專利名稱：結(jié)合配偶體及其用于篩查抑制劑和診斷或治療疾病的用途的制作方法
本申請(qǐng)涉及一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)p27，從而可解除由p27引起的對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，本申請(qǐng)還涉及該蛋白質(zhì)的突變體，一些所述的突變體具有顯性干涉性狀，本申請(qǐng)還涉及編碼這些蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸，以及所述蛋白質(zhì)和核酸用于預(yù)防和治療疾病的用途。
真核細(xì)胞的細(xì)胞周期受依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶(cdks)的控制；所述激酶需要調(diào)節(jié)性亞單位(“細(xì)胞周期蛋白”)才能保持活性。細(xì)胞周期的不同過(guò)程(如復(fù)制和進(jìn)入有絲分裂)受不同cdks控制(Morgan，自然，374,131(1995))。與之相關(guān)的是依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶的活性受到高水平的調(diào)節(jié)。在這種情況下存在的內(nèi)部控制機(jī)制可以例如防止進(jìn)入有絲分裂直至DNA已完成其復(fù)制。如生長(zhǎng)因子的外部因子的控制僅在DNA復(fù)制開始前發(fā)生；復(fù)制由有活性的細(xì)胞周期蛋白E/cdks2復(fù)合物起始。
除了激酶亞單位中細(xì)胞周期蛋白的量以外，依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶的活性也受小的抑制蛋白調(diào)節(jié)(Sherr和Roberts,Gene Dev.,9,1149(1995))。例如，根據(jù)其大小被稱為p21和p27的兩個(gè)抑制劑對(duì)于細(xì)胞周期蛋白E/cdk2而言是至關(guān)重要的。通常，在表達(dá)大量p27的細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白E/cdk2激酶不具活性，DNA復(fù)制的進(jìn)入因而被阻斷。
盡管細(xì)胞周期正調(diào)節(jié)物在很多人腫瘤中過(guò)量表達(dá)或至少組成型表達(dá)(Sherr,科學(xué)，274,1672(1996)),而負(fù)調(diào)節(jié)物經(jīng)常突變或僅少量表達(dá)(Fero等，細(xì)胞，85,733(1996))。這兩者存在特殊的關(guān)聯(lián)例如，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白D1基因在很多頸腫瘤中過(guò)量表達(dá)。因此我們希望依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶及其功能是尋求新的，選擇性的，具有抗增殖效應(yīng)的物質(zhì)過(guò)程中的靶結(jié)構(gòu)。
幾年前已知p27蛋白的基因(K.Polyak等，細(xì)胞，78,59-66(1994)),該基因可得自GenBank[鼠p27；登記號(hào)為K09968；人p27:K10906]。盡管已對(duì)p27基因進(jìn)行了深入的研究，但迄今為止仍未在人腫瘤中發(fā)現(xiàn)p27基因的突變。這種現(xiàn)象非常令人驚奇，因?yàn)閜27基因失活的小鼠表現(xiàn)出多發(fā)性發(fā)育異常的表型和腫瘤發(fā)生率增加(Fero等，細(xì)胞，85,733(1996),Kiyokawa等，細(xì)胞，85.721(1996))。取而代之的是p27的功能明顯地受轉(zhuǎn)錄后主調(diào)節(jié)。
因此，p27由蛋白酶解降解；在正常細(xì)胞中這也在DNA復(fù)制開始時(shí)發(fā)生。與正常組織相比，很多腫瘤中蛋白酶解降解p27的能力顯著增加，這似乎與不利的預(yù)后直接相關(guān)(Loda等，天然藥物，3,231(1997))。
然而，也必定有能導(dǎo)致p27失活的其它機(jī)制。例如，用Mvc癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞之后，p27首先在功能上失活(即不再與細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合物結(jié)合)，并僅在較晚的階段被降解。迄今為止仍無(wú)法理解例如為什么很多乳腺腫瘤可表達(dá)大量p27蛋白，而這些腫瘤仍能非?？焖俚厣L(zhǎng)。目前仍不知道在這些腫瘤中使p27失活的機(jī)制(Fredersdorf等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,6380(1997))。
因此，有關(guān)專家很有興趣發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)使腫瘤中p27失活的機(jī)制或物質(zhì)。本發(fā)明已解決了這一難題。本申請(qǐng)中描述的蛋白質(zhì)p163能結(jié)合p27，可抑制p27的功能并可導(dǎo)致p27在胞質(zhì)中被蛋白酶解。1)蛋白質(zhì)p163及其核酸序列本發(fā)明涉及一種新的，被稱為p163的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能結(jié)合p27，從而可抑制p27的功能并可導(dǎo)致p27在胞質(zhì)中被蛋白酶解。該蛋白質(zhì)的氨基酸序列已被測(cè)定。
蛋白質(zhì)p163特異性地與p27結(jié)合，而不與如Myc,Max,Bcl-6或前胸腺素-α的其它蛋白質(zhì)結(jié)合。
本發(fā)明還涉及編碼蛋白質(zhì)p163的核苷酸序列。已測(cè)定小鼠p163蛋白的核苷酸序列，通過(guò)序列比較，也測(cè)定了人p163蛋白的核苷酸序列。2)顯性失活的p163類似物本發(fā)明還涉及編碼p163組成肽的核苷酸序列和/或編碼身為p163的類似物并可發(fā)揮顯性失活作用的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述顯性失活作用即為抑制天然p163蛋白與蛋白質(zhì)p27結(jié)合，而基本上不會(huì)削弱p27蛋白與細(xì)胞周期蛋白E/cdk2的結(jié)合和由此引發(fā)的細(xì)胞周期蛋白E/cdk2的抑制作用。
本發(fā)明還涉及編碼p163蛋白顯性失活突變體的核酸序列或其組成序列的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括將這些核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞，抑制靶細(xì)胞-特異性p163蛋白和靶細(xì)胞-特異性p27蛋白之間的結(jié)合，以使靶細(xì)胞的增殖被由此釋放的靶細(xì)胞-特異性p27蛋白抑制。3)抑制p163的肽然而，本發(fā)明也涉及編碼抑制p163功能的蛋白質(zhì)或肽的核苷酸序列。所述蛋白質(zhì)或肽包括與p163蛋白上用于結(jié)合p27蛋白的位點(diǎn)結(jié)合或與p163蛋白上用于結(jié)合Ran(Loeb等，分子細(xì)胞生物學(xué)，4,209-222(1993))的位點(diǎn)結(jié)合，從而可抑制對(duì)細(xì)胞而言為內(nèi)源性的p163蛋白的蛋白質(zhì)或肽。
這些蛋白質(zhì)包括對(duì)應(yīng)于p27蛋白或Ran蛋白上用于結(jié)合p163蛋白的位點(diǎn)的肽。這些蛋白質(zhì)另外還包括對(duì)蛋白質(zhì)p163，尤其是對(duì)其結(jié)合p27蛋白的位點(diǎn)具有特異性的抗體或抗體裂解產(chǎn)物，如F(ab)2,Fab,Fv和scFv。
本發(fā)明還涉及編碼這類抑制蛋白或肽的核酸序列的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括將這些核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞，抑制靶細(xì)胞-特異性p163蛋白和靶細(xì)胞-特異性p27蛋白或靶細(xì)胞-特異性Ran蛋白之間的結(jié)合，以使靶細(xì)胞的增殖被由此釋放的靶細(xì)胞-特異性p27蛋白抑制。4)p163刺激細(xì)胞分裂的用途本發(fā)明還涉及編碼p163蛋白的核苷酸序列或p163蛋白自身用于抑制對(duì)細(xì)胞而言為內(nèi)源性的p27蛋白，從而刺激靶細(xì)胞的細(xì)胞分裂的用途。5)抑制p163的轉(zhuǎn)錄和翻譯然而，本發(fā)明也涉及抑制編碼p163蛋白的靶細(xì)胞-特異性核酸序列轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而導(dǎo)致p27蛋白被釋放，進(jìn)而抑制靶細(xì)胞增殖的核酸序列。本發(fā)明的這類核酸序列可以是例如反義(三鏈體)DNA，反義RNA和/或核酶。6)篩查p163抑制劑的檢測(cè)系統(tǒng)本發(fā)明還涉及編碼p163蛋白的核酸序列，或p163蛋白，或其組成序列用于篩查p163蛋白和p27蛋白或Ran蛋白之間結(jié)合的抑制劑的檢測(cè)系統(tǒng)的用途，和這些檢測(cè)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的p163蛋白抑制劑用于抑制靶細(xì)胞增殖的用途。7)檢測(cè)p163以診斷疾病本發(fā)明還涉及編碼p163蛋白或編碼p163蛋白之組成序列的核酸構(gòu)建體，或與p163蛋白的這些核酸序列結(jié)合的核酸序列或蛋白質(zhì)序列，或與p163蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)用于檢測(cè)細(xì)胞或組織或體液中編碼p163的核酸或檢測(cè)其中的p163蛋白以確定細(xì)胞或組織的增殖狀況或診斷疾病狀況的用途。1)鑒定p163蛋白和編碼p163蛋白的核酸序列使用“雙雜合體(two-hybrid)技術(shù)”(Fields和Song，自然，340,245(1989))發(fā)現(xiàn)p163蛋白是一種新的p27配偶體蛋白，為此，使用PCR將鼠p27蛋白的完整編碼序列和轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合域符合讀框地克隆至酵母載體pGBT10(Clontech)中。用此載體轉(zhuǎn)化酵母菌株Hf7c(Clontech Heidelberg,Matchmaker Two Hybrid,K1605-1),然后分離色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌落，在使用針對(duì)GAL4和p27的特異性抗體的Western印跡中檢測(cè)正確融合蛋白的表達(dá)。
在第二次轉(zhuǎn)化中，使用得自小鼠胚的經(jīng)VP16標(biāo)記的cDNA文庫(kù)(Vojtek等，細(xì)胞，74,205(1993))轉(zhuǎn)化此菌株。對(duì)在15nM氨基三唑存在下表現(xiàn)為組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的400個(gè)菌落進(jìn)行進(jìn)一步的分析，對(duì)這些克隆中的70個(gè)測(cè)序；它們都編碼不同的D-型細(xì)胞周期蛋白；已知它們是與p27相互作用的配偶體。使用Southern印跡顯示出400個(gè)抗性克隆中有390個(gè)編碼D細(xì)胞周期蛋白。其余克隆中有兩個(gè)(第163號(hào))編碼相同的蛋白質(zhì)對(duì)它們進(jìn)行完整地測(cè)序。
由Balb/c-3T3細(xì)胞制備λZAP cDNA文庫(kù)，得自該文庫(kù)的幾個(gè)克隆被鑒定為與p163同源。序列分析顯示出開放閱讀框；該閱讀框也被用于得自cDNA文庫(kù)的VP16嵌合體。兩個(gè)原始克隆都編碼此閱讀框的氨基酸121-252。在使用β-半乳糖苷酶作為報(bào)道基因的酵母中更詳細(xì)地鑒定了克隆p163如表1所示，酵母中編碼的蛋白質(zhì)特異性地與p27相互作用，而不與如Myc,Max,Bcl-6或前胸腺素-α的其它蛋白質(zhì)相互作用。表1也顯示了p27中與p163發(fā)生相互作用的區(qū)域的第一處定界。這些數(shù)據(jù)表明p163和依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶(Russo等，自然，382,325(1996))一樣與p27的相同區(qū)域結(jié)合。這暗示了p163和依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶競(jìng)爭(zhēng)同p27的結(jié)合。其次，可將p163中與p27相互作用的區(qū)域劃定為氨基酸121-252。
為了證實(shí)得自所述酵母檢測(cè)系統(tǒng)的這些結(jié)果，將重組表達(dá)的p163[與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)一起表達(dá)成融合蛋白]結(jié)合到柱上，然后通過(guò)在此柱上進(jìn)行親和層析試著純化35S-標(biāo)記的p27蛋白。含有p163以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白的應(yīng)用使得在這些實(shí)驗(yàn)中利用均一的基質(zhì)成為可能(所謂的GST pulldowns；Hateboer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,8489(1993))。
為了進(jìn)行這些研究，將得自酵母克隆的閱讀框轉(zhuǎn)移至pGEX載體(Pharmacia,Freiburg pGEX-2T；Cat.No.27-4801-01)中，所述載體編碼與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合的嵌合蛋白，該嵌合蛋白受大腸桿菌的IPTG-誘導(dǎo)的TAC啟動(dòng)子控制(Smith和Johnson，基因，67:31,1988)。通過(guò)在谷胱甘肽-瓊脂糖上進(jìn)行親和層析(Smith和Johnson,1988)從經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化嵌合蛋白，然后對(duì)100mMTris-HCl,pH7.5,100mMKCl,20mMEDTA,10％甘油，O.1mMPMSF透析嵌合蛋白。根據(jù)相同方案純化谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，然后進(jìn)行透析以作為對(duì)照；將純化的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存于-80℃。
