + 0.878、1.88 + 1.094，Ρ〈0.001)，均優(yōu)于SASP ；甘草黃酮高劑量能極顯著減少結(jié)腸潰瘍面積(25.14±4.11%，Ρ〈0.001)，中劑量能顯著減少結(jié)腸潰瘍面積(38.46±11.32%，Ρ〈0.05)。甘草黃酮類(lèi)提取物相比陽(yáng)性對(duì)照藥物SASP對(duì)乙酸致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)出更好的治療作用，甘草黃酮類(lèi)提取物中甘草脂溶性黃酮類(lèi)提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎疾病藥物得到良好的應(yīng)用效果，甘草類(lèi)黃酮提取物中的查耳酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)于治療潰瘍性結(jié)腸炎療效明顯顯著?？梢?jiàn)，甘草黃酮類(lèi)提取物對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎具有顯著治療作用。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041]圖1顯示為柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0042]圖2顯示為實(shí)驗(yàn)期間小鼠每日體重變化圖。
[0043]圖3顯示為甘草黃酮對(duì)脾臟重量系數(shù)的影響圖。圖中，#Ρ〈0.05，##P<0.01 and###P<0.001 vs.normal control; *Ρ〈0.05，**P〈0.01 and 林*P〈0.001 vs.acetic acidcolitis controlo
[0044]圖4顯示為甘草黃酮對(duì)結(jié)腸濕重的影響圖。圖中，#P〈0.05，##P<0.01 and###P<0.001 vs.normal control; *P〈0.05，**P〈0.01 and ***P〈0.001 vs.acetic acidcolitis controlo
[0045]圖5顯示為甘 草黃酮對(duì)結(jié)腸大體形態(tài)的影響圖。圖中，#P〈0.05，##P<0.01 and###P<0.001 vs.normal control; *P〈0.05，**P〈0.01 and ***P〈0.001 vs.acetic acidcolitis controlo
[0046]圖6顯示為各組結(jié)腸潰瘍情況對(duì)比圖。圖中，A:對(duì)照；B:結(jié)腸炎模型；C:陽(yáng)性藥SASP(600mg/kg) ；D:甘草黃酮低劑量組(100mg/kg) ；E:甘草黃酮中劑量組(200mg/kg) ；F:甘草黃酮高劑量組(400mg/kg)。
[0047]圖7顯示為甘草黃酮對(duì)潰瘍面積的影響圖。圖中，#P〈0.05，##P〈0.01 and###P<0.001 vs.normal control; *P〈0.05，**P〈0.01 and ***P〈0.001 vs.acetic acidcolitis controlo
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。另外，在下述的說(shuō)明中，如無(wú)特別說(shuō)明，％皆指質(zhì)量百分比。
[0049]主要儀器:回流提取器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、大孔樹(shù)脂柱、真空干燥箱、冷凍干燥儀、動(dòng)物天平等。
[0050]主要原輔材料:本發(fā)明所述原料甘草，來(lái)源于豆科植物烏拉爾甘草uralensis Fish.)、脹果甘 ^iGlycyrrhiza inf I at a Bat.)、或光果甘 ^iGlycyrrhizaglabra L.)的干燥根及根莖。作為提取甘草黃酮的原材料，可以是市售甘草飲片，也可以是這些植物的莖、葉、花穗、果實(shí)、地下根莖及根等任一部位或全部植株，其中優(yōu)選的藥材部位為干燥根及根莖。上述所述的甘草包括未經(jīng)任何炮制處理的原藥材及飲片，還包括各種炮制品，如“蜜炙甘草”等各類(lèi)甘草生產(chǎn)加工的原輔料成品半成品、廢渣廢料都行。本發(fā)明所述甘草廢渣為提取過(guò)甘草酸、甘草膏等的殘留的廢渣。這種甘草廢渣富含脂溶性黃酮類(lèi)化合物。
[0051]本發(fā)明中選用的所有試劑、儀器及原輔材料都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。
[0052]實(shí)施例一:甘草黃酮類(lèi)提取物的制備
(O甘草渣8kg加15倍量80%乙醇溶液80°C提取3次，每次1.5h，合并3次提取液，80°C減壓濃縮回收乙醇，60°C干燥后粉碎，得到提取物。
[0053](2)總黃酮含量34%。
[0054]實(shí)施例二:甘草黃酮類(lèi)提取物的制備
