專利名稱：：戊型肝炎巴基斯坦病毒株的重組蛋白及其在診斷方法和疫苗中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及肝炎病毒學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及來自腸傳播的、巴基斯坦戊型肝炎病毒株SAR-55的重組蛋白，以及采用這些蛋白的診斷方法和疫苗應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)報道，在亞洲、非洲和中美洲有戊型肝炎流行病，一種腸傳播的非甲型/非乙型肝炎(Balayan，M.S.(1987)，蘇聯(lián)醫(yī)學(xué)回顧，章節(jié)E，病毒學(xué)回顧，Zhdanov，0-V.M.(編輯)，Chur，瑞士Harwood學(xué)術(shù)出版社，2卷，235-261；Purcell，R.G.，等人(1988)Zuckerman，A.J.(編輯)，″病毒性肝炎和肝疾病″，NewYorkAlanR.Liss，131-137；Bradley，D.W.(1990)，英國醫(yī)學(xué)公告，46442-461；Ticehurst，J.R.(1991)Hollinger，F(xiàn).B.，Lemon，S.M.，Margolis，H.S.(編輯)″病毒性肝炎和肝疾病″，WilliamsandWilkins，Baltimore，501-513)。在戊型肝炎病毒(HEV)是地方病的國家中，偶發(fā)性的肝炎病例(推測是戊型肝炎)占報道肝炎的90％。需要開發(fā)在受感染個體的血清中檢測出抗-HEV抗體的血清學(xué)測試方法是本領(lǐng)域中廣泛意識到的，但是從受感染的人或動物中分泌出的HEV的濃度非常低，這使得不可能將這種HEV用作血清學(xué)測試的抗原源，盡管有少數(shù)在細胞培養(yǎng)中繁殖HEV的成功報道(Huang，R.T.等人，(1992)，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)，731143-1148)，但是目前細胞培養(yǎng)不能有效地產(chǎn)生血清測試所需數(shù)量的抗原。最近，世界范圍內(nèi)的為鑒別出與戊型肝炎關(guān)聯(lián)的病毒基因組序列而進行的主要努力，已經(jīng)導(dǎo)致克隆出數(shù)目有限的HEV株的基因組(Tam，A.W.等人(1991)，病毒學(xué)，185120-131；Tsarev，S.A.等人(1992)，美國科學(xué)院院報，89559-563；Fry，K.E.等人(1992)，病毒基因，6173-185)。對DNA序列的分析使研究者假設(shè)HEV基因組被分成3個開放閱讀框(ORF)，并且假設(shè)這些ORF編碼完整的HEV蛋白。來自緬甸(Myanmar)的HEV株的一部分基因組DNA序列公開于Reyes等人，1990.科學(xué)，2471335-1339。Tam等人(1991)和Reyes等人PCT專利申請WO91/15603(1991年10月17日出版)公開了HEV緬甸株的完整的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。這些作者假設(shè)，在該毒株的序列中含有3個正向的開放閱讀框(ORF)。Ichikawa等人，1991，微生物免疫學(xué)，35535-543，公開了用來自HEV感染的獼猴血清篩選λgt11表達文庫而分離出長度為240-320核苷酸的一系列克隆。一個克隆所表達的重組蛋白在大腸桿菌中被表達。該融合蛋白是由HEVMyanmar株的ORF-2的3′區(qū)域所編碼的。HEV墨西哥株和HEV緬甸株的ORF-2的3′區(qū)域中所編碼的其他蛋白的表達，在Yarbough等人，1991，病毒學(xué)雜志，655790-5797中有描述。這篇文章描述分離出來自HEV的2種cDNA克隆。這些克隆編碼ORF-2的3′區(qū)域中的蛋白質(zhì)。這些克隆在大腸桿菌中以融合蛋白形式表達。Purdy等人，1992，病毒學(xué)檔案，123335-349和Favorov等人，1992，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志，36246-250，公開了在大腸桿菌中表達來自緬甸株的更大的ORF-2蛋白片段。這些文獻以及那些前面討論的文獻都僅公開了用細菌表達體系來表達一部分ORF-2基因。在本發(fā)明之前還沒有公開全長ORF-2蛋白的成功表達。將HEV的基因組結(jié)構(gòu)和形態(tài)結(jié)構(gòu)與其他病毒進行比較揭示，HEV與杯狀病毒最接近。感興趣的是，杯狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白是由其基因組的3′部分所編碼(Neil，J.D.等人(1991)病毒學(xué)雜志，655440-5447；和Carter，M.J.等人(1992)，病毒學(xué)檔案雜志(J.Arch.Virol.)，122223-235)而且盡管沒有HEV基因組的3′端部分也編碼結(jié)構(gòu)蛋白的直接證據(jù)，但是在細菌細胞中3′基因組區(qū)域的某些小片段的表達導(dǎo)致產(chǎn)生與抗-HEV血清在ELISA和Western印跡法中反應(yīng)的蛋白質(zhì)(Yarborough，等人，(1991)；Ichikawa等人(1991)；Favorov等人(1992)和Dawson，G.J.等人(1992)病毒學(xué)方法雜志；38175-186)。然而ORF-2蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白的功能在本發(fā)明之前還沒有被證明。由ORF-2基因片段所編碼的小蛋白已經(jīng)被用于免疫測定以檢測動物血清中的抗HEV抗體。在血清學(xué)免疫測定中使用細菌表達的小蛋白作為抗原有多種潛在的缺點。首先，在細菌細胞中表達這些小蛋白常導(dǎo)致溶解度問題，并當粗制大腸桿菌裂解液被用作免疫測定中的抗原時會導(dǎo)致病人血清與大腸桿菌蛋白質(zhì)的非特異性交叉反應(yīng)(Purdy等人(1992))。其次，由于時間和成本的限制，將Western印跡法作為日常的傳染病學(xué)中抗-HEV抗體的一線血清測試方法是不實際的。用來自HEV3′端部分的小肽進行的ELISA僅能從已知的HEV感染病人中檢測出41％的陽性。第三，已表明，對于許多病毒，包括小RNA病毒科(Picornaviridae)(它是與杯狀病毒科最接近的科)，主要的抗原和免疫原表位是高度構(gòu)象化的(Lemon，S.M.等人(1991)，Hollinger，F(xiàn).B.，Lemon，S.M.，Margolis，H.S.(編輯)“病毒性肝炎和肝疾病”，WilliamsandWilkins，Baltimore，20-24)。出于這個原因，據(jù)信在真核體系中表達編碼完整HEV基因的完整ORF，可導(dǎo)致產(chǎn)生可形成HEV-病毒樣顆粒的蛋白。與上述的、僅代表HEV結(jié)構(gòu)蛋白的部分的小蛋白相比，這種完整的ORF蛋白，會具有更接近天然衣殼蛋白的免疫學(xué)結(jié)構(gòu)。所以，與目前使用的小蛋白相比，這些完整的ORF蛋白可以作為更具代表性的抗原和更有效的免疫原。發(fā)明概述本發(fā)明涉及分離的和基本純化的人戊型肝炎病毒株SAR-55的制劑。本發(fā)明還涉及分離的和基本純化的人戊型肝炎病毒株SAR-55基因組RNA的制劑。本發(fā)明還涉及人戊型肝炎病毒株SAR-55的cDNA。本發(fā)明的一個目的是提供能夠指導(dǎo)產(chǎn)生重組HEV蛋白的合成的核酸序列，以及等價的天然核酸序列。這種天然的核酸序列可從cDNA或基因組文庫中分離出，即從這些文庫中鑒別和分離出能指導(dǎo)HEV蛋白合成的基因。出于本申請的目的，核酸序列指RNA、DNA、cDNA或其任何合成的編碼蛋白質(zhì)的變異體。本發(fā)明還涉及一種基于采用衍生自SAR-55cDNA的引物而選擇性擴增戊型肝炎基因片段，從而在生物樣品中檢測戊型肝炎的方法。本發(fā)明還涉及使用衍生自SAR-55cDNA的單鏈反義多聚或寡聚核苷酸來抑制戊型肝炎基因的表達。本發(fā)明還涉及分離的和基本純化的、由SAR-55的HEV基因組編碼的或由合成的核酸序列編碼的HEV蛋白或其變異體，尤其涉及由至少一個HEV的完整開放閱讀框所編碼的重組蛋白。本發(fā)明還涉及制備衍生自HEV基因組序列的重組HEV蛋白的方法，它通過克隆核酸和將cDNA插入表達載體，然后在宿主細胞中表達重組蛋白。本發(fā)明還涉及將得到的重組HEV蛋白作為診斷劑和疫苗的用途。本發(fā)明還包括在生物樣品中檢測對戊型肝炎特異的抗體的方法。這些方法可用于診斷由HEV引起的感染和疾病，還可用于監(jiān)測疾病的進展情況。這些方法還可用于監(jiān)測治療哺乳動物HEV感染和疾病過程中治療劑的功效。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或治療哺乳動物戊型肝炎的藥物組合物。圖1是用于表達HEV株SAR-55基因組的完整的ORF-2蛋白質(zhì)的重組載體。圖2A和2B是十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，其中用野生型桿狀病毒或重組桿狀病毒(含有編碼ORF-2的基因)感染的昆蟲細胞的細胞裂解液或者用考馬斯藍(A)染色，或者用HEV感染的黑猩猩血清進行Western印跡分析(B)。在圖2A和2B中，泳道1含有未感染的SF-9細胞的全部細胞裂解液；泳道2含有用野生型桿狀病毒感染的細胞的裂解液；泳道3含有用重組的桿狀病毒感染的細胞的裂解液；和泳道4含有分子量參照物。圖3A-3A和3B分別顯示了30nm和20nm病毒樣顆粒的免疫電鏡顯微圖(immunoelectronmicrograph，IEM)，它們是在重組感染的昆蟲細胞中表達ORF-2蛋白而形成的。圖4顯示了ELISA結(jié)果，其中從含有編碼完整ORF-2的基因的昆蟲細胞中表達出的重組ORF-2被用作抗原。在獼猴(cynomolgusmonkey)用HEV的墨西哥株(Cyno-80A82、Cyno-9A97和Cyno83)或巴基斯坦株(Cyno-374)接種后的不同時間，測定血清中抗HEV抗體的水平。圖5A-D顯示了ELISA結(jié)果，其中從含有編碼完整ORF-2的基因的昆蟲細胞中表達出的重組ORF-2被用作抗原。在接種2只黑猩猩后，測定血清中抗HEV的IgG或IgM水平。圖6A-J顯示了ELISA數(shù)據(jù)的比較，其中將重組的衍生自SAR-55的完整ORF-2蛋白用作抗原對將重組的衍生自HEV面甸株(Genelabs)的部分ORF-2蛋白用作抗原而獲得ELISA數(shù)據(jù)。圖7A-J顯示了用SAR-55HEV的10％排泄物懸浮液的10倍連續(xù)稀釋液(顯示在各圖上方的括號中)接種的獼猴中，抗HEVIgGELISA和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)值。用于ELISA的重組抗原是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)；3-2(M)，一種3-2表位(Yarbough等人，(1991)病毒學(xué)雜志，655790-5797)和GST的融合蛋白；SG3(B)，它是ORF-2的327個C末端氨基酸與GST的融合蛋白(Yarbough等人，(1993)AssayDevelopmentofdiagnostictestsforHepatitisEin″InternationalSymposiumonViralHepatitisandLiverDisease.ScientificProgramandAbstractVolume.″東京VHFLp.87)；和在昆蟲細胞中直接表達的55KDaORF-2產(chǎn)物。圖8A-E顯示了用SAR-55HEV的10％排泄物懸浮液的10倍連續(xù)稀釋液(顯示在各圖上方的括號中)接種的陽性獼猴中，抗HEVIgMELISA和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)值。用于ELISA的重組抗原是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)；3-2(M)，一種3-2表位(Yarbough等人，1991)和GST的融合蛋白；SG3(B)，它是ORF-2的327個C末端氨基酸與GST的融合蛋白(Yarbough等人，1993)；和在昆蟲細胞中直接表達的55KDaORF-2產(chǎn)物。圖9顯示了2％瓊脂糖凝膠的溴化乙錠染色結(jié)果，其中在凝膠上對SAR-55HEV的10％排泄物懸浮液的10倍連續(xù)稀釋液(顯示在各凝膠泳道上方)抽提物的PCR產(chǎn)物進行分離。PCR產(chǎn)物的預(yù)計長度為約640堿基對，在標為(M)的泳道中含有DNA大小的參照物。圖10顯示在酵母中表達完整ORF-2蛋白或分子量更低的片段的pPIC9載體。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及分離的和基本純化的、來自巴基斯坦的戊型肝炎病毒(hepatitisEVirus，HEV)株SAR-55。本發(fā)明還涉及克隆編碼HEV蛋白質(zhì)的病毒基因以及用表達系統(tǒng)表達重組蛋白。更具體地，本發(fā)明涉及衍生自SAR-55的開放閱讀框(ORF)的克隆和表達。本發(fā)明涉及分離的HEV蛋白質(zhì)。本發(fā)明的HEV蛋白質(zhì)較佳地是與天然的HEV蛋白質(zhì)基本同源，最佳地是與天然HEV蛋白質(zhì)在生物學(xué)上等價。如說明書和權(quán)利要求書中所用，“生物學(xué)上等價”指組份能夠形成病毒樣顆粒而且有免疫原性。一旦注射入哺乳動物，本發(fā)明的HEV蛋白質(zhì)還可刺激產(chǎn)生保護性的抗體，這些抗體會保護哺乳動物免受野生型HEV的侵襲。如隨后的說明書和權(quán)利要求書中所用，“基本同源”指與天然HEV蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源程度。與天然HEV蛋白質(zhì)的同源程度較佳地為超過70％，更佳地超過90％，特別優(yōu)選的是同源性超過90％的蛋白質(zhì)。較佳的HEV蛋白質(zhì)是那些由ORF基因編碼的蛋白質(zhì)。特別感興趣的是由HEV的ORF-2基因所編碼的蛋白質(zhì)，最感興趣的是由HEVSAR-55株ORF-2基因所編碼的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的、由ORF-2基因編碼的本發(fā)明蛋白質(zhì)可形成病毒樣顆粒。ORF-1、ORF-2和ORF-3蛋白質(zhì)的氨基酸序列在下面分別示作SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。(SEQIDNO.1)MetGluAlaHisGlnPheIleLysAlaProGlyIleThrThrAla151015IleGluGlnAlaAlaLeuAlaAlaAlaAsnSerAlaLeuAlaAsn202530AlaValValValArgProPheLeuSerHisGlnGlnIleGluIle354045LeuIleAsnLeuMetGlnProArgGlnLeuValPheArgProGlu505560ValPheTrpAsnHisProIleGlnArgValIleHisAsnGluLeu657075GluLeuTyrCysArgAlaArgSerGlyArgCysLeuGluIleGly808590AlaHisProArgSerIleAsnAspAsnProAsnValValHisArg95100105CysPheLeuArgProAlaGlyArgAspValGlnArgTrpTyrThr110115120AlaProThrArgGlyProAlaAlaAsnCysArgArgSerAlaLeu125130135ArgGlyLeuProAlaAlaAspArgThrTyrCysPheAspGlyPhe140145150SerGlyCysAsnPheProAlaGluThrGlyIleAlaLeuTyrSer155160165LeuHisAspMetSerProSerAspValAlaGluAlaMetPheArg170175180HisGlyMetThrArgLeuTyrAlaAlaLeuHisLeuProProGlu185190195ValLeuLeuProProGlyThrTyrArgThrAlaSerTyrLeuLeu200205210IleHisAspGlyArgArgValValValThrTyrGluGlyAspThr215220225SerAlaGlyTyrAsnHisAspValSerAsnLeuArgSerTrpIle230235240ArgThrThrLysValThrGlyAspHisProLeuValIleGluArg245250255ValArgAlaIleGlyCysHisPheValLeuLeuLeuThrAlaAla260265270ProGluProSerProMetProTyrValProTyrProArgSerThr275280285GluValTyrValArgSerIlePheGlyProGlyGlyThrProSer290295300LeuPheProThrSerCysSerThrLysSerThrPheHisAlaVal305310315ProAlaHisIleTrpAspArgLeuMetLeuPheGlyAlaThrLeu320325330AspAspGlnAlaPheCysCysSerArgLeuMetThrTyrLeuArg335340345GlyIleSerTyrLysValThrValGlyThrLeuValAlaAsnGlu350355360GlyTrpAsnAlaSerGluAspAlaLeuThrAlaValIleThrAla365370375AlaTyrLeuThrIleCysHisGlnArgTyrLeuArgThrGlnAla380385390IleSerLysGlyMetArgArgLeuGluArgGluHisAlaGlnLys395400405PheIleThrArgLeuTyrSerTrpLeuPheGluLysSerGlyArg410415420AspTyrIleProGlyArgGlnLeuGluPheTyrAlaGlnCysArg425430435ArgTrpLeuSerAlaGlyPheHisLeuAspProArgValLeuVal440445450PheAspGluSerAlaProCysHisCysArgThrAlaIleArgLys455460465AlaValSerLysPheCysCysPheMetLysTrpLeuGlyGlnGlu470475480CysThrCysPheLeuGlnProAlaGluGlyValValGlyAspGln485490495GlyHisAspAsnGluAlaTyrGluGlySerAspValAspProAla500505510GluSerAlaIleSerAspIleSerGlySerTyrValValProGly515520525ThrAlaLeuGlnProLeuTyrGlnAlaLeuAspLeuProAlaGlu530535540IleValAlaArgAlaGlyArgLeuThrAlaThrValLysValSer545550555GlnValAspGlyArgIleAspCysGluThrLeuLeuGlyAsnLys560565570ThrPheArgThrSerPheValAspGlyAlaValLeuGluThrAsn575580585GlyProGluArgHisAsnLeuSerPheAspAlaSerGlnSerThr590595600MetAlaAlaGlyProPheSerLeuThrTyrAlaAlaSerAlaAla605610615GlyLeuGluValArgTyrValAlaAlaGlyLeuAspHisArgAla620625630ValPheAlaProGlyValSerProArgSerAlaProGlyGluVal635640645ThrAlaPheCysSerAlaLeuTyrArgPheAsnArgGluAlaGln650655660ArgLeuSerLeuThrGlyAsnPheTrpPheHisProGluGlyLeu665670675LeuGlyProPheAlaProPheSerProGlyHisValTrpGluSer680685690AlaAsnProPheCysGlyGluSerThrLeuTyrThrArgThrTrp695700705SerGluValAspAlaValProSerProAlaGlnProAspLeuGly710715720PheThrSerGluProSerIleProSerArgAlaAlaThrProThr725730735ProAlaAlaProLeuProProProAlaProAspProSerProThr740745750LeuSerAlaProAlaArgGlyGluProAlaProGlyAlaThrAla755760765ArgAlaProAlaIleThrHisGlnThrAlaArgHisArgArgLeu770775780LeuPheThrTyrProAspGlySerLysValPheAlaGlySerLeu785790795PheGluSerThrCysThrTrpLeuValAsnAlaSerAsnValAsp800805810HisArgProGlyGlyGlyLeuCysHisAlaPheTyrGlnArgTyr815820825ProAlaSerPheAspAlaAlaSerPheValMetArgAspGlyAla830835840AlaAlaTyrThrLeuThrProArgProIleIleHisAlaValAla845850855ProAspTyrArgLeuGluHisAsnProLysArgLeuGluAlaAla860865870TyrArgGluThrCysSerArgLeuGlyThrAlaAlaTyrProLeu875880885LeuGlyThrGlyIleTyrGlnValProIleGlyProSerPheAsp890895900AlaTrpGluArgAsnHisArgProGlyAspGluLeuTyrLeuPro905910915GluLeuAlaAlaArgTrpPheGluAlaAsnArgProThrCysPro920925930ThrLeuThrIleThrGluAspValAlaArgThrAlaAsnLeuAla935940945IleGluLeuAspSerAlaThrAspValGlyArgAlaCysAlaGly950955960CysArgValThrProGlyValValGlnTyrGlnPheThrAlaGly965970975ValProGlySerGlyLysSerArgSerIleThrGlnAlaAspVal980985990AspValValValValProThrArgGluLeuArgAsnAlaTrpArg99510001005ArgArgGlyPheAlaAlaPheThrProHisThrAlaAlaArgVal101010151020ThrGlnGlyArgArgValValIleAspGluAlaProSerLeuPro102510301035ProHisLeuLeuLeuLeuHisMetGlnArgAlaAlaThrValHis104010451050LeuLeuGlyAspProAsnGlnIleProAlaIleAspPheGluHis105510601065AlaGlyLeuValProAlaIleArgProAspLeuAlaProThrSer107010751080TrpTrpHisValThrHisArgCysProAlaAspValCysGluLeu108510901095IleArgGlyAlaTyrProMetIleGlnThrThrSerArgValLeu110011051110ArgSerLeuPheTrpGlyGluProAlaValGlyGlnLysLeuVal111511201125PheThrGlnAlaAlaLysAlaAlaAsnProGlySerValThrVal113011351140HisGluAlaGlnGlyAlaThrTyrThrGluThrThrIleIleAla114511501155ThrAlaAspAlaArgGlyLeuIleGlnSerSerArgAlaHisAla116011651170IleValAlaLeuThrArgHisThrGluLysCysValIleIleAsp117511801185AlaProGlyLeuLeuArgGluValGlyIleSerAspAlaIleVal119011951200AsnAsnPhePheLeuAlaGlyGlyGluIleGlyHisGlnArgPro120512101215SerValIleProArgGlyAsnProAspAlaAsnValAspThrLeu122012251230AlaAlaPheProProSerCysGluIleSerAlaPheHisGluLeu123512401245AlaGluGluLeuGlyHisArgProAlaProValAlaAlaValLeu125012551260ProProCysProGluLeuGluGlnGlyLeuLeuTyrLeuProGln126512701275GluLeuThrThrCysAspSerValValThrPheGluLeuThrAsp128012851290IleValHisCysArgMetAlaAlaProSerGlnArgLysAlaVal129513001305LeuSerThrLeuValGlyArgTyrGlyArgArgThrLysLeuTyr131013151320AsnAlaSerHisSerAspValArgAspSerLeuAlaArgPheIle132513301335ProAlaIleGlyProValGlnValThrThrCysGluLeuTyrGlu134013451350LeuGluGluAlaMetValGluLysGlyGlnAspGlySerAlaVal135513601365LeuGluLeuAspLeuCysSerArgAspValSerArgIleThrPhe137013751380PheGlnLysAspCysAsnLysPheThrThrGlyGluThrIleAla138513901395HisGlyLysValGlyGlnGlyIleSerAlaTrpSerLysThrPhe140014051410CysAlaLeuPheGlyProTrpPheArgAlaIleGluLysAlaIle141514201425LeuAlaLeuLeuProGlnGlyValPheTyrGlyAspAlaPheAsp143014351440AspThrValPheSerAlaAlaValAlaAlaAlaLysAlaSerMet144514501455ValPheGluAsnAspPheSerGluPheAspSerThrGlnAsnAsn146014651470PheSerLeuGlyLeuGluCysAlaIleMetGluGluCysGlyMet147514801485ProGlnTrpLeuIleArgLeuTyrHisLeuIleArgSerAlaTrp149014951500IleLeuGlnAlaProLysGluSerLeuArgGlyPheTrpLysLys150515101515HisSerGlyGluProGlyThrLeuLeuTrpAsnThrValTrpAsn152015251530MetAlaValIleThrHisCysTyrAspPheArgAspLeuGlnVal153515401545AlaAlaPheLysGlyAspAspSerIleValLeuCysSerGluTyr155015551560ArgGlnSerProGlyAlaAlaValLeuIleAlaGlyCysGlyLeu156515701575LysLeuLysValAspPheArgProIleGlyLeuTyrAlaGlyVal158015851590ValValAlaProGlyLeuGlyAlaLeuProAspValValArgPhe159516001605AlaGlyArgLeuThrGluLysAsnTrpGlyProGlyProGluArg161016151620AlaGluGlnLeuArgLeuAlaValSerAspPheLeuArgLysLeu162516301635ThrAsnValAlaGlnMetCysValAspValValSerArgValTyr164016451650GlyValSerProGlyLeuValHisAsnLeuIleGluMetLeuGln165516601665AlaValAlaAspGlyLysAlaHisPheThrGluSerValLysPro167016751680ValLeuAspLeuThrAsnSerIleLeuCysArgValGlu16851690(SEQIDNO2)MetArgProArgProIleLeuLeuLeuLeuLeuMetPheLeuPro151015MetLeuProAlaProProProGlyGlnProSerGlyArgArgArg202530GlyArgArgSerGlyGlySerGlyGlyGlyPheTrpGlyAspArg354045ValAspSerGlnProPheAlaIleProTyrIleHisProThrAsn505560ProPheAlaProAspValThrAlaAlaAlaGlyAlaGlyProArg657075ValArgGlnProAlaArgProLeuGlySerAlaTrpArgAspGln808590AlaGlnArgProAlaAlaAlaSerArgArgArgProThrThrAla95100105GlyAlaAlaProLeuThrAlaValAlaProAlaHisAspThrPro110115120ProValProAspValAspSerArgGlyAlaIleLeuArgArgGln125130135TyrAsnLeuSerThrSerProLeuThrSerSerValAlaThrGly140145150ThrAsnLeuValLeuTyrAlaAlaProLeuSerProLeuLeuPro155160165LeuGlnAspGlyThrAsnThrHisIleMetAlaThrGluAlaSer170175180AsnTyrAlaGlnTyrArgValAlaArgAlaThrIleArgTyrArg185190195ProLeuValProAsnAlaValGlyGlyTyrAlaIleSerIleSer200205210PheTyrProGlnThrThrThrThrProThrSerValAspMetAsn215220225SerIleThrSerThrAspValArgIleLeuValGlnProGlyIle230235240AlaSerGluLeuValIleProSerGluArgLeuHisTyrArgAsn245250255GlnGlyTrpArgSerValGluThrSerGlyValAlaGluGluGlu260265270AlaThrSerGlyLeuValMetLeuCysIleHisGlySerProVal275280285AsnSerTyrThrAsnThrProTyrThrGlyAlaLeuGlyLeuLeu290295300AspPheAlaLeuGluLeuGluPheArgAsnLeuThrProGlyAsn305310315ThrAsnThrArgValSerArgTyrSerSerThrAlaArgHisArg320325330LeuArgArgGlyAlaAspGlyThrAlaGluLeuThrThrThrAla335340345AlaThrArgPheMetLysAspLeuTyrPheThrSerThrAsnGly350355360ValGlyGluIleGlyArgGlyIleAlaLeuThrLeuPheAsnLeu365370375AlaAspThrLeuLeuGlyGlyLeuProThrGluLeuIleSerSer380385390AlaGlyGlyGlnLeuPheTyrSerArgProValValSerAlaAsn395400405GlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAlaGln410415420GlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyGlu425430435SerArgValValIleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAsp440445450ArgProThrProSerProAlaProSerArgProPheSerValLeu455460465ArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGluTyr470475480AspGlnSerThrTyrGlySerSerThrGlyProValTyrValSer485490495AspSerValThrLeuValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaVal500505510AlaArgSerLeuAspTrpThrLysValThrLeuAspGlyArgPro515520525LeuSerThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPhePheValLeuPro530535540LeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAla545550555GlyTyrProTyrAsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnLeuLeu560565570ValGluAsnAlaAlaGlyHisArgValAlaIleSerThrTyrThr575580585ThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerIleSerAlaValAlaVal590595600LeuAlaProHisSerValLeuAlaLeuLeuGluAspThrMetAsp605610615TyrProAlaArgAlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCys620625630ArgProLeuGlyLeuGlnGlyCysAlaPheGlnSerThrValAla635640645GluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGluLeu650655660(SEQIDNO.3)MetAsnAsnMetSerPheAlaAlaProMetGlySerArgProCys151015AlaLeuGlyLeuPheCysCysCysSerSerCysPheCysLeuCys202530CysProArgHisArgProValSerArgLeuAlaAlaValValGly354045GlyAlaAlaAlaValProAlaValValSerGlyValThrGlyLeu505560IleLeuSerProSerGlnSerProIlePheIleGlnProThrPro657075SerProProMetSerProLeuArgProGlyLeuAspLeuValPhe808590AlaAsnProProAspHisSerAlaProLeuGlyValThrArgPro95100105SerAlaProProLeuProHisValValAspLeuProGlnLeuGly110115120ProArgArg三字符縮寫按照20個天然存在的氨基酸的常規(guī)氨基酸速記。優(yōu)選的重組HEV蛋白質(zhì)含有至少一個ORF蛋白質(zhì)?？梢灾苽淦渌梢粋€以上相同或不同ORF蛋白構(gòu)成的重組蛋白，以改變蛋白質(zhì)的生物特性。添加、置換或缺失個別氨基酸或個別氨基酸序列可能會提高HEV的生物活性，這在構(gòu)思之中。本發(fā)明還涉及一種核酸序列，它能夠指導(dǎo)產(chǎn)生上述的HEV蛋白質(zhì)或與HEV蛋白質(zhì)基本同源的蛋白質(zhì)。該核酸序列被稱為SAR-55，它作為SEQIDNO.4示于下面，并且于1992年9月17日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(ATCC保藏號75302)。