然后于4℃下將10μg兩種蛋白質(zhì)各與10μgBSA和20mg膨脹的GST-瓊脂糖一起保溫2小時(shí)；之后離心分離出瓊脂糖，用透析緩沖液將瓊脂糖洗滌兩次。將瓊脂糖的等分試樣直接煮沸于樣品緩沖液中以作為蛋白質(zhì)結(jié)合的對(duì)照，SDS凝膠電泳后檢測(cè)結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過(guò)體外翻譯制備35S-甲硫氨酸-標(biāo)記的p27(根據(jù)廠商的說(shuō)明Promega,Mannheim；TNT coupled retc.lys.systems；L4610),于4℃下將所述經(jīng)標(biāo)記的p27與上樣的瓊脂糖一起在總體積為200μl的含有0.1％NP-40的透析緩沖液中保溫2小時(shí)。用透析緩沖液/0.1％NP-40將瓊脂糖洗滌4次，然后在SDS樣品緩沖液中煮沸。通過(guò)SDS凝膠電泳和熒光顯影檢測(cè)結(jié)合的蛋白質(zhì)。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表2。表2表明重組的、體外合成的35S-標(biāo)記的p27選擇性地與用嵌合的GST-p163融合蛋白上樣的柱結(jié)合，而不與用相同量的GST上樣的柱結(jié)合。表2也表明得自細(xì)胞提取物的p27不能有效地與GST-p163結(jié)合；在此提取物中，p27與依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶的復(fù)合物結(jié)合。稍作加熱處理可從這些復(fù)合物中釋放出p27，從而使之與p163結(jié)合。這表明p163和依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶競(jìng)爭(zhēng)與p27的結(jié)合。
本發(fā)明的編碼鼠p163蛋白的核酸序列示于表3。數(shù)據(jù)庫(kù)中有此序列的同系物；該同系物是酵母核蛋白(Nup)2基因。Nup2是核膜蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)參與核蛋白的形成和蛋白質(zhì)進(jìn)出核的轉(zhuǎn)運(yùn)。在酵母中，Nup2可能特別地參與輸出。
盡管從整體上看同源性并不高，但幾個(gè)功能域是保守的(表4)。例如，Ran-結(jié)合蛋白(RBP-1),NuP-2和p163之間與調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)蛋白(Ran，一種GTP-結(jié)合蛋白)結(jié)合的位點(diǎn)是保守的(表5)，結(jié)構(gòu)功能已定的短五肽序列也是保守的(表6)。
為了毫無(wú)疑問(wèn)地闡明p163就是核孔蛋白，產(chǎn)生了針對(duì)蛋白質(zhì)[組氨酸-p163(氨基酸121-252)]的多克隆抗血清，然后進(jìn)行親和純化；從免疫熒光下典型的核孔染色(核表面和外周的點(diǎn)被染色)結(jié)果看，此抗血清毫無(wú)疑問(wèn)地識(shí)別了核孔蛋白。
為了闡明p163或Nup2和p27在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合，使用CMV表達(dá)載體在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)兩種蛋白質(zhì)；48小時(shí)后，裂解細(xì)胞并通過(guò)免疫沉淀/Western印跡檢查可能存在的兩種蛋白質(zhì)的相互作用(Peukert等，EMBO J,16,5672(1997))。在每種情況下使用針對(duì)Nup2的多克隆抗體和針對(duì)鼠p27的多克隆抗體可闡明p27和Nup2之間的結(jié)合。僅當(dāng)p163被表達(dá)時(shí)p27蛋白才能沉淀良好(見表7)。這證明在HeLa細(xì)胞中Nup2和p27能在體內(nèi)互相結(jié)合。
通過(guò)使用人EST進(jìn)行序列比較和序列檢索鑒定出人p163蛋白的核酸序列。其中Ran-結(jié)合域位于序列AA161285中的第173≥575位，p27-結(jié)合域位于序列R62312的第318≥486位，p163的其它組成區(qū)段位于序列THC199124的第348≥489位。
為了更精確地限定與Nup2-p163相互作用的p27氨基酸，在酵母中尋找不再與p163相互作用的突變體。為此，對(duì)編碼p27的cDNA進(jìn)行誘導(dǎo)錯(cuò)誤的PCR反應(yīng)(PCR的條件描述于“PCR-技術(shù)，DNA擴(kuò)增的原理和應(yīng)用”；H.A.Erlich,Stockton出版社，紐約1989)，檢測(cè)含有隨機(jī)錯(cuò)誤的所得克隆與Nup2的相互作用，檢測(cè)所述克隆與細(xì)胞周期蛋白D1的相互作用以作為對(duì)照。該P(yáng)CR的條件(不同于標(biāo)準(zhǔn)條件)是在1U GIBCO Taq聚合酶和0.1mMMnCl2存在下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
將所得cDNA片斷與已被BamHⅠ和EcoRⅠ線性化然后經(jīng)純化的pGBT10載體一起共轉(zhuǎn)化至酵母菌株HF7c-p163/Nup2中。通過(guò)從缺少-Leu-Trp的培養(yǎng)基中選擇篩選出經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落。分離出960個(gè)獨(dú)立的克隆，將它們平鋪在選擇培養(yǎng)基上(-Leu-His-Trp)。對(duì)在此選擇培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行第二個(gè)相互作用試驗(yàn)，即β-半乳糖苷試驗(yàn)。鑒定陰性克隆，從中分離出pGBT10-p27質(zhì)粒。首先，所得質(zhì)粒與將p163/Nup2表達(dá)成含有反式激活域的嵌合體的酵母表達(dá)質(zhì)粒一起被重新轉(zhuǎn)化，然后所得質(zhì)粒與將細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)成含有反式激活域的嵌合體的質(zhì)粒一起被重新轉(zhuǎn)化以作為對(duì)照。如此產(chǎn)生了3個(gè)克隆，所述克隆不再選擇性地與Nup2相互作用，但與細(xì)胞周期蛋白D1相互作用。與幾個(gè)對(duì)照一起測(cè)定這些質(zhì)粒的序列。
所得表型的范圍簡(jiǎn)述于表13。在這些實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)在缺乏組氨酸(-Trp-Leu-His,“選擇性的”)的條件下生長(zhǎng)時(shí)，相互作用證實(shí)了其自身，而對(duì)照(-Trp-Leu；“非選擇性的”)顯示出兩種蛋白質(zhì)都可在酵母中表達(dá)。發(fā)現(xiàn)1000個(gè)克隆中有3個(gè)不再特異性地與p163-Nup2相互作用，但與細(xì)胞周期蛋白D1相互作用。這些序列示于表14。所有3個(gè)克隆，而不是一系列對(duì)照克隆在氨基酸的精氨酸90處攜帶相同的突變(突變成甘氨酸)。序列也表明克隆是獨(dú)立形成的，因?yàn)樗鼈償y有額外的，不同的突變。這清楚地將精氨酸90鑒定為p27與Nup2相互作用的主要氨基酸?？捎么送蛔凅w證實(shí)這種相互作用的生物學(xué)關(guān)聯(lián)。2)p163蛋白的顯性失活類似物的核苷酸序列上述功能分析揭示了p163蛋白的兩個(gè)區(qū)域?qū)τ谄涔δ苁侵陵P(guān)重要的。
其中一個(gè)區(qū)域是結(jié)合p27的區(qū)域(氨基酸121-252),另一個(gè)是結(jié)合Ran的區(qū)域(氨基酸307-467),Ran是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的GTP-結(jié)合蛋白。
因此，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)p163的核酸序列或此蛋白質(zhì)的一部分的核酸序列，這些核酸序列在p27結(jié)合域和/或Ran結(jié)合域表現(xiàn)出突變，以使所表達(dá)的突變蛋白質(zhì)與p27或Ran的結(jié)合大幅度地減少。當(dāng)導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，p163的這些類似物抑制功能細(xì)胞-特異性的p163。這會(huì)產(chǎn)生游離的p27，導(dǎo)致細(xì)胞分裂被抑制。p163的這種顯性失活突變體的例子示于表8和9。表8顯示出其中缺失了p27-結(jié)合域的p163，而表9顯示出缺乏Ran-結(jié)合域的p163。
因此，本發(fā)明涉及將顯性失活的p163類似物用于細(xì)胞，目的是抑制此細(xì)胞的增殖。3)與p163結(jié)合域結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽的核苷酸序列已描述的研究成果將p163蛋白的p27-結(jié)合域確定為氨基酸121-252，將Ran-結(jié)合域確定為氨基酸307-467。
另一類例子是與p163結(jié)合，特別是與p163的p27-結(jié)合域或Ran-結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的抗體或抗體片段，如F(ab)2,Fab,Fv或s.c.Fv。通過(guò)例如用p163或p163的p27-結(jié)合域或Ran-結(jié)合域免疫動(dòng)物可產(chǎn)生這種抗體。所述結(jié)合域示于表5(Ran-結(jié)合域)或表10(p27-結(jié)合域)。4)刺激細(xì)胞分裂的p163的核苷酸序列將p163的核苷酸序列或p163蛋白導(dǎo)入細(xì)胞可抑制細(xì)胞內(nèi)的p27。這可釋放細(xì)胞周期蛋白E/cdk2復(fù)合物(受p27抑制)，所述復(fù)合物可啟動(dòng)細(xì)胞分裂。5)抑制p163蛋白轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核苷酸序列有關(guān)p163蛋白核酸序列的知識(shí)提供了制備可用于特異性抑制p163轉(zhuǎn)錄或翻譯的寡核苷酸的可能性。這些反義核酸包括寡核苷酸，反義(三鏈體)DNA，核酶和反義RNA。制備三鏈體DNA寡核苷酸的方法詳細(xì)描述于Frank-Kamenetskii和Mirkin,Ann.Rev.Biochem,64,65(1995),制備反義RNA寡核苷酸的方法詳細(xì)描述于Neckers等，Crit.Rev.Oncogen,3,175(1992)；Carter和Lemoine,Br.J.Cancer,67,869(1993)；Mukhdopadhyay和Roth,Crit.Rev.Oncogen,7,151(1996)和Mercola和Cohen,癌癥基因療法，2,47(1995)。
本發(fā)明中優(yōu)選使用能與p163核苷酸序列雜交的三鏈體DNA或反義RNA寡核苷酸，所述核苷酸序列編碼p27蛋白-結(jié)合域(總區(qū)域，氨基酸121-252)的組成區(qū)域或Ran蛋白-結(jié)合域(總區(qū)域，氨基酸307-467)組成區(qū)域。
抑制p163轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核苷酸序列還包括特異于p163蛋白核苷酸序列區(qū)域的核酶。
制備核酶的方法詳細(xì)描述于Burke，核酸分子生物學(xué)，8,105(1994),Christoffersen和Marr，藥物化學(xué)雜志，38,2023(1995)和Scott等，科學(xué)，274,2065(1996)。本發(fā)明優(yōu)選與p163核苷酸序列雜交的核酶，所述核苷酸序列位于p27蛋白-結(jié)合域(氨基酸121-252)或Ran蛋白-結(jié)合域(氨基酸307-467)的核苷酸序列的區(qū)域。
能被核酶裂解的p163蛋白核苷酸序列的例子列于表11。
將寡核苷酸形式的三鏈體DNA，反義RNA或核酶[使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(見上述文獻(xiàn))制備并保護(hù)以防DNA酶或RNA酶降解]或者在體外加入靶細(xì)胞，或者通過(guò)注射或局部應(yīng)用而進(jìn)行體內(nèi)施用。
然而，本發(fā)明也涉及將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞，目的是通過(guò)轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞中形成對(duì)應(yīng)于本發(fā)明寡核苷酸的反義RNA或核酶，從而抑制所述細(xì)胞的增殖。導(dǎo)入細(xì)胞可在體外或體內(nèi)發(fā)生。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，以裸DNA的形式，或借助于非病毒載體，或借助于并插入病毒載體將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞。6)篩查p163功能抑制劑的檢測(cè)系統(tǒng)有關(guān)p163蛋白及其與p27蛋白的相互作用的發(fā)現(xiàn)使篩查所述相互作用的抑制劑成為可能。這需要檢測(cè)系統(tǒng)，該檢測(cè)系統(tǒng)中p27蛋白和p163蛋白之間的結(jié)合被抑制，這種抑制的出現(xiàn)由指示劑顯示。
大量方法是已知的，一個(gè)所述方法的例子是雙雜合體篩選試驗(yàn)(有關(guān)內(nèi)容見C.1節(jié)和表1)。
然而也可以使用例如親和系統(tǒng)來(lái)篩選，在該系統(tǒng)中，p163[優(yōu)選為p27-結(jié)合域(氨基酸121-252)]與固相結(jié)合并與檢測(cè)物質(zhì)一起保溫，通過(guò)對(duì)p163蛋白中p27-結(jié)合域的經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合配偶體的結(jié)合的抑制作用可確定檢測(cè)物質(zhì)的結(jié)合。所述經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合配偶體可以是p27或特異性地結(jié)合p163蛋白的p27-結(jié)合域的抗體。可以按照與組建檢測(cè)p163和p27之間結(jié)合的抑制劑的系統(tǒng)相同的方式，組建檢測(cè)p163和Ran之間結(jié)合的抑制劑的系統(tǒng)，并將該檢測(cè)系統(tǒng)用于篩選。因此，本發(fā)明涉及編碼p163或p163的組成蛋白的核酸序列用于篩選p163抑制劑的用途，或p163蛋白或其組成蛋白用于篩選p163抑制劑的用途。7)p163的核酸序列或p163的蛋白質(zhì)序列用于診斷細(xì)胞增殖時(shí)期或疾病狀況的用途如A)節(jié)中所述，很多腫瘤的特征在于p27的胞內(nèi)濃度增加。由于這些腫瘤在增殖，可假定這種濃度增加的p27的功能受到抑制。根據(jù)本發(fā)明，p163是p27的特異性抑制劑。在細(xì)胞中檢測(cè)這種抑制劑使得對(duì)細(xì)胞的增殖狀況得出結(jié)論成為可能。這種結(jié)論對(duì)于例如評(píng)估腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織的惡性非常重要。通過(guò)細(xì)胞死亡可釋放p163蛋白。因此，在體液中檢測(cè)到p163即可對(duì)體內(nèi)的增殖過(guò)程和/或伴隨細(xì)胞死亡的過(guò)程，如炎癥過(guò)程有一定論。通過(guò)與經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)的特異性結(jié)合可檢測(cè)到p163蛋白。所述特異性結(jié)合的物質(zhì)包括p27蛋白，Ran蛋白和例如通過(guò)用p163蛋白或用p163蛋白的組成序列免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體。
