專利名稱：使干擾素α-2結(jié)晶的方法
人干擾素α是一類至少包含24個亞種的蛋白(Zoon K.C.，Interferon 91-12，1987，Gresser I.編，AcademicPress，New York)。它們原來被描述為能夠在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)的藥劑，但現(xiàn)在被稱為影響免疫系統(tǒng)許多功能的多效性淋巴激活素(Opdenakker等，Experimentia 45513-520，1989)。除了其體外生物活性外，人干擾素α目前用于幾種重要的指征，例如毛細(xì)胞性白血病、卡波濟(jì)肉瘤、尖銳濕疣等，并正在研究將其用于其他幾種指征(Intron A(干擾素α-2b)ClinicalStatus(1989))。這是從1989年9月在英國倫敦召開的第五屆歐洲臨床腫瘤學(xué)大會的一個附屬討論會上得來的進(jìn)展。對結(jié)構(gòu)的闡明及各種劑型的配制來說，最為重要的是要得到高度純化的結(jié)晶態(tài)干擾素α，尤其是重組型α-2b。
現(xiàn)已報(bào)道了兩種形式的結(jié)晶人干擾素α-2(Miller等，Science 215689-690，1982；Kung等，美國專利4,672,108；Weissmann，“干擾素的克隆及其它錯誤”，Interferon 1981，Ion Gresser編，Academic Press，New York，101-734；Weissmann，Phil.Trans.R.Soc.Lond.，B2997-28，1982；Nagabhusban等，“遺傳工程α-2干擾素的定性鑒定”，InterferonResearch，Clinical Application and RegulatoryConsideration，Zoon等編，Elsevier，New York79-88，1982)。這些出版物敘述了在低溫下從聚乙二醇中結(jié)晶干擾素α-2的方法，或者通過調(diào)節(jié)PH或溫度而從磷酸鹽緩沖液中結(jié)晶干擾素α-2的方法。通常用這些方法得到的針狀結(jié)晶，用X射線衍射技術(shù)難以準(zhǔn)確鑒定其特性。Miller等人的文章還提到了“棱狀”結(jié)晶干擾素α-2。
一般來說，對干擾素這樣的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶的方法是無法預(yù)言的。例如，Kung等人的美國專利4,672,108(1987)在笫1欄笫52-64行特別指出“現(xiàn)已建立了多種蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)，但尚未發(fā)現(xiàn)通用的方法，因此許多蛋白質(zhì)仍未結(jié)晶出來。所以，蛋白質(zhì)的結(jié)晶是一門無法預(yù)言的技術(shù)，需要對許多可供選擇的可能方法作反復(fù)試驗(yàn)。
應(yīng)用最為廣泛的方法之一，涉及在蛋白質(zhì)溶液中加入一種結(jié)晶劑，通常是一種鹽(例如硫酸銨或檸檬酸銨)或一種有機(jī)溶劑(例如乙醇或2-乙基-2，4-戊二醇)。但這些方法并未提供生產(chǎn)人白細(xì)胞干擾素結(jié)晶的合適手段?！?加了著重號。)我們現(xiàn)已意外地發(fā)現(xiàn)了一種即使在室溫下也能有效地產(chǎn)生高質(zhì)量結(jié)晶干擾素α-2的方法，該方法包括使干擾素α-2的溶液與一種硫酸鹽溶液平衡，使干擾素α-2溶液變得更濃，從而形成干擾素α-2結(jié)晶。最好利用超濾法或透析法，或采用液滴(如懸滴或夾滴)來實(shí)現(xiàn)平衡。
干擾素α-2的溶液最好含有一種硫酸鹽，并且該溶液最好與濃度更高的硫酸鹽溶液平衡。該硫酸鹽優(yōu)選銨鹽、鈣鹽、鎘鹽、鉀鹽、鋰鹽、鎂鹽或鈉鹽，更為優(yōu)選的是硫酸銨。開始形成結(jié)晶時硫酸鹽在結(jié)晶干擾素α-2溶液中的濃度最好為約12％至30％飽和，更為優(yōu)選的是濃度為約15％至25％飽和的硫酸銨。如下面所指出的，平衡步驟開始時硫酸鹽的濃度較低，即約2％至18％飽和。