AGGCAGACCACATATGTGGTCGATGCCATGGAGGCCCATCAGTTTATCAA50GGCTCCTGGCATCACTACTGCTATTGAGCAGGCTGCTCTAGCAGCGGCCA100ACTCTGCCCTTGCGAATGCTGTGGTAGTTAGGCCTTTTCTCTCTCACCAG150CAGATTGAGATCCTTATTAACCTAATGCAACCTCGCCAGCTTGTTTTCCG200CCCCGAGGTTTTCTGGAACCATCCCATCCAGCGTGTTATCCATAATGAGC250TGGAGCTTTACTGTCGCGCCCGCTCCGGCCGCTGCCTCGAAATTGGTGCC300CACCCCCGCTCAATAAATGACAATCCTAATGTGGTCCACCGTTGCTTCCT350CCGTCCTGCCGGGCGTGATGTTCAGCGTTGGTATACTGCCCCTACCCGCG400GGCCGGCTGCTAATTGCCGGCGTTCCGCGCTGCGCGGGCTCCCCGCTGCT450GACCGCACTTACTGCTTCGACGGGTTTTCTGGCTGTAACTTTCCCGCCGA500GACGGGCATCGCCCTCTATTCTCTCCATGATATGTCACCATCTGATGTCG550CCGAGGCTATGTTCCGCCATGGTATGACGCGGCTTTACGCTGCCCTCCAC600CTCCCGCCTGAGGTCCTGTTGCCCCCTGGCACATACCGCACCGCGTCGTA650CTTGCTGATCCATGACGGCAGGCGCGTTGTGGTGACGTATGAGGGTGACA700CTAGTGCTGGTTATAACCACGATGTTTCCAACCTGCGCTCCTGGATTAGA750ACCACTAAGGTTACCGGAGACCACCCTCTCGTCATCGAGCGGGTTAGGGC800CATTGGCTGCCACTTTGTCCTTTTACTCACGGCTGCTCCGGAGCCATCAC850CTATGCCCTATGTCCCTTACCCCCGGTCTACCGAGGTCTATGTCCGATCG900ATCTTCGGCCCGGGTGGCACCCCCTCCCTATTTCCAACCTCATGCTCCAC950CAAGTCGACCTTCCATGCTGTCCCTGCCCATATCTGGGACCGTCTCATGT1000TGTTCGGGGCCACCCTAGATGACCAAGCCTTTTGCTGCTCCCGCCTAATG1050ACTTACCTCCGCGGCATTAGCTACAAGGTTACTGTGGGCACCCTTGTTGC1100CAATGAAGGCTGGAACGCCTCTGAGGACGCTCTTACAGCTGTCATCACTG1150CCGCCTACCTTACCATCTGCCACCAGCGGTACCTCCGCACTCAGGCTATA1200TCTAAGGGGATGCGTCGCCTGGAGCGGGAGCATGCTCAGAAGTTTATAAC1250ACGCCTCTACAGTTGGCTCTTTGAGAAGTCCGGCCGTGATTATATCCCCG1300GCCGTCAGTTGGAGTTCTACGCTCAGTGTAGGCGCTGGCTCTCGGCCGGC1350TTTCATCTTGACCCACGGGTGTTGGTTTTTGATGAGTCGGCCCCCTGCCA1400CTGTAGGACTGCGATTCGTAAGGCGGTCTCAAAGTTTTGCTGCTTTATGA1450AGTGGCTGGGCCAGGAGTGCACCTGTTTTCTACAACCTGCAGAAGGCGTC1500GTTGGCGACCAGGGCCATGACAACGAGGCCTATGAGGGGTCTGATGTTGA1550CCCTGCTGAATCCGCTATTAGTGACATATCTGGGTCCTACGTAGTCCCTG1600GCACTGCCCTCCAACCGCTTTACCAAGCCCTTGACCTCCCCGCTGAGATT1650GTGGCTCGTGCAGGCCGGCTGACCGCCACAGTAAAGGTCTCCCAGGTCGA1700CGGGCGGATCGATTGTGAGACCCTTCTCGGTAATAAAACCTTCCGCACGT1750CGTTTGTTGACGGGGCGGTTTTAGAGACTAATGGCCCAGAGCGCCACAAT1800CTCTCTTTTGATGCCAGTCAGAGCACTATGGCCGCCGGCCCTTTCAGTCT1850CACCTATGCCGCCTCTGCTGCTGGGCTGGAGGTGCGCTATGTCGCCGCCG1900GGCTTGACCACCGGGCGGTTTTTGCCCCCGGCGTTTCACCCCGGTCAGCC1950CCTGGCGAGGTCACCGCCTTCTGTTCTGCCCTATACAGGTTTAATCGCGA2000GGCCCAGCGCCTTTCGCTGACCGGTAATTTTTGGTTCCATCCTGAGGGGC2050TCCTTGGCCCCTTTGCCCCGTTTTCCCCCGGGCATGTTTGGGAGTCGGCT2100AATCCATTCTGTGGCGAGAGCACACTTTACACCCGCACTTGGTCGGAGGT2150TGATGCTGTTCCTAGTCCAGCCCAGCCCGACTTAGGTTTTACATCTGAGC2200CTTCTATACCTAGTAGGGCCGCCACACCTACCCCGGCGGCCCCTCTACCC2250CCCCCTGCACCGGATCCTTCCCCTACTCTCTCTGCTCCGGCGCGTGGTGA2300GCCGGCTCCTGGCGCTACCGCCAGGGCCCCAGCCATAACCCACCAGACGG2350CCCGGCATCGCCGCCTGCTCTTTACCTACCCGGATGGCTCTAAGGTGTTC2400GCCGGCTCGCTGTTTGAGTCGACATGTACCTGGCTCGTTAACGCGTCTAA2450TGTTGACCACCGCCCTGGCGGTGGGCTCTGTCATGCATTTTACCAGAGGT2500ACCCCGCCTCCTTTGATGCTGCCTCTTTTGTGATGCGCGACGGCGCGGCC2550GCCTACACATTAACCCCCCGGCCAATAATTCATGCCGTCGCTCCTGATTA2600TAGGTTGGAACATAACCCAAAGAGGCTTGAGGCTGCCTACCGGGAGACTT2650GCTCCCGCCTCGGTACCGCTGCATACCCACTCCTCGGGACCGGCATATAC2700CAGGTGCCGATCGGTCCCAGTTTTGACGCCTGGGAGCGGAATCACCGCCC2750CGGGGACGAGTTGTACCTTCCTGAGCTTGCTGCCAGATGGTTCGAGGCCA2800ATAGGCCGACCTGCCCAACTCTCACTATAACTGAGGATGTTGCGCGGACA2850GCAAATCTGGCTATCGAACTTGACTCAGCCACAGACGTCGGCCGGGCCTG2900TGCCGGCTGTCGAGTCACCCCCGGCGTTGTGCAGTACCAGTTTACCGCAG2950GTGTGCCTGGATCCGGCAAGTCCCGCTCTATTACCCAAGCCGACGTGGAC3000GTTGTCGTGGTCCCGACCCGGGAGTTGCGTAATGCCTGGCGCCGCCGCGG3050CTTCGCTGCTTTCACCCCGCACACTGCGGCTAGAGTCACCCAGGGGCGCC3100GGGTTGTCATTGATGAGGCCCCGTCCCTTCCCCCTCATTTGCTGCTGCTC3150CACATGCAGCGGGCCGCCACCGTCCACCTTCTTGGCGACCCGAATCAGAT3200CCCAGCCATCGATTTTGAGCACGCCGGGCTCGTTCCCGCCATCAGGCCCG3250ATTTGGCCCCCACCTCCTGGTGGCATGTTACCCATCGCTGCCCTGCGGAT3300GTATGTGAGCTAATCCGCGGCGCATACCCTATGATTCAGACCACTAGTCG3350GGTCCTCCGGTCGTTGTTCTGGGGTGAGCCCGCCGTTGGGCAGAAGCTAG3400TGTTCACCCAGGCGGCTAAGGCCGCCAACCCCGGTTCAGTGACGGTCCAT3450GAGGCACAGGGCGCTACCTACACAGAGACTACCATCATTGCCACGGCAGA3500TGCTCGAGGCCTCATTCAGTCGTCCCGAGCTCATGCCATTGTTGCCTTGA3550CGCGCCACACTGAGAAGTGCGTCATCATTGACGCACCAGGCCTGCTTCGC3600GAGGTGGGCATCTCCGATGCAATCGTTAATAACTTTTTCCTTGCTGGTGG3650CGAAATTGGCCACCAGCGCCCATCTGTTATCCCTCGCGGCAATCCTGACG3700CCAATGTTGACACCTTGGCTGCCTTCCCGCCGTCTTGCCAGATTAGCGCC3750TTCCATCAGTTGGCTGAGGAGCTTGGCCACAGACCTGCCCCTGTCGCGGC3800TGTTCTACCGCCCTGCCCTGAGCTTGAACAGGGCCTTCTCTACCTGCCCC3850AAGAACTCACCACCTGTGATAGTGTCGTAACATTTGAATTAACAGATATT3900GTGCATTGTCGTATGGCCGCCCCGAGCCAGCGCAAGGCCGTGCTGTCCAC3950GCTCGTGGGCCGTTATGGCCGCCGCACAAAGCTCTACAATGCCTCCCACT4000CTGATGTTCGCGACTCTCTCGCCCGTTTTATCCCGGCCATTGGCCCCGTA4050CAGGTTACAACCTGTGAATTGTACGAGCTAGTGGAGGCCATGGTCGAGAA4100GGGCCAGGACGGCTCCGCCGTCCTTGAGCTCGACCTTTGTAGCCGCGACG4150TGTCCAGGATCACCTTCTTCCAGAAAGATTGTAATAAATTCACCACGGGG4200GAGACCATCGCCCATGGTAAAGTGGGCCAGGGCATTTCGGCCTGGAGTAA4250GACCTTCTGTGCCCTTTTCGGCCCCTGGTTCCGTGCTATTGAGAAGGCTA4300TCCTGGCCCTGCTCCCTCAGGGTGTGTTTTATGGGGATGCCTTTGATGAC4350ACCGTCTTCTCGGCGGCTGTGGCCGCAGCAAAGGCATCCATGGTGTTCGA4400GAATGACTTTTCTGAGTTTGATTCCACCCAGAATAATTTTTCCTTGGGCC4450TAGAGTGTGCTATTATGGAGGAGTGTGGGATGCCGCAGTGGCTCATCCGC4500TTGTACCACCTTATAAGGTCTGCGTGGATTCTGCAGGCCCCGAAGGAGTC4550CCTGCGAGGGTTTTGGAAGAAACACTCCGGTGAGCCCGGCACCCTTCTGT4600GGAATACTGTCTGGAACATGGCCGTTATCACCCACTGTTATGATTTCCGC4650GATCTGCAGGTGGCTGCCTTTAAAGGTGATGATTCGATAGTGCTTTGCAG4700TGAGTACCGTCAGAGCCCAGGGGCTGCTGTCCTGATTGCTGGCTGTGGCC4750TAAAGTTGAAGGTGGATTTCCGTCCGATTGGTCTGTATGCAGGTGTTGTG4800GTGGCCCCCGGCCTTGGCGCGCTTCCTGATGTCGTGCGCTTCGCCGGTCG4850GCTTACTGAGAAGAATTGGGGCCCTGGCCCCGAGCGGGCGGAGCAGCTCC4900GCCTCGCTGTGAGTGATTTTCTCCGCAAGCTCACGAATGTAGCTCAGATG4950TGTGTGGATGTTGTCTCTCGTGTTTATGGGGTTTCCCCTGGGCTCGTTCA5000TAACCTGATTGGCATGCTACAGGCTGTTGCTGATGGCAAGGCTCATTTCA5050CTGAGTCAGTGAAGCCAGTGCTTGACCTGACAAATTCAATTCTGTGTCGG5100GTGGAATGAATAACATGTCTTTTGCTGCGCCCATGGGTTCGCGACCATGC5150GCCCTCGGCCTATTTTGCTGTTGCTCCTCATGTTTCTGCCTATGCTGCCC5200GCGCCACCGCCCGGTCAGCCGTCTGGCCGCCGTCGTGGGCGGCGCAGCGG5250CGGTTCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACCGGGTTGATTCTCAGCCCTTCG5300CAATCCCCTATATTCATCCAACCAACCCCTTCGCCCCCGATGTCACCGCT5350GCGGCCGGGGCTGGACCTCGTGTTCGCCAACCCGCCCGACCACTCGGCTC5400CGCTTGGCGTGACCAGGCCCAGCGCCCCGCCGCTGCCTCACGTCGTAGAC5450CTACCACAGCTGGGGCCGCGCCGCTAACCGCGGTCGCTCCGGCCCATGAC5500ACCCCGCCAGTGCCTGATGTTGACTCCCGCGGCGCCATCCTGCGCCGGCA5550GTATAACCTATCAACATCTCCCCTCACCTCTTCCGTGGCCACCGGCACAA5600ATTTGGTTCTTTACGCCGCTCCTCTTAGCCCGCTTCTACCCCTCCAGGAC5650GGCACCAATACTCATATAATGGCTACAGAAGCTTCTAATTATGCCCAGTA5700CCGGGTTGCTCGTGCCACAATTCGCTACCGCCCGCTGGTCCCCAACGCTG5750TTGGTGGCTACGCTATCTCCATTTCGTTCTGGCCACAGACCACCACCACC5800CCGACGTCCGTTGACATGAATTCAATAACCTCGACGGATGTCCGTATTTT5850AGTCCAGCCCGGCATAGCCTCCGAGCTTGTTATTCCAAGTGAGCGCCTAC5900ACTATCGCAACCAAGGTTGGCGCTCTGTTGAGACCTCCGGGGTGGCGGAG5950GAGGAGGCCACCTCTGGTCTTGTCATGCTCTGCATACATGGCTCACCTGT6000AAATTCTTATACTAATACACCCTATACCGGTGCCCTCGGGCTGTTGGACT6050TTGCCCTCGAACTTGAGTTCCGCAACCTCACCCCCGGTAATACCAATACG6100CGGGTCTCGCGTTACTCCAGCACTGCCCGTCACCGCCTTCGTCGCGGTGC6150AGATGGGACTGCCGAGCTCACCACCACGGCTGCTACTCGCTTCATGAAGG6200ACCTCTATTTTACTAGTACTAATGGTGTTGGTGAGATCGGCCGCGGGATA6250GCGCTTACCCTGTTTAACCTTGCTGACACCCTGCTTGGCGGTCTACCGAC6300AGAATTGATTTCGTCGGCTGGTGGCCAGCTGTTCTACTCTCGCCCCGTCG6350TCTCAGCCAATGGCGAGCCGACTGTTAAGCTGTATACATCTGTGGAGAAT6400GCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGA6450ATCCCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGAC6500CGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGTCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCTAAC6550GATGTGCTTTGGCTTTCTCTCACCGCTGCCGAGTATGACCAGTCCACTTA6600CGGCTCTTCGACCGGCCCAGTCTATGTCTCTGACTCTGTGACCTTGGTTA6650ATGTTGCGACCGGCGCGCAGGCCGTTGCCCGGTCACTCGACTGGACCAAG6700GTCACACTTGATGGTCGCCCCCTTTCCACCATCCAGCAGTATTCAAAGAC6750CTTCTTTGTCCTGCCGCTCCGCGGTAAGCTCTCCTTTTGGGAGGCAGGAA6800CTACTAAAGCCGGGTACCCTTATAATTATAACACCACTGCTAGTGACCAA6850CTGCTCGTTGAGAATGCCGCTGGGCATCGGGTTGCTATTTCCACCTACAC6900TACTAGCCTGGGTGCTGGCCCCGTCTCTATTTCCGCGGTTGCTGTTTTAG6950CCCCCCACTCTGTGCTAGCATTGCTTGAGGATACCATGGACTACCCTGCC7000CGCGCCCATACTTTCGATGACTTCTGCCCGGAGTGCCGCCCCCTTGGCCT7050CCAGGGTTGTGCTTTTCAGTCTACTGTCGCTGAGCTTCAGCGCCTTAAGA7100TGAAGGTGGGTAAAACTCGGGAGTTATAGTTTATTTGCTTGTGCCCCCCT7150TCTTTCTGTTGCTTATTT7168核苷酸的縮寫是本領(lǐng)域中標準使用的。在一個方向上的序列按常規(guī)被稱為正鏈(“+”鏈)，因為它是RNA病毒的蛋白質(zhì)編碼鏈，即在上面被示作SEQIDNO.4的序列。SAR-55開放閱讀框的推導(dǎo)出的氨基酸序列是SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。ORF-1從SEQIDNO.4的核苷酸28開始并延伸至核苷酸5078；ORF-2從SEQIDNO.4的核苷酸5147處開始并延伸至核苷酸1979；而ORF-3從SEQIDNO.4的核苷酸5106處開始并延伸至核苷酸368。在構(gòu)思之中的還有DNA序列的變異體，它們導(dǎo)致產(chǎn)生能夠指導(dǎo)產(chǎn)生ORF-2蛋白類似物的DNA序列。如說明書和權(quán)利要求書中所用，“ORF-2蛋白類似物”指氨基酸序列與此處具體給出的序列基本上相同的蛋白質(zhì)，其中此處所述序列中的一個或多個殘基被生物學(xué)上等價的殘基所替代，這樣形成的蛋白質(zhì)(即“類似物”)能夠形成病毒顆粒而且是免疫原性的。應(yīng)注意，上面給出的DNA序列代表了本發(fā)明的一個優(yōu)選例子。由于遺傳密碼的簡并性，所以可以制備許多種核苷酸，它們都是能夠指導(dǎo)合成該ORF蛋白質(zhì)或其類似物的DNA序列。因此，功能上與上述序列等價的DNA序列，或者功能上與指導(dǎo)合成ORF蛋白質(zhì)類似物(按照上述的氨基酸序列產(chǎn)生的)的序列等價的DNA序列都被包括在本發(fā)明之內(nèi)。本發(fā)明涉及一種基于選擇性地擴增戊型肝炎基因片段而在生物樣品中檢測戊型肝炎的方法。較佳地，這種方法采用一對單鏈引物，這一對引物來自DNA雙鏈片段的相對鏈的非同源區(qū)域，而該DNA雙鏈片段又來自在基因組中含有與SEQIDNO.4所示的SAR-55序列同源的區(qū)域的戊型肝炎病毒。這些引物可用于擴增選定核酸序列的方法，如在美國專利No.4,683,202中所述的方法。本發(fā)明還涉及使用衍生自SAR-55cDNA的單鏈反義多聚或寡聚核苷酸來抑制戊型肝炎基因的表達。這些反義的多聚或寡聚核苷酸可以是DNA或RNA。靶序列典型地是信使RNA，更佳地是加工或翻譯RNA所需的信號序列。反義的多聚或寡聚核苷酸可偶連于聚陽離子比如聚賴氨酸，如Lemaitre，M.等人(1989)美國科學(xué)院院報84648-652中所公開的那樣；然后該偶聯(lián)物可給哺乳動物施用，用量足以雜交并抑制信使RNA的功能。本發(fā)明還涉及一種重組DNA方法，它用于制備HEV蛋白質(zhì)，較佳地是含有至少一個ORF蛋白的蛋白質(zhì)，最佳地是含有至少一個ORF-2蛋白的蛋白質(zhì)。重組的ORF蛋白可以由一個ORF構(gòu)成，或者由相同或不同的ORF蛋白組合而成?？墒褂锰烊坏幕蚝铣傻暮怂嵝蛄衼碇笇?dǎo)產(chǎn)生HEV蛋白。在本發(fā)明的一個例子中，該方法包括(a)制備能夠指導(dǎo)宿主有機體產(chǎn)生HEV蛋白質(zhì)的核酸序列；(b)將核酸序列克隆入能夠轉(zhuǎn)入并在宿主有機體中復(fù)制的載體，該載體含有用于該核酸序列的可操作元件；(c)將含有該核酸和可操作元件的載體轉(zhuǎn)入能夠表達蛋白質(zhì)的宿主有機體；(d)在適合擴增載體和表達蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)宿主有機體；和(e)收獲蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一例子中，公開了一種用于重組DNA合成由HEV核酸編碼的蛋白質(zhì)、較佳地由HEV的至少一個ORF編碼的蛋白質(zhì)或者相同或不同ORE蛋白質(zhì)的組合、最佳地由至少一個ORF-2核酸序列編碼的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)在適合產(chǎn)生蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的宿主有機體，該宿主有機體含有能夠指導(dǎo)宿主有機體產(chǎn)生某蛋白質(zhì)的核酸序列，該蛋白質(zhì)與從HEV分離出的，具有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3或其組合的氨基酸序列的天然HEV蛋白質(zhì)基本同源。