然而，通過(guò)使編碼p163蛋白的核酸序列與相應(yīng)的mRNA雜交也可檢測(cè)到細(xì)胞或組織中的p163mRNA?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，其中使用所謂的引物對(duì)可復(fù)制欲檢測(cè)的幾拷貝核酸序列，從而增加了檢測(cè)的敏感性。
用于擴(kuò)增和檢測(cè)編碼p163的核酸序列的引物對(duì)的例子示于表12a,b和c。
然而，也可以通過(guò)例如使用Gussoni等，Nature Biotechnol,14,1012(1996)所述的熒光原位雜交法來(lái)檢測(cè)編碼p163的RNA。
因此，本發(fā)明涉及檢測(cè)編碼p163的核酸序列或檢測(cè)p163蛋白以確定細(xì)胞或組織的增殖狀況或檢測(cè)活的哺乳動(dòng)物中的增殖變化，或伴隨細(xì)胞死亡的變化。本發(fā)明的主題概括如下1．抑制p27從而可解除由p27蛋白引起的對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用的蛋白質(zhì)。2．第1項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有表6所示的P163氨基酸序列[SEQID NO:16]或其部分。3．第2項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中根據(jù)表6的編號(hào)，p163氨基酸序列的部分選自具有下列位置的氨基酸序列的肽1至24[SEQ ID NO:2],137至196[SEQ ID NO:4],215至265[SEQ ID NO:6],239至272[SEQ IDNO:8],399至438[SEQ ID NO:10]和307至469[SEQ ID NO:12]。4．通過(guò)缺失功能域可衍生自第2項(xiàng)所述蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，其中從表6的[SEQ ID NO:16]中缺失p27-結(jié)合域或Ran-結(jié)合域。5．第4項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中缺失了p27-結(jié)合域之后得到具有表8所示氨基酸序列[SEQ ID NO:18]的蛋白質(zhì)，缺失了Ran-結(jié)合域之后得到具有表9所示氨基酸序列[SEQ ID NO:19]的蛋白質(zhì)。6．通過(guò)缺失除p27結(jié)合域區(qū)以外的所有氨基酸序列可衍生自第2項(xiàng)所述蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。7．第6項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有表10所示氨基酸序列[SEQ IDNO:20]。8．第1至7項(xiàng)中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是得自另一哺乳動(dòng)物種或人的相應(yīng)同源性蛋白質(zhì)，或其相應(yīng)的部分。9．第8項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有p163人同系物的氨基酸序列。10．編碼第1至9項(xiàng)中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述蛋白質(zhì)的DNA。11．第10項(xiàng)所述的DNA，該DNA(a)含有表3所示的核苷酸序列[SEQ ID NO:1]或其部分，(b)在嚴(yán)格條件下能與(a)所述序列雜交，或(c)遵照遺傳密碼的簡(jiǎn)并性與(a)所述序列相比有所變化，但仍編碼相同的氨基酸序列。12．用作PCR引物的第11項(xiàng)所述的DNA，其中這些PCR引物的核苷酸序列選自表12a的[SEQ ID NO:21]至[SEQ ID NO:30]，表12b的[SEQID NO:31]至[SEQ ID NO:32]，和表12c的[SEQ ID NO:33]至[SEQ IDNO:40]。13．第10或11項(xiàng)所述的DNA用于檢測(cè)和/或定量細(xì)胞和/或組織中的p163mRNA的用途。14．第13項(xiàng)所述的用途，其中通過(guò)Northern印跡實(shí)現(xiàn)檢測(cè)和/或定量。15．第13項(xiàng)所述的用途，其中利用PCR實(shí)現(xiàn)檢測(cè)和/或定量。16．第15項(xiàng)所述的用途，其中利用了第12項(xiàng)所述的PCR引物。17．第13項(xiàng)所述的用途，其中通過(guò)熒光原位雜交實(shí)現(xiàn)檢測(cè)和/或定量。18．第1至9項(xiàng)中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)用于制備與所述蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的用途。19．與第1至9項(xiàng)中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)上的p27蛋白結(jié)合域結(jié)合的抗體和這些抗體的裂解產(chǎn)物。20．與第1至9項(xiàng)中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)上的Ran蛋白結(jié)合域結(jié)合的抗體和這些抗體的裂解產(chǎn)物。21．第19或20項(xiàng)所述的抗體用于檢測(cè)細(xì)胞、組織或體液中第1或2項(xiàng)中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的用途。22．與第10或11項(xiàng)所述DNA的組成區(qū)域互補(bǔ)的反義核酸，所述組成區(qū)域位于編碼氨基酸121至467的核苷酸區(qū)域內(nèi)。23．第22項(xiàng)所述的反義核酸，該反義核酸選自三鏈體DNA，合成的寡核苷酸，反義RNA和核酶。24．第22或23項(xiàng)所述的反義核酸抑制細(xì)胞增殖的用途，其中將細(xì)胞在體外或體內(nèi)與反義核酸接觸。25．編碼第22或23項(xiàng)所述的用于抑制細(xì)胞增殖的反義核酸的核酸構(gòu)建體，其中將編碼反義核酸序列的DNA與至少一種激活序列連接，并以插入非病毒載體或插入病毒載體的裸DNA的形式導(dǎo)入靶細(xì)胞中。26．第1至9項(xiàng)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)用于篩查所述蛋白質(zhì)和細(xì)胞結(jié)合配偶體之間相互作用的抑制劑的用途。27．第26項(xiàng)所述的用途，其中使用了雙雜合體系統(tǒng)。28．第26項(xiàng)所述的用途，其中使用了親和系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中p163或其p27結(jié)合域與固相結(jié)合，然后將所述固相與受試物質(zhì)一起保溫，最后利用第1至9項(xiàng)的蛋白質(zhì)測(cè)定對(duì)結(jié)合配偶體與所述蛋白質(zhì)的結(jié)合的抑制作用。29．第28項(xiàng)所述的用途，其中結(jié)合配偶體選自p27和Ran。30．第3至9項(xiàng)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)作為第1,2,8和9項(xiàng)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的功能的抑制劑的用途。31．第19或20項(xiàng)所述的抗體作為第1,2,8和9項(xiàng)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述蛋白質(zhì)的功能的抑制劑的用途。32．核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有第10或11項(xiàng)所述的DNA，所述DNA與能使第1至9項(xiàng)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中被表達(dá)的激活序列有效連接。33．第32項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體用于刺激細(xì)胞增殖的用途。
表1
+ p27(1-198) - - -+ p27(1-198) - + -+ p27(1-198) p163+ ++++ - - - -- - p163+ -+Myc262-439 p163+ -+Max p163+ -+前胸腺素 p163+ -+LAZ3/Bcl6p163+ -+p27(1-178) p163+ ++++p27(1-94)p163+ ++p27(69-198) p163+ ++++p27(69-94) p163+ n.d.+p27(1-198) p163(121- + +++252)
表2柱上樣品與下列物質(zhì)涂覆的親和層析柱的結(jié)合谷胱甘肽 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-p163轉(zhuǎn)移酶融合蛋白重組的 ++++(35S-標(biāo)記的)p27含有p27的細(xì)胞提取物 (+)-(RAT1-Myc ER)含有p27的細(xì)胞提取物 +++-(RAT1-Myc ER)，(95℃加熱2分鐘)cdk-2(細(xì)胞提取物) - -cdk-4(細(xì)胞提取物) - -
表3[SEQ ID NO.:1]TCGAATTGGG TACCGGGCCC CCCCTCGAGG TCGACGGTAT CGATAAGCTT GATATCGAAT60TCGCGGCCGC TCGAGTTACA AGATGGCGGC CCCGGGCGCT CTCTTCACCG TTCTGTAGCA 120GCTTCGGGCT GAGCGGATGT CTCTTCTTGT CCTCAGTGTC GGACTCAGAG ACACACGGCT 180CCCGAGTTCT GCTGATCACG AAGTTCCCGG AGGCGCTCGA CGCACCGGAA TCTCCCAGCG 240GCCGCGACCG CCGCCTCGGC CCTGCTCGCC GCGGCGCCGG GACTCCAGCG TGATCGGCGG 300CGGCAGTCAA GGTTCACAAA AATGGCGAAG AGAGTTGCGG AGAAGGAGTT GACTGACAGG 360AACTGGGATG AGGAAGACGA AGTTGAAGAG ATGGGAACAT TCTCAGTGGC CAGTGAGGAA 420GTCATGAAGA ACAGAGCCGT AAAGAAGGCA AAGCGCAGAA ACGTTGGATT TGAATCTGAT 480AGCGGAGGAG CCTTTAAAGG TTTCAAAGGT TTGGTTGTGC CTTCTGGAGG AGGAGGGTTT 540TCTGGATTTG GTGGCTCTGG AGGAAAGCCT CTGGAAGGAC TGACAAATGG AAACAGCACA 600GACAATGCCA CGCCCTTCTC CAATGTAAAG ACAGCAGCAG AGCCCAAGGC AGCCTTTGGT 660TCTTTTGCTG TGAATGGCCC TACTACCTTG GTGGATAAAG TTTCAAATCC AAAAACTAAT 720GGGGACAGCA ATCAGCCGCC CTCCTCCGGC CCTGCTTCCA GTACCGCCTG CCCTGGGAAT 780GCCTATCACA AGCAGCTGGC TGGCTTGAAC TGCTCCGTCC GCGATTGGAT AGTGAAGCAC 840GTGAACACAA ACCCGCTTTG TGACCTGACT CCCATTTTTA AAGACTATGA GAGATACTTG 900GCGACGATCG AGAAGCAGCT TGAGAATGGA GGCGGCAGCA GTTCTGAGAG CCAGACAGAC 960AGGGCGACGG CTGGAATGGA GCCTCCTTCC CTTTTTGGTT CAACAAAACT ACAGCAAGAG 1020TCACCATTTT CATTTCATGG CAACAAAGCG GAGGACACAT CTGAAAAGGT GGAGTTTACA 1080GCAGAAAAGA AATCGGACGC AGCACAAGGA GCAACAAGTG CCTCGTTTAG TTTCGGCAAG 1140AAAATTGAGA GCTCGGCTTT GGGCTCGTTA AGCTCTGGCT CCCTAACTGG GTTTTCATTC 1200TCTGCTGGAA GCTCCAGCTT GTTTGGTAAA GATGCTGCCC AGAGTAAAGC AGCCTCTTCG 1260CTGTTCTCTG CTAAAGCATC CGAGAGTCCG GCAGGAGGCG GCAGCAGCGA GTGCAGAGAT 1320GGTGAAGAAG AGGAGAATGA CGAGCCACCC AAGGTAGTGG TGACCGAAGT AAAGGAAGAG 1380GATGCTTTCT ACTCCAAAAA ATGTAAACTA TTTTACAAGA AAGACAACGA ATTTAAAGAG 1440AAGGGTGTGG GGACCCTGCA TTTAAAACCC ACAGCAACTC AGAAGACCCA GCTCTTGGTG 1500CGGGCAGACA CCAACCTAGG CAACATACTG CTGAATGTTC TGATCGCCCC CAACATGCCG 1560TGCACCCGGA CAGGAAAGAA CAACGTCCTT ATCGTCTGTG TCCCCAACCC CCCACTCGAT 1620GAGAAGCAGC CCACTCTCCC GGCCACCATG CTGATCCGGG TGAAGACGAG CGAGGATGCC 1680GATGAATTGC ACAAGATTTT ACTGGAGAAA AAGGATGCCT GAGCACTGAG GCTGACCAAG 1740GCATGTTGCC ACGTTGCTGC TTCCCCTCCG TCCCTAACTT AGTCACATTC TTTCCTCTTC1800TACTGTGACA TTCTGAGAAC TTCTAGGTAA CTTGAACTTT TGTGAGGAAG ATTAAGGCCA1860ATAAATCCTT TCAGTGGCGG CCGCGAATTC CTGCAGCCCG GGGGATCCAC TAGTTCTAGA1920GCGGCCGCCA CCGCGGTGGA GCTCCAGCTT TTGGGAGA1958表4p163: 1 MAKRVAEKELTDRNWDEEDEVEEM 24 [SEQ ID NO.:2]MAKRVA+ +++D + +++YNup2: 1 MAKRVADAQIQRETYDSNESDDDV 24 [SEQ ID NO.:3]P163:137 NQPPSSGPASSTACPGNAYHKQLAGLNCSN+ +G A P+ +L LNYNup2:71 NRADGTGEAQVDNSPTTESNSRLKALNLQVRDWIVKHVNTNPLCDLTPIFKDYERYLATI 196 [SEQ ID NO.:4]++ + V PL DL P+F YE Y+ IFKAKVDDLVLGKPLADLRPLFTRYELYIKNI 130 [SEQ ID NO.:5]P163:215 ATAGMEPPSLFGSTKLQQESPFSFHGNKAEDTA + P ST + PF G++YNup2: 535 ANSSTSPAPSIPSTGFKFSLPFEQKGSQTTTNSEKVEFTAEKKSDAAQGAT265 [SEQ ID NO.:6]K E T E + +Q ATDSKEESTTEATGNESQDAT585 [SEQ ID NO.:7]P163:239 HGNKAEDTSEKVEFTAEKKSDAAQGATSASFSFG 272 [SEQ ID NO.:8]+G++++D+ ++A+ + AT +FSFGYNup2: 444 NGSESKDSDKPSLPSAVDGENDKKEATKPAFSFG477 [SEQ ID NO.:9]P163:399 LGNILLNVLIAPNMPCTRTGKNNVLIVCVPNPPLDEKQPT 438[SEQ ID NO.:10]+GN+LLN + + N ++ PD K TYNup2: 655 MGNVLLNATVVDSFKYEPLAPGNDNLIKAPTVAADGKLVT 694[SEQ ID NO.:11]
