專利名稱：：抗贅生物的可可提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及這樣一些可可提取物，它們是例如多酚，優(yōu)選的是富含原花青素(procyanidin)的多酚。本發(fā)明也涉及這些提取物的制備方法及應(yīng)用；它們被作為例如抗贅生物(antineoplastic)藥劑和抗氧化劑。本發(fā)明公開中所引用文獻(xiàn)的全部出處列在說明書末尾，權(quán)利要求之前的“參考文獻(xiàn)”部分。這些文獻(xiàn)屬于本發(fā)明領(lǐng)域并在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
：多酚是一類種類多得驚人的化合物(Ferreira等，1992)，廣泛存在于不同的植物中，其中一些進(jìn)入食物鏈。在某些情況下，它們代表人類飲食中重要的一類化合物。盡管人們認(rèn)為某些多酚是沒有營養(yǎng)的，但是由于它們可能對(duì)健康帶來益處，人們對(duì)這些化合物還是產(chǎn)生了興趣。例如，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中，槲皮苷(黃酮類化合物)顯示出抗致癌作用(Deshner等，1991和Kato等，1983)。(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素(3-黃烷醇類化合物)顯示出抑制白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性(Chu等，1992)。Nobotanin(一種寡聚可水解單寧)也具有抗腫瘤的活性(Okuda等，1992)。統(tǒng)計(jì)資料表明，日本產(chǎn)茶區(qū)的胃癌死亡率明顯較低。據(jù)報(bào)導(dǎo)，表?xiàng)攦翰杷貤斔猁}是綠茶中抑制小鼠皮膚瘤的藥物活性成分(Okuda等，1992)。鞣花酸對(duì)不同動(dòng)物腫瘤模型也具有抗致癌活性(Bukharta等，1992)。最后，原花色青素(proanthocyanidin)寡聚物由Kikkoman公司為我們申請(qǐng)了專利，用作抗誘變劑。其實(shí)，最近在第202屆美國化學(xué)學(xué)會(huì)國家會(huì)議上已提出了食物中的酚類化合物的范圍和它們對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中腫瘤發(fā)育的調(diào)節(jié)作用(Ho等，1992；Huang等，1992)。但是，這些報(bào)道沒有講述或建議可可提取物、任何一種制備該提取物的方法或可可提取物的任何一種作為抗贅生物藥劑的應(yīng)用。由于未發(fā)酵的可可豆含有豐富的多酚，所以本發(fā)明人考慮到通過從可可中提取化合物并篩選提取物的活性，可以找到可可提取物(例如可可中的化合物)的相似的活性和應(yīng)用。國家癌癥研究所從各種可可和Herrania中篩選抗癌活性物質(zhì)，作為他們的龐大的天然產(chǎn)品篩選計(jì)劃的一部分。據(jù)報(bào)導(dǎo)，可可組織的一些提取物活性低，于是工作沒有深入進(jìn)行。因此，在抗贅生物或抗癌領(lǐng)域，可可和它的提取物并不被認(rèn)為是有用的；也就是說，抗贅生物或抗癌領(lǐng)域的經(jīng)驗(yàn)使得該領(lǐng)域的技術(shù)人員沒有把可可和它的提取物用于癌癥治療。由于發(fā)展了一些用于研究可可多酚在味道形成中的作用的分析方法(Clapperton等，1992)，本發(fā)明人決定用相似的方法來制備用于抗癌篩選的樣品，而與抗贅生物或抗癌領(lǐng)域的知識(shí)不同。另人驚訝的是，與本領(lǐng)域的知識(shí)(例如國家癌癥研究所的篩選方法)不同，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)含有原花青素的可可多酚提取物明顯地具有抗癌或抗贅生物藥劑的作用。此外，本發(fā)明人證明含有原花青素的可可提取物可用作抗氧化劑。發(fā)明目的和發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是為制備可可提取物提供一種方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種可可提取物。本發(fā)明的另一目的是提供一種抗氧化劑組合物。本發(fā)明的另一目的是表明DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的酶活性的抑制。本發(fā)明的另一目的是為腫瘤或癌癥治療提供一種方法。本發(fā)明的另一目的是提供抗癌、抗腫瘤或抗贅生物的組合物。本發(fā)明的另一目的是提供制備抗癌、抗腫瘤或抗贅生物的組合物的方法。本發(fā)明的另一目的是提供用于腫瘤或癌癥治療的試劑盒。人們驚訝地發(fā)現(xiàn)可可提取物具有抗癌、抗腫瘤或抗贅生物活性；或者，它是一種抗氧化劑組合物，或它能抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的酶活性。因此本發(fā)明提供一種基本上純的可可提取物。該提取物優(yōu)選地含有多酚，例如富含可可原花青素的多酚，例如至少一種原花青素的多酚，其中原花青素選自(-)表兒茶素、原花青素B-2、原花青素寡聚物2-12優(yōu)選2-5或4-12、原花青素B-5、原花青素A-2和原花青素C-1。本發(fā)明也提供一種抗腫瘤、抗癌或抗贅生物組合物，或抗氧化劑或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑組合物，該組合物包含基本上純的可可提取物或合成的可可多酚(例如富含原花青素的多酚)和合適的載體。該提取物優(yōu)選地含有可可原花青素。優(yōu)選地通過如下方法得到可可提取物將可可豆變成粉末，將粉末脫脂，從粉末中提取活性化合物。本發(fā)明還涉及一種用于治療需要用抗癌、抗腫瘤或抗贅生物藥劑或抗氧化劑或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑治療的病人的方法，該方法包括給病人施用一種組合物，這種組合物包含有效量的基本上純的可可提取物或合成的可可多酚或原花青素和載體?？煽商崛∥锟梢允强煽稍ㄇ嗨?；優(yōu)選地通過將可可豆變成粉末，將粉末脫脂和從粉末中提取活性化合物而獲得。此外，本發(fā)明為需要用抗癌、抗腫瘤或抗贅生物藥劑或抗氧化劑或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑治療的病人提供了一種試劑盒，該試劑盒包含基本上純的可可提取物或合成的可可多酚或原花青素，以及用于與提取物或合成的多酚或原花青素混合的合適載體。這些目的以及其它目的及實(shí)施方案將在下面的發(fā)明詳述中公開或是顯而易見的。附圖簡述參照附圖可更好地理解下面的發(fā)明詳述圖1給出了可可原花青素粗提物體的典型凝膠滲透色譜；圖2A給出了顯示從未發(fā)酵可可中提取的可可原花青素的分離(洗脫曲線)的典型反相HPLC色譜；圖2B給出了顯示從未發(fā)酵可可中提取的可可原花青素的分離的典型正相HPLC色譜；圖3給出了幾個(gè)典型的原花青素的結(jié)構(gòu)；圖4A-4B給出了五個(gè)用于篩選抗癌或抗贅生物活性級(jí)分的典型HPLC色譜；圖5和6A-6D給出了可可提取物和癌細(xì)胞ACHN(圖5)以及PC-3(圖6A-6D)(存活率對(duì)劑量，μg/ml)；M&M2F4/92，M&MA+EU12P1，M&MB+EY192P1，M&MC+EU12P2，M&MD+EU12P2的劑量-反應(yīng)關(guān)系；圖7A-7H給出了可可原花青素級(jí)分A、B、C、D、E、A+B、A+E、A+D和PC-3細(xì)胞系(存活率對(duì)劑量，μg/ml)；MM-1A0212P3、MM-1B0162P1、MM-1C0122P3、MM-1D0122P3、MM-1E0292P8，MM-1A/B0292P6，MM-1A/E0292P6，MM-1A/D0292P6的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系；圖8A-8H給出了可可原花青素級(jí)分A、B、C、D、E、A+B、A+E、D+E和KB鼻咽/宮頸癌(Nasopharyngeal/HeLa)細(xì)胞系(存活率對(duì)劑量，μg/ml)；MM-1A092K3，MM-1B0212K5，MM-1C0162K3，MM-1D0212K5，MM-1E0292K5，MM-1A/B0292K3，MM-1B/E0292K4，MM-1D/E0292K5的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系；圖9A-9H給出了可可原花青素級(jí)分A、B、C、D、E、B+D、A+E、D+E和HCT-116細(xì)胞系(存活率對(duì)劑量，μg/ml)；MM-1C0192H5，D0192H5，E0192H5，MM-1B&D0262H2，A/E0262H3，MM-1D&E0262H1的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系；圖10A-10H給出了可可原花青素級(jí)分A、B、C、D、E、B+D、C+D、A+E和ACHN腎細(xì)胞系(存活率對(duì)劑量，μg/ml)；MM-1A092A5，MM-1B092A5，MM-1C0192A7，MM-1D0192A7，M&