在一個例子中，如下對HEV株SAR-55的病毒基因組的RNA序列進行分離并克隆cDNA。從用SAR-55感染的獼猴收集生物樣品，然后從中抽提出病毒RNA，再對病毒RNA進行反轉(zhuǎn)錄，并用互補于HEV面甸株(Tam等人(1991))基因組或SAR-55基因組正鏈或負鏈的引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)加以擴增。將PCR片段亞克隆入pBR322或pGEM-32，然后測序雙鏈PCR片段?？捎糜诒景l(fā)明的載體包括任何載體，只要在該載體中可以插入所述的核酸序列，以及任何優(yōu)選的或所需的可操作元件，并且該載體可以隨后被轉(zhuǎn)入宿主有機體并在該有機體中復(fù)制。優(yōu)選的載體是，那些限制性位點已記載清楚而且含有轉(zhuǎn)錄核酸序列所需的或優(yōu)選的可操作元件的載體。如此處所用，“可操作元件”包括至少一個啟動子、至少一個操縱基因、至少一個前導(dǎo)序列、至少一個終止密碼子和其他任何對于載體核酸序列的合適轉(zhuǎn)錄和隨后翻譯所必需或優(yōu)選的DNA序列。特別地，在構(gòu)思之中的是這樣的載體，它含有至少一個被宿主有機體識別的復(fù)制起始點和至少一個供選擇的標記以及至少一個能夠引發(fā)核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。在構(gòu)建本發(fā)明的克隆載體過程中，還應(yīng)注意，可在每個載體中插入多拷貝的核酸序列及其可操作元件。在這樣的例子中，對于每個載體而言，每個宿主有機體會產(chǎn)生更多的所需HEV蛋白質(zhì)?？梢圆迦胼d體的多拷貝DNA序列的數(shù)目僅取決于形成的載體的能力，這些能力受其大小、轉(zhuǎn)入以及在合適的宿主微生物中復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等因素的影響。在另一例子中，將含有HEV蛋白編碼序列的限制性消化片段插入合適的、會在原核或真核細胞中起作用的表達載體?！昂线m的”指載體能夠攜帶和表達為HEV蛋白(較佳地，至少一個完整的ORF蛋白)編碼的完整核酸序列。在ORF-2的情況下，表達的蛋白質(zhì)會形成病毒樣顆粒。優(yōu)選的表達載體是那些能在真核細胞中起作用的種類。這類載體的例子包括但并不限于用于在酵母中表達的載體(如pPIC9載體-Invitrogen)、痘苗病毒載體、腺病毒或皰疹病毒，尤其是桿狀病毒轉(zhuǎn)化載體、pBlueBac。優(yōu)選的載體是p63-2(它含有完整的ORF-2基因)和P59-4(它含有完整的ORF-3和ORF-2基因)。這些載體于1992年9月10日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852，USA)，保藏號為75299(P63-2)和75300(P59-4)。實施例1講述了將ORF-2基因克隆入pBlueBac以產(chǎn)生p63-2的過程。該方法包括用限制酶NruI和BglII消化HEV株SAR-55的基因組，將含有BlnI和BglII應(yīng)點的多接頭插入載體上唯一的NheI位點，然后用銜接頭將NruI-BglIIORF-2片段插入BlnI-BglIIpBlueBac。在另一例子中，選定的重組表達載體可接著被轉(zhuǎn)染入合適的真核細胞系統(tǒng)，以便表達重組蛋白。這種真核細胞系統(tǒng)包括但并不限于酵母和諸如HeLa、MRC-5或Cv-1之類的細胞系。一種優(yōu)選的真核細胞系統(tǒng)是SF9昆蟲細胞。一種優(yōu)選的方法涉及使用pBlueBac表達載體，其中通過鈣沉淀法用重組pBlueBac和AcMNPV桿狀病毒共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞SF9。表達的重組蛋白可用本領(lǐng)域中已知的方法進行檢測，其中包括考馬斯藍染色法和Western印跡法(使用含有抗HEV抗體的血清)，如實施例2中所示。另一方法是用免疫電子顯微鏡檢測病毒樣顆粒，如實施例3中所示。在另一例子中，由SF9細胞表達的重組蛋白可以粗裂解液形式獲得，或者用本領(lǐng)域中已知的標準蛋白質(zhì)純化程序加以純化。純化方法包括差示沉淀、分子篩色譜、離子交換、等電聚焦、凝膠電泳、親和色譜和免疫親和色譜等。在免疫親和色譜中，重組蛋白可通過含有樹脂的柱而純化，其中在樹脂上結(jié)合有對ORF蛋白特異的抗體。在實施例10中提供了純化重組表達的HEVORF蛋白的方案的一個例子。在另一例子中，表達的本發(fā)明的重組蛋白被用于免疫分析，以診斷或預(yù)后哺乳動物中的戊型肝炎。其中哺乳動物包括但并不限于人、黑猩猩、舊大陸猴、新大陸猴、其他靈長目動物。在一個優(yōu)選例子中，免疫分析被用于診斷人的戊型肝炎感染。使用HEV蛋白，尤其是ORF蛋白，特別是ORE-2蛋白而進行免疫分析，提供了高特異性的、靈敏的、可重復(fù)的、診斷HEV感染的方法，這與采用不完整的ORF蛋白而進行的免疫分析形成了鮮明的對比。本發(fā)明的免疫分析可以是放射免疫分析、Western印跡分析、免疫熒光分析、酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光分析、免疫組織化學(xué)分析等。本領(lǐng)域中已知的ELISA標準技術(shù)在“免疫診斷方法”(MethodsinImmunodiagnosis)，第2版，Rose和Bigazzi編輯，JohnWileyandSons，1980和Campbell等人，“免疫學(xué)方法”(MethodsofImmunology)，W.A.Benjamin，Inc.，1964中有描述，這兩篇文獻都在此引用作為參考。這種分析可以是本領(lǐng)域中所述的直接的、間接的、競爭性的或非競爭性的免疫測定。(Oellerich，M.1984.“臨床化學(xué)臨床生物化學(xué)雜志”(J.Clin.Chem.Clin.Biochem.)22895-904)。適用于這種檢測分析的生物樣品包括但并不限于組織解剖抽提物、全血、血漿、血清、腦脊液、胸膜液、尿液等。在一個例子中，測試血清與一固相試劑進行反應(yīng)，該固相試劑表面結(jié)合有作為抗原的重組HEV蛋白，較佳地為ORF蛋白或不同ORF蛋白的組合形式如ORF-2和ORF-3、ORF-1和ORF-3等。較佳地，HEV蛋白是會形成病毒樣顆粒的ORF-2蛋白?？梢杂靡阎膶⒌鞍踪|(zhì)結(jié)合于固相載體材料的技術(shù)制備固相表面試劑。這些結(jié)合方法包括蛋白質(zhì)與載體的非特異吸附或蛋白質(zhì)與載體上反應(yīng)基團的共價結(jié)合。在抗原與抗HEV抗體反應(yīng)之后，通過洗滌而除去未結(jié)合的血清組份，然后抗原-抗體復(fù)合物再與次級抗體(如標記的抗-人抗體)反應(yīng)。標記物可以是在合適熒光試劑或生色試劑的存在下孵育固相載體而被檢測出的酶。其他的合適標記物也可使用，如放射性標記物或膠體金等。在一個優(yōu)選的例子中，由含有完整的SAR-55ORF-2序列的重組載體pBlueBac所表達的蛋白被用作特異性結(jié)合劑，以檢測抗HEV抗體，尤其是IgG或IgM抗體。實施例4和5顯示了ELISA的結(jié)果，其中固相試劑具有重組的ORF-2作為表面抗原。這個由完整的ORF-2核酸序列所編碼的蛋白質(zhì)優(yōu)于不完整的ORF-2蛋白，因為與ORF-2部分抗原相比，它可與更多的、來自被HEV感染的不同靈長目的抗血清反應(yīng)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還能檢測出針對不同HEV株而產(chǎn)生的抗體，但是不會檢測出針對甲型、乙型、丙型或丁型肝炎而產(chǎn)生的抗體。HEV蛋白和類似物可以單獨地或與其他試劑如次級抗體一起被制成試劑盒形式用于免疫測定。本發(fā)明的重組HEV蛋白，較佳地為ORF蛋白或ORF蛋白的重組蛋白，更佳地為ORF-2蛋白和基本同源的蛋白質(zhì)及類似物，可以被用作疫苗以保護哺乳動物免受戊型肝炎的侵襲。作為免疫原的疫苗，可以是細胞、用重組表達載體轉(zhuǎn)染過的細胞的細胞裂解液或含有表達蛋白的培育上清液?；蛘呙庖咴遣糠只蚧炯兓闹亟M蛋白。盡管可以將免疫原以純的或基本純的形式進行施用，但是最好還是以藥物組合物、藥劑或制劑形式使用。本發(fā)明的藥劑可用作獸藥或用于人類，它含有上述的免疫原和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和任選的其他治療成分。載體必須是“可接受的”，意味著與藥劑的其他成分相容而且對接受者無害。藥劑可以方便地作為單位劑量形式，并且可用藥物領(lǐng)域中公知的方法制備。所有的方法包括將活性成分與作為一種或多種附屬成分的載體混合起來。一般，藥劑的制備是通過將活性成分與液態(tài)載體或細分固相載體，或與兩者一起均勻地和緊密地混合在一起，然后如果需要將產(chǎn)品制成所需的藥劑。適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)給藥的藥劑，可以是活性成分與其他溶液(最好與接受者的血液是等滲的溶液)形成的無菌水溶液。這種藥劑可以方便地將固體的活性成分溶解在含有生理相容物質(zhì)如氯化鈉(如0.1-2.0M)、甘油等并且具有與生理條件相容的緩沖pH的水中，以產(chǎn)生水溶液，然后使該溶液無菌。它們可以裝在單劑量或多劑量容器中如密封的安瓿或小瓶。本發(fā)明的藥劑可以加入穩(wěn)定劑。代表性的穩(wěn)定劑是聚乙二醇、蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸、無機酸和有機酸，它們可以單獨使用或混合使用。這些穩(wěn)定劑較佳的加入量相對每份重量的免疫原而言為0.11-10,000重量份數(shù)。如果使用兩種或多種穩(wěn)定劑，那么它們的重量最好在上述范圍之內(nèi)。這些穩(wěn)定劑被用于合適濃度和pH下的水溶液中。這種水溶液的比滲透壓一般為0.1-3.0滲透壓摩爾，較佳地為0.8-1.2滲透壓摩爾。水溶液的pH被調(diào)節(jié)至范圍5.0-9.0，較佳地為6-8之內(nèi)。在配制本發(fā)明的免疫原時，可使用抗吸附劑。還可采用額外的藥物學(xué)方法來控制作用的持續(xù)時間。通過使用聚合物來復(fù)合或吸附蛋白質(zhì)或其衍生物，可以獲得控釋劑。還可以通過選擇合適的大分子(如聚酯、聚氨基酸、乙烯類聚合物、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白)和大分子濃度以及控釋的摻入方法，來實施受控的給藥。另一種通過控釋制劑而控制作用持續(xù)時間的可行方法是，將蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)類似物或其功能衍生物摻入聚合物材料如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物?；蛘撸粚⑦@些試劑摻入聚合物顆粒，而是將這些顆粒截留在例如通過團聚技術(shù)或界面聚合反應(yīng)制備的微囊中，如羥甲基生物素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，或者截留在膠體藥物給藥系統(tǒng)中如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米級顆粒和納米級膠囊，或者截留在大乳狀液(macroemulsion)中。當需要口服制劑時，組合物可以與典型的載體混合，其中有如乳糖、蔗糖、淀粉、滑石硬脂酸鎂、結(jié)晶纖維素、甲基纖維素、羥甲基纖維素、甘油、藻酸鈉或阿拉伯膠。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以單獨作為試劑盒形式提供，也可以上述的藥物組合物的形式提供。接種疫苗可以用常規(guī)方法進行。例如，可以使用在適當稀釋劑如鹽水或水，或完全或不完全的佐劑中的免疫原。此外，為了使蛋白質(zhì)有免疫原性，免疫原可以結(jié)合或不結(jié)合于載體。載體分子的來自包括但并不限于牛血清白蛋白(BAS)、匙孔血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素等。免疫原可以通過任何適合抗體產(chǎn)品的途徑進行給藥，如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下等給藥。免疫原可以給藥一次或者按固定間隔給藥，直至產(chǎn)生大量的抗HEV抗體?？贵w可用免疫測定在血清中檢測出。在另一例子中，免疫原是能指導(dǎo)宿主有機體合成HEVORF蛋白的核酸序列。這種核酸序列可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法插入合適的表達載體。適合在體內(nèi)產(chǎn)生高效基因轉(zhuǎn)化的表達載體包括但并不限于反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和痘苗病毒載體。這些表達載體的可操作元件在本說明書之前已經(jīng)公開并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉。這些表達載體可以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或口服施用。在另一例子中，通過肌內(nèi)注射例如基于質(zhì)粒的真核表達載體(該載體含有能指導(dǎo)宿主有機體合成HEVORF蛋白的核酸序列)而實現(xiàn)直接基因轉(zhuǎn)化。這種方法以前被用過，以便在體內(nèi)產(chǎn)生乙型肝炎表面抗原并導(dǎo)致了針對表面抗原的抗體應(yīng)答(Davis，H.L.等人(1993)“人類分子遺傳學(xué)”，21847-1851；還參見Davis等人(1993)“人類基因治療”，4151-159和733-740)。當免疫原是部分純化或基本純化的重組HEVORF蛋白時，引發(fā)保護性的、針對HEV的抗體應(yīng)答的有效劑量為約2微克-100微克。更佳的范圍為約5微克-70微克，最佳的范圍為約10微克-60微克。對于編碼HEVORF蛋白的核酸序列而言，引發(fā)保護性的、針對HEV的抗體應(yīng)答的有效劑量為約1微克-5000微克。更佳的范圍為約300微克-1000微克。含有能指導(dǎo)宿主有機體合成HEVORF蛋白的核酸序列的表達載體，可以單獨作為試劑盒形式提供，也可以以上述的藥物組合物的形式提供。可以出于預(yù)防或治療目的而施用本發(fā)明的免疫原。當預(yù)防性地施用時，免疫原是在暴露于HEV之前或在出現(xiàn)HEV感染癥狀之前施用。預(yù)防性施用免疫原起到在哺乳動物體中防止或減輕隨后的HEV感染的作用。當治療性地施用時，免疫原在感染發(fā)生時(或發(fā)生后不久)，或者在出現(xiàn)HEV感染或疾病的癥狀時施用。治療性施用免疫原起到減輕感染或疾病的作用。一個優(yōu)選例子是用重組ORF-2蛋白制備的疫苗。該重組ORF-2蛋白由HEV株SAR-55的ORF-2序列或其等價序列所表達。因為已表明重組ORF-2蛋白可與多種HEV陽性血清反應(yīng)，所以表明可用于防止多種HEV株。除了用作疫苗之外，可用組合物制備針對HEV病毒樣顆粒的抗體。這些抗體可直接用作抗病毒劑。為了制備抗體，用病毒顆粒免疫宿主動物，或者合適的話，將產(chǎn)生在病毒顆粒上的非顆?？乖Y(jié)合在載體上，如上對疫苗所述的那樣。按適當?shù)臅r間間隔收集宿主的血清或血漿，從而提供含有與病毒顆粒反應(yīng)的抗體的組合物。例如通過使用飽和硫酸銨或DEAESephadex，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的其他技術(shù)，可以獲得γ球蛋白或IgG抗體。這些抗體基本上沒有那些伴隨其他抗病毒劑如藥物的不良副作用。通過減弱潛在的不良的免疫系統(tǒng)應(yīng)答，可以使抗體組合物與宿主系統(tǒng)更相容。這是通過除去外來物種抗體的全部或部分Fc區(qū)，或者使用與宿主動物同物種的抗體(如使用來自人/人雜交瘤的抗體)而實現(xiàn)的。通過用相應(yīng)的但是無免疫原性的部分來替換抗體的免疫原性部分(即嵌合抗體)，可以產(chǎn)生人源化抗體(即在人體中無免疫原性)。這種嵌合抗體可含有一個物種抗體的活性或抗原結(jié)合部分和另一個物種抗體的Fc區(qū)(無免疫原性)。這種嵌合抗體的例子包括但并不限于非人哺乳動物-人嵌合體、嚙齒動物-人嵌合體、鼠科動物-人嵌合體和大鼠-人嵌合體(Robinson等人，國際專利申請184,187；TaniguchiM.，歐洲專利申請171,496；Morrison等人，歐洲專利申請173,494；Neuberger等人，PCT申請WO86/01533；Cabilly等人，1987“美國科學(xué)院院報”843439；Nishimura等人，1987“癌癥研究”47999；Wood等人，1985“自然”314446；Shaw等人，1988，“國家癌癥研究院雜志”(″J.Natl.CancerInst.″)8015553，這些文獻都在此引用作為參考)?！叭嗽椿鼻逗峡贵w的總回顧由MorrisonS.，1985“科學(xué)”2291202和Oi等人，1986“生物技術(shù)”(″BioTechniques″)4214中提供。合適的“人源化”抗體也可以用CDR或CEA取代法而制備(Jones等人，1986“自然”321552；Verhoeyan等人，1988“科學(xué)”2391534；Biedler等人，1988，“免疫學(xué)雜志”1414053，這些文獻都在此引用作為參考)。還可通過遺傳工程來產(chǎn)生抗體或抗原結(jié)合片段。在大腸桿菌中表達重鏈和輕鏈基因的技術(shù)是PCT專利申請出版號WO901443。WO901443和WO9014424，以及Huse等人，1989“科學(xué)”2461275-1281中的主題。抗體還可用作增加免疫應(yīng)答的手段。可以按與其他治療性地施用抗體時相類似的劑量來施用抗體。例如在其他病毒疾病如狂犬病、麻疹和乙型肝炎的潛伏早期，按0.02-0.1毫升/磅體重施用混合的γ球蛋白以干擾病毒進入細胞。因此，與HEV病毒顆粒反應(yīng)的抗體可被動地單獨或與其他抗病毒劑一起給受HEV感染的宿主施用，以增加抗病毒藥物的功效?；蛘撸ㄟ^將抗獨特型抗體作為免疫原施用，可以誘導(dǎo)出抗HEV抗體。方便地，可以用上述制備的、純化的抗HEV抗體制劑在宿主動物中誘導(dǎo)抗獨特型抗體。將在合適稀釋劑中的組合物施用給宿主動物。在施用(通常是重復(fù)施用)后，宿主會產(chǎn)生抗獨特型抗體。為了消除對Fc區(qū)的免疫應(yīng)答，可使用與宿主動物相同物種產(chǎn)生的抗體，或者將所用抗體的Fc區(qū)去除。在宿主動物中誘導(dǎo)抗獨特型抗體之后，取出血清或血漿，從而提供抗體組合物。組合物可用上述抗HEV抗體的純化方法進行純化，或者使用結(jié)合于親和基質(zhì)的抗HEV抗體通過親和色譜而純化。產(chǎn)生的抗獨特型抗體在構(gòu)象上與真的HEV抗原相似，它可在不使用HEV顆?？乖那闆r下用于制備HEV疫苗。當用作在動物中誘導(dǎo)抗HEV病毒抗體的手段時，可以用與疫苗一樣的方式即肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下等注射有效濃度的、在生理上合適的稀釋劑中的抗體，其中可以有或沒有佐劑。