(I)甘草渣8kg加15倍量90%乙醇溶液，浸泡30min，85°C提取2次，每次1.5h，合并提取液，靜置取澄清液，85°C減壓回收乙醇，得到水懸液。
[0055](2)水懸液加鹽酸溶液調(diào)整pH至3，靜置沉淀2h，取沉淀物干燥。
[0056](3)總黃酮含量44%。
[0057]實(shí)施例三:甘草黃酮類(lèi)提取物的制備
Cl)甘草粉碎，取8kg加60%乙醇溶液(15、10、10倍量)提取85°C 3次，每次2h，85°C減壓回收乙醇至無(wú)醇，水溶液10-20 V靜置沉淀，取沉淀物，冷水洗，干燥不溶物。
[0058](2)總黃酮含量28%。
[0059]實(shí)施例四:甘草黃酮類(lèi)提取物的制備
(I)甘草粉碎成小塊，取IOkg加20倍量70%乙醇溶液85°C提取2次，每次2h，85°C減壓回收乙醇，得到醇濃度35%的提取液。
[0060](2)提取液過(guò)大孔樹(shù)脂柱，上樣流速流速l_2Bv/h，50%乙醇溶液洗脫除雜，5Bv80%乙醇溶液洗脫，洗脫流速l_3Bv/h，收集洗脫液，85°C減壓回收乙醇，甘草乙醇提取物。[0061](3)總黃酮含量55%。
[0062]實(shí)施例五:甘草黃酮類(lèi)提取物的制備
(I)甘草渣10kg80%乙醇溶液85°C提取2次(20、15倍量)，每次2h，加水至醇濃度35%，得上樣液。
[0063](2)過(guò)大孔樹(shù)脂柱，上樣流速流速l_2Bv/h，80%乙醇溶液洗脫，洗脫流速l_3Bv/h，收集洗脫液，85°C減壓回收乙醇，85°C干燥得到提取物。
[0064](3)總黃酮含量80%。
[0065]實(shí)施例六:甘草黃酮類(lèi)提取物的測(cè)定
1.1對(duì)照品配制:稱(chēng)取柚皮苷IOmg, IOml甲醇溶解,制成lmg/ml的溶液。
[0066]1.2 UV法測(cè)定總黃酮含量:分別取對(duì)照品溶液0.1,0.15,0.2,0.25,0.3ml于50ml容量瓶中，分別加入5ml甲醇，再加2.5mllO%KOH溶液顯色5min，甲醇定容?？瞻?分別取對(duì)照品溶液0.1,0.15,0.2,0.25,0.3ml，于50ml容量瓶中用甲醇定容。在415nm處測(cè)定吸光度，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線。
[0067]標(biāo)準(zhǔn)方程為:Y=0.0234Χ+0.0015, R=0.9996，X:溶液吸光度，Y:溶液濃度。見(jiàn)表1。
[0068]表1:柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)吸光度測(cè)定
【權(quán)利要求】
1.一種甘草黃酮類(lèi)提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的甘草黃酮類(lèi)提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的甘草黃酮類(lèi)提取物中甘草脂溶性黃酮類(lèi)提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎疾病藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的甘草黃酮類(lèi)提取物在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的甘草類(lèi)黃酮提取物中的查耳酮類(lèi)物質(zhì)在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎疾病藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1、2或3任意一項(xiàng)所述的甘草黃酮類(lèi)提取物的制備方法，其特征在于，所述的制備方法如下: (1)提取:甘草藥材加50%-95%乙醇，回流提取2-3次，每次提取1-3小時(shí)，溶劑用量為 5-20 倍量(L/kg)； (2)過(guò)濾:包括離心、抽濾、超濾、壓濾，使用或不使用以下任意一種澄清劑或其組合:水、酸、醇沉劑，明膠，高嶺土，各種樹(shù)脂，聚乙二醇，聚乙三醇，殼聚糖以及天然澄清劑成品如101果汁澄清劑、ZTC+1天然澄清劑； (3)濃縮:包括常壓或減壓條件下的薄膜蒸發(fā)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及煎煮濃縮； (4)干燥:包括真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥。
【文檔編號(hào)】A61P1/04GK104013668SQ201410305018
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】倪慧, 賈曉光, 曹麗, 斯建勇, 劉冬羽, 張娟, 卿德剛, 孫宇 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所