優(yōu)選的干擾素α-2為干擾素α-2b，更為優(yōu)選的是人的重組結(jié)晶干擾素α-2b。在一個實(shí)施方案中，結(jié)晶物為具有如下所示氨基酸順序的干擾素α-2b1Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg13 Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile25 Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe37 Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln49 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile61 Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser73 Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe85 Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu97 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr109 Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg121 Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu133 Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg145 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn157 Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu也可采用干擾素α-2a。干擾素α-2a的一級氨基酸順序與上述干擾素α-2b順序的不同之處在于，23位殘基處由賴氨酸置換了精氨酸。
干擾素α-2的硫酸鹽溶液最好含有一種緩沖液，其pH為6.5至8.5，較為優(yōu)選的是7.3至8.0，例如磷酸鈉緩沖液。
由上述方法制得的結(jié)晶干擾素α-2可作為晶種而用于制備另一批結(jié)晶干擾素α-2。
如前面所指出的，本發(fā)明的方法包括使干擾素α-2的硫酸鹽溶液與一種硫酸鹽溶液平衡，使結(jié)晶干擾素α-2溶液變得更濃，從而形成干擾素α-2結(jié)晶?？梢圆捎萌魏芜m宜的干擾素α-2，例如干擾素α-2a和干擾素α-2b，更為優(yōu)選的是人的重組干擾素α-2a(r-h-干擾素α-2a)或干擾素α-2b(r-h-干擾素α-2b)。商品α-2干擾素制劑可從Hoffmann-La Roche公司(Roferon)和先靈公司(IntronA)得到。含有各種α-2干擾素的純凈干擾素混合物可從Burroughs-Wellcome公司(Wellferon)得到。鑒于人干擾素α中有高度的順序同源性，本發(fā)明的方法應(yīng)對每一亞種都適用。
人干擾素α-2各亞種可通過重組DNA技術(shù)來制取，也可以從天然來源(如人外周血淋巴細(xì)胞、人類淋巴母細(xì)胞系)純化，例如如Pestka等人所述(Ann.Rev.Biochem.，56727-777，1987)。優(yōu)選的干擾素α-2是具有上述氨基酸順序的r-h-干擾素α-2b。
天然人干擾素α已從若干細(xì)胞來源中純化出來，其中包括從全血中分離出的白細(xì)胞、新生成纖維細(xì)胞、類淋巴母細(xì)胞及各種自血病細(xì)胞系。首先應(yīng)用于臨床的人白細(xì)胞干擾素制劑是由芬蘭的K.Cantell及其同事研制的，他們的方法是將取自正常供血者的血液離心后注入干擾素，加入仙臺病毒進(jìn)行誘導(dǎo)并離心。所得上清液用硫氰酸鉀沉淀，用乙醇提取，經(jīng)pH沉淀后對磷酸鹽緩沖液透析(K.E.Morgensen，L.Cantell，Pharmacol.Ther.1369-381，1977)。