進行一次或多次的加強注射是有利的。本發(fā)明的HEV衍生蛋白也可用于產(chǎn)生暴露前或暴露后預(yù)防用的抗血清。其中，HEV蛋白或蛋白混合物與合適的佐劑一起配制，然后根據(jù)已知方法通過注射給志愿者而進行給藥，以便產(chǎn)生人抗血清。在免疫后數(shù)周期間，通過定期采集血清樣本，用此處所述的免疫測定檢測抗HEV血清抗體的存在與否從而監(jiān)測對注入蛋白質(zhì)的抗體應(yīng)答情況。來自免疫個體的抗血清可作為受接觸感染威脅的個體的暴露前預(yù)防手段?？寡暹€可用于治療暴露后的個體，這類似于使用高效價的針對乙型肝炎病毒的抗血清進行暴露后預(yù)防。當然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會輕易地理解，用標準技術(shù)從免疫個體的抗血清中純化出的免疫球蛋白(HEV免疫球蛋白)，可用作暴露前預(yù)防措施或用于治療暴露后的個體。對于體內(nèi)使用針對HEV病毒樣顆粒和蛋白的抗體和抗獨特型抗體以及診斷用途，優(yōu)選使用單克隆抗體。單克隆抗病毒顆粒的抗體或抗獨特型抗體可如下產(chǎn)生。用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的方法，從免疫動物中取出脾或淋巴細胞，并進行使之無限增殖化，或者用于制備雜交瘤(Goding，J.W.1983.“單克隆抗體原理和實踐(″MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice″)，PladermicPress，Inc.，NY，NY，pp.56-97)。為了產(chǎn)生人-人雜交瘤，可選擇人淋巴細胞供體。已知可被HEV感染的供體(其中通過例如在血液中存在抗病毒抗體或通過病毒培育而表明發(fā)生了感染)可作為合適的淋巴細胞供體。淋巴細胞可從外周血樣品中分離出，或者如果供體進行脾切除術(shù)，那么可使用脾細胞?？捎肊pstein-Barr病毒(EB病毒)使人淋巴細胞無限增殖化，或者使用人融合配偶物(partner)來產(chǎn)生人-人雜交瘤。用肽進行的原發(fā)性體外免疫也可用于產(chǎn)生人單克隆抗體?？珊Y選由無限增殖化細胞分泌的抗體，以確定分泌具有所需特異性的抗體的克隆。對于單克隆的抗病毒顆粒抗體，抗體必須結(jié)合HEV病毒顆粒。對于單克隆抗獨特型抗體，抗體必須結(jié)合抗病毒顆粒抗體。選擇出產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的細胞。上述的抗體和抗原結(jié)合片段可以單獨地以試劑盒形式提供，或者作為藥物組合物提供，供體內(nèi)使用。如本文所述，抗體可用于治療用途、免疫測定中的診斷用途或作為純化ORF蛋白的免疫親和劑。材料實施例中使用的材料如下靈長動物黑猩猩(Chimp)(Pantroglodyes)。舊大陸猴獼猴(Cyno)(Macacafascicularis)、恒河猴(Rhesus)(M.mulatta)、豚尾猴(PT)(M.nemestrina)、和非洲綠猴(AGM)(Cercopithecusaethiops)。新大陸猴須絹毛猴(mustachedtamarins)(Tam)(Saguinusmystax)、松鼠猴(SQM)(Saimirisciureus)和夜猴(OWL)(Aotustrivigatus)。靈長動物在生命危險受控制的條件下單獨飼養(yǎng)。動物的居住、維護和照顧達到或超過靈長動物飼養(yǎng)業(yè)的所有標準。大多數(shù)動物用0.5毫升稀釋在胎牛血清中糞便懸浮液中所含的HEV株SAR-55進行靜脈內(nèi)接種，如Tsarev，S.A.等人(1992)，美國科學(xué)院院報，89559-563；和Tsarev，S.A.等人(1993)，“感染疾病雜志”(″J.Infect.Dis.″)(1671302-1306)中所述。Chimp-1313和1310用從7個巴基斯坦戊型肝炎病人中收集而來的糞便混合物進行接種。在接種之前和之后每周約兩次收集血清樣品。用市售的測試品(MedpathInc.，Rockville，MD)分析肝酶血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、異檸檬酸脫氫酶(ICD)和γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)的水平。血清學(xué)測試如上所述進行。實施例1鑒別HEV株SAR-55基因組的DNA序列制備用于PCR的病毒RNA模板?；旌螲EV感染的獼猴的膽汁(10微升)、20(重量/體積)SDS(至終濃度為1％)、蛋白酶K(10mg/ml；至終濃度為1mg/ml)、1微升tRNA(10mg/ml)和3微升0.5MEDTA，最終體積為250微升，然后在55℃溫育30分鐘。在65℃，用苯酚/氯仿(1∶1，v/v)從膽汁中抽提總核酸二次，然后用氯仿抽提一次，再用乙醇沉淀，用95％乙醇洗滌，然后用于RT-PCR。當RNA被更全面地加以純化時，通過RT-PCR擴增來自糞中，尤其來自血清中的HEVRNA會更有效。同上用蛋白酶K處理血清(100微升)或10％糞便懸浮液(200微升)。在溫育30分鐘后，加入300微升CHAOS緩沖液(4.2M硫氰酸胍、0.5N月桂?；“彼?0.025MTris-HCl，pH8.0)。在65℃，用苯酚/氯仿萃取核酸兩次，然后在室溫下用氯仿萃取。再將7.5M乙酸銨(225微升)加入上相，并用0.68毫升2-丙醇沉淀核酸。沉淀溶解在300微升CHAOS緩沖液中，然后加入100微升水。重復(fù)氯仿萃取和2-丙醇沉淀步驟。將核酸溶解在水中，用乙醇沉淀，用95％乙醇洗滌，再用于RT-PCR。引物。用AppliedBiosystems391型DNA合成儀合成94個引物，它們的長度為21-40核苷酸(nt)并且互補于緬甸HEV株(BUR-121)基因組或SAR-55基因組的正鏈或負鏈(Tam，A.W.等人(1991)，“病毒學(xué)”(″Virology″)，185120-131)。這94個引物的序列示于下面，從SEQIDNO.5一直到SEQIDNO.98。HEV引物表引物ORF序列區(qū)域D3042B1ACATTTGAATTCACAGACATTGTGCSEQIDNO.5R3044B1ACACAGATCTGAGCTACATTCGTGAGSEQIDNO.6D3044B1AAAGGGATCCATGGTGTTTGAGAATGSEQIDNO.7R3045B1ACTCACTGCAGAGCACTATCGAATCSEQIDNO.8R261S1CGGTAAACTGGTACTGCACAACSEQIDNO.9D260S1AAGTCCCGCTCTATTACCCAAGSEQIDNO.10D259S1ACCCACGGGTGTTGGTTTTTGSEQIDNO.11R255S1TTCTTGGGGCAGGTAGAGAAGSEQIDNO.12R254S2TTATTGAATTCATGTCAACGGACGTCSEQIDNO.13D242S1AATAATTCATGCCGTCGCTCCSEQIDNO.14R241S1AAGCTCAGGAAGGTACAACTCSEQIDNO.15R231S1AAATCGATGGCTGGGATCTGATTCSEQIDNO.16R230S1GAGGCATTGTAGAGCTTTGTGSEQIDNO.17D229S1GATGTTGCACGGACAGCAAATCSEQIDNO.18D228S1ATCTCCGATGCAATCGTTAATAACSEQIDNO.19D227B1TAATCCATTCTGTGGCGAGAGSEQIDNO.20R218B2AAGTGTGACCTTGGTCCAGTCSEQIDNO.21D217B2TTGCTCGTGCCACAATTCGCTACSEQIDNO.22D211B1CATTTCACTGAGTCAGTGAAGSEQIDNO.23D202B2TAATTATAACACCACTGCTAGSEQIDNO.24R201B2GATTGCAATACCCTTATCCTGSEQIDNO.25R200S1ATTAAACCTGTATAGGGCAGAACSEQIDNO.26R199S1AAGTTCGATAGCCAGATTTGCSEQIDNO.27R198S2TCATGTTGGTTGTCATAATCCSEQIDNO.28R193B1GATGACGCACTTCTCAGTGTGSEQIDNO.29R192B1AGAACAACGAACGGAGAACSEQIDNO.30R191B1AGATCCCAGCCATCGACTTTGSEQIDNO.31R190S2TAGTAGTGTAGGTGGAAATAGSEQIDNO.32D189B2GTGTGGTTATTCAGGATTATGSEQIDNO.33D188B2ACTCTGTGACCTTGGTTAATGSEQIDNO.34R187S2AACTCAAGTTCGAGGGCAAAGSEQIDNO.35D186S2CGCTTACCCTGTTTAACCTTGSEQIDNO.36D185B2，3ATCCCCTATATTCATCCAACCAACSEQIDNO.37D184S2，3CTCCTCATGTTTCTGCCTATGSEQIDNO.38R181S2GCCAGAACGAAATGGAGATAGCSEQIDNO.39R180B1CTCAGACATAAAACCTAAGTCSEQIDNO.40D179S1TGCCCTATACAGGTTTAATCGSEQIDNO.41D178B1ACCGGCATATACCAGGTGCSEQIDNO.42D177B2ACATGGCTCACTCGTAAATTCSEQIDNO.43R174B1AACATTAGACGCGTTAACGAGSEQIDNO.44D173S1CTCTTTTGATGCCAGTCAGAGSEQIDNO.45D172B1ACCTACCCGGATGGCTCTAAGGSEQIDNO.46R166B2TATGGGAATTCGTGCCGTCCTGAAG(EcoRI)SEQIDNO.47R143B1AGTGGGAGCAGTATACCAGCGSEQIDNO.48D141B1CTGCTATTGAGCAGGCTGCTCSEQIDNO.49R142S1GGGCCATTAGTCTCTAAAACCSEQIDNO.50D135B1GAGGTTTTCTGGAATCATCSEQIDNO.51R134B1GCATAGGTGAGACTGSEQIDNO.52R133B1AGTTACAGCCAGAAAACCSEQIDNO.53D132S2，3CCATGGATCCTCGGCCTATTTTGCTGTTGCSEQIDNO.54TCC(BamHI)D131B5′NCAGGCAGACCACATATGTGSEQIDNO.55R119B1GGTGCACTCCTGACCAAGCCSEQIDNO.56D118B1ATTGGCTGCCACTTTGTTCSEQIDNO.57R117B1ACCCTCATACGTCACCACAACSEQIDNO.58R116B1GCGGTGGACCACATTAGGATTATCSEQIDNO.59D115B1CATGATATGTCACCATCTGSEQIDNO.60D114B1GTCATCCATAACGAGCTGGSEQIDNO.61R112B2AGCGGAATTCGAGGGGCGGCATAAAGAACCAGGSEQIDNO.62(EcoRI)R111B2GCGCTGAATTCGGATCACAAGCTCAGAGGCSEQIDNO.63TATGCC(EcoRI)D110B2GTATAACGGATCCACATCTCCCCTTACCTC(BamHI)SEQIDNO.64D109B2TAACCTGGATCCTTATGCCGCCCCTCTTAG(BamHI)SEQIDNO.65D108B1AAATTGGATCCTGTGTCGGGTGGAATGAATSEQIDNO.66AACATGTC(BamHI)R107B1ATCGGCAGATCTGATAGAGCGGGGACTTGCCGGATCCSEQIDNO.67D101B2TACCCTGCCCGCGCCCATACTTTTGATGSEQIDNO.68R100B1GGCTGAGATCTGGTTCGGGTCGCCAAGAAGGTGSEQIDNO.69BglII)R99B2TACAGATCTATACAACTTAACAGTCGG(BglII)SEQIDNO.70R98B2GCGGCAGATCTCACCGACACCATTAGTAC(BglII)SEQIDNO.71D97S1CCGTCGGATCCCAGGGGCTGCTGTCCTG(BamHI)SEQIDNO.72R96B2AAAGGAATTCAAGACCAGAGGTAGCCTCCTCSEQIDNO.73(EcoRI)D95B2GTTGATATGAATTCAATAACCTCGACGGSEQIDNO.74R94B3′NCTTTGGATCCTCAGGGAGCGCGGAACGCAGASEQIDNO.75AATGAG(BamHI)D90B2TCACTCGTGAATTCCTATACTAATAC(EcoRI)SEQIDNO.76R89B3′NCTTTGGATCCTCAGGGAGCGCGGAACGCAGASEQIDNO.77AATG(BamHI)R88B1TGATAGAGCGGGACTTGCCGGATCC(BamHI)SEQIDNO.78R87B1TTGCATTAGGTTAATGAGGATCTCSEQIDNO.79D86B1ACCTGCTTCCTTCAGCCTGCAGAAGSEQIDNO.80R81B1GCGGTGGATCCGCTCCCAGGCGTCAAAAC(BamHI)SEQIDNO.81D80B1GGGCGGATCGAATTCGAGACCCTTCTTGG(EcoRI)SEQIDNO.82R79B1AGGATGGATCCATAAGTTACCGATCAG(BamHI)SEQIDNO.83D78B1GGCTGGAATTCCTCTGAGGACGCCCTCAC(EcoRI)SEQIDNO.84R77B1GCCGAAGATCTATCGGACATAGACCTC(BglII)SEQIDNO.85R76B2CAGACGACGGATCCCCTTGGATATAGCCTG(BamHI)SEQIDNO.86D75B5′NCGGCCGAATTCAGGCAGACCACATATGTGGTSEQIDNO.87CGATGCCATG(EcoRI)D72B1GCAGGTGTGCCTGGATCCGGCAAGT(BamHI)SEQIDNO.88R71B1GTTAGAATTCCGGCCCAGCTGTGGTAGGTC(EcoRI)SEQIDNO.89D63B1CCGTCCGATTGGTCTGTATGCAGGSEQIDNO.90D61B1TACCAGTTTACTGCAGGTGTGCSEQIDNO.91D60B1CAAGCCGATGTGGACGTTGTCGSEQIDNO.92R59B2，3GGCGCTGGGCCTGGTCACGCCAAGSEQIDNO.93D50B1GCAGAAACTAGTGTTGACCCAGSEQIDNO.94R49B2TAGGTCTACGACGTGAGGCAACSEQIDNO.95R48B1TACAATCTTTCAGGAAGAAGGSEQIDNO.96R47B1CCCACACTCCTCCATAATAGCSEQIDNO.97D46B1GATAGTGCTTTGCAGTGAGTACCGSEQIDNO.98在序列左邊的縮寫含義如下R和D分別指反向或正向引物；B和S分別指序列衍生自戊型肝炎緬甸-121株和戊型肝炎SAR-55株；5′NC和3′NC分別指HEV基因組5’和3’非編碼區(qū)域；1，2和3分別指來自開放閱讀框1、2或3的序列。在某些所示序列右邊的符號()中給出了插入這些序列中的人工限制性位點。為了克隆PCR片段，在引物的5′端添加了位于3-7個核苷酸之后的EcoRI、BamHI或BglII限制性位點。RT-PCR。通常100微升RT-PCR混合物含有模板、10mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、2.5mMMgCl2、所有4種dNTP(各0.2mM)、50pmol正向引物、50pmol反向引物、40單位RNasin(Promega)、16單位鳥成髓細胞過多癥病毒反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)、4單位AmpliTaq(Cetus)，在其上方為100微升輕礦物油。混合物在42℃溫育1小時，然后擴增35個PCR循環(huán)94℃1分鐘，45℃1分鐘和72℃1分鐘。PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上分析?？寺CR片段。在末端含有限制性位點的PCR片段用EcoRI和BamHI，或用EcoRI和BglII限制性酶進行消化，然后克隆人EcoRI/BamHI-消化過的pBR322或pGEM3Z(Promega)?；蛘?，用TA克隆試劑盒(Invitrogen)將PCR片段克隆入pCR1000(Invitrogen)。PCR片段和質(zhì)粒的測序。從1％瓊脂糖凝膠中切取PCR片段，用Geneclean(Bio101，LaJolla，CA)純化。按Winship，P.R.(1984)，NucleicAcidRev，171266中所述，用Sequenase(UnitedStatesBiochemical)測序雙鏈PCR片段。用Sequenase試劑盒(UnitedStatesBiochemical)測序經(jīng)氯化銫梯度純化的雙鏈質(zhì)粒。序列的計算機分析。用7.5版本的GeneticsComputerGroup(Madison，WI)軟件包(Devereaux，J.等人(1984)，“核酸研究回顧”，12387-395)，在VAX8650計算機(國立癌癥研究院，F(xiàn)rederick，MD)上比較HEV株的核酸序列。實施例2構(gòu)建重組表達載體P63-2含有HEV株SAR-55基因組的完整ORF-2的質(zhì)粒(Tsarev，S.A.等人(1992)，美國科學(xué)院院報，89559-563)被用于獲得限制性片段NruI-BglII。NruI在ORF-2的ATG起始密碼子上游5個核苷酸處切割HEVcDNA。剛好在polyA序列之前的HEV基因組3′端以前已有一個人工BglII位點(Tsarev，S.A.等人(1992)，美國科學(xué)院院報，89559-563)。為了將該片段插入pBlueBac-Transfer載體(Invitrogen)，在載體唯一的NheI位點處引入一個合成的多接頭。該多接頭含有HEVcDNA和pBlueBac序列中都缺乏的BlnI和BglII位點。用銜接頭將NruI-BglIIORF-2片段插入BlnI-BglIIpBlueBac，如圖1所示。實施例3P63-2在SF9昆蟲細胞中的表達按照Invitrogen的方案，用鈣沉淀法將p63-2和AcMNPV桿狀病毒(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染入SF9細胞(Invitrogen)。按照這個方案，AcMNPV桿狀病毒DNA可產(chǎn)生活的、完整的桿狀病毒，它會將p63-2包裝起來形成重組桿狀病毒。通過噬菌斑純化該重組桿狀病毒4次。得到的重組桿狀病毒63-2-IV-2被用于感染SF9細胞。SDS-PAGE和Western印跡法。將昆蟲細胞再懸浮于加樣緩沖液中(50mMTris-HCl，pH6.8，100mMDTT，2％SDS，0.1％溴酚藍和10％甘油)，然后按Laemmli，U.K.(1970)，″自然″，227680所述的方法進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠用考馬斯藍染色，或者將蛋白質(zhì)電印跡于BA-85硝酸纖維素濾膜(Schleicher&amp;Schuell)。在轉(zhuǎn)化后，硝酸纖維素濾膜在含10％胎牛血清和0.5％明膠的PBS中封閉。