M1E0192A7，MM-1B&D0302A6，MM-1C&D0302A6，MM-1A&E0262A6的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系；圖11A-11H給出了可可原花青素級(jí)分A、B、C、D、E、A+E、B+E、C+E和A-549肺細(xì)胞系(存活率對(duì)劑量，μg/ml)；MM-1A019258，MM-1B09256，MM-1C019259，MM-1D019258，MM-1E019258，A/E026254，MM-1B&E030255，MM-1C&EN6255的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系；圖12A-12H給出了可可原花青素級(jí)分A、B、C、D、E、B+C、C+D、D+E和SK-5黑色素瘤細(xì)胞系(存活率對(duì)劑量，μg/ml)；MM-1A0212S4，MM-1B0212S4，MM-1C0212S4，MM-1D0212S4，MM-1EN32S1，MM-1B&CN32S2，MM-1C&DN32S3，MM-1D&EN32S3的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系；圖13A-13H給出了可可原花青素級(jí)分A、B、C、D、E、B+C、C+E、D+E和MCF-7乳腺細(xì)胞系(存活率對(duì)劑量，μg/ml)；MM-1AN22M4，MM-1BN22M4，MM-1CN22M4，MM-1DN22M3，MM-1E0302M2，MM-1B/C0302M4，MM-1C&EN22M3，MM-1D&EN22M3的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系；圖14給出了可可原花青素(特別是級(jí)分D)和CCRF-CEMT細(xì)胞白血病細(xì)胞系的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系(細(xì)胞/ml對(duì)生長天數(shù)；空心圓是對(duì)照，實(shí)心圓是125μg級(jí)分D，空心倒三角是250μg級(jí)分D，實(shí)心倒三角是500μg級(jí)分D)；圖15A給出了用XTT和結(jié)晶紫對(duì)經(jīng)級(jí)分D+E處置過的MCF-7p168乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性分析的比較結(jié)果(空心圓代表XTT，實(shí)心圓代表結(jié)晶紫)；圖15B給出了用從UIT-1可可屬型中獲得的不同水平的粗多酚處理MDAMB231乳腺細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)曲線(吸收值(540nm)對(duì)天數(shù)；空心圓是對(duì)照，實(shí)心圓是媒液，空心倒三角是250μg/ml，實(shí)心倒三角是100μg/ml，空心方塊是10μg/ml；酶標(biāo)板讀數(shù)器的最高值是2.0，也許不足以代表細(xì)胞數(shù))；圖15C給出了用從UIT-1可可屬型中獲得的不同水平的粗多酚處理PC-3前列腺癌細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)曲線(吸收值(540nm)對(duì)天數(shù)；空心圓是對(duì)照，實(shí)心圓是媒液，空心倒三角是250μg/ml，實(shí)心倒三角是100μg/ml，空心方塊是10μg/ml)；圖15D給出了用從UIT-1可可屬型中獲得的不同水平的粗多酚處理MCF-7p168乳腺癌細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)曲線(吸收值(540nm)對(duì)天數(shù)；空心圓是對(duì)照，實(shí)心圓是媒液，空心倒三角是250μg/ml，實(shí)心倒三角是100μg/ml，空心方塊是10μg/ml，實(shí)心方塊是1μg/ml；酶標(biāo)板讀數(shù)器的最高值是2.0，也許不足以代表細(xì)胞數(shù))；圖15E給出了用從UIT-1可可屬型中獲得的不同水平的粗多酚處理Hela宮頸癌細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)曲線(吸收值(540nm)對(duì)天數(shù)；空心圓是對(duì)照，實(shí)心圓是媒液，空心倒三角是250μg/ml，實(shí)心倒三角是100μg/ml，空心方塊是10μg/ml，酶標(biāo)板讀數(shù)器的最高值是2.0，也許不足以代表細(xì)胞數(shù))；圖15F給出了用不同的可可多酚級(jí)分處理Hela宮頸癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒效應(yīng)(吸收值(540nm)對(duì)天數(shù)；空心圓是100μg/ml的A-E，實(shí)心圓是100μg/ml的A-C，空心倒三角是100μg/ml的D&E；酶標(biāo)板讀數(shù)器的最高值是2.0，也許不足以代表細(xì)胞數(shù))；圖15G給出了用不同的可可多酚級(jí)分處理SKBR-3乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒效應(yīng)(吸收值(540nm)對(duì)天數(shù)；空心圓是A-E，實(shí)心圓是A-C，空心倒三角是D&E)；圖15H給出了可可原花青素級(jí)分D+E和Hela細(xì)胞的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系(吸收值(540nm)對(duì)天數(shù)；空心圓是對(duì)照，實(shí)心圓是100μg/ml，空心倒三角是75μg/ml，實(shí)心倒三角是50μg/ml，空心方塊是25μg/ml，實(shí)心方塊是10μg/ml；酶標(biāo)板讀數(shù)器的最高值是2.0，也許不足以代表細(xì)胞數(shù))；圖15I給出了可可原花青素級(jí)分D+E和SKBR-3細(xì)胞的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系(吸收值(540nm)對(duì)天數(shù)；空心圓是對(duì)照，實(shí)心圓是100μg/ml，空心倒三角是75μg/ml，實(shí)心倒三角是50μg/ml，空心方塊是25μg/ml，實(shí)心方塊是10μg/ml)；圖15J給出了用軟瓊脂克隆法分析可可原花青素級(jí)分D+E和Hela細(xì)胞的典型劑量-反應(yīng)關(guān)系(條狀圖；集落數(shù)目對(duì)對(duì)照、1、10、50、100μg/ml)；圖15K給出了當(dāng)用從八個(gè)不同可可屬型中獲得的粗多酚提取物處理Hela細(xì)胞時(shí)的生長抑制率(％百分?jǐn)?shù)對(duì)濃度，μg/ml；空心圓是C-1，實(shí)心圓是C-2，空心倒三角是C-3，實(shí)心倒三角是C-4，空心方塊是C-5，實(shí)心方塊是C-6，空心三角是C-7，實(shí)心三角是C-8；C-1＝UF-12園藝種類＝Criollo，說明是UF-12(巴西)可可多酚(去咖啡因的/去可可堿的)的粗提物；C-2＝NA-33園藝種類＝Forastero，說明是NA-33(巴西)可可多酚(去咖啡因的/去可可堿的)的粗提物；C-3＝EEG-48園藝種類＝Forastero，說明是EEG-48(巴西)可可多酚(去咖啡因的/去可可堿的)的粗提物；C-4＝未知園藝種類＝Forastero，說明是未知(西非)可可多酚(去咖啡因的/去可可堿的)的粗提物；C-5＝UF-613園藝種類＝Trinitario，說明是UF-613(巴西)可可多酚(去咖啡因的/去可可堿的)的粗提物；C-6＝ICS-100園藝種類＝Trinitario，說明是ICS-100(巴西)可可多酚(去咖啡因的/去可可堿的)的粗提物；C7＝ICS-139園藝種類＝Trinitario，說明是ICS-139(巴西)可可多酚(去咖啡因的/去可可堿的)的粗提物；C-8＝UIT-1園藝種類＝Trinitario，說明是UIT-1(馬來西亞)可可多酚(去咖啡因的/去可可堿的)的粗提物；圖15L給出了當(dāng)用從未發(fā)酵的可可豆和干可可豆中獲得的粗多酚提取物處理Hela細(xì)胞時(shí)的生長抑制率(干可可豆通過發(fā)酵和日照；％對(duì)照對(duì)濃度，μg/ml；空心圓代表第0天的級(jí)分，實(shí)心圓代表第一天時(shí)的級(jí)分，空倒三角代表第二天時(shí)的級(jí)分，實(shí)心倒三角代表第三天時(shí)的級(jí)分，空心方塊代表第四天時(shí)的級(jí)分，實(shí)心方塊代表第九天時(shí)的級(jí)分)；圖15M給出了經(jīng)酶氧化的可可花青素對(duì)Hela細(xì)胞的影響(對(duì)經(jīng)多酚氧化酶處理的粗可可多酚的劑量反應(yīng)；％對(duì)照對(duì)濃度，μg/ml；實(shí)心方塊代表粗UIT-1(含咖啡因和可可堿)，空心圓代表粗UIT-1(不含咖啡因和可可堿)，實(shí)心圓代表粗UIT-1(多酚氧化酶催化過的)；圖15N給出了可可原花青素復(fù)合級(jí)分D和E的典型半制備反相HPLC分離色譜；圖15O給出了可可多酚粗提物的典型半制備正相HPLC分離色譜；圖16給出了可可原花青素提取物及其餾分