表5RBP1(小鼠) DSHADHDTST---ENADESTTHP--QFEPIVSVPE----RBP1(人) 5 DSHADHDTST---ENADESNHDP--QFEPIVSVPE----NUP2p(酵母)560 SQTTTNDSKE---ESTTEATGNESQDATKVDATPEESKPp163(小鼠) 307 QSKAASSLFSAKASESPAGGGSSECRDGEEEENDEPPKVRBP1(小鼠) QEIKTLEEDEEELFKMRAKLFRFASENDLPEWKEPRHGDVKLIKHK-RBP1(人) QEIKTLEEDEEELFKMRAKLFRFASENDLPEWKERGTGDVKLLKHK-NUP2p(酵母)INLQNGEEDEVALFSQKAKLMTFNA--ETKSYDSRGVGEMKLLKKKDp163(小鼠) VVTEVK--EEDAFYSKKCKLFYKKDNEF----KEKGVGTLHL-KPT-RBP1 (小鼠)EKGTIRLLMRRDKTLKI-CANHYITPMMELKP-NAGSDRAWVWNTHTDRBP1(人) EKGTIRLLMRRDKTLKI-CANHYITPMMELKP-NAGSDRAWVWNTHTDNUP2p (酵母) DSPKVRLLCRSDGMGNV-LLNATVVDSFKYEPLAPGNDNLIKAPTVAAp163(小鼠) ATQKTQLLVRADTNLGNILLNVLIAPNMPCTRTGKNNVLIVCVPNP--RBP1(小鼠) FADECP--KPELLAIRFLNAENAQKFKTKFEECRKEI[SEQ ID NO.:12]RBP1(人) FADECP--KPELLAIRFLNAENAQKFKTKFEECRKEI[SEQ ID NO.:13]NUP2p(酵母)DG-------KLVTYIVFKQKLEGRSFTKAIEDAKKEM[SEQ ID No.:14]p163(小鼠) PLDEKQPTLPATMLIRVKTSEDADELHKILLEKKDAA[SEQ ID NO.:15]
表6p163(小鼠)[SEQ ID NO.:16]Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser115 120 125Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro130 135 140Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr165 170 175Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr180 185 190Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser195 200 205Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu210 215 220Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly225 230 235 240Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys245 250 255Lys Ser Asp Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly260 265 270Lys Lys Ile Glu Ser Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu275 280 285Thr Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Ser Ser Ser Leu Phe Gly Lys Asp290 295 300Ala Ala Gln Ser Lys Ala Ala Ser Ser Leu Phe Ser Ala Lys Ala Ser305 310 315 320Glu Ser Pro Ala Gly Gly Gly Ser Ser Glu Cys Arg Asp Gly Glu Glu325 330 335Glu Glu Asn Asp Glu Pro Pro Lys Val Val Val Thr Glu Val Lys Glu340 345 350Glu Asp Ala Phe Tyr Ser Lys Lys Cys Lys Leu Phe Tyr Lys Lys Asp355 360 365Asn Glu Phe Lys Glu Lys Gly Val Gly Thr Leu His Leu Lys Pro Thr370 375 380Ala Thr Gln Lys Thr Gln Leu Leu Val Arg Ala Asp Thr Asn Leu Gly385 390 395 400Asn Ile Leu Leu Asn Val Leu Ile Ala Pro Asn Met Pro Cys Thr Arg405 410 415Thr Gly Lys Asn Asn Val Leu Ile Val Cys Val Pro Asn Pro Pro Leu420 425 430Asp Glu Lys Gln Pro Thr Leu Pro Ala Thr Met Leu Ile Arg Val Lys435 440 445Thr Ser Glu Asp Ala Asp Glu Leu His Lys Ile Leu Leu Glu Lys Lys450 455 460Asp Ala465NUP2(酵母)[SEQ ID No.:17]Met Ala Lys Arg Val Ala Asp Ala Gln Ile Gln Arg Glu Thr Tyr Asp1 5 10 15Ser Asn Glu Ser Asp Asp Asp Val Thr Pro Ser Thr Lys Val Ala Ser20 25 30Ser Ala Val Met Asn Arg Arg Lys Ile Ala Met Pro Lys Arg Arg Met35 40 45Ala Phe Lys Pro Phe Gly Ser Ala Lys Ser Asp Glu Thr Lys Gln Ala50 55 60Ser Ser Phe Ser Phe Leu Asn Arg Ala Asp Gly Thr Gly Glu Ala Gln65 70 75 80Val Asp Asn Ser Pro Thr Thr Glu Ser Asn Ser Arg Leu Lys Ala Leu85 90 95Asn Leu Gln Phe Lys Ala Lys Val Asp Asp Leu Val Leu Gly Lys Pro100 105 110Leu Ala Asp Leu Arg Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Glu Leu Tyr Ile Lys115 120 125Asn Ile Leu Glu Ala Pro Val Lys Phe Ile Glu Asn Pro Thr Gln Thr130 135 140Lys Gly Asn Asp Ala Lys Pro Ala Lys Val Glu Asp Val Gln Lys Ser145 150 155 160Ser Asp Ser Ser Ser Glu Asp Glu Val Lys Val Glu Gly Pro Lys Phe165 170 175Thr Ile Asp Ala Lys Pro Pro Ile Ser Asp Ser Val Phe Ser Phe Gly180 185 190Pro Lys Lys Glu Asn Arg Lys Lys Asp Glu Ser Asp Ser Glu Asn Asp195 200 205Ile Glu Ile Lys Gly Pro Glu Phe Lys Phe Ser Gly Thr Val Ser Ser210 215 220Asp Val Phe Lys Leu Asn Pro Ser Thr Asp Lys Asn Glu Lys Lys Thr225 230 235 240Glu Thr Asn Ala Lys Pro Phe Ser Phe Ser Ser Ala Thr Ser Thr Thr245 250 255Glu Gln Thr Lys Ser Lys Asn Pro Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Lys260 265 270Thr Asn Val Asp Asn Asn Ser Lys Ala Glu Ala Ser Phe Thr Phe Gly275 280 285Thr Lys His Ala Ala Asp Ser Gln Asn Asn Lys Pro Ser Phe Val Phe290 295 300Gly Gln Ala Ala Ala Lys Pro Ser Leu Glu Lys Ser Ser Phe Thr Phe305 310 315 320Gly Ser Thr Thr Ile Glu Lys Lys Asn Asp Glu Asn Ser Thr Ser Asn325 330 335Ser Lys Pro Glu Lys Ser Ser Asp Ser Asn Asp Ser Asn Pro Ser Phe340 345 350Ser Phe Ser Ile Pro Ser Lys Asn Thr Pro Asp Ala Ser Lys Pro Ser355 360 365Phe Asn Phe Gly Val Pro Asn Ser Ser Lys Asn Glu Thr Ser Lys Pro370 375 380Val Phe Ser Phe Gly Ala Ala Thr Pro Ser Ala Lys Glu Ala Ser Gln385 390 395 400Glu Asp Asp Asn Asn Asn Val Glu Lys Pro Ser Ser Lys Pro Ala Phe405 410 415Asn Phe Ile Ser Asn Ala Gly Thr Glu Lys Glu Lys Glu Ser Lys Lys420 425 430Asp Ser Lys Pro Ala Phe Ser Phe Gly Ile Ser Asn Gly Ser Glu Ser435 440 445Lys Asp Ser Asp Lys Pro Ser Leu Pro Ser Ala Val Asp Gly Glu Asn450 455 460Asp Lys Lys Glu Ala Thr Lys Pro Ala Phe Phe Gly Ile Asn Thr Asn465 470 475 480Thr Thr Lys Thr Ala Asp Thr Lys Ala Pro Thr Phe Thr Phe Gly Ser485 490 495Ser Ala Leu Ala Asp Asn Lys Glu Asp Val Lys Lys Pro Phe Ser Phe500 505 510Gly Thr Ser Gln Pro Asn Asn Thr Pro Ser Phe Ser Phe Gly Lys Thr515 520 525Thr Ala Asn Leu Pro Ala Asn Ser Ser Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ile530 535 540Pro Ser Thr Gly Phe Lys Phe Ser Leu Pro Phe Glu Gln Lys Gly Ser545 550 555 560Gln Thr Thr Thr Asn Asp Ser Lys Glu Glu Ser Thr Thr Glu Ala Thr565 570 575Gly Asn Glu Ser Gln Asp Ala Thr Lys Val Asp Ala Thr Pro Glu Glu580 585 590Ser Lys Pro Ile Asn Leu Gln Asn Gly Glu Glu Asp Glu Val Ala Leu595 600 605Phe Ser Lys Ala Lys Leu Met Thr Phe Asn Ala Glu Thr Lys Ser Tyr610 615 620Asp Ser Arg Gly Val Gly Glu Met Lys Leu Leu Lys Lys Lys Asp Asp625 630 635 640Pro Ser Lys Val Arg Leu Leu Cys Arg Ser Asp Gly Met Gly Asn Val645 650 655Leu Leu Asn Ala Thr Val Val Asp Ser Phe Lys Tyr Glu Pro Leu Ala660 665 670Pro Gly Asn Asp Asn Leu Ile Lys Ala Pro Thr Val Ala Ala Asp Gly675 680 685Lys Thr Tyr Ile Val Lys Phe Lys Gln Lys Glu Glu Gly Arg Ser Phe690 695 700Thr Lys Ala Ile Glu Asp Ala Lys Lys Glu Lys705 710 715
表7檢測(cè)HeLa細(xì)胞中p27和p163之間的結(jié)合被下列物質(zhì)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的總蛋白的沉淀與下列物質(zhì)的沉淀 CMV-p27 CMV-p27-+CMV-NapCMV-Nap2-Nap2-特異性抗體-+ + -p27-特異性抗體 +++ - -