將1∶1000稀釋的黑猩猩-1313的超免疫血清用作第一抗體。將1∶2000稀釋的、磷酸酶標記的、經(jīng)親和純化的、針對人IgG的羊抗體(Kirkegaard&amp;PerryLaboratories，Inc.)用作第二抗體。濾膜在Western藍穩(wěn)定化的底物中對堿性磷酸酶進行顯色(Promega)。所有的溫育都在封閉緩沖液中進行，洗滌是用含0.05％Tween-20(Sigma)的PBS進行。HEVORF-2的表達。在用重組桿狀病毒63-2-IV-2感染的SF9細胞中合成的主要蛋白是表觀分子量為74KD的蛋白質(zhì)(圖2A，泳道3)。該大小比完整ORF-2的預(yù)計分子量(71KD)稍大。大小差異可以是由蛋白質(zhì)的糖基化造成的，因為在N-末端部分有至少一個潛在的糖基化位點(Asn-Leu-Ser)。沒有在未感染細胞(圖2A，泳道1)或用野生型非重組桿狀病毒感染的細胞(圖2A，泳道2)中檢測到這個蛋白質(zhì)。在后一種情況下，檢測到的主要蛋白質(zhì)是多角體蛋白。用黑猩猩-1313(已用HEV超免疫過)的血清，通過Western印跡分析同樣的裂解液時(圖2B)，只有重組細胞裂解液中的蛋白發(fā)生反應(yīng)(泳道3)，而且主條帶仍是74KD的蛋白質(zhì)(圖2B)。在考馬斯藍染色的凝膠中約25、29、35、40-45和55-70千道爾頓的次條帶(圖2A，泳道3)也在Western印跡中與血清反應(yīng)(圖2B，泳道3)。某些分子量大于74KD的條帶是不同程度的糖基化所造成的，而分子量較小的條帶可能反映了加工和/或降解。用Western印跡法顯示，在用HEV接種之前從黑猩猩-1313中取出的血清不與任何蛋白質(zhì)反應(yīng)。實施例4重組感染的SF9細胞的免疫電鏡顯微觀察5×106個重組感染的SF9細胞，在含10mMTris-HCl，pH7.4，0.3％十二烷基肌氨酸鈉的氯化銫(1.30克/毫升)溶液中進行超聲波處理，然后在40,000rpm(SW60Ti)離心68小時。將50微升ELISA應(yīng)答最高的、浮力密度為1.30克/毫升的組份稀釋于1毫升PBS中，然后加入5微升黑猩猩-1313的超免疫血清。超免疫血清是通過用戊型肝炎的第二種株(墨西哥HEV)再侵襲已感染過的黑猩猩而制備的。樣品在室溫下溫育1小時，然后在4℃溫育過夜。用SW60Ti離心機轉(zhuǎn)頭在30,000rpm，4℃下離心2小時而沉淀出免疫復(fù)合物。將沉淀再懸浮于蒸餾水中，用3％PTA負染色，置于碳載網(wǎng)上，在電子顯微鏡EM-10(CarlZeiss，Oberkochen，德國)上，于40,000放大倍數(shù)下檢查。VLP的檢測。用野生型桿狀病毒或重組桿狀病毒63-2-IV-2感染的昆蟲細胞的細胞裂解液，通過氯化銫密度離心進行分級。當來自重組感染昆蟲細胞的氯化銫梯度組份與黑猩猩-1313超免疫血清混合時，在浮力密度為1.30克/毫升的組份中觀察到兩種覆蓋著抗體的病毒樣顆粒(virus-likeparticle，VLP)第一種(圖3A-3A)，是覆蓋有抗體的各顆粒，其大小(30納米)和形態(tài)結(jié)構(gòu)暗示它是HEV，第二種(圖3B)，是被抗體包裹的、由小于HEV(約20納米)但其他方面很象HEV的顆粒構(gòu)成的聚集體。直接的電子顯微鏡觀察顯示，存在非常不均一的物體群，其中包括某些直徑分別為30納米和20納米的物體，它們看上去象病毒顆粒，但是在沒有結(jié)合的抗體的情況下，不能被證實為HEV。大量免疫電鏡顯微試驗揭示，至少部分從HEV基因組ORF-2區(qū)域合成出的蛋白質(zhì)已被裝配成顆粒結(jié)構(gòu)。觀察到，感染晚期的昆蟲細胞，此時較小的蛋白質(zhì)的比例更高，一律在ELISA中給出更佳的結(jié)果。因此，來自感染晚期的重組昆蟲細胞的未分級裂解液，在隨后的試驗中被用作ELISA的抗原。實施例5在用不同株的HEV感染后，根據(jù)來自表達完整的抗HEVORF-2的昆蟲細胞的抗原而進行ELISA檢測將5×106個用63-2-IV-2病毒感染過的SF9細胞懸浮在1毫升的10mMTris-HCl，pH7.5，0.15NaCl中，然后凍融3次。將10微升這種懸浮液溶解在10毫升碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中，然后用于覆蓋一個柔性的微效價分析板(Falcon)。以1∶20、1∶400和1∶8000，或者以1∶100、1∶1000和1∶10000的比例稀釋血清樣品。在ELISA中使用Western印跡法中所述的同樣的封閉劑和洗滌溶液。作為次級抗體，使用針對人IgG的偶連過氧化酶的羊IgG片段或偶連辣根過氧化物酶的羊抗-舊大陸猴或抗-新大陸猴的免疫球蛋白。結(jié)果是在405納米處通過測量光密度(O.D.)而確定。為了確定代表HEV巴基斯坦株的、來自昆蟲細胞的抗原是否能檢測出用HEV墨西哥株感染的獼猴中的抗-HEV抗體，檢查了3只猴子(圖4)。用含有墨西哥’86HEV株(Ticehurst，J.等人，(1992)，傳染病雜志，165835-845)的糞便感染2只猴子cyno-80A82和cyno-9A97。而第3只猴子用相同株的第二代進行感染。作為對照，在同一試驗中測試來自cyno-374(被巴基斯坦HEV株SAR-55感染的)的血清樣品。所有3只用墨西哥株感染后的猴子血清轉(zhuǎn)變?yōu)榭笻EV。用第一代感染的動物在15周時血清轉(zhuǎn)變，而用第二代感染的動物在5周時血清轉(zhuǎn)變。令人感興趣的是，在4只動物中，最高的抗HEV效價是在cyno-83中發(fā)現(xiàn)的，而cyno-83是用墨西哥株的第二代接種的。用第一代墨西哥株接種的獼猴產(chǎn)生最低的效價，而用第一代巴基斯坦株接種的獼猴產(chǎn)生介于其中的效價。實施例6根據(jù)來自表達完整ORF-2的昆蟲細胞的抗原，進行抗-HEV特異性的ELISA分析為了估計此處所述的ELISA分析是否排斥其他類型的肝炎相關(guān)抗體而特異性地檢查抗HEV，分析一組4只用其他已知肝炎病毒(Garci，P.等人(1992)，傳染病雜志，1651006-1011；Farci，P.等人(1992)，科學(xué)(出版中)；Ponzetto，A.等人(1987)，傳染病雜志，15572-77；Rizzetto，M.等人(1981)肝炎學(xué)，1567-574；有關(guān)黑猩猩-1413、1373、1442、1551(HAV)和有關(guān)黑猩猩-982、1442、1420、1410(HBV)的參考資料是來自Purcell等人的未發(fā)表資料。)感染的黑猩猩的血清樣品(表1)。在接種前、接種后5周和15周時的血清樣品在1∶100、1∶1000和1∶10000的血清稀釋比下進行HEVELISA分析。用HAV、HBV、HCV和HDV感染的動物中，沒有一種血清在ELISA分析中呈現(xiàn)HEV抗體反應(yīng)，但是用HEV接種的所有4只黑猩猩都產(chǎn)生了IgM和IgG級的抗HEV抗體。表1血清學(xué)分析用不同的肝炎病毒(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型)感染的黑猩猩中的抗HEV抗體黑猩猩接種的病毒對接種病毒發(fā)生血清轉(zhuǎn)變的周數(shù)前血清接種后的周數(shù)51520/25IgGIgMIgGIgMIgGIgMIgGIgM黑猩猩-1413HAV5------黑猩猩-1373HAV7------黑猩猩-1442HAV5------黑猩猩-1451HAV5------黑猩猩-982HBV3------黑猩猩-1442HBV7--------黑猩猩-11420HBV9------黑猩猩-1410HBV5------黑猩猩-51HCV10------黑猩猩-502HCV12------黑猩猩-105HCV28------黑猩猩-793HCV13------黑猩猩-904HDV8------黑猩猩-814HDV7------黑猩猩-800HDV10------黑猩猩-29HDV10--------黑猩猩-1310HEV5--1∶10,0001∶1001∶10,000-黑猩猩-1374HEV3--1∶8000-*1∶8000-黑猩猩-1375HEV3--1∶80001∶4001∶400-黑猩猩-1313HEV第一次**5--1∶10,0001∶1001∶1000-黑猩猩-1313HEV第二次**0.51∶100-1∶10,000-1∶10,000-</table></tables>*黑猩猩-1374在接種后3、4周左右對抗HEVIgM呈陽性(見圖5)。**黑猩猩-1313用HEV接種2次。第一次用7個巴基斯坦病人的混合樣品接種，第二次是45個月后用HEV墨西哥株接種。實施例7確定HEVSAR-55株在除人之外的靈長目動物中的宿主范圍用HEV的標準糞便懸浮液通過靜脈內(nèi)接種不同的靈長目動物，然后收集一系列的血清樣品以監(jiān)測感染情況。確定血清ALT水平作為有肝炎的標志，而血清轉(zhuǎn)變被定義為抗HEV的增加。將這些結(jié)果與在獼猴和黑猩猩中獲得的結(jié)果進行比較。用HEV接種的兩只恒河猴(表2)都表現(xiàn)出非常明顯的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性和強抗-HEV應(yīng)答。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性于第35天時在2只猴子中觀察到，而血清轉(zhuǎn)變發(fā)生于21天。抗HEV的最大效價在29天時達到。在該研究中所用的2只非洲綠猴(表2)都表現(xiàn)出增加的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性和抗-HEV。盡管非洲綠猴230在接種后7周時死亡，但是在死亡之前已獲得了感染證據(jù)。對于猴子74而言，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的峰值超過接種前血清的平均值約3倍；對于猴子230而言，超過約5倍。在猴子74和230中，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性和血清轉(zhuǎn)變的峰值分別在28天和21天同時出現(xiàn)。表2在8種靈長目物種中HEV感染的生物化學(xué)和血清學(xué)情況注-，沒有檢測到抗-HEV。*，以前曾經(jīng)用在細菌中表達的HEV蛋白片段作為抗原進行過研究[18]+，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的生物式(biomodal)升高。SD＝標準差豚尾猴99顯示，其丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性比接種前的血清平均值的增加＞3SD，而豚尾猴98不顯示。然而2只猴子都在第21天發(fā)生血清轉(zhuǎn)變，而且抗-HEV效價與黑猩猩和舊大陸猴的效價相當。因為在豚尾猴中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶峰值低，所以不能完全排除是免疫而不是感染的可能性。然而，出于多種原因，不太可能是免疫。首先，在2只絹毛猴中都沒有觀察到免疫。這些絹毛猴只有豚尾猴的1/4大小但接受了相同量的接種物。其次，眾所周知在糞便中排泄出的HEV數(shù)量一般是非常少的，因而在本研究中所用的0.5毫升10％糞便懸浮液不太可能含有數(shù)量足以免疫動物的抗原，尤其是通過靜脈內(nèi)接種時。在本研究中接種的絹毛猴，其丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性都沒有顯著上升，也沒有出現(xiàn)抗-HEV(表2)。因此，這些動物似乎不被感染。松鼠猴產(chǎn)生抗-HEV，但是水平明顯低于黑猩猩和舊大陸猴(表2)。此外，在其他動物中血清轉(zhuǎn)變出現(xiàn)得更晚。松鼠猴868在41天發(fā)生血清轉(zhuǎn)變，而869在35天時發(fā)生。在大于3個月的監(jiān)測期中，任何時候的抗-HEV都不大于1∶20，很明顯在47-54天達到峰值之后2只動物中的抗-HEV變?nèi)?。但是，?只動物中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的增加相當顯著，并且與血清轉(zhuǎn)變的時間暫時相關(guān)。夜猴對HEV感染的應(yīng)答與舊大陸猴物種相似(表2)。2只夜猴在21天血清轉(zhuǎn)變，并且在28天之前抗-HEV效價達到1∶8000的數(shù)值。夜猴924的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性于35天達到峰值，而猴925在49天才達到峰值。實施例8在黑猩猩中檢測IgM和抗-HEVIgG在2只黑猩猩中，在接種后約4周其血清ALT水平增加(表2，圖5)。2只黑猩猩在ALT酶上升時或更早的時候發(fā)生血清轉(zhuǎn)變(圖5A，5C)。還測定了黑猩猩抗-HEVIgM的水平。在黑猩猩-1374中，抗-HEVIgM的效價(圖5B)沒有IgG效價(圖5A)那么高，而且在2周后下降。盡管IgG和IgM抗體在20天時首先在該動物中檢測到，但是在那一天抗-HEVIgM的效價最高而IgG的效價在那一天最低，但其隨后上升并在3個月多的時間停留在幾乎相同的水平上。在黑猩猩-1375中，在20天僅檢測到抗-HEVIgG(圖5D)。該效價比黑猩猩1374中的高，而抗-HEVIgM在整個監(jiān)測期間都檢測到。在該動物中，抗-HEVIgG先在27天被觀察到(圖5D)，而且它在整個試驗中基本維持相同水平。實施例9基于昆蟲細胞中表達的完整ORF-2蛋白的ELISA和基于大腸桿菌中表達的結(jié)構(gòu)蛋白片段的ELISA之間的比較為了估計在真核細胞中表達HEV基因組的完整ORF區(qū)域是否比在大腸桿菌中表達結(jié)構(gòu)蛋白片段更有利，我們用以前的ELISA中的抗原來重新測試早先已分析過的獼猴血清(Tsarev，S.A.等人(1992)，美國科學(xué)院院報，89559-563；和Tsarev，S.A.等人(1993)傳染病雜志，1671302-1306)，其中使用在細菌中表達的抗原片段(表3)。表3.基于來自表達完整ORF-2蛋白的昆蟲細胞的抗原的ELISA和基于來自表達結(jié)構(gòu)蛋白片段的大腸桿菌的抗原的ELISA之間的比較獼猴編號來自細菌細胞的抗原來自昆蟲細胞的抗原(完整的ORF-2)(ORF-2片段)*抗-HEV第一次檢測到抗-HEV第一次檢測到的效價最大效價的日期日期獼猴-37628211∶4001∶8000獼猴-36954401∶1001∶8000獼猴-37419191∶4001∶8000獼猴-37526261∶4001∶8000獼猴-37921191∶1001∶8000獼猴-38128281∶4001∶8000*血清還用更不靈敏的ORF-3抗原進行測試[..]。(Tsarev，S.A.等人(1993)傳染病雜志，1671302-1306)對于用ELISA檢查的6只猴子中的3只，在昆蟲細胞中表達的抗原可比在大腸桿菌中表達的抗原更早地檢測出血清轉(zhuǎn)變。使用來自昆蟲細胞的抗原，我們能在所有6只猴子的血清中在測試的最高稀釋度(1∶8000)下檢測到抗-HEV抗體。用來自大腸桿菌的抗原(緬甸株)時，沒有獲得抗-HEV效價的信息，因為所有的血清僅在1∶100的稀釋度下進行測試(Tsarev，S.A.等人(1992)，美國科學(xué)院院報，89559-563；和Tsarev，S.A.等人(1993)傳染病雜志，1671302-1306)。在另一研究中，戊型肝炎病毒SAR-55株以10倍遞增進行連續(xù)稀釋，將10-1至10-5稀釋物接種于各對獼猴以測定病毒的效價。測量血清的ALT水平以確定肝炎，而針對HEV的血清抗體用本發(fā)明的ELISA法進行測定(數(shù)據(jù)在圖中)或通過Genelab的ELISA法進行測定(三個ELISA，每個ELISA基于Yarbrough等人(病毒學(xué)雜志，(1991)655790-5797)的、名稱為4-2、3-2和612的抗原中的一種。(數(shù)據(jù)在圖6a-g的底部，陽性為(+)，陰性為(-))。所有的樣品都按標準進行測定。在所有接種過的獼猴和所有稀釋度的病毒中，本發(fā)明的ELISA法都檢測到了向抗-HEVIgG的血清轉(zhuǎn)變。相反，Genelab′s法的結(jié)果變化很大，如下面所總結(jié)的那樣。表4病毒的稀釋度Genelab′sELISA本發(fā)明的ELISA10-1未測試陽性10-2對2只動物呈陽性，有限期限內(nèi)陽性10-3對2只動物呈陰性陽性10-4獼猴389對IgM和IgG為陽性陽性獼猴383陰性陽性10-5獼猴386陰性陽性獼猴385陽性陽性因為獼猴385(10-5)在用Genelabs和本發(fā)明的ELISA測試時都為陽性，所以10-4(接種的病毒大10倍)和10-3(接種的病毒大100倍)也應(yīng)是陽性的。本發(fā)明ELISA將其定為陽性。與之相反，Genelab′sELISA在10-3時漏了2個陽性，而在10-4時漏了一個陽性，盡管獼猴383的ALT水平暗示為陽性肝炎。因此，這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的ELISA法優(yōu)于已有技術(shù)中檢測針對HEV抗體的方法。實施例10基于重組ORF-2抗原的ELISA比較，其中該抗原或者由從HEV巴基斯坦SAR-55株的完整ORF-2區(qū)域表達出的55kDa蛋白質(zhì)，或者由較短的作為融合蛋白在細菌中表達的ORF-2區(qū)域的構(gòu)成如實施例3中所述和如圖2A和2B中所示，在用含完整ORF-2的重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達出許多種不同分子量的蛋白質(zhì)。如下，在接種后7天時從5×108個SF-9細胞中部分純化出分子量約為55kDa的蛋白質(zhì)離心感染的細胞，再懸浮于10毫升10mMTris-HCl(pH8.0)、50mMNaCl、含40微克/毫升苯基甲基磺酰氯(Sigma，StLouis，Missouri)的溶液中，超聲波破細胞，然后裂解液在4℃于90,000×g離心30分鐘。將上清液上樣于用10mMTris-HCl(pH8.0)、50mMNaCl平衡的DEAE-瓊脂糖凝膠CL-6B(PHarmacia，Uppsala，Sweden)柱。用上樣緩沖液洗滌柱，然后用10mMTris-HCl(pH8.0)、250mMNaCl洗脫55kDa蛋白。合并含55kDa蛋白的組分，通過向10毫升蛋白質(zhì)溶液中加入3克(MH4)2SO4而沉淀出蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)沉淀溶解在10mMTris-HCl(pH8.0)、50mMNaCl中。再將55kDa蛋白用作ELISA分析中的昆蟲細胞表達的HEV抗原，與基于細菌表達的兩種HEV抗原中任何一種(3-2(墨西哥)(Goldsmith等人，(1992)柳葉刀，339328-331)或SG3(緬甸)(Yarbough等人，(1993)AssayDevelopmentofdiagnostictestsforHepatitisE在″InternationalSymposiumonViralHepatitisandLiverDisease.ScientificProgramandAbstractVolume.″中，東京VHFLp.87))而進行的ELSA進行比較試驗。