與合成的抗氧化劑BHA和BHT進(jìn)行比較時(shí)的Rancimat氧化曲線(任意單位對(duì)時(shí)間；虛線和十字線(+)代表BHA和BHT；*代表D-E；x代表粗提物；空心方塊代表A-C；空心菱形代表對(duì)照)；圖17給出的典型瓊脂糖凝膠電泳顯示了可可原花青素級(jí)分對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II催化動(dòng)核(kinetoplast)DNA解鏈的抑制作用(第一泳道含有0.5μg單體長度的動(dòng)核DNA環(huán)標(biāo)記物(M)；第2和20泳道含有在有4％DMSO但不含可可原花青素的條件下與拓?fù)洚悩?gòu)酶II共同培養(yǎng)的動(dòng)核DNA(對(duì)照-C)；第3和4泳道含有在含0.5和5.0μg/ml可可原花青素級(jí)分A的條件下與拓?fù)洚悩?gòu)酶II共同培養(yǎng)的動(dòng)核DNA；第5和6泳道含有在含0.5和5.0μg/ml可可原花青素級(jí)分B的條件下與拓?fù)洚悩?gòu)酶II共同培養(yǎng)的動(dòng)核DNA；第7、8、9、13、14和15是同樣在含0.05、0.5和5.0μg/ml可可原花青素級(jí)分D的條件下與拓?fù)洚悩?gòu)酶II共同培養(yǎng)的動(dòng)核DNA；第10、11、12、16、17和18是同樣在含0.05、0.5和5.0μg/ml可可原花青素級(jí)分E的條件下與拓?fù)洚悩?gòu)酶II共同培養(yǎng)的動(dòng)核DNA；第19泳道是同樣在含5.0μg/ml可可原花青素級(jí)分E的條件下與拓?fù)洚悩?gòu)酶II共同培養(yǎng)的動(dòng)核DNA)；圖18給出了可可原花青素級(jí)分D對(duì)感受態(tài)和缺陷型DNA修補(bǔ)細(xì)胞系的劑量反應(yīng)關(guān)系(殘存率對(duì)μg/ml；左邊xrs-6是缺陷型DNA修補(bǔ)細(xì)胞系MM-1DD282X1；右邊是感受態(tài)DNA修補(bǔ)細(xì)胞系MM-1DD282B1)；圖19給出了用可可級(jí)分D+E處理時(shí)阿霉素抗性細(xì)胞MCF-7與親本細(xì)胞系MCF-7p168進(jìn)行比較的劑量反應(yīng)曲線(％對(duì)照對(duì)濃度μg/ml；空心圓是MCF-7p168；實(shí)心圓是MCF-7ADR)；圖20給出了由正相半制備HPLC得到的12個(gè)級(jí)分在100μg/ml和25μg/ml水平對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)的劑量反應(yīng)關(guān)系(直條圖，％對(duì)照對(duì)對(duì)照和級(jí)分1-12)。發(fā)明詳述正如前面所論述的，人們驚奇地發(fā)現(xiàn)可可提取物具有抗癌、抗腫瘤或抗贅生物活性，抗氧化活性和抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性。該提取物的制備方法通常是把可可豆粉碎成粉末，對(duì)粉末進(jìn)行脫脂，然后從脫脂的粉末中提取活性化合物。粉末可以如下制備凍干可可豆和果肉，從可可豆和果肉中除去果肉，去除凍干的可可豆的殼，然后粉碎去殼后的豆?；钚曰衔锟捎萌軇┨崛〖夹g(shù)進(jìn)行提取?？蓱?yīng)用例如凝膠滲透色譜或用制備型高效液相色譜(HPLC)技術(shù)或綜合應(yīng)用這些技術(shù)對(duì)提取物進(jìn)行純化。不希望被任何具體理論所限制，已鑒定出提取物的活性成分是可可多酚，例如原花青素。這些可可多酚有顯著的抗癌、抗腫瘤或抗贅生物活性，抗氧化活性和抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性。可遵從藥學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)制備這些含有創(chuàng)新性可可多酚或原花青素的抗癌、抗腫瘤或抗贅生物或抗氧化劑或抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的組合物。應(yīng)用醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，考慮到年齡、性別、體重、具體病人的狀況和施用途徑等因素，可把這些組合物施用給需要這些組合物治療的病人。這些組合物可和其它的抗贅生物、抗腫瘤或抗癌藥劑或抗氧化劑或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制劑聯(lián)合施用或依次施用，和/或與減輕或消除這些藥劑的副作用的藥劑聯(lián)合施用或依次施用；此時(shí)同樣應(yīng)考慮到年齡、性別、體重、具體病人的狀況和施用途徑等因素。本發(fā)明的組合物的實(shí)例包括口服施用的固體組合物，例如膠囊、片劑、丸劑等，以及可咀嚼的固體制劑，因?yàn)楸景l(fā)明來源于食用品(例如，可可或巧克力味的固體物)，所以很適于咀嚼；用于口腔、鼻腔、肛門、陰道等孔竅的液體制劑，象懸液、糖漿或酏劑；以及胃腸外、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)施用的制劑(例如可注射施用)，例如滅菌的懸液或乳濁液。但是，也許組合物中的活性成分與蛋白質(zhì)復(fù)合，所以當(dāng)施用到血液中時(shí)可因血液蛋白的凝集而形成血塊；技術(shù)人員應(yīng)考慮到這些。在這樣的組合物中，活性可可提取物可與合適的載體、稀釋劑、賦形劑如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等混合應(yīng)用。本發(fā)明的活性可可提取物可以以凍干的形式提供，在等滲水溶液、鹽水緩沖液中重建。本發(fā)明還包括一種試劑盒，其中提供了活性可可提取物。試劑盒可包括容納了合適的載體、稀釋劑、賦形劑的單獨(dú)的容器。試劑盒還可包括與可可活性提取物聯(lián)合施用或依次施用的其他抗癌、抗腫瘤或抗贅生物藥劑、抗氧化劑或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制劑和/或減輕或消除這些藥劑的副作用的藥劑。附加的藥劑可在單獨(dú)的容器內(nèi)提供或與可可活性提取物混合。此外，試劑盒可包括混合或聯(lián)合施用成份的說明和/或施用說明。盡管本發(fā)明著眼于描述可可提取物(優(yōu)選含有可可原花青素的)，但有經(jīng)驗(yàn)的有機(jī)化學(xué)技術(shù)人員會(huì)從這些內(nèi)容意識(shí)到并想象出獲得這些活性化合物的合成途徑。因此，本發(fā)明包括合成的可可多酚或原花青素或它們的衍生物，包括葡萄糖苷、沒食子酸化物、酯等，但并不僅限于此。下面的非限制性實(shí)施例是僅以示例的方式給出的，并不能認(rèn)為是本發(fā)明的限制，在不違背本發(fā)明精神或范圍的條件下，可能存在許多表面上的變化方式。實(shí)施例實(shí)施例1可可來源和制備方法幾個(gè)Theobromacacao屬型是從世界的三個(gè)主要可可產(chǎn)地獲得的，它們代表了可可的三個(gè)公認(rèn)的園藝種類(Enriquez，1967；Engels，1981)。表1列出了本研究中所用的屬型。剝開收獲的可可豆莢取出帶果肉的豆用于凍干。從凍干的團(tuán)塊中手工除去果肉，豆被用于下面的分析。首先對(duì)未發(fā)酵的凍干的可可豆進(jìn)行手工去殼，用TEKMAR磨粉碎成細(xì)粉末，然后用重蒸的己烷作溶劑通過Soxhlet萃取進(jìn)行過夜脫脂。殘留的溶劑在環(huán)境溫度下用真空除去。表1Theobromacacao來源材料的描述實(shí)施例2原花青素的提取方法A方法1用Jalal和Collin所描述的方法(1977)的改進(jìn)方法，從實(shí)施例1的脫脂、未發(fā)酵、凍干的可可豆中提取原花青素。原花青素是從50克脫脂的可可中提取的，先用2×400ml70％的丙酮/去離子水，然后用400ml70％甲醇/去離子水。合并提取物，溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在45℃半真空的條件下蒸發(fā)掉。獲得的水相用1L的去離子水稀釋，用2×400mlCHCl3萃取，去掉溶劑相。然后用4×500ml的醋酸甲酯對(duì)水相進(jìn)行萃取，通過SorvallRC28S離心機(jī)，在10℃2000×g的條件下離心30分鐘破壞乳濁液，把100-200ml的去離子水加到混合的醋酸甲酯提取物中，溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在45℃半真空的條件下蒸發(fā)掉，獲得的水相部分在液氮中冷凍，然后在LABCONCO凍干系統(tǒng)中凍干。表2中列出了從不同的可可屬型中獲得的粗原花青素的量。表2粗提原花青素的量B方法2另外，可用70％的丙酮水溶液從實(shí)施例1的脫脂、未發(fā)酵、凍干的可可豆中提取原花青素。10克脫脂物和100ml溶劑調(diào)和5-10分鐘，將漿液在4℃3000×g的條件下離心15分鐘，上清過玻璃毛柱。濾液在半真空下蒸餾，所得水相在液氮中冷凍，然后在LABCONCO凍干系統(tǒng)中凍干。所得粗提原花青素的范圍為15-20％。不希望被任何具體理論所束縛，可以相信粗提物量的不同反應(yīng)了不同屬型、產(chǎn)地、園藝種類和制備方法的不同。