表8[SEQ ID NO.:18]Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Mer Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Phe Thr Ala Glu Lys Lys Ser Asp115 120 125Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly Lys Lys Ile130 135 140Glu Ser Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu Thr Gly Phe145 150 155 160Ser Phe Ser Ala Gly Ser Ser Ser Leu Phe Gly Lys Asp Ala Ala Gln165 170 175Ser Lys Ala Ala Ser Ser Leu Phe Ser Ala Lys Ala Ser Glu Ser Pro180 185 190Ala Gly Gly Gly Ser Ser Glu Cys Arg Asp Gly Glu Glu Glu Glu Asn195 200 205Asp Glu Pro Pro Lys Val Val Val Thr Glu Val Lys Glu Glu Asp Ala210 215 220Phe Tyr Ser Lys Lys Cys Lys Leu Phe Tyr Lys Lys Asp Asn Glu Phe225 230 235 240Lys Glu Lys Gly Val Gly Thr Leu His Leu Lys Pro Thr Ala Thr Gln245 250 255Lys Thr Gln Leu Leu Val Arg Ala Asp Thr Asn Leu Gly Asn Ile Leu260 265 270Leu Asn Val Leu Ile Ala Pro Asn Met Pro Cys Thr Arg Thr Gly Lys275 280 285Asn Asn Val Leu Ile Val Cys Val Pro Asn Pro Pro Leu Asp Glu Lys290 295300Gln Pro Thr Leu Pro Ala Thr Met Leu Ile Arg Val Lys Thr Ser Glu305 310 315 320Asp Ala Asp Glu Leu His Lys Ile Leu Leu Glu Lys Lys Asp Ala325 330 335表9[SEQ ID NO.:19]Mer Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met Gly Thr Phe Ser Val Ala Ser Glu20 25 30Glu Val Met Lys Asn Arg Ala Val Lys Lys Ala Lys Arg Arg Asn Val35 40 45Gly Phe Glu Ser Asp Ser Gly Gly Ala Phe Lys Gly Phe Lys Gly Leu50 55 60Val Val Pro Ser Gly Gly Gly Gly Phe Ser Gly Phe Gly Gly Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Pro Leu Glu Gly Leu Thr Asn Gly Asn Ser Thr Asp Asn Ala85 90 95Thr Pro Phe Ser Asn Val Lys Thr Ala Ala Glu Pro Lys Ala Ala Phe100 105 110Gly Ser Phe Ala Val Asn Gly Pro Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser115 120 125Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro130 135 140Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala145 150 155 160Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp Trp Ile Val Lys His Val Asn Ile165 170 175Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr180 185 190Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser195 200 205Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu210 215 220Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly225 230 235 240Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys245 250 255Lys Ser Asp Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser Phe Gly260 265 270Lys Lys Ile Glu Ser Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu275 280 285Thr Gly Phe Ser Phe Ser Ala Gly Ser Ser Ser Leu Phe Gly Lys Asp290 295 300Ala Ala Glu Lys Glu Leu305 310
表10[SEQ ID NO.:20]Thr Thr Leu Val Asp Lys Val Ser Asn Pro Lys Thr Asn Gly Asp Ser1 5 10 15Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly20 25 30Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp35 40 45Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro50 55 60Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile Glu Lys Gln Leu65 70 75 80Glu Asn Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Ser Gln Thr Asp Arg Ala Thr85 90 95Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu Gln Gln100 105 110Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu115 120 125Lys Val Glu Phe130
表11p163中的GUC序列核苷酸位置 序列<
相互作用的區(qū)域含有編號(hào)所涉及的小鼠序列的氨基酸121-252。這對(duì)應(yīng)于小鼠序列的核苷酸685-1078。
表12a5個(gè)選定的引物對(duì)評(píng)分長(zhǎng)度 GC％ 基因座名稱5｀ 3｀5.8 108 43.5 122..143 上AGAAAGCAAAGCGCAGAAATGT[SEQ ID NO.:21]229..209 下CAAATCCAGAAAAGCGTCCTC[SEQ ID NO.:22]6.7 119 42.0 104..127 上TGAAGAATAGAGCCATAAAGAAAG[SEQ ID NO.:23]240..220 下AGAAAAGCGTCCTCCTCCAGA[SEQ ID NO.:24]23.313743.8104..127 上TGAAGAATAGAGCCATAAAGAAAG[SEQ ID NO.:25]204..220 下AGCGCCACTAACCAAATCCAGA[SEQ ID NO.:26]25.7100 44.0 122..143 上AGAAAGCAAAGCGCAGAAATGT[SEQ ID NO.:27]221..200 下GAAAAGCGTCCTCCTCCAGAAG[SEQ ID NO.:28]48.7 122 46.7 123..144 上GAAAGCAAAGCGCAGAAATGTT[SEQ ID NO.:29]244..224 下CTCCAGCGCCACTACCAAATC[SEQ ID NO.:30]
表12b1個(gè)選定的引物對(duì)評(píng)分長(zhǎng)度GC％ 基因座名稱5｀ 3｀51.3193 52.8 34..53 上 CCCGCACGGAGCAGTTCAAG[SEQ ID NO.:31]226..205下 GCAGCGGCAGATCCCAAGGTAG[SEQ ID NO.:32]表12c1個(gè)選定的引物對(duì)評(píng)分長(zhǎng)度GC％基因座名稱5｀ 32.4 136 45.64..20 上GGCATCCTTTTTCTCCA[SEQ ID NO.:33]139..120 下CGTTCTTATCGTCTCTGTGTTC[SEQ ID NO.:34]2.5120 45.05..23 上GCATCCTTTTTCTCCAGTA[SEQ ID NO.:35]139..119 下TGTTCCAAATCCACCAAT[SEQ ID NO.:36]2.7 100 48.040..58 上GTCTGCATCCTCGCTGGTT[SEQ ID NO.:37]139..119 下CGTTCTTATCGTCTGTGTTCC[SEQ ID NO.:38]50.0 105 44.8 57..75 上TTTTACCCGAATCAACAT[SEQ ID NO.:39]161..141 下GTAcGCGAACAGGGAAGAATA[SEQ ID NO.:40]
表13生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)概要細(xì)胞周期蛋白D1Nup2非選擇性的選擇性的非選擇性的選擇性的
<p>表14與野生型相比突變p27蛋白的序列A)
B)序列 SEQ ID NO.:大多數(shù) 41克隆 # 106 42克隆 # 152 43克隆 # 294 44克隆 # 660 45克隆 # 687 46克隆 # 826 47克隆 # 850 48p27(小鼠) 49
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH(B)街道-(C)城市法蘭克福(D)州-(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼(ZIP)65926(G)電話069-305-3005(H)傳真069-35-7175(I)電報(bào)-(ⅱ)發(fā)明題目依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶的抑制劑的結(jié)合配偶體及其用于篩查抑制劑和診斷或治療疾病的用途(ⅲ)序列數(shù)49(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1958個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…1958(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:TCGAATTGGG TACCGGGCCC CCCCTCGAGG TCGACGGTAT CGATAAGCTT GATATCGAAT60TCGCGGCCGC TCGAGTTACA AGATGGCGGC CCCGGGCGCT CTCTTCACCG TTCTGTAGCA 120GCTTCGGGCT GAGCGGATGT CTCTTCTTGT CCTCAGTGTC GGACTCAGAG ACACACGGCT 180CCCGAGTTCT GCTGATCACG AAGTTCCCGG AGGCGCTCGA CGCACCGGAA TCTCCCAGCG 240GCCGCGACCG CCGCCTCGGC CCTGCTCGCC GCGGCGCCGG GACTCCAGCG TGATCGGCGG 300CGGCAGTCAA GGTTCACAAA AATGGCGAAG AGAGTTGCGG AGAAGGAGTT GACTGACAGG 360AACTGGGATG AGGAAGACGA AGTTGAAGAG ATGGGAACAT TCTCAGTGGC CAGTGAGGAA 420GTCATGAAGA ACAGAGCCGT AAAGAAGGCA AAGCGCAGAA ACGTTGGATT TGAATCTGAT 480AGCGGAGGAG CCTTTAAAGG TTTCAAAGGT TTGGTTGTGC CTTCTGGAGG AGGAGGGTTT 540TCTGGATTTG GTGGCTCTGG AGGAAAGCCT CTGGAAGGAC TGACAAATGG AAACAGCACA 600GACAATGCCA CGCCCTTCTC CAATGTAAAG ACAGCAGCAG AGCCCAAGGC AGCCTTTGGT 660TCTTTTGCTG TGAATGGCCC TACTACCTTG GTGGATAAAG TTTCAAATCC AAAAACTAAT 720GGGGACAGCA ATCAGCCGCC CTCCTCCGGC CCTGCTTCCA GTACCGCCTG CCCTGGGAAT 780GCCTATCACA AGCAGCTGGC TGGCTTGAAC TGCTCCGTCC GCGATTGGAT AGTGAAGCAC 840GTGAACACAA ACCCGCTTTG TGACCTGACT CCCATTTTTA AAGACTATGA GAGATACTTG 900GCGACGATCG AGAAGCAGCT TGAGAATGGA GGCGGCAGCA GTTCTGAGAG CCAGACAGAC 960AGGGCGACGG CTGGAATGGA GCCTCCTTCC CTTTTTGGTT CAACAAAACT ACAGCAAGAG 1020TCACCATTTT CATTTCATGG CAACAAAGCG GAGGACACAT CTGAAAAGGT GGAGTTTACA 1080GCAGAAAAGA AATCGGACGC AGCACAAGGA GCAACAAGTG CCTCGTTTAG TTTCGGCAAG 1140AAAATTGAGA GCTCGGCTTT GGGCTCGTTA AGCTCTGGCT CCCTAACTGG GTTTTCATTC 1200TCTGCTGGAA GCTCCAGCTT GTTTGGTAAA GATGCTGCCC AGAGTAAAGC AGCCTCTTCG 1260CTGTTCTCTG CTAAAGCATC CGAGAGTCCG GCAGGAGGCG GCAGCAGCGA GTGCAGAGAT 1320GGTGAAGAAG AGGAGAATGA CGAGCCACCC AAGGTAGTGG TGACCGAAGT AAAGGAAGAG 1380GATGCTTTCT ACTCCAAAAA ATGTAAACTA TTTTACAAGA AAGACAACGA ATTTAAAGAG 1440AAGGGTGTGG GGACCCTGCA TTTAAAACCC ACAGCAACTC AGAAGACCCA GCTCTTGGTG 1500CGGGCAGACA CCAACCTAGG CAACATACTG CTGAATGTTC