這些細菌抗原是26kDa谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與3-2(M)抗原序列(該序列由位于ORF-2C末端上游6個氨基酸處的42個氨基酸構(gòu)成)(Yarbough等人，(1991)病毒學(xué)雜志，655790-5797)，或者與ORF-2的327個C末端氨基酸形成的融合蛋白(Yarbough等人，(1993))。ELISA如下進行。將處于碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中的60ng/孔55kDa蛋白或200ng/孔融合抗原在聚苯乙烯微量滴定板(Dynateck，S.Windham，ME)于37℃溫育2小時。板用含10％胎牛血清和0.5％明膠的PBS進行封閉。來自用含10-1-10-8(如表5和圖7A-7J和8A-8D中所示)SAR-55株HEV的糞便稀釋液靜脈內(nèi)接種的獼猴的血清樣品(注意獼猴389和392是口服接種的)，在封閉液中以1∶100稀釋。將1∶1000或1∶2000稀釋的偶連過氧化物酶的羊抗-人IgM(Zymed，SanFrancisco，CA)，或者按1∶1000稀釋的過氧化物酶標記的羊抗-人免疫球蛋白用作檢測抗體。在除了針對2只口服接種猴子(獼猴-387和獼猴-392)之外的所有的ELISA測試中，在同一實驗室中同時測試55kDa抗原和融合抗原，這樣僅有的可變因素便是所有的抗原。評分與55kDa抗原的抗HEVELISA中陽性反應(yīng)的標準是，光密度值≥0.2并且大于同一動物的接種前血清樣品光密度值的2倍。此外，因為在細菌中表達的2種抗原都是與GST的融合蛋白，所以與這些抗原測試的樣品的光密度值必須比用非融合的GST獲得的數(shù)值大3倍才能被認為是陽性的(Goldsmith等人，1992)。結(jié)果用10-1稀釋度的標準HEV糞便懸浮液接種的2只獼猴(377，378)，其ALT活性在接種4-5周后有明顯增加，這表示有肝炎(表5，圖7A和7B)。表5用含10-1-10-8稀釋度的SAR-55HEV接種物標準液接種后，在獼猴中發(fā)生的生物化學(xué)和血清學(xué)事件的總結(jié)1接種前血清的ALT平均值和標準差(SD)數(shù)值。+該試驗在15周后結(jié)束。*獼猴-380的接種前血清的OD值，當用55kDa抗原進行ELISA進行測試時，為其他獼猴接種前血清平均值的2倍高?！斐双J猴-387和獼猴-392之外的所有ELISA測試都在相同試驗中進行。-未檢測。ND-未進行。所有3種測試的抗原都在從獼猴377中于接種后3周取出的樣品中檢測到抗-HEVIgM(表5，圖8A)，但是不能在來自第二只猴子獼猴-378的所有樣品中檢測到抗-HEVIgM。在基于55kDa的ELISA中，在2只猴子中都檢測到抗-HEVIgG，但是在基于融合抗原的ELISA中僅在獼猴-377中被檢測到?？?HEVIgG的OD值明顯高于抗-HEVIgM的OD值。用55kDa抗原獲得的ELISA值也明顯高于用2種融合抗原中任一種所獲得的ELISA值(圖7A和7B)。在2種來源的抗原的ELISA中所觀察到的OD值的模式也明顯不同。在基于融合抗原的ELISA中，陽性信號在血清轉(zhuǎn)變后不久便到達最大值，然后在15周的試驗中下降。在基于55kDa抗原的ELISA中，陽性信號在血清轉(zhuǎn)變后不久便到達最大值，并且試驗中(15周)基本維持一樣高的水平。在2只用10-2稀釋度標準HEV糞便懸浮液接種的猴子(394和395)中ALT活性的升高情況，在預(yù)期的肝炎時間明顯低于用高10倍劑量接種的動物(表5，圖7C和7D)。在接種前以及在接種后15周時，獼猴-395確實有更高的ALT活性。后者可能與HEV感染無關(guān)。弱陽性的抗-HEVIgM僅在獼猴-394中(圖8B)和基于55kDa抗原的試驗中檢測到。然而，2只動物都是被感染的，因為在2只動物中都觀察到抗-HEV血清轉(zhuǎn)變。在獼猴-394中，在第3周首先由55kDa抗原以及在晚一周之后用3-2(M)檢測到抗HEVIgG。SG(3)抗原不能在獼猴-395中檢測出血清轉(zhuǎn)變，而且抗-HEVIgG僅被55kDa抗原檢測出。在該動物中，抗HEV的效價傾向于隨時間而下降。獼猴-380和獼猴383是用10-3稀釋度標準HEV糞便懸浮液接種的(表5，圖7E、7F和8C)。獼猴-380在接種之前和之后有波動的ALT活性；因此，在該動物中ALT水平不能用于記錄戊型肝炎。在獼猴-383中，觀察到ALT活性的輕微上升(圖7F)，這與血清轉(zhuǎn)變同時發(fā)生，因此這可能是中度的戊型肝炎造成的。在獼猴-380的血清中，用3種抗原中的任何一種都不能檢測出抗-HEVIgM。當用SG3(B)測試時，獼猴-380發(fā)生了向抗-HEVIgG的血清轉(zhuǎn)變，但是用3-2(M)抗原測試時不顯示。雖然用55kDa抗原測試時，該動物有已有的抗-HEVIgG，但是從5周時開始抗-HEVIgG有大大的增加(圖7E)。早先已報道過在來自另一獼猴的血清中鑒別出早已存在的抗體(Ticehurst，J.等人，(1992)，傳染病雜志，165835-845；Tsarev等人，(1993)傳染病雜志，168369-378)。在預(yù)計時間發(fā)生了血清轉(zhuǎn)變，但是在來自獼猴-383的樣品中抗-HEVIgG水平仍低，僅能用55kDa抗原檢測出。獼猴-389和獼猴-393是用10-4稀釋度標準HEV糞便懸浮液接種(圖7G、7H、8D和表5)。沒有一只動物的ALT活性明顯上升，盡管在5周時在獼猴-393的血清中確定了一個小的但明顯的ALT峰(圖7H)，這暗示界線型肝炎?；赟G(B)或3-2(M)的ELISA將2只動物都評為HEV感染陰性。與之相反，55kDa抗原于接種后6-8周在獼猴-389的血清中檢測到抗-HEVIgM(圖8D)而且在6周-15周時在2只動物中都檢測出抗-HEVIgG。沒有1只用10-5稀釋度標準HEV糞便懸浮液接種的動物產(chǎn)生ALT活性的明顯上升(表5)，但是在獼猴-386中，在8-13周和8-15周用55kDa抗原分別檢測出抗-HEV的IgM和IgG(圖7J，8E)。獼猴-385的抗-HEVIgG可用55kDa和3-2(M)抗原檢測出但不能用SG3(B)抗原檢測出。與前面模式相反，用融合蛋白檢測出抗-HEVIgG的時間比用55kDa抗原檢測出早4周，而且檢測出的抗-HEVIgG水平也更高。沒有1只用10-6至10-8稀釋度標準HEV糞便懸浮液接種的動物產(chǎn)生對3種抗原的任一種的抗體，而且在那些動物中沒有觀察到ALT活性的上升，除了在獼猴-400中于第9周時有一個相當顯著的ALT活性峰(表5)。然而，在該動物中沒有血清轉(zhuǎn)變的情況表明，這個峰可能與HEV感染無關(guān)。至于用10-1稀釋度的10％糞便懸浮液口服接種2只獼猴(387和392)中，沒有一只猴子被感染，因為ALT水平?jīng)]有上升而且用3-2(M)和55kDa抗原進行的ELISA沒有檢測出對HEV的血清轉(zhuǎn)變(表5)。最后，在用10-1至10-5稀釋度的糞便懸浮液接種的所有動物中都發(fā)現(xiàn)了HEV感染的血清學(xué)證據(jù)；在接受更高稀釋度的動物中沒有這種證據(jù)。用ALT升高而確定的明顯肝炎，僅在用10-1稀釋度顯示的2只猴子中觀察到。在某些用更高稀釋度糞便懸浮液接種的動物中觀察到ALT活性低得多的升高，而在另一些動物中則沒有發(fā)現(xiàn)升高。單獨考慮時，這些低幅度的ALT上升不能診斷肝炎。但是血清轉(zhuǎn)變和這些ALT峰出現(xiàn)的同時發(fā)生暗示，在這些動物中存在中度的肝炎。在用10-1至10-5稀釋度的糞便懸浮液接種的所有動物中都檢測到抗-HEVIgG血清轉(zhuǎn)變。在用更高稀釋度原液接種的動物中，觀察到抗-HEVIgG的水平趨于下降而且血清轉(zhuǎn)變的時間趨晚?？傊?，55kDa巴基斯坦ORF-2抗原比3-2(M)或SG3(B)抗原更有效地檢測被HEV巴基斯坦株感染的獼猴中的抗-HEVIgM和IgG。例如對于除獼猴-385之外的所有動物血清，用55kDa抗原都比3-2(M)或SG3(B)抗原更有效地檢測出抗-HEVIgM和IgG。在所有10只用10-5或更低稀釋度糞便接種的動物中檢測抗-HEVIgG時，用55KDa抗原進行的ELISA產(chǎn)生了內(nèi)在的一致的和可重復(fù)的結(jié)果。ELISA信號的大小也隨著接種物的被稀釋而下降。融合抗原在各對動物之間不產(chǎn)生一致的結(jié)果。在用10-1、10-2、10-3或10-5稀釋度接種的各對動物中僅有1只顯示出向抗-HEVIgG的血清轉(zhuǎn)變，而且用這些抗原僅檢測出一個向抗-HEVIgM的血清轉(zhuǎn)變。沒有1只用10-4稀釋度的原接種物接種的動物發(fā)生針對兩種融合抗原中任何一種的血清轉(zhuǎn)變，盡管1只動物(獼猴-393)用55KDa抗原分析時有持續(xù)高水平的抗-HEVIgG。如上所述，盡管對抗-HEVIgM的ELISA的靈敏度明顯低于對獼猴抗-HEVIgG的ELISA的靈敏度，但是與3-2(M)或SG3(B)抗原相比55KDa抗原能夠在更多的動物中檢測出抗-HEVIgM?？傊?，有關(guān)該研究中所用的巴基斯坦病毒接種物感染效價的確定性的結(jié)論，不能根據(jù)基于3-2(M)和SG3(B)的ELISA的合并數(shù)據(jù)而得出，但是可僅根據(jù)55KDa巴基斯坦株的ELISA獲得的數(shù)據(jù)而得出。至于獼猴-385，在2個測試結(jié)果中的抗-HEVIgG的差別是4周。這些數(shù)據(jù)暗示，在3-2(M)抗原上存在區(qū)別性的、在較大的55kDa和SG3(B)抗原上不存在的、被該動物識別的表位。當含有完整ORF-2(75kDa)和55kDa蛋白的全昆蟲細胞裂解液被用作抗原重新測試這些樣品時，結(jié)果與僅用55kDa時的結(jié)果一樣。這個發(fā)現(xiàn)暗示，55kDa蛋白可能不缺少3-2表位氨基酸，而是在該研究中所用的3種抗原中的3-2表位序列的構(gòu)象有差別。最后，感興趣地注意到，盡管抗原SG3(B)含有更長的ORF-2部分而且包含表位3-2的全部序列，但是它不能比3-2(M)抗原檢測出更多的陽性血清。實施例11用RT-PCR確定HEVSAR-55病毒原液的感染效價有關(guān)接種物感染效價的知識對于解釋在動物模型的試驗感染中許多獲得的數(shù)據(jù)是至關(guān)重要的。然而，直到目前為止，還沒有報道過HEV病毒原種的感染效價。抽提10倍稀釋的、含有HEVSAR-55株的糞便懸浮液，然后如下進行RT-PCR擴增，以確定能檢測出HEV基因組的最高稀釋度。將200微升懸浮液與0.4毫升1.5MNaCl加15％聚乙二醇(PEG)8000混合，在4℃保溫過夜。在微離心機(Beckman，PaloAlto，CA)上于16,000g離心3分鐘而收集沉淀，然后將沉淀溶于475微升溶液(含4.2M異硫氰酸胍，0.5％N-月桂?；“彼帷?.25MTris-HCl(pH8.0)，0.15M二硫蘇糖醇(DTT)和1.0微克tRNA)中。接著加入50微升1MTris-HCL(pH8.0)、100mMEDTA和10％SDS。RNA用苯酚-氯仿(1∶1)抽提2次，然后在室溫下用氯仿抽提一次。向上相中加入250微升7.5M乙酸銨，用0.6毫升2-丙醇沉淀出核酸，用75％乙醇洗滌，用100％乙醇洗滌，然后用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)PCR。為了檢測HEV基因組，使用2套代表SAR-55基因組的3′區(qū)域(ORF-2)序列的嵌套引物。用于逆轉(zhuǎn)錄和第一次PCR的引物分別為SEQIDNO.99GTATAACGGATCCACATCTCCCCTTACCTC和SEQIDNO.100TACAGATCTATACAACTTAACAGTCGG。而用于第二次PCR的引物分別是SEQIDNO.101GCGGCAGATCTCACCGACACCATTAGTAC和SEQIDNO.102TAACCTGGATCCTTATGCCGCCCCTCTTAG。將RNA沉淀溶解在20微升0.05MTris-HCl(pH7.6)、0.06MKCl、0.01MMgCl2、0.001MDTT、40單位的RNasin(PromegaBiotec，Madison，WI)、16單位禽成髓細胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(PromegaBiotec)，和10pmol逆轉(zhuǎn)錄引物，然后在42℃溫育1小時。向20微升逆轉(zhuǎn)錄酶混合物中加入100微升0.01MTris-HCl(pH8.4)、0.05MKCl、0.0025MMgCl2、0.0002M各種dNTP，50pmol直接引物，50pmol逆轉(zhuǎn)錄引物和4單位AmpliTaq(Perkin-ElmerCetus，Norwalk，CT)，再覆蓋100微升輕礦物油。HEVcDNA擴增35個循環(huán)94℃1分鐘，55℃1分鐘和72℃1分鐘，PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上分析。然后將5微升這種混合物用于第二輪的相同條件下的擴增反應(yīng)，不同點是延伸時間增加到3分鐘。用10-1至10-5的各種稀釋度的標準HEV糞便產(chǎn)生的RT-PCR產(chǎn)物(圖9)，在2％瓊脂糖凝膠上分離，然后通過溴化乙錠(EB)對凝膠染色而進行檢測。觀察到在更高的稀釋度下特異PCR產(chǎn)物數(shù)量的下降，而檢測出HEV基因組的10％糞便懸浮液的最高稀釋度為10-5。因此，考慮到稀釋因素，HEV基因組效價約為106.7/克糞便。此外，僅那些用RT-PCR顯示含有HEV基因組的稀釋度是對獼猴有感染的。因此，標準糞便懸浮液的感染效價及其用RT-PCR檢測的基因組效價基本上相同。在RT-PCR和感染力效價之間的類似相關(guān)關(guān)系在另一丙型肝炎株中發(fā)現(xiàn)過(Cristiano等人，(1991)，肝炎學(xué)，1451-55；Farci等人(1991)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，2598-104；Bukh等人，(1992)美國科學(xué)院院報，89187-191)。實施例12將ORF-2蛋白用作疫苗進行主動免疫和用抗-HEV陽性恢復(fù)血清進行被動免疫在基于55KDaORF-2蛋白的ELISA中為HEV抗體陰性(＜1∶10)的獼猴(Macacafascicularis)在BL-2生命危險防范下被單獨居住，然后將含巴基斯坦HEV株SAR-55的、已稀釋至含有10,000或1000CID50的糞便懸浮液(于胎牛血清中)用于靜脈內(nèi)接種動物。對于主動免疫研究，從5×108個在感染后7天收獲的SF-9細胞中純化出桿狀病毒重組表達的55kDaORF-蛋白，如實施例10中所述。將3毫克純化的55kDa蛋白用明礬沉淀，然后用0.5毫升含有50微克明礬沉淀出的55kDa蛋白的疫苗，通過肌內(nèi)注射而免疫8只獼猴。4只猴子接受一次劑量，而另4只猴子接受二次劑量，其中間隔4周。在最后一次免疫后4周，用1,000-10,000CID50的HEV靜脈內(nèi)侵襲這些靈長目動物。4只獼猴在主動免疫研究中作為對照。獼猴-412和413接受一次空白對照劑(0.5毫升磷酸鹽緩沖液)，而獼猴-397和849接受了2次空白對照劑。對照動物用1,000-10,000CID50的HEV進行侵襲。對于被動免疫研究，用0.5毫升10％混合的、含有兩種中國HEV分離株KS1-1987和KS2-1987的糞便懸浮液感染獼猴-384，然后在恢復(fù)期從動物體重復(fù)收集血漿(Yin等人，(1993)醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志，41230-241)。約1％獼猴-396和獼猴-399的血液以及10％獼猴-401和獼猴-402的血液用來自獼猴-384的、HEV抗體效價為1∶10,000的恢復(fù)期血漿加以替換。在注入血漿后2天，用1000CID50HEV侵襲動物。作為對照，在用HEV感染之前，10％獼猴-405的血液用從獼猴-384獲得的抗-HEV陰性血漿加以替換。然后用1000CID50HEV侵襲獼猴-405。對于被動和主動免疫研究，在接種前和接種后15周，對肝進行皮膚針刺活組織檢查和收集血清和糞便樣品。用市售的測試手段(MetpathInc.，Rockville，MD)測試血清的丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平，并將患肝炎的生物化學(xué)證據(jù)定義為ALT增加2倍或更多。肝活組織檢查按標準進行，而采用的抗-HEVELISA描述于實施例10中。RNA抽提和RT-PCR的進行如實施例11中所述，不同點在于按制造商的方案，用TRIzol試劑(GibcoBRL，Gaithersburg，Maryland)抽提來自100微升血清或來自100微升糞便懸浮液的RNA。對于定量，合并來自各動物的PCR陽性系列血清或糞便，然后在胎牛血清中按10倍進行連續(xù)的稀釋。將100微升各種稀釋液如該實施例前面所述的那樣，用于RNA抽提和RT-PCR。用于該研究的PCR方案檢測水平可低至10CID50HEV/毫升血清和低至100CID50/毫升糞便。對于接種之前5周和接種之后15周的每周血清樣品的ALT峰值，對各個動物以比例(之后/之前)的形式表示。用Simes測試法，將對照組動物的該比例的幾何平均值與被動或主動免疫的動物的數(shù)值進行比較(Simes，R.J.(1986)Biometrika，73751-754)。用Wilcoxon測試法(Noether，G.(1967)非參數(shù)統(tǒng)計學(xué)要素(Elementsofnonparametricstatsitics)(JohnWiley&amp;SonsInc.，NewYork)，pp.31-36)，將對照組動物的病毒血癥和散布在糞便中病毒的持續(xù)時間以及HEV基因組效價與被動或主動免疫的動物進行比較。用相同的測試比較被動免疫和主動免疫動物之間的上述各參數(shù)。對于統(tǒng)計分析，在1毫升血清中HEV基因組＜10的血清樣品被指定為效價為1∶1，而在1克糞便中HEV基因組＜100的糞便樣品被指定為效價為1∶10。結(jié)果在非免疫動物中戊型肝炎的感染進程。在5只用HEV侵襲的非免疫動物中的3只，記錄到了肝炎的生物化學(xué)證據(jù)，因為血清ALT值增加至少2倍。在2只動物中，沒有發(fā)現(xiàn)ALT活性的明顯增加。但是，組織病理學(xué)數(shù)據(jù)記錄了所有5只動物中的肝炎，如表6所示。表6在接種過的動物和對照動物用HEV侵襲后的組織病理學(xué)、生物化學(xué)、血清學(xué)和病毒學(xué)情況</tables>*在肝中的壞死-炎癥變化分成1+、2+、3+和4+，然后將每周的評分加起來。+免疫預(yù)防在獼猴-396中在2周內(nèi)檢測到1+等級的壞死-炎癥變化，但是它們與僅持續(xù)一周的病毒性肝炎相符?！飓J猴013在侵襲后9周死亡。壞死-炎癥變化一般在1+至4+的尺度下為1+和2+之間，而且在具有這種升高中的動物中暫時性地與ALT活性的升高相關(guān)。所有的對照動物在侵襲后3-5周發(fā)生血清轉(zhuǎn)變，并產(chǎn)生為1∶1,000至1∶32,000最大HEV抗體效價。在感染即肝炎的嚴重程度和抗-HEV應(yīng)答水平之間有良好的相關(guān)性。獼猴-405具有最高的累積肝炎評分，它也具有最長時間的病毒血癥和病毒排泄以及最高水平的抗-HEV(表6)。散布在糞便中的病毒的持續(xù)時間與病毒血癥的持續(xù)時間一樣長或更長。對于所有的對照動物，在血清中的HEV基因組效價(10-3至10-4.7)比在糞便中效價(10-5.7至10-7)低。