實(shí)施例3可可原花青素的部分純化A凝膠滲透色譜用葡聚糖LH-20(28×2.5cm)液相色譜對(duì)實(shí)施例2中得到的原花青素進(jìn)行部分純化。分離通過從去離子水到甲醇的梯度進(jìn)行。最初的梯度液從溶于去離子水的15％甲醇開始，然后每30分鐘用溶于去離子水的25％甲醇、溶于去離子水的35％甲醇、溶于去離子水的70％甲醇、最后用100％的甲醇。收集黃嘌呤、生物堿(咖啡因和可可堿)的洗提物作為單一級(jí)分，從該級(jí)分中分離出無黃嘌呤生物堿的細(xì)級(jí)分，該細(xì)級(jí)分進(jìn)一步分離得到五個(gè)細(xì)級(jí)分，標(biāo)記為MM2A-MM2E。每一細(xì)級(jí)分中的溶劑被旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在45℃半真空的條件下蒸發(fā)掉，獲得的水相部分在液氮中冷凍，然后在LABCONCO凍干系統(tǒng)中過夜進(jìn)行凍干。圖1給出了級(jí)分的典型凝膠滲透色譜。用這種方法大致細(xì)分離了100mg物質(zhì)。圖1粗提原花青素在葡聚糖LH-20的凝膠滲透色譜色譜條件柱28×2.5cm葡聚糖LH-20；流動(dòng)相甲醇/水，梯度15∶85，25∶75，35∶65，70∶30，100∶0，每隔半小時(shí)一步；流速1.5ml/min檢出UV@λ1＝254nm，λ2＝365nm；記錄速度0.5mm/ml；柱載1120mg。B.半制備高效液相色譜(HPLC)方法1反相分離從實(shí)施例2和/或3A中獲得的原花青素通過半制備HPLC進(jìn)行部分分離?；萜?HewlettPackard)1050HPLC系統(tǒng)裝有不同波長的檢測器，帶有1ml注射環(huán)的Rheodyne7010注射閥和PharmaciaFRAC-100收集器裝配在一起。在聯(lián)有Phenomenex10μODSUltracarb保護(hù)柱(60×10mm)的PhenomenexUltracarb10μODS柱(250×22.5mm)上進(jìn)行分離。流動(dòng)相的組合物是A＝水；B＝甲醇，應(yīng)用以下線性梯度[時(shí)間，％A]；(0，85)，(60，50)，(90，0)，(110，0)，流速為5ml/min。圖15N給出了從級(jí)分D+E中分離原花青素的典型半制備HPLC的跡線。每隔一定的時(shí)間或手控收集單個(gè)峰或所選色譜區(qū)域的級(jí)分，進(jìn)行進(jìn)一步提純和定性。注射負(fù)載范圍是25-100mg。方法2正相分離從實(shí)施例2和/或3A中獲得的原花青素通過半制備HPLC進(jìn)行部分分離?；萜?050HPLC系統(tǒng)，設(shè)置在254nm的480型微孔-水LC檢測器與設(shè)置在峰值的PharmaciaFrac-100收集器裝配在一起。在聯(lián)有Supelco5μLC-Si保護(hù)柱(20×4.6mm)的Supelco5μSupelcosilLC-Si柱(250×10mm)上進(jìn)行分離。按下列條件用線性梯度洗脫液進(jìn)行洗脫(時(shí)間，％A，％B)；(0，82，14)，(30，67.6，28.4)，(60，46，50)，(65，10，86)，(70k，10，86)，隨后進(jìn)行重新平衡10分鐘。流動(dòng)相的組合物是A＝二氯甲烷；B＝甲醇∶C＝醋酸∶水(1∶1)，流速為3ml/min。用波長為254nm的紫外檢測，在Kipp@ZonanBD41記錄器上記錄。注射體積范圍是10mg的原花青素100-250μl，該提取物溶于0.25ml70％的丙酮水溶液中。圖15O給出了其典型半制備HPLC跡線。每隔一定的時(shí)間或手控收集單個(gè)峰或所選色譜區(qū)域的級(jí)分，進(jìn)行進(jìn)一步提純和定性。HPLC條件250×10mmSupelcoSupelcosilLC-Si(5μm)半制備柱20×4.6SupelcoSupelcosilLC-Si(5μm)保護(hù)柱檢測器Waters480型LC分光光度計(jì)，波長254nm流速3毫升/分柱溫環(huán)境溫度進(jìn)樣70％丙酮水溶液提取物250μl。<p>獲得的級(jí)分如下<>實(shí)施例4分析HPLC對(duì)原花青素提取物的分析方法1反相分離從實(shí)施例3得到的原花青素提取物通過0.45μ的濾器進(jìn)行過濾，用惠普1090三元(ternary)HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析，該系統(tǒng)配有二極管陣列檢測器和1046A型HP程序熒光檢測器。用惠普5μHypersilODS柱在45℃進(jìn)行分離。黃酚和原花青素用60％B-A的線性梯度洗脫液進(jìn)行洗脫，用B以0.3ml/min的流速洗柱。流動(dòng)相的組合物是B＝用甲醇配置的0.5％醋酸，A＝用去離子水配置的0.5％醋酸。A、B流動(dòng)相中的醋酸可增到2％。級(jí)分用熒光檢測，λex＝276nm、λem＝316nm?？蓞⒄諛?biāo)準(zhǔn)溶液確定(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素的濃度。根據(jù)(-)-表兒茶素的反應(yīng)指數(shù)估計(jì)原花青素的水平。圖2A給出了一種可可屬型不同級(jí)分分離時(shí)的典型HPLC色譜。從其它的可可屬型中也可得到相似的HPLC曲線。HPLC條件柱200×2.1mm惠普HypersilODS(5μ)保護(hù)柱20×2.1mm惠普HypersilODS(5μ)檢測器二極陣列管280nm熒光λex＝276nm、λem＝316nm流速0.3ml/min柱溫45℃方法2正相分離從實(shí)施例2和/或3得到的原花青素提取物通過0.45μ的濾器進(jìn)行過濾，用惠普1090IIHPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析，該系統(tǒng)配有二極管陣列檢測器和1046A型HP程序熒光檢測器。在聯(lián)有SupelcoSupelguardLC-Si5μ保護(hù)柱(20×4.6mm)的5μPhenomenxLichrosphereSilica100LC-Si柱(250×3.2mm)上，37℃時(shí)進(jìn)行分離。按下列條件用線性梯度洗脫液進(jìn)行洗脫(時(shí)間，％A，％B)；(0，82，14)，(30，67.6，28.4)，(60，46，50)，(65，10，86)，(70k，10，86)，隨后進(jìn)行重新平衡8分鐘。流動(dòng)相的組合物是A＝二氯甲烷；B＝甲醇∶C＝醋酸∶水(1∶1)，流速為0.5ml/min。級(jí)分用熒光檢測，λex＝276nm、λem＝316nm或用紫外在280nm檢測。圖2B給出了一種可可屬型不同原花青素分離時(shí)的典型HPLC色譜。從其它的可可屬型中也可得到相似的HPLC曲線。HPLC條件250×3.2mmPhenomenexLichrosphereSilica100柱(5μ)20×4.6mmSupelcoSupelguardLC-Si(5μ)保護(hù)柱檢測器二極陣列管280nm熒光λex＝276nm、λem＝316nm流速0.5ml/min柱溫37℃實(shí)施例5原花青素的鑒定原花青素用交聯(lián)葡聚糖LH-20(28×2.5cm)液相色譜進(jìn)行純化，隨后用10μBondapakC18(100×8mm)柱半制備HPLC或5μSupelcosilLC-Si(250×10mm)柱半制備HPLC進(jìn)行純化。特殊純化的分離物用快速原子撞擊-質(zhì)譜法(FAB-MS)，在VGZAB-T高分辨MS系統(tǒng)中進(jìn)行分析，該系統(tǒng)在陰陽離子態(tài)應(yīng)用了液態(tài)二次離子質(zhì)譜技術(shù)。用銫離子槍在30KV作電離源，“魔力子彈基質(zhì)”(1∶1二硫蘇糖醇/二赤蘚糖醇)當(dāng)作質(zhì)子源。用LSIMS對(duì)這些級(jí)分所進(jìn)行的分析研究揭示出存在一些黃烷-3-酚寡聚物，如表3所示。表3主要的質(zhì)子碎片離子與以前用陰陽離子FAB-MS對(duì)原花青素所作的分析結(jié)果一致(Self等，1986和Porter等，1991)。與m/z577(M+H)+相對(duì)應(yīng)的離子和它在m/z599(M+Na)+的鹽加成物說明在物中有雙環(huán)原花青素二聚體存在。有趣的是與其說更高的寡聚物組成質(zhì)子化了的分子離子(M+H)+不如說它組成鹽加成物(M+Na)+。在Revila等(1991)，Self等(1986)和Porter等(1991)工作的基礎(chǔ)上，對(duì)原花青素的異構(gòu)體B-2，B-5和C-1進(jìn)行了嘗試性的鑒定。通過FAB-MS確定了，在特殊純化級(jí)分中的原花青素達(dá)到八聚體和十聚體。此外，在HPLC正相色譜分析中得到原花青素達(dá)到十聚體的證據(jù)(圖2B)。不希望被任何特殊理論所限制可以相信十聚體達(dá)到在萃取和純化應(yīng)用的溶劑中溶解度的極限。表4列出了在不含有黃嘌呤生物堿的分離物中發(fā)現(xiàn)的原花青素的相對(duì)濃度，這是在反相HPLC分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。