TGATCGCCCC CAACATGCCG 1560TGCACCCGGA CAGGAAAGAA CAACGTCCTT ATCGTCTGTG TCCCCAACCC CCCACTCGAT 1620GAGAAGCAGC CCACTCTCCC GGCCACCATG CTGATCCGGG TGAAGACGAG CGAGGATGCC 1680GATGAATTGC ACAAGATTTT ACTGGAGAAA AAGGATGCCT GAGCACTGAG GCTGACCAAG 1740GCATGTTGCC ACGTTGCTGC TTCCCCTCCG TCCCTAACTT AGTCACATTC TTTCCTCTTC 1800TACTGTGACA TTCTGAGAAC TTCTAGGTAA CTTGAACTTT TGTGAGGAAG ATTAAGGCCA 1860ATAAATCCTT TCAGTGGCGG CCGCGAATTC CTGCAGCCCG GGGGATCCAC TAGTTCTAGA 1920GCGGCCGCCA CCGCGGTGGA GCTCCAGCTT TTGGGAGA 1958(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…24(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Ala Lys Arg Val Ala Glu Lys Glu Leu Thr Asp Arg Asn Trp Asp1 5 10 15Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Met20(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…24(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Met Ala Lys Arg Val Ala Asp Ala Gln Ile Gln Arg Glu Thr Tyr Asp15 10 15Ser Asn Glu Ser Asp Asp Asp Val20(2)SEQ ID NO:4的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度60個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…60(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Asn Gln Pro Pro Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ser Thr Ala Cys Pro Gly1 5 10 15Asn Ala Tyr His Lys Gln Leu Ala Gly Leu Asn Cys Ser Val Arg Asp20 25 30Trp Ile Val Lys His Val Asn Thr Asn Pro Leu Cys Asp Leu Thr Pro35 40 45Ile Phe Lys Asp Tyr Glu Arg Tyr Leu Ala Thr Ile50 55 60(2)SEQ ID NO:5的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度60個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…60(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Asn Arg Ala Asp Gly Thr Gly Glu Ala Gln Val Asp Asn Ser Pro Thr1 5 10 15Thr Glu Ser Asn Ser Arg Leu Lys Ala Leu Asn Leu Gln Phe Lys Ala20 25 30Lys Val Asp Asp Leu Val Leu Gly Lys Pro Leu Ala Asp Leu Arg Pro35 40 45Leu Phe Thr Arg Tyr Glu Leu Tyr Ile Lys Asn Ile50 55 60(2)SEQ ID NO:6的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)
(B)位置1…51(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Ala Thr Ala Gly Met Glu Pro Pro Ser Leu Phe Gly Ser Thr Lys Leu1 5 10 15Gln Gln Glu Ser Pro Phe Ser Phe His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr20 25 30Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala Glu Lys Lys Ser Asp Ala Ala Gln35 40 45Gly Ala Thr50(2)SEQ ID NO:7的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…51(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Ala Asn Ser Ser Thr Ser Pro Ala Pro Ser Ile Pro Ser Thr Gly Phe1 5 10 15Lys Phe Ser Leu Pro Phe Glu Gln Lys Gly Ser Gln Thr Thr Thr Asn20 25 30Asp Ser Lys Glu Glu Ser Thr Thr Glu Ala Thr Gly Asn Glu Ser Gln35 40 45Asp Ala Thr50(2)SEQ ID NO:8的資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…34(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:His Gly Asn Lys Ala Glu Asp Thr Ser Glu Lys Val Glu Phe Thr Ala1 5 10 15Glu Lys Lys Ser Asp Ala Ala Gln Gly Ala Thr Ser Ala Ser Phe Ser20 25 30Phe Gly(2)SEQ ID NO:9的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…34(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Asn Gly Ser Glu Ser Lys Asp Ser Asp Lys Pro Ser Leu Pro Ser Ala1 5 10 15Val Asp Gly Glu Asn Asp Lys Lys Glu Ala Thr Lys Pro Ala Phe Ser20 25 30Phe Gly(2)SEQ ID NO:10的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…40(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Leu Gly Asn Ile Leu Leu Asn Val Leu Ile Ala Pro Asn Met Pro Cys1 5 10 15Thr Arg Thr Gly Lys Asn Asn Val Leu Ile Val Cys Val Pro Asn Pro20 25 30Pro Leu Asp Glu Lys Gln Pro Thr35 40(2)SEQ ID NO:11的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…40
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Met Gly Asn Val Leu Leu Asn Ala Thr Val Val Asp Ser Phe Lys Tyr1 5 10 15Glu Pro Leu Ala Pro Gly Asn Asp Asn Leu Ile Lys Ala Pro Thr Val20 25 30Ala Ala Asp Gly Lys Leu Val Thr35 40(2)SEQ ID NO:12的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度157個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…157(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Asp Ser His Ala Asp His Asp Thr Ser Thr Glu Asn Ala Asp Glu Ser1 5 10 15Thr Thr His Pro Gln Phe Glu Pro Ile Val Ser Val Pro Glu Gln Glu20 25 30Ile Lys Thr Leu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Leu Phe Lys Met Arg Ala35 40 45Lys Leu Phe Arg Phe Ala Ser Glu Asn Asp Leu Pro Glu Trp Lys Glu50 55 60Pro Arg His Gly Asp Val Lys Leu Leu Lys His Lys Glu Lys Gly Thr65 70 75 80Ile Arg Leu Leu Met Arg Arg Asp Lys Thr Leu Lys Ile Cys Ala Asn85 90 95His Tyr Ile Thr Pro Met Met Glu Leu Lys Pro Asn Ala Gly Ser Asp100 105 110Arg Ala Trp Val Trp Asn Thr His Thr Asp Phe Ala Asp Glu Cys Pro115 120 125Lys Pro Glu Leu Leu Ala Ile Arg Phe Leu Asn Ala Glu Asn Ala 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(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…24(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:TGAAGAATAG AGCCATAAAG AAAG 24(2)SEQ ID NO:24的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…21(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:24:AGAAAAGCGT CCTCCTCCAG A 21(2)SEQ ID N0:25的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…24(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:TGAAGAATAG AGCCATAAAG AAAG 24(2)SEQ ID NO:26的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:AGCGCCACTA ACCAAATCCA GA 22(2)SEQ ID NO:27的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)
(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:AGAAAGCAAA GCGCAGAAAT GT 22(2)SEQ ID NO:28的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:GAAAAGCGTC CTCCTCCAGA AG 22(2)SEQ ID NO:29的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:GAAAGCAAAG CGCAGAAATG TT 22(2)SEQ ID NO:30的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:CTCCAGCGCC ACTACCAAAT C 21(2)SEQ IDNO:31的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…20(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:CCCGCACGGA GCAGTTCAAG20(2)SEQ ID NO:32的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:GCAGCGGCAG ATCCCAAGGT AG 22(2)SEQ ID NO:33的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…17(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33:GGCATCCTTT TTCTCCA 17(2)SEQ ID NO:34的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…22(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:CGTTCTTATC GTCTCTGTGT TC 22(2)SEQ ID NO:35的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…19(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:GCATCCTTTT TCTCCAGTA 19(2)SEQ ID NO:36的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…18(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:TGTTCCAAAT CCACCAAT 18(2)SEQ ID NO:37的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…19(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:GTCTGCATCC TCGCTGGTT 19(2)SEQ ID NO:38的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子