在所有這些5只動物中，病毒血癥和散布在糞便中的病毒在4-11周內(nèi)被檢測到，即平均為在血清轉(zhuǎn)變后4.2周內(nèi)被檢測到(從2-9周)。被動免疫。對于獼猴-396和399，約1％的它們血液用抗-HEV陽性恢復(fù)期血漿加以替換，結(jié)果在轉(zhuǎn)輸(侵襲的時刻)后2天測定時它們的HEV抗體血漿為1∶40(表6)。在轉(zhuǎn)輸后1周時在2只動物中觀察到HEV抗體效價的2倍下降，而且在轉(zhuǎn)輸后2周內(nèi)HEV抗體下降至可檢測水平(＜1∶10)之下。在獼猴-396中在侵襲后5周而在獼猴-399中在侵襲后4周，同樣檢測到抗-HEV，這表示發(fā)生了HEV感染。在侵襲后9-10周達到最大的HEV抗體效價(1∶8,000)。二只獼猴中沒有一只在侵襲后表現(xiàn)出ALT活性的明顯上升。在獼猴-396中檢測到肝炎的組織學(xué)證據(jù)，而且在2只動物的血清和糞便中都檢測到HEV基因組(表6)。獼猴-401和402的約10％血液用恢復(fù)期血漿加以替換。在轉(zhuǎn)輸(侵襲的時刻)后2天，在2只獼猴中的HEV抗體效價為1∶200(表7)。表7在對照的和免疫的獼猴中的HEV抗體情況</tables>抗-HEV在兩只動物中于侵襲后15周連續(xù)地進行檢測，在獼猴-401中達到最大效價1∶4,000但在獼猴-402中最大效價僅為1∶80。在獼猴-401中達到最大效價1∶4,000但在獼猴-402中最大效價僅為1∶80。生物化學(xué)和組織學(xué)分析沒有揭示在2只動物中有肝炎。然而，在2只動物中，觀察到病毒血癥和散布在糞便中的病毒，這表明發(fā)生了感染(表6)。因此，達到較高抗體效價的被動性免疫預(yù)防可以保護獼猴抵抗HEV侵襲后的肝炎。主動免疫。用50微克55kDa蛋白免疫的4只靈長目動物產(chǎn)生了針對重組蛋白的、效價為1∶100-1∶10,000(表7)的抗體。一頭動物(獼猴013)在侵襲后9周死于一次麻醉事故，并包含在分析中(表6)。接受雙劑量抗原的4頭動物產(chǎn)生效價為1∶10,000的HEV抗體。4頭動物中的2頭在HEV靜脈內(nèi)侵襲后死亡。這也可能是麻醉事故的結(jié)果，但是沒有確定確切的病原。這2頭動物從進一步的分析中刪去。6只余下的動物中沒有一只在侵襲后產(chǎn)生異常的ALT水平或肝炎的組織學(xué)證據(jù)(表6)。用1或2劑量的55kDa蛋白免疫的獼猴沒有得病毒血癥。然而，4只接受1個劑量的免疫原的動物中有3只在糞便中排泄病毒。與之相反，在2只接受2個劑量疫苗的受侵襲動物中都沒有觀察到排泄病毒。大多數(shù)主動免疫動物比被動免疫動物產(chǎn)生更高的HEV抗體。然而，與用抗-HEV血漿被動免疫的2只動物中1∶200的效價相比，獼猴-013在侵襲時HEV抗體效價為1∶100。但是，獼猴-013顯示出比被動免疫動物更大的抗HEV感染的保護能力。獼猴-009(它在侵襲時的HEV抗體的效價為1∶1000)是完全抗肝炎和HEV感染的(表6)。與之相反，盡管在侵襲時的HEV抗體效價為1∶10,000，但是獼猴-003被感染而且在糞便中有散落的HEV。但是在該動物以及接受1個劑量免疫原且HEV抗體效價為10,000或更高的獼猴中，沒有檢測到肝炎或病毒血癥。對照的和免疫的動物中HEV感染進程的比較。如用組織病理學(xué)手段檢測的那樣，所有免疫的動物，除了一只被動免疫的猴子，都在用HEV靜脈內(nèi)侵襲后有抗肝炎的保護。將對照組與被動免疫和主動免疫動物之間的肝炎嚴重程度和病毒復(fù)制水平的平均值的比較揭示，一般地，感染嚴重程度與侵襲時HEV抗體效價反相關(guān)，而且以下列次序遞減未免疫的＞被動免疫(1％)＞被動免疫(10％)＞主動免疫(1劑量)＞主動劑量(2劑量)(表6，8)。然而，在被動和主動免疫動物的2個亞組中的每一組中的動物數(shù)目都不足以進行統(tǒng)計分析。因此，統(tǒng)計分析是將合并后的被動免疫組和合并后的主動免疫組分別與合并的對照組進行的。該分析的結(jié)果列于表8。表8在對照的和免疫的動物中HEV感染的平均值總結(jié)<p>它們顯示，在對照組中的組織病理學(xué)評分和組織變化的持續(xù)時間與被動或主動免疫的動物在統(tǒng)計學(xué)上是不同的。當與被動或主動免疫的動物相比時，在對照組中ALT峰值的更高的接種前/接種后比例在統(tǒng)計上是顯著的，這表明，在2組免疫動物中都有針對肝炎生物化學(xué)顯示的保護。病毒血癥的持續(xù)時間和糞便中HEV的效價在2組免疫動物中明顯低于對照組。然而，病毒散落持續(xù)時間和血清中HEV效價的差異在對照組和被動免疫組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，盡管當對照組與主動免疫組進行比較時這些參數(shù)是顯著不同的。對于病毒血癥和糞便散落以及HEV效價，還在被動免疫組和主動免疫組的動物之間發(fā)現(xiàn)了顯著差異?？傊?，在表6-8中所示的數(shù)據(jù)顯示，被動地或主動地獲得的HEV抗體兩者都保護獼猴在用毒HEV侵襲后抵抗肝炎。盡管在用1,00-10,000CID50的SAR-55侵襲后，所有的5只未免疫的獼猴都產(chǎn)生了肝炎的組織學(xué)證據(jù)，但是被動性地獲得1∶200抗體效價的2只動物沒有患肝炎，而且抗體效價低至1∶40的2只動物中的1只也沒有患肝炎。然而，應(yīng)注意，主動免疫動物表現(xiàn)出完全的抗肝炎保護而且能比被動免疫動物更有效地抗HEV感染。例如，與被動免疫動物中獲得的結(jié)果不同，在用HEV侵襲后沒有在主動免疫動物中檢測到病毒血癥。在用重組55kDa蛋白免疫一次或兩次后，可在獼猴中達到高至1∶10,000的HEV抗體效價。盡管1只猴子(013)在主動免疫后產(chǎn)生1∶100的效價，但是這個水平仍然防止了肝炎和病毒血癥。主動免疫研究還表明，盡管單劑量疫苗可防止HEV病毒血癥，但是仍可檢測到在糞便中散落的病毒。但是，觀察到2劑量的疫苗可防止肝炎和HEV感染的所有癥狀。因此，這些暗示，例如給個體在外出旅行前施用單劑量的免疫可以保護它們在高危環(huán)境中不得戊型肝炎。最后，注意到給出的結(jié)果與以前報道的、對非人類的靈長動物進行被動和主動免疫預(yù)防以防甲型肝炎而獲得的結(jié)果非常類似被動性免疫預(yù)防可防止肝炎但是不能防止感染，而接種不僅可防止肝炎而且可防止HAV感染(Purcell，R.H.等人(1992)疫苗，105148-5149)。此處所給出的有關(guān)HEV免疫預(yù)防的研究與以前的針對HAV的免疫預(yù)防的研究，在確定保護的抗體效價(＜1∶100)和在用毒病毒靜脈內(nèi)侵襲后的結(jié)果這2方面是相一致的，這是人們感興趣的。因為其他研究已經(jīng)表明了在人中被動性和主動性獲得相當效價的抗-HEV的有效性，而且已經(jīng)證實了在肝炎研究中靈長動物研究的預(yù)測性價值(Stapleton，J.，等人(1985)胃腸學(xué)，89637-642；Innis，B.L.，等人，疫苗，10S159)，所以很有可能用這些獼猴中的結(jié)果可預(yù)期在人中可起保護作用。實施例13在酵母中完整ORF-2蛋白和更小分子量片段的直接表達4種cDNAORF-2片段編碼1.完整的ORF-2蛋白(氨基酸1-660，分子量70979)，片段1778-1703。(其中片段號碼指下面給出的引物號碼)2.從第34個氨基酸開始的ORF-2蛋白(氨基酸34-660，分子量67206)，片段1779-17033.從第96個氨基酸開始的ORF-2蛋白(氨基酸96-660，分子量60782)，片段1780-17034.從第124個氨基酸開始的ORF-2蛋白(氨基酸124-660，分子量58050)，片段1781-1703它們是通過PCR而獲得的，其中將質(zhì)粒P63-2用作模板并使用下列合成的寡核苷酸SEQIDNO.103(反向引物#1073)GCACAACCTAGGTTACTATAACTCCCGAGTTTTACC，SEQIDNO.104(正向引物#1778)GGGTTCCCTAGGATGCGCCCTCGGCCTATTTTG，SEQIDNO.105(正向引物#1779)CGTGGGCCTAGGAGCGGCGGTTCCGGCGGTGGTSEQIDNO.106(正向引物#1780)GCTTGGCCTAGGCAGGCCCAGCGCCCCGCCGCT和SEQIDNO.107(正向引物#1781)CCGCCACCTAGGGATGTTGACTCCCGCGGCGCC。在SEQIDNO.103-107中所示的所有序列都在其5′端的4個核苷酸之后含有人工序列CCTAGG。人工序列是AvrII(BlnI)限制酶的識別位點。用BlnI切割合成的PCR片段，然后將其連入pPIC9載體(圖10)(Invitrogen)的AvrII位點。通過限制性分析而確定方向正確的片段，其中使用存在于ORF-2序列和載體上的不對稱EcoRI位點。按照Invitrogen的方案，使用純化的重組質(zhì)粒pPIC9-1778(含有片段1778-1703)、pPIC9-1779(含有片段1779-1703)、pPIC9-1780(含有片段1780-1703)和pPIC9-1781(含有片段1781-1703)轉(zhuǎn)化酵母原生質(zhì)球(Picha株)。用相同的方案進行重組克隆的篩選和表達的分析。如本申請中所述，這些表達的蛋白質(zhì)可用作疫苗中的免疫原和用作免疫分析中的抗原。最后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會意識到，用于所述實施例的載體和酵母菌株可以用其他載體(如pHIL-F1；Invitrogen)或酵母菌株(如釀酒酵母)。實施例14在用重組桿狀病毒63-2-IV-2感染的SF-9昆蟲細胞中合成的HEVORF-2基因產(chǎn)物的純化和氨基端序列分析如實施例10中所述，用重組桿狀病毒63-2-IV-2感染SF-9細胞并在接種后7天收獲。昆蟲細胞裂解液在SDS-PAGE上的主蛋白條帶的分子量約55kDa。該55kDa條帶的進一步純化是使用DEAE-瓊脂糖凝膠和150-450mMNaCl梯度，通過離子交換柱色譜而實現(xiàn)的。通過SDS-PAGE然后進行考馬斯藍染色而分析DEAE組分是否存在55kDa條帶。峰組分在無SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳中被分離成55kDa、61kDa和中等分子量的3條條帶。通過氨基端微蛋白測序?qū)碜跃郾０纺z的各蛋白質(zhì)條帶進行的分析揭示，55和61kDa蛋白共有SEQIDNO.2Ala-112的單一N-末端。據(jù)信，2種ORF-2切割產(chǎn)物的大小差別可能反映了不同的糖基化方式或者更大產(chǎn)物的羧基端切割。在聚丙烯酰胺凝膠上的第三種中等的蛋白質(zhì)是桿狀病毒的殼多糖酶蛋白。通過對DEAE峰組分進行反向HPLC(使用微孔系統(tǒng)和NaCl及乙腈溶劑)，將55和61kDaORF-2蛋白分成不含殼多糖酶的單一的對稱峰組分。實施例1555KDa和61kDa切割產(chǎn)物的直接表達通過PCR，用質(zhì)粒p63-2作為模板而獲得編碼從第112個氨基酸開始的ORF-2蛋白(ORF-2的氨基酸112-660)的cDNAORF-2片段。然后將cDNA片段插入pBlueBac-3Transfer載體中的BamHI-PstI位點。用該載體產(chǎn)生的重組桿狀病毒感染SF9昆蟲細胞，然后通過考馬斯藍染色聚丙烯酰胺凝膠而分析昆蟲裂解液中是否存在55和61kDaORF-2蛋白。如此處所述，直接表達的蛋白質(zhì)可用作疫苗中的免疫原和免疫測定中的抗原。權(quán)利要求1.一種分離的和純化的病毒，其特征在于，它是戊型肝炎SAR-55株。2.戊型肝炎的cDNA，其特征在于，該cDNA具有如SEQIDNO.4的cDNA序列。3.一種DNA序列，其特征在于，它含有能夠指導(dǎo)宿主有機體合成至少一個完整的開放閱讀框蛋白或該蛋白的類似物的序列，該蛋白與來自HEV的蛋白基本同源。4.如權(quán)利要求3所述的cDNA序列，其特征在于，該cDNA編碼含有SEQIDNO.2氨基酸序列的蛋白或其變異蛋白。5.一種重組蛋白，其特征在于，它由戊型肝炎病毒的完整開放閱讀框2的cDNA序列所編碼，而且該蛋白大于約50千道爾頓。6.如權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白由SEQIDNO.4中完整開放閱讀框2的cDNA序列所編碼。7.如權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白選自圖2B中泳道3中所示的大于50千道爾頓的條帶之一。8.如權(quán)利要求7所示的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)的分子量約74千道爾頓，且該蛋白是抗原性的。9.如權(quán)利要求7所示的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)的分子量約55千道爾頓，且該蛋白是抗原性的。10.一種重組蛋白，其特征在于，它由戊型肝炎病毒的開放閱讀框2的cDNA序列所編碼，而且該蛋白大于約50千道爾頓。11.一種含有SEQIDNO.2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。12.一種權(quán)利要求11所述蛋白質(zhì)的多肽片段，其特征在于，該片段選自圖2B中泳道3中所示的大于50千道爾頓的條帶。13.一種產(chǎn)生重組HEV蛋白的方法，其特征在于，它包括(a)在適合擴增從而導(dǎo)致表達蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)用HEVcDNA序列轉(zhuǎn)化的宿主有機體，該序列能夠指導(dǎo)宿主有機體合成該重組蛋白；和(b)收獲該蛋白。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，表達載體是真核表達載體。15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，cDNA序列編碼完整的開放閱讀框。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，cDNA序列編碼完整的開放閱讀框2。17.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，cDNA序列編碼大于約50千道爾頓的開放閱讀框2蛋白。18.一種重組表達載體，其特征在于，它含有編碼完整的HEV開放閱讀框的cDNA序列。19.如權(quán)利要求18所述的重組表達載體，其特征在于，該cDNA序列編碼完整的開放閱讀框2。20.如權(quán)利要求19所述的重組表達載體，其特征在于，該載體是p63-2或pPIC-1778。21.一種重組表達載體，其特征在于，它含有編碼大于約50千道爾頓的HEV開放閱讀框2蛋白。22.如權(quán)利要求21所述的重組表達載體，其特征在于，該載體選自下組pPIC-1779、pPIC-1780或pPIC-1781。23.一種用權(quán)利要求19所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主有機體。24.一種用權(quán)利要求21所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主有機體。25.一種在可能含有針對戊型肝炎的抗體的生物樣品中檢測該抗體的方法，其特征在于，它包括(a)將樣品與戊型肝炎表達開放閱讀框2的cDNA序列所編碼的重組蛋白接觸，其中該蛋白大于約50千道爾頓，從而與抗體形成免疫復(fù)合物；(b)檢測免疫復(fù)合物的存在。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，該生物樣品選自下組全血、血漿、血清、腦脊液、組織、尿和胸膜液。27.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，檢測IgM或IgG抗體。28.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，重組的HEV蛋白連于固相載體。29.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，用標記的抗體來檢測免疫復(fù)合物。30.一種用于權(quán)利要求25所述方法的試劑盒，其特征在于，它包括戊型肝炎表達開放閱讀框2的cDNA序列所編碼的重組HEV蛋白，其中該蛋白大于約50千道爾頓。31.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其特征在于，它還含有次級抗體。32.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)和適當?shù)馁x形劑、稀釋劑或載體。33.一種預(yù)防戊型肝炎的方法，其特征在于，它包括給哺乳動物施用有效量的權(quán)利要求32所述的藥物組合物，以刺激產(chǎn)生保護性的抗體。34.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)和適當?shù)馁x形劑、稀釋劑或載體。35.一種預(yù)防戊型肝炎的方法，其特征在于，它包括給哺乳動物施用有效量的權(quán)利要求34所述的藥物組合物，以刺激產(chǎn)生保護性的抗體。36.一種用于使哺乳動物免疫以抗戊型肝炎感染的疫苗，其特征在于，它含有在藥學(xué)上可接受的載體中的權(quán)利要求5所述的重組蛋白。37.一種用于使哺乳動物免疫以抗戊型肝炎感染的疫苗，其特征在于，它含有在藥學(xué)上可接受的載體中的權(quán)利要求10所述的重組蛋白。38.一種檢測戊型肝炎的方法，其特征在于，它包括(a)通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)擴增RNA，產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；和(b)檢測該擴增產(chǎn)物。39.一種檢測戊型肝炎的方法，其特征在于，它包括(a)將生物樣品與抗-HEV抗體接觸，從而與該戊型肝炎形成免疫復(fù)合物；和(b)檢測該免疫復(fù)合物的存在。40.一種抗體，其特征在于，它對HEVORF-2蛋白有特異性的結(jié)合親和性。41.如權(quán)利要求40所述的抗體，其特征在于，該抗體是單克隆抗體。42.一種預(yù)防戊型肝炎的方法，其特征在于，它包括給哺乳動物施用有效量的、從HEV感染對象獲得的抗-HEV血清，以保護該哺乳動物免受HEV的侵襲。43.一種預(yù)防戊型肝炎的方法，其特征在于，它包括給哺乳動物施用有效量的權(quán)利要求40所述的抗體，以保護該哺乳動物免受HEV的侵襲。全文摘要公開了一種在腸傳播的非甲型、非乙型肝炎(現(xiàn)在被稱為戊型肝炎)的流行病中所涉及的巴基斯坦戊型肝炎病毒株(SAR-55)，本發(fā)明涉及在真核表達體系中表達SAR-55整個結(jié)構(gòu)區(qū)域，即開放閱讀框2(ORF2)。表達的蛋白質(zhì)能夠形成HEV病毒樣顆粒，它們可以作為診斷免疫測定的抗原以及作為免疫原或疫苗來防止戊型肝炎的感染。文檔編號A61K35/76GK1168698SQ95196548公開日1997年12月24日申請日期1995年10月3日優(yōu)先權(quán)日1994年10月3日發(fā)明者S·A·察廖夫,S·U·埃默森,R·H·珀塞爾申請人:美國健康及大眾服務(wù)部部長