表4不含有黃嘌呤生物堿的分離物中原花青素的相對(duì)濃度</tables>表5丙酮水溶液提取物中原花青素的相對(duì)濃度</tables>圖3給出了原花青素的幾個(gè)結(jié)構(gòu)，圖4A-4E給出了用于下面抗癌或抗腫瘤活性篩選的五個(gè)級(jí)分的典型HPLC色譜。以下是圖4A-4B的HPLC條件HPLC條件惠普1090三元HPLC系統(tǒng)，配有1064A型HP可編程熒光檢測器。柱惠普5μHypersilODS(200×2.1mm)線性梯度60％B-A，流速0.3ml/min。B＝甲醇配制的0.5％醋酸；A＝去離子水配制的醋酸；λex＝276nm、λem＝316nm。圖15O給出了用于抗癌或抗腫瘤活性篩選的12個(gè)額外級(jí)分的典型半制備HPLC色譜(色譜條件如上述)。實(shí)施例6可可提取物(原花青素)的抗癌、抗腫瘤或抗贅生物活性用最初由Mosmann(1983)建立的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2基)-2，5-二苯基四唑溴化物)-微滴定板四唑細(xì)胞毒測定方法來篩選從實(shí)施例5獲得的試樣。試樣、標(biāo)準(zhǔn)品(二氨二氯絡(luò)鉑和苯丁酸氮介)和MTT試劑溶于100％的DMSO(二甲基亞砜)，配成10mg/ml的濃度。從原液配成系列的稀釋液。對(duì)于試樣，稀釋范圍為0.01-100μg/ml，用0.5％的DMSO配制。所有的人類腫瘤細(xì)胞從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得。細(xì)胞在含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和240u/ml制霉菌素的α-MEM培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)。細(xì)胞在37℃、加濕的、5％CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞用胰酶消化后，計(jì)數(shù)并調(diào)細(xì)胞濃度為50×105/ml(依細(xì)胞系不同而異)。把細(xì)胞懸液加到96孔板，4排，200μl/孔。細(xì)胞貼壁4小時(shí)后，加含有試樣的DMSO2μl，每4個(gè)復(fù)孔。初始的劑量-反應(yīng)尋找試驗(yàn)，利用試樣稀釋度的順序來確定被檢測劑量的范圍。用BIORADMP450酶標(biāo)板讀數(shù)器讀出540nm時(shí)每孔的吸收值。試樣作用的四個(gè)復(fù)孔的平均值與對(duì)照相比，結(jié)果表示為對(duì)照吸收值的百分率+/-標(biāo)準(zhǔn)差。MTT生成甲贊紫量的減少與每孔活性細(xì)胞的數(shù)量呈線性關(guān)系。因此，通過測定減少的產(chǎn)物的吸收值可獲得一定劑量的試樣作用時(shí)細(xì)胞殘存的數(shù)量百分比。對(duì)照孔含有終濃度為1％的DMSO。用這種方法首先對(duì)兩種試樣進(jìn)行了檢測。試樣MM1代表可可原花青素相當(dāng)粗的分離物，含有大量的咖啡因和生物堿。試樣MM2經(jīng)凝膠滲透色譜部分純化了的可可原花青素分離物。兩種試樣都用前面描述的方法篩選對(duì)下列癌細(xì)胞系的活性HCT116結(jié)腸癌ACFHN腎上腺癌SK-5黑色素瘤A498腎上腺癌MCF-7乳腺癌PC-3前列腺癌CAPAN-2胰腺癌發(fā)現(xiàn)MM1對(duì)用于研究的癌細(xì)胞系沒有活性或活性很小。發(fā)現(xiàn)MM2對(duì)HCT-116、PC-3和ACHN癌細(xì)胞系有作用。但是，發(fā)現(xiàn)MM1和MM2都干擾MTT，結(jié)果阻礙了吸收值的下降，本來這可以反映細(xì)胞存活數(shù)目的下降。這種干擾也可導(dǎo)致大量的錯(cuò)誤吸收，因?yàn)檫@種化學(xué)反應(yīng)好象在板孔四周進(jìn)行的更快一些。圖5是這種效應(yīng)的典型例子。原本預(yù)料，試驗(yàn)物質(zhì)在高濃度時(shí)可觀測到的細(xì)胞存活要大大低于顯示出的高存活性。但是，不管MTT的干擾效應(yīng)，顯微鏡檢測可證明發(fā)生細(xì)胞毒效應(yīng)。例如，用這種方法可以得到MM2作用于ACHN細(xì)胞系時(shí)0.5μg/ml的IC50值。根據(jù)這些初步結(jié)果，發(fā)明人認(rèn)為應(yīng)該對(duì)測定方案作一些修整，以排除MTT的干擾。這按以下方案完成在37℃、加濕了的、5％CO2條件下培養(yǎng)18小時(shí)以后，小心地從板中吸出培養(yǎng)液，補(bǔ)充新鮮的α-MEM培養(yǎng)液，第三天又從板中吸去培養(yǎng)液，補(bǔ)充100μl新鮮的制備好了的McCoy’s培養(yǎng)基。然后每孔加11μl用PBS(磷酸鹽緩沖液)配制的5mg/mlMTT原液。在37℃、加濕了的、5％CO2條件下培養(yǎng)4小時(shí)以后，每孔加0.04N鹽酸異丙醇，然后充分?jǐn)嚢枰匀芙庥苫罴?xì)胞產(chǎn)生的甲簪。此外，決定對(duì)原花青素進(jìn)行細(xì)分離，以確定具有反應(yīng)活性的特殊成分。應(yīng)用前面描述的細(xì)分餾過程制備樣品以進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。圖1給出了代表這一部分的五個(gè)級(jí)分，圖4A-4E給出了組分的分布。試樣編碼為MM2A-MM2E以反映它們的分析特性和顯示不含有咖啡因和生物堿。每個(gè)級(jí)分都單獨(dú)對(duì)HCT-116、PC-3和ACHN癌細(xì)胞系進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示活性與任何一個(gè)單體成分都無關(guān)。因?yàn)榛钚蕴烊划a(chǎn)品分離物中的級(jí)分可協(xié)同作用，所以這種結(jié)果并不認(rèn)為不平常。在可可原花青素的分離物(MM2)中有12多種可檢測的級(jí)分。可以認(rèn)為活性與存在于不同級(jí)分中的級(jí)分聯(lián)合作用相關(guān)，而不是與單體成分相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，合并級(jí)分，重復(fù)對(duì)同一癌細(xì)胞的分析。有幾個(gè)聯(lián)合成分對(duì)PC-3癌細(xì)胞系產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)。尤其是得到MM2A和MM2E各40μg/ml進(jìn)行合并時(shí)的IC50值，和MM2C與MM2E各20μg/ml進(jìn)行合并時(shí)的IC50值。對(duì)HCT-116和ACHN細(xì)胞系也報(bào)導(dǎo)有活性，但是，和前面一樣，由于受到MTT指示劑的干擾，阻礙了精確的研究。為了增加數(shù)據(jù)，對(duì)HCT-116和ACHN細(xì)胞系重復(fù)了同樣的試驗(yàn)，但是，由于細(xì)菌污染及用完了試樣，沒有得到結(jié)果。圖6A-6D可可提取物的聯(lián)合物與PC-3癌細(xì)胞的劑量-反應(yīng)關(guān)系。不過，從這些數(shù)據(jù)可清楚的看到，可可提取物尤其是可可多酚或原花青素有明顯的抗腫瘤、抗癌或抗贅生物作用，尤其對(duì)于人類PC-3(前列腺)、HCT-116(結(jié)腸)和ACHN(腎)癌細(xì)胞系。此外，這些結(jié)果提示特異的原花青素級(jí)分或許是對(duì)抗PC-3細(xì)胞系的活性成分。實(shí)施例7可可提取物(原花青素)的抗癌、抗腫瘤或抗贅生物活性為了證明上述結(jié)果及進(jìn)一步探討級(jí)分組合物，進(jìn)行了另外的綜合性篩選。除每一實(shí)驗(yàn)劑量由通常4個(gè)復(fù)孔增至8或12個(gè)復(fù)孔之外，所有制備的物質(zhì)和過程與前面報(bào)導(dǎo)的一致。這次研究中，五個(gè)可可原花青素級(jí)分單獨(dú)或聯(lián)合使用，對(duì)下列癌細(xì)胞系的對(duì)抗作用進(jìn)行了篩選。PC-3前列腺KB鼻咽/宮頸癌HCT-116結(jié)腸ACHN腎MCF-7乳腺SK-5黑色素瘤A-549肺CCRF-CEMT-細(xì)胞白血病單獨(dú)篩選包括分析級(jí)分A、B、C、D、E(見圖4A-4E及其討論，同上)對(duì)抗每一細(xì)胞系的不同劑量水平。聯(lián)合篩選包括結(jié)合的等劑量水平的級(jí)分A+B，A+C，A+D，A+E，B+C，B+D，B+E，C+D，C+E和D+E對(duì)抗每一細(xì)胞系。對(duì)這些測定結(jié)果單獨(dú)進(jìn)行討論，隨后進(jìn)行全面的總結(jié)。A.PC-3前列腺細(xì)胞系圖7A-7H給出了可可原花青素級(jí)分和PC-3細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)關(guān)系。圖7D-7E證明級(jí)分D和E在75μg/ml的IC50值下具有活性。當(dāng)級(jí)分D和E存在時(shí)，從其它原花青素級(jí)分聯(lián)合應(yīng)用得到的劑量反應(yīng)曲線上得到的IC50值的范圍為60-80μg/ml。表6列出了單獨(dú)的IC50值。B.KB鼻咽/宮頸癌細(xì)胞系圖8A-8H給出了可可原花青素級(jí)分和KB鼻咽/宮頸癌細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)關(guān)系。