(B)位置1…21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:CGTTCTTATC GTCTGTGTTC C 21(2)SEQ ID NO:39的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…18(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:TTTTACCCGA ATCAACAT 18(2)SEQ ID NO:40的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1…21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:GTACGCGAAC AGGGAAGAAT A 21(2)SEQ ID NO:41的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度212個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…212(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41:Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln1 5 10 15Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val20 25 30Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met35 40 45Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys50 55 60Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu65 70 75 80Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys85 90 95Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val100 105 110Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp115 120 125Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys130 135 140Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile145 150 155 160Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn165 170 175Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln180 185 190Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser Phe Arg Ala Asn Phe Leu Phe Met195 200 205Ile Phe Ile Lys210(2)SEQ ID NO:42的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度183個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…183(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42:Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn1 5 10 15Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys20 25 30His Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp35 40 45Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val50 55 60Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Cys Pro Pro65 70 75 80Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly85 90 95Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp100 105 110Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly115 120 125Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp130 135 140Ser Ser Ser Gln Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser145 150 155160Asp Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro165 170 175Gly Leu Arg Arg Gln Thr Arg180(2)SEQ ID NO:43的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度199個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…199(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43:
Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Pro Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln1 5 10 15Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val20 25 30Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met35 40 45Glu Glu Ala Ser Gln His Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Arg50 55 60Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu65 70 75 80Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys85 90 95Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val100 105 110Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp115 120 125Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys130 135 140Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile145 150 155 160Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn165 170 175Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Pro Arg Arg Gln180 185 190Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro195(2)SEQ ID NO:44的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度199個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…199(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:44:Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln1 5 10 15Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val20 25 30Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met35 40 45Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys50 55 60Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu65 70 75 80Pro Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys85 90 95Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Gly Gly Ser Arg Gln Ala Val100 105 110Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp115 120 125Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys130 135 140Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile145 150 155 160Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn165 170 175Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln180 185 190Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro195(2)SEQ ID NO:45的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度199個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…199(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45:Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala Arg Gln Ala1 5 10 15Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro Val Asn20 25 30His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp Met Glu35 40 45Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His Lys Pro50 55 60Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser Leu Pro65 70 75 80Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys Lys Val85 90 95Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala Val Pro100 105 110Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val Asp Gln115 120 125Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln Cys Pro130 135 140Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln Ile Lys145 150 155 160Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro Asn Ala165 170 175Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg Gln Thr180 185 190Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser195(2)SEQ ID NO:46的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度220個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…220(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:46:Asn Val Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met Asp Ala1 5 10 15Arg Gln Ala Asp His Pro Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly Pro20 25 30Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His Cys Arg Asp35 40 45Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe Gln Asn His50 55 60Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu Arg Gly Ser65 70 75 80Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys Ser Ala Cys85 90 95Lys Val Pro Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser Arg Gln Ala100 105 110Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg His Leu Val115 120 125Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu Ala Glu Gln130 135 140Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser Ser Ser Gln145 150 155 160Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp Gly Ser Pro165 170 175Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly Leu Arg Arg180 185 190Gln Thr Arg Val Asp Leu Gln Pro Ser Phe Arg Ala Asn Phe Leu Phe195 200 205Met Ile Phe Ile Ile Lys Val Ile Lys Lys Ile Ser210 215 220(2)SEQ ID NO:47的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度183個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…183(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:47:Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp Mis Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn1 5 10 15Leu Phe Gly Pro Val Asn His Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys20 25 30His Cys Gln Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp35 40 45Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val50 55 60Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro65 70 75 80Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly85 90 95Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp100 105 110Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly115 120 125Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp130 135 140Ser Ser Ser Gln Ile Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser145 150 155 160Asp Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro165 170 175Gly Leu Arg Arg Gln Thr Arg180(2)SEQ ID NO:48的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度138個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…138(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:48:Met Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn1 5 10 15Leu Phe Gly Pro Val Asn Mis Gly Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys20 25 30His Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp35 40 45Phe Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val50 55 60Glu Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Pro Arg Pro Pro65 70 75 80Lys Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly85 90 95Ser Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp100 105 110Arg His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Ser Gln Ala Gly115 120 125Leu Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys130 135(2)SEQ ID NO:49的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度197個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1…197(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:49:Met Ser Asn Val Arg Val Ser Asn Gly Ser Pro Ser Leu Glu Arg Met1 5 10 15Asp Ala Arg Gln Ala Asp His Pro Lys Pro Ser Ala Cys Arg Asn Leu20 25 30Phe Gly Pro Val Asn His Glu Glu Leu Thr Arg Asp Leu Glu Lys His35 40 45Cys Arg Asp Met Glu Glu Ala Ser Gln Arg Lys Trp Asn Phe Asp Phe50 55 60Gln Asn His Lys Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Gln Glu Val Glu65 70 75 80Arg Gly Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Tyr Arg Pro Pro Arg Pro Pro Lys85 90 95Ser Ala Cys Lys Val Leu Ala Gln Glu Ser Gln Asp Val Ser Gly Ser100 105 110Arg Gln Ala Val Pro Leu Ile Gly Ser Gln Ala Asn Ser Glu Asp Arg115 120 125His Leu Val Asp Gln Met Pro Asp Ser Ser Asp Asn Gln Ala Gly Leu130 135 140Ala Glu Gln Cys Pro Gly Met Arg Lys Arg Pro Ala Ala Glu Asp Ser145 150 155 160Ser Ser Gln Asn Lys Arg Ala Asn Arg Thr Glu Glu Asn Val Ser Asp165 170 175Gly Ser Pro Asn Ala Gly Thr Val Glu Gln Thr Pro Lys Lys Pro Gly180 185 190Leu Arg Arg Gln Thr19權(quán)利要求
1．抑制p27從而可解除由p27蛋白引起的對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用的蛋白質(zhì)。
2．權(quán)利要求1所要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有表6所示的P163氨基酸序列[SEQ ID NO:16]或其部分。
3．權(quán)利要求2所要求的蛋白質(zhì)，其中根據(jù)表6的編號(hào)，p163氨基酸序列的部分選自具有下列位置的氨基酸序列的肽1至24[SEQ IDNO:2],137至196[SEQ ID NO:4],215至265[SEQ ID NO:6],239至272[SEQ ID NO:8],399至438[SEQ ID NO:10]和307至469[SEQ IDNO:12]。
4．通過(guò)缺失功能域可衍生自權(quán)利要求2所要求的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，其中從表6的[SEQ ID NO:16]中缺失p27-結(jié)合域或Ran-結(jié)合域。
5．權(quán)利要求4所要求的蛋白質(zhì)，其中缺失了p27-結(jié)合域之后得到具有表8所示氨基酸序列[SEQ ID NO:18]的蛋白質(zhì)，缺失了Ran-結(jié)合域之后得到具有表9所示氨基酸序列[SEQ ID NO:19]的蛋白質(zhì)。
6．通過(guò)缺失除p27結(jié)合域區(qū)以外的所有氨基酸序列可衍生自權(quán)利要求2所要求的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
7．權(quán)利要求6所要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有表10所示氨基酸序列[SEQ ID NO:20]。
8．權(quán)利要求1至7中一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是得自另一哺乳動(dòng)物種或人的相應(yīng)同源性蛋白質(zhì)，或其相應(yīng)的部分。
9．權(quán)利要求8所要求的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有p163人同系物的氨基酸序列。
10．編碼權(quán)利要求1至9中一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)的DNA。
11．權(quán)利要求10所要求的DNA，該DNA(a)含有表3所示的核苷酸序列[SEQ ID NO:1]或其部分，(b)在嚴(yán)格條件下能與(a)所述序列雜交，或(c)遵照遺傳密碼的簡(jiǎn)并性與(a)所述序列相比有所變化，但仍編碼相同的氨基酸序列。
12．用作PCR引物的權(quán)利要求11所要求的DNA，其中這些PCR引物的核苷酸序列選自表12a的[SEQ ID NO:21]至[SEQ ID NO:30],表12b的[SEQ ID NO:31]和[SEQ ID NO:32],和表12c的[SEQ ID NO:33]至[SEQ ID NO:40]。
13．權(quán)利要求10或11所要求的DNA用于檢測(cè)和/或定量細(xì)胞和/或組織中的p163mRNA的用途。
14．權(quán)利要求13所要求的用途，其中通過(guò)Northern印跡實(shí)現(xiàn)檢測(cè)和/或定量。
15．權(quán)利要求13所要求的用途，其中利用PCR實(shí)現(xiàn)檢測(cè)和/或定量。
16．權(quán)利要求15所要求的用途，其中利用了權(quán)利要求12所要求的PCR引物。
17．權(quán)利要求13所要求的用途，其中通過(guò)熒光原位雜交實(shí)現(xiàn)檢測(cè)和/或定量。
18．權(quán)利要求1至9中一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)用于制備與所述蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的用途。
19．與權(quán)利要求1至9中一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)上的p27蛋白結(jié)合域結(jié)合的抗體和這些抗體的裂解產(chǎn)物。
20．與權(quán)利要求1至9中一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)上的Ran蛋白結(jié)合域結(jié)合的抗體和這些抗體的裂解產(chǎn)物。
21．權(quán)利要求19或20所要求的抗體用于檢測(cè)細(xì)胞、組織或體液中權(quán)利要求1或2中一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)的用途。
22．與權(quán)利要求10或11所要求DNA的組成區(qū)域互補(bǔ)的反義核酸，所述組成區(qū)域位于編碼氨基酸121至467的核苷酸區(qū)域內(nèi)。
23．權(quán)利要求22所要求的反義核酸，該反義核酸選自三鏈體DNA，合成的寡核苷酸，反義RNA和核酶。
24．權(quán)利要求22或23所要求的反義核酸抑制細(xì)胞增殖的用途，其中將細(xì)胞在體外或體內(nèi)與反義核酸接觸。
25．編碼權(quán)利要求22或23所要求的用于抑制細(xì)胞增殖的反義核酸的核酸構(gòu)建體，其中將編碼反義核酸序列的DNA與至少一種激活序列連接，并以插入非病毒載體或插入病毒載體的裸DNA的形式導(dǎo)入靶細(xì)胞中。
26．權(quán)利要求1至9中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)用于篩查所述蛋白質(zhì)和細(xì)胞結(jié)合配偶體之間相互作用的抑制劑的用途。
27．權(quán)利要求26所要求的用途，其中使用了雙雜合體系統(tǒng)。
28．權(quán)利要求26所要求的用途，其中使用了親和系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中p163或其p27結(jié)合域與固相結(jié)合，然后將所述固相與受試物質(zhì)一起保溫，最后利用權(quán)利要求1至9中一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)的標(biāo)記過(guò)的結(jié)合配偶體測(cè)定對(duì)結(jié)合配偶體與所述蛋白質(zhì)的結(jié)合的抑制作用。
29．權(quán)利要求28所要求的用途，其中結(jié)合配偶體選自p27和Ran。
30．權(quán)利要求3至9中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)作為權(quán)利要求1,2,8和9中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)的功能的抑制劑的用途。
31．權(quán)利要求19或20所要求的抗體作為權(quán)利要求1,2,8和9中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)的功能的抑制劑的用途。
32．核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有權(quán)利要求10或11所要求的DNA，所述DNA與能使權(quán)利要求1至9中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中被表達(dá)的激活序列有效連接。
33．權(quán)利要求32所要求的核酸構(gòu)建體用于刺激細(xì)胞增殖的用途。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及可抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)p27,因而可解除由p27引起的對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用的蛋白質(zhì),其突變體,一些這種突變體具有顯性干擾性狀,本申請(qǐng)還涉及編碼所述蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸以及所述蛋白質(zhì)和核酸預(yù)防和治療疾病的用途。本申請(qǐng)還公開了用于疾病的基因療法的核酸構(gòu)建體,所述構(gòu)建體含有上述核酸。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1225367SQ9812535
公開日1999年8月11日 申請(qǐng)日期1998年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月20日
發(fā)明者M·艾勒斯, A·布爾吉恩, H－H·塞德拉克 申請(qǐng)人:德國(guó)赫徹斯特馬里奧羅塞爾有限公司