圖8D-8E證明級(jí)分D和E在75μg/ml的IC50值下具有活性。圖8F-8H描記了聯(lián)合研究時(shí)獲得的典型結(jié)果。在此過程中，原花青素A+B的聯(lián)合無效，而B+E和D+E在60μg/ml的IC50值下有效。當(dāng)級(jí)分D和E存在時(shí)，從其它級(jí)分聯(lián)合應(yīng)用得到的劑量反應(yīng)曲線上得到的IC50值的范圍為60-80μg/ml。表6列出了單獨(dú)的IC50值。這些結(jié)果基本上與對(duì)抗PC-3細(xì)胞系時(shí)的一致。C.HCT-116結(jié)腸細(xì)胞系圖9A-9H給出了可可原花青素級(jí)分和HCT-116結(jié)腸細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)關(guān)系。圖9D-9E證明級(jí)分E在接近400μg/ml的IC50值具有活性。該值是通過存在的曲線進(jìn)行推測而得到的。應(yīng)注意到級(jí)分D劑量反應(yīng)曲線的斜度也顯示出活性。但是，由于曲線坡度太緩以致于從圖上確定不出IC50值。圖9F-9H描記了聯(lián)合研究時(shí)獲得的典型結(jié)果。在此過程中，原花青素B+D的聯(lián)合無顯效，而A+E和D+E在500μg/ml和85μg/ml的IC50值有效。當(dāng)E存在時(shí)，從其它級(jí)分聯(lián)合應(yīng)用得到的劑量反應(yīng)曲線上得到的IC50值平均在250μg/ml。表6列出了推測的IC50值。D.ACHN腎細(xì)胞系圖10A-10H給出了可可原花青素級(jí)分和ACHN腎細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)關(guān)系。圖10A-10E說明對(duì)這一細(xì)胞系單獨(dú)級(jí)分無效。圖10F-10H描記了聯(lián)合研究時(shí)獲得的典型結(jié)果。在此過程中，原花青素B+C的聯(lián)合無顯效，而A+E在接近500μg/ml的IC50值有效。因?yàn)榍€的坡度太緩，所以認(rèn)為與C+D聯(lián)合應(yīng)用得到的劑量反應(yīng)曲線相似地?zé)o效。表6列出了其它級(jí)分聯(lián)合應(yīng)用時(shí)推測的IC50值。E.A-549肺細(xì)胞系圖11A-11H給出了可可原花青素級(jí)分和A-549肺細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)關(guān)系。在本測定中所應(yīng)用的劑量范圍內(nèi)，沒檢測到任何有活性的單體級(jí)分或組合級(jí)分。但是原花青素也許尤對(duì)這一細(xì)胞系有效。F.SK-5黑色素瘤細(xì)胞系圖12A-12H給出了可可原花青素級(jí)分和SK-5黑色素瘤細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)關(guān)系。在本測定中所應(yīng)用的劑量范圍內(nèi)，沒檢測到任何有活性的單體級(jí)分或組合級(jí)分。但是原花青素也許對(duì)這一細(xì)胞系有效。G.MCF-7乳腺細(xì)胞系圖13A-13H給出了可可原花青素級(jí)分和MCF-7乳腺細(xì)胞系的典型劑量反應(yīng)關(guān)系。在本測定中所應(yīng)用的劑量范圍內(nèi)，沒檢測到任何有活性的單體級(jí)分或組合級(jí)分。但是原花青素也許對(duì)這一細(xì)胞系有效。H.CCRF-CEMT-細(xì)胞白血病系本來由對(duì)抗CCRF-CEMT-細(xì)胞白血病系得到的典型劑量反應(yīng)曲線，但是，不同濃度時(shí)顯微鏡下的細(xì)胞數(shù)對(duì)時(shí)間顯示出，經(jīng)過4天，500μg的A、B和D能引起80％的生長下降。圖14給出了典型的劑量反應(yīng)關(guān)系。I小結(jié)除CCRF-CEMT-細(xì)胞白血病外，用這些分析方法得到的所有細(xì)胞系的IC50值均收集在表6中，由于應(yīng)用了不同的分析方法，所以計(jì)劃從表中刪除T-細(xì)胞白血病的數(shù)據(jù)。大致而言，這些結(jié)果說明活性最高的部分與級(jí)分D和E有關(guān)。這些級(jí)分對(duì)PC-3(前列腺)和KB(鼻咽/宮頸癌)細(xì)胞系的活性最高。也證明這些級(jí)分對(duì)HCT-116(結(jié)腸)和ACHN(腎)有效，但是僅僅在非常高的劑量時(shí)，對(duì)MCF-7(乳腺)、SK-5(黑色素瘤)、和A-549(肺)細(xì)胞系無效。但是，原花青素級(jí)分也許仍對(duì)這些細(xì)胞系有作用。對(duì)CCRF-CEM(T-細(xì)胞白血病)細(xì)胞系也顯示出活性。同樣也應(yīng)該指出的是D和E在組合上是最復(fù)雜的。然而，從這些數(shù)據(jù)可清楚的看到，可可提取物尤其是可可原花青素有明顯的抗腫瘤、抗癌或抗贅生物作用。表6可可原花青素級(jí)分對(duì)不同細(xì)胞系的IC50值(在μg/ml的IC50值)超過100μg/ml的值通過劑量反應(yīng)曲線進(jìn)行推測實(shí)施例8可可提取物(原花青素)的抗癌、抗腫瘤或抗贅生物活性應(yīng)用幾個(gè)附加的體外分析方法對(duì)例6和7中的結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充和擴(kuò)充。方法A結(jié)晶紫染色方法所有的人類腫瘤細(xì)胞均來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞在含有10％胎牛血清無抗菌素的IMEM中，以單層細(xì)胞生長，在加濕的、5％CO2、37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。胰酶消化后，計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為1000-2000/100μl。鋪細(xì)胞到96孔板(1000-2000細(xì)胞/孔)測定細(xì)胞增殖。每孔加100μl的細(xì)胞后，貼壁24小時(shí)，24小時(shí)結(jié)束之前，加入不同濃度的不同可可提取物，以獲取劑量反應(yīng)結(jié)果。用培養(yǎng)液把可可提取物配成2倍濃度，每種溶液加100μl，每三個(gè)復(fù)孔。連續(xù)幾天以后，用50μl結(jié)晶紫染色，作用15分鐘(2.5克結(jié)晶紫溶于125ml甲醇，375ml水中)，然后移去染劑，把板輕輕浸入冷水中以除去過剩的染劑。這樣重復(fù)洗滌2次，把板晾干。每孔加入100ml的0.1M檸檬酸鹽/50％甲醇100μl，以溶解殘留的染料。溶解以后，用ELISA酶標(biāo)儀在540nm處(410nm作為參照)對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量。以Y軸為吸收值，X軸為生長天數(shù)，把從ELISA酶標(biāo)儀獲得的結(jié)果制圖。方法B軟瓊脂克隆測定法參照Nawata等(1981)的方法，在軟瓊脂上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行克隆。在含有0.8％軟瓊脂和不同濃度可可成分的培養(yǎng)基中制備單個(gè)細(xì)胞懸液，懸液等分到覆蓋到0.1％瓊脂的35mm平皿中，培養(yǎng)10天后，在Ominicron3600成象分析系統(tǒng)上檢測直徑大于60μm的集落數(shù)，以集落數(shù)為Y軸，可可成分的不同濃度為X軸，對(duì)結(jié)果制圖。方法CXTT--微型培養(yǎng)四唑測定法用Scudiero等(1988)所描述的XTT測定法來篩選各種可可成分。除了下面的調(diào)整以外，這種方法基本上與MTT的過程一樣。XTT(2，3-二(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-((苯基氨基)羰基)-2H-四唑氫氧化物)在不含血清，預(yù)熱到37℃的培養(yǎng)基中配制，濃度為1mg/ml。PMS在5mMPBS中配制。XTT與PMS混合，10μLPBS/mlXTT，每孔加50μLPMS-XTT。在37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，在機(jī)械振蕩器上混合30分鐘，然后，在450-600nm處測定吸收值。所得結(jié)果以吸收值為Y軸，生長天數(shù)或濃度為X軸，制成圖表。方法A和方法C中，所得結(jié)果均以百分率對(duì)照為Y軸，生長天數(shù)或濃度為X軸進(jìn)行制圖，制成圖表。用可可級(jí)分D&E(實(shí)施例3B)對(duì)抗乳腺癌細(xì)胞系MCF-TP168的實(shí)驗(yàn)對(duì)XTT和結(jié)晶紫兩種方法進(jìn)行了比較，以找到最敏感的方法。如圖15A所示，在濃度275μg/μL時(shí)，兩種方法顯示出同樣的劑量反應(yīng)關(guān)系。在濃度低于此值時(shí)，結(jié)晶紫測定方法的標(biāo)準(zhǔn)差高于XTT測定法。但是，由于結(jié)晶紫測定方法易于應(yīng)用，所以，除個(gè)別特殊的外，以后的測定方法均用此法。給出的結(jié)晶紫測定結(jié)果(圖15B-15E)證明了多酚粗提物(實(shí)施例2)分別對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDAMB231，前列腺癌細(xì)胞系PC-3，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7p168，宮頸癌細(xì)胞系Hela有效。在所有的情況下250μg/ml的劑量可完全抑制經(jīng)過5-7天培養(yǎng)的所有癌細(xì)胞的生長。因?yàn)?00μg/ml時(shí)已經(jīng)抑制了Hela細(xì)胞的生長，所以Hela細(xì)胞系對(duì)提取物似乎更敏感。對(duì)實(shí)施例3B中得到的可可級(jí)分對(duì)Hela和另外一個(gè)乳腺癌細(xì)胞系SKBR_3的活性也進(jìn)行了檢測。結(jié)果(圖15F和15G)顯示D&E級(jí)分活性最高。如圖15H和15I所示，從兩種癌細(xì)胞系均獲得D&E40μg/ml時(shí)的IC50值。也用軟瓊脂克隆測定法的對(duì)D&E級(jí)分進(jìn)行了檢測，以確定受試化合物錨基(anchorage)非依賴生長的能力。如圖15J所示，100μg/ml的濃度完全抑制了Hela細(xì)胞集落的形成。代表可可三個(gè)園藝種類的八種不同屬型中得到的多酚粗提物對(duì)Hela細(xì)胞系的作用也進(jìn)行了檢測。如圖15K所示，可可所有的不同產(chǎn)物都具有相似的劑量-反應(yīng)效果。對(duì)于Hela細(xì)胞系，UIT-1種的活性最高。這些結(jié)果證明，所有的可可屬型具有多酚級(jí)分，該級(jí)分至少誘導(dǎo)對(duì)人的癌細(xì)胞系產(chǎn)生抵抗活性，而不依賴于產(chǎn)地，園藝種類和屬型。另外，對(duì)從一噸傳統(tǒng)的經(jīng)五天發(fā)酵，然后經(jīng)四天太陽曬干的巴西可可豆中制備的多酚粗提物進(jìn)行了系列分析。圖15L中的結(jié)果顯示，這些早期的處理過程沒有明顯效果，提示多酚組合物發(fā)生了少許變化。但是，已知(Lehrian和Patterson，1983)在酵解過程中，多酚氧化酶(PPO)會(huì)氧化多酚。為了確定出哪種經(jīng)酶氧化的多酚具有活性，又進(jìn)行了另外的實(shí)驗(yàn)。粗PPO的制備方法是，用丙酮以1gm粉末/10ml丙酮的比例，從未發(fā)酵、凍干、脫脂、粉碎成細(xì)末的巴西可可豆中提取。在3000rpm下把漿液離心15分鐘，這樣重復(fù)3次，每次都棄去上清液，第四次的萃取物用Buchner過濾漏斗過濾。丙酮粉末在空氣中干燥，然后依照McLord和Kilara(1983)描述的方法進(jìn)行測定。100mg的粉末(400μ/mg蛋白質(zhì))加入到粗多酚的溶劑中(100mg/10ml檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，0.02M，PH5.5)，然后將空氣鼓入漿液進(jìn)行攪拌30Min。樣品在5000×g離心15Min，用20ml乙酸乙脂萃取到3×。合并乙酸乙酯的萃取物，用半真空蒸餾進(jìn)行干燥，加入5ml水然后進(jìn)行冷凍。接著，測定該物質(zhì)對(duì)Hela細(xì)胞的作用，所得的劑量-反應(yīng)曲線與未經(jīng)酶處理的多酚粗提物的進(jìn)行比較。結(jié)果(圖15M)顯示經(jīng)酶氧化提取物的劑量-反應(yīng)曲線發(fā)生了明顯的轉(zhuǎn)移，表明氧化產(chǎn)物比其原本形式具有更高的抑制活性。實(shí)施例9含有原花青素可可提取物的抗氧化劑活性文獻(xiàn)中的論述提示了天然存在的抗氧化劑(維生素C、E和B-胡羅卜素)的消費(fèi)和低發(fā)病率的關(guān)系，所述疾病包括癌癥在內(nèi)(DesigningFoods，1993；Caragay，1992)。通常認(rèn)為這些抗氧化劑影響參與某些涉及腫瘤促進(jìn)因素的氧化與自由基過程。此外，一些具有抗致癌的植物多酚化合物也具有基本的抗氧化活性(Ho等，1992；Huang等，1992)。為了檢測含原花青素的可可提取物是否具有抗氧化特性，應(yīng)用了標(biāo)準(zhǔn)的Rancimat法。用實(shí)施例1、2、3中描述的方法制備可可提取物，進(jìn)一步通過凝膠滲透色譜分離出兩種級(jí)分。這兩種級(jí)分實(shí)際上是A至C，D和E的組合(見圖1)，它們的抗氧化劑特性與合成的抗氧化劑BHA和BHT被進(jìn)行了比較。從去皮后、未發(fā)酵的花生中可壓出花生油。將每種受試化合物滴到油中，達(dá)到兩個(gè)濃度水平-100ppm和20ppm，表7給出了實(shí)際濃度水平，每種樣品中加入50μl甲醇溶解的抗氧化劑，以幫助抗氧化劑分散。不含有抗氧化劑的50μl作對(duì)照。采取Rancimat穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，在100℃和20cc/min空氣的條件下，用雙份樣品測定其氧化穩(wěn)定性。選擇實(shí)驗(yàn)特色與活性氧方法(AOM)或快速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較(VanOosten等，1981)。圖16給出了典型的Rancimat曲線。表8報(bào)告了結(jié)果，該結(jié)果的時(shí)間是要求過氧化物達(dá)到100meq時(shí)的時(shí)間。表7抗氧化劑的濃度<p>表8含不同抗氧化劑的花生油的氧化穩(wěn)定性該結(jié)果表明，含所有受試添加劑的花生油氧化穩(wěn)定性提高了。加入乙酸乙酯粗提物的樣品氧化穩(wěn)定性提高得最高。這些結(jié)果證明含有原花青素的可可提取物，其抗氧化劑能力與等量的合成BHT和BHA相等，或高于它。因此，本發(fā)明可應(yīng)用于BHT或BHA已知應(yīng)用的領(lǐng)域中，如作為抗氧化劑或食物添加劑。并且，在這一點(diǎn)上，還需要指出的是本發(fā)明源于可食之物。給出這些結(jié)果后，技術(shù)人員不經(jīng)實(shí)驗(yàn)可容易地確定出本發(fā)明在應(yīng)用BHT或BHA場合中的合適用量，例如，加到食品中的量。實(shí)施例10拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制研究DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II是催化DNA螺旋打開或連接的酶，由此可控制DNA的拓?fù)錉顟B(tài)(Wang，1985)。除了對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶細(xì)胞內(nèi)功能的研究以外，已確定出的最顯著的發(fā)現(xiàn)之一是，拓?fù)洚悩?gòu)酶是一些臨床上主要抗腫瘤化合物的初始細(xì)胞內(nèi)的靶(Yamashita等，1990)，這些抗腫瘤化合物包括嵌合劑(intercalatingagent，如m-AMSM、阿霉素和橢圓玫瑰樹)以及非嵌合劑表鬼臼毒素。一些證據(jù)表明一些抗腫瘤藥物具有相同的穩(wěn)定DNA--拓?fù)洚悩?gòu)酶II復(fù)合體(可分裂復(fù)合體)的特性，當(dāng)復(fù)合體遇到變性劑時(shí)可導(dǎo)致DNA的分裂(Muller等，1989)。這也暗示了由抗腫瘤藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的可分裂復(fù)合體，可產(chǎn)生松馳DNA的加成物從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。依照這一吸引人的模式，特異的新DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II可分裂性復(fù)合體誘導(dǎo)物可用作抗癌、抗腫瘤或抗贅生物劑。為了確定具有以DNA作靶活性的細(xì)胞毒性化合物，對(duì)幾種DNA--損壞敏感細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性具有增強(qiáng)作用的可可原花青素進(jìn)行了篩選，并用從人的淋巴瘤獲得的拓?fù)洚悩?gòu)酶II進(jìn)行酶測定。A拓?fù)洚悩?gòu)酶II對(duì)動(dòng)核DNA的解鏈按Muller的方法(1989)，進(jìn)行了體外抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II對(duì)動(dòng)核DNA的解鏈實(shí)驗(yàn)。按Muller等(1981)和Danks等(1988)的方法，略加調(diào)整，從人的淋巴瘤制備出含活性拓?fù)洚悩?gòu)酶II的核提取物。34℃，作用30Min，1單位的純化酶就足以對(duì)0.25μg的動(dòng)核DNA進(jìn)行解鏈。動(dòng)核DNA從Crithidiahsciculata錐蟲中獲得。每個(gè)反應(yīng)在0.5ml微離心管中進(jìn)行，管中含有19.5μlH2O，2.5μl10×緩沖液(1×緩沖液含有50mMTris_HCl，PH8.0，120mMKCL，10mMMgCl2，0.5mMATP，0.5mM二硫蘇糖醇和30μgBSA/ml)，1μl動(dòng)核DNA(0.2μg)，和1μl含有相同濃度可可原花青素受試級(jí)分的DMSO。充分混合這些物質(zhì)并放置在冰上。在進(jìn)行34℃水浴培養(yǎng)之前立即加入1單位的拓?fù)洚悩?gòu)酶，作用30分鐘。培養(yǎng)以后，加入5μl中止緩沖液(5％sarkosyl，0.0025％溴酚蘭，25％甘油)中止反應(yīng)，并放于冰上。在周含溴化乙錠(0.5μg/ml)的TAE配制的1％瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳。紫外燈在310nm處照明可看到DNA。用PolaroidLand照相機(jī)對(duì)凝膠照相。圖17給出了這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果。全部解鏈的動(dòng)核DNA不移進(jìn)1％瓊脂糖膠。由拓?fù)洚悩?gòu)酶II解鏈的DNA一般形成單聚DNA(單環(huán)，I和II)帶，這些帶一定移進(jìn)膠里。隨濃度的升高，單體帶逐漸消失，由此可看出添加劑可可原花青素對(duì)酶的抑制作用?；谶@些實(shí)驗(yàn)，可可原花青素的成分A、B、D、E在0.5-5.0μg/ml這一濃度范圍可抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II。這些抑制濃度與mitoxanthrone和m-AMSA(4′-(9-吖啶基氨基)甲磺基-間-甲氧基苯酰碘胺)非常相似。B藥物敏感細(xì)胞系用幾種DNA損害敏感細(xì)胞系對(duì)可可原花青素的細(xì)胞毒活性進(jìn)行了篩選。其中一個(gè)細(xì)胞系是P.Jeggo(Kemp等，1984)建立的xrs-6DNA雙股螺旋斷裂修補(bǔ)突變株，xrs-6細(xì)胞系的DVA修補(bǔ)缺陷株對(duì)X-射線非常敏感，對(duì)直接導(dǎo)致DNA雙股螺旋斷裂的化合物，如爭光霉素非常敏感，對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制物非常敏感，這樣可象Waters(1991)指出的那樣直接導(dǎo)致雙股螺旋的斷裂。對(duì)修補(bǔ)缺陷細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性與對(duì)修補(bǔ)完全的CHO系，BR1的細(xì)胞毒活性進(jìn)行了比較，DNA可分裂雙股螺旋斷裂的形成，作為依據(jù)解釋了對(duì)修補(bǔ)缺陷細(xì)胞系xrs-6細(xì)胞毒活性的增強(qiáng)。DNA修補(bǔ)感受態(tài)CHO系-BR1-是由Barrows等(1987)建立的，除表達(dá)正常的CHODNA修補(bǔ)酶外，還表達(dá)O6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶。CHO雙股螺旋斷裂修補(bǔ)缺陷株(xrs-6)是Dr.P.Jeggo和合作者(Jeggo等，1989)的慷慨禮品。兩種細(xì)胞系均以單層生長在實(shí)施例6描述的含血清和抗生素的α-MEM中，細(xì)胞在37℃、加濕的含5％CO2的空氣中培養(yǎng)。在可可原花青素處理以前，用胰蛋白酶消化。用實(shí)施例6中的MTT法進(jìn)行測定。結(jié)果(圖18)顯示出對(duì)xrs-6細(xì)胞的細(xì)胞毒作用無增強(qiáng)，提示可可原花青素抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的方式與可分裂雙股螺旋斷裂形成不同。也就是說，可可原花青素在拓?fù)洚悩?gòu)酶II與DNA相互作用之前就和它產(chǎn)生了相互作用，從而形成非可分裂復(fù)合體。非可分裂復(fù)合體是相對(duì)新的發(fā)現(xiàn)。蒽環(huán)型藥、鬼臼樹脂生物堿、蒽雙酮、吖啶和ellipticines都是臨床應(yīng)用的抗癌、抗腫瘤或抗贅生物劑，它們都形成可分裂復(fù)合體(Lin1989)。最近確定出幾種新的拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑并不產(chǎn)生可分裂復(fù)合體。它們包括amonafide(Hsiang等1989)，偏端霉素(Fesen等，1989)，黃烷類(Yamashit等，1990)，samtopm(Yamashirt等，1991)，membranone(Drake等，1989)，萜類化合物(Kawada等，1991)，anthrapyrazoles(Fry等，1985)，二氧代哌嗪(Tanabe等，1991)和marineacridine-dercitin(Burres等，1989)。因?yàn)榭煽稍ㄇ嗨卦诳煞至褟?fù)合體形成以前已抑制了拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性。所以不論單獨(dú)應(yīng)用還是與其它作用機(jī)制已明確的拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制物聯(lián)合應(yīng)用，可可原花青素都具有化療價(jià)值。此外，可可原花青素也可作為一種新的拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制物(Kashiwata等，1993)，其細(xì)胞毒性比其它已知的抑制物要低，從而可增強(qiáng)它在化療中的作用。人類乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(ADR)表達(dá)一種膜結(jié)合蛋白，從而授予細(xì)胞多藥抵抗性(Lenonessa等，1994)和它的親本系MCF-Tp168用于分析級(jí)分D&E的效果。如圖19所示，隨D&E濃度逐漸升高，親本系受到抑制而阿霉素(ADR)抵抗系在較高濃度時(shí)幾乎不受影響。這些結(jié)果顯示D&E對(duì)多藥抵抗性細(xì)胞系有效。實(shí)施例11原花青素的合成依照Delcour等(1983)建立的方法加以調(diào)整來合成原花青素。除了在減壓條件下用二氫懈皮酮縮合的(+)-兒茶素外，(-)-表兒茶素也常用于反映未發(fā)酵可可豆中天然存在的(-)-表兒茶素的高濃度。用例3、4、5中的方法對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化、分析和鑒定。用這種方法制備的二黃烷類、三黃烷類、四黃烷類在與上述可可提取物有關(guān)的情況下可用作分析標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例12正相半制備級(jí)分的鑒定既然多酚提取物在組成上是復(fù)合物，所以有必要確定哪種成分在抗癌細(xì)胞時(shí)具有活性，以進(jìn)一步進(jìn)行純化、劑量-反應(yīng)測定和綜合結(jié)構(gòu)鑒定。正相半制備HPLC分離(實(shí)施例3B)可用于分離寡聚體大小的可可原花青素。除了最初的提取物，又制備出12個(gè)級(jí)分(圖2B-15O)，在100μg/ml和25μg/ml兩個(gè)濃度測定其對(duì)Hela細(xì)胞的作用，以確定哪種寡聚體具有最高的活性。如圖20所示，級(jí)分4-11(5聚體-12聚體)表明接近25μg/ml時(shí)的IC50值。結(jié)果表明這些特殊的寡聚體對(duì)Hela細(xì)胞的活性最高。另外，可可成分D&E的正相HPLC分析結(jié)果顯示這一成分富含這些寡聚體。從以上可以看出，本發(fā)明的提取物、可可多酚及合成方法和試劑盒具有實(shí)用價(jià)值。在這一點(diǎn)上，要提出本發(fā)明源于食物，體外的活性至少可證明體內(nèi)的一些活性，尤其就上述的劑量而言。此外，上面的論述表明本發(fā)明的提取物、可可多酚及合成方法和試劑盒具有和BHT、BHA相似的抗氧化劑活性及氧化穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明可在BHT、BHA已知的應(yīng)用領(lǐng)域代替它們，象作為抗氧化劑，如抗食物氧化的添加劑。本發(fā)明也可在拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制物現(xiàn)知的應(yīng)用領(lǐng)域代替它。由此本發(fā)明設(shè)想出許多化合物和方法；例如，抗氧化劑或防腐劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制物，保存食物的方法或希望的目的如防氧化和抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的方法，既可包括提取物和/或可可多酚，又可包括用各個(gè)化合物或提取物和/或可可多酚與食物、目的物或拓?fù)洚悩?gòu)酶接觸。通過詳細(xì)論述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)該理解，由所附權(quán)利要求限定的發(fā)明不能被上述說明的具體細(xì)節(jié)所限制，因?yàn)樵谂c本發(fā)明的精神或范圍不相違背的情況下可能有許多表面上的變動(dòng)。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