重組干擾素α已由幾個研究小組克隆出來并在大腸桿菌中表達(dá)(例如C.Weissmann等，Science 2091343-1349，1980)。有幾個研究小組描述了純化重組α-2干擾素的方法，該方法配合使用了一些層析步驟，例如硫酸銨沉淀、染料親和層析、離子交換和凝膠過濾，例如如Weissmann，C.所述(Phil.R.Soc.(Lond)，b2997-28，1982)。另一種純化重組干擾素α的方法采用了免疫親和層析法和固定化抗體(P.P.Trotta等，Developments in Industrial Microbiology，7253-64，Elsevier，Amsterdam)。有關(guān)用于重組α干擾素的現(xiàn)有純化方案的綜述，參見T.L.Nagabhushan和P.P.Trotta，《Ullmann工業(yè)化學(xué)大全》，A14，VCH，Weinheim(聯(lián)邦德國)，372-374，1989。所用的干擾素α-2b最好用該綜述所述的常規(guī)純化方法純化，然后進(jìn)行反相高效層析。
適宜的平衡方法包括透析、超濾，例如透濾，或者利用液滴，例如懸滴或夾滴?？梢杂脻舛雀哂诟蓴_素α-2的硫酸鹽溶液的另一種硫酸鹽溶液實(shí)現(xiàn)平衡。一種特別優(yōu)選的方法是使r-h-干擾素α-2的溶液與使用磷酸鹽緩沖液的硫酸鹽溶液平衡。平衡過程最好緩慢進(jìn)行，例如長達(dá)2-30天。
大規(guī)模的結(jié)晶可以用相當(dāng)于蒸氣擴(kuò)散的方法來進(jìn)行，即利用透析和超濾。在臨床制備過程中，可以利用大規(guī)模結(jié)晶作為純化或濃縮步驟。此外，在這種操作中可以用其它常用硫酸鹽代替硫酸銨。
結(jié)晶時，即首次出現(xiàn)結(jié)晶時，干擾素α-2在硫酸鹽溶液中的終濃度可為約10-80毫克/毫升。更為優(yōu)選的是，干擾素α-2的濃度為約30-50毫克/毫升。干擾素α-2的起始濃度最好為約20毫克/毫升。
在結(jié)晶步驟開始前的起始階段，干擾素α-2溶液中硫酸鹽的濃度可為約2％-18％飽和，即，硫酸鹽的濃度為溶液達(dá)100％飽和時濃度的2-18％。更為優(yōu)選的是，干擾素α-2溶液中硫酸鹽的濃度為約7％-15％飽和。結(jié)晶步驟開始時抗衡溶液中硫酸鹽的濃度為約12-30％飽和，更為優(yōu)選的是約15-25％飽和。
干擾素α-2溶液和抗衡硫酸鹽溶液的pH最好控制在約6.5-8.5的范圍，更優(yōu)選的是約7.3-8.0。為此可采用任何合適的緩沖劑。例如可以采用磷酸鈉、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽或N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)緩沖劑。
結(jié)晶過程最好在控溫條件下進(jìn)行。溫度最好在約15℃-37℃的范圍內(nèi)，更為優(yōu)選的是約18℃-25℃。
由于本發(fā)明意外地在室溫下產(chǎn)生結(jié)晶干擾素α-2，所以與在4℃下用聚乙二醇得到的晶體相比具有突出的優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)在已經(jīng)有可能在室溫下貯存和配制人干擾素α-2晶體。用加有0.15M氯化鈉的20mM磷酸鈉(pH7.5)緩沖液透析可以使該晶體溶解。此外，由于硫酸鹽溶液比聚乙二醇更容易用透析等方法除去，可以在重新溶解后用本發(fā)明的方法得到更純的干擾素α-2結(jié)晶。
用本發(fā)明方法制得的結(jié)晶干擾素α-2將構(gòu)成各種藥物制劑的基礎(chǔ)。例如，該結(jié)晶干擾素可應(yīng)用于緩釋制劑。例如能夠以相當(dāng)于0.1-1.0微克/千克體重的日劑量釋放的貯庫制劑。采用用本發(fā)明方法制得的晶體的貯庫制劑，其溶解速度應(yīng)大大低于含有在4℃下制得的晶體的制劑。特別是，室溫(22℃)晶體的溫度敏感性應(yīng)低于要求較低結(jié)晶溫度的晶體。
此外，可以使人干擾素α-2與金屬形成配合物，然后再用本發(fā)明的方法結(jié)晶。這樣一種配合物的結(jié)晶同樣可以用于緩釋制劑。用于緩釋制劑中的金屬離子-蛋白配合物的例子在先有技術(shù)中已有描述。轉(zhuǎn)讓給Novo Terapeutisk Laboratorium A/S的美國專利2,882,203，描述了將氯化鋅加入無菌胰島素溶液中而制得的鋅和胰島素的配合物。這種配合物的結(jié)晶懸浮液的作用時間比非結(jié)晶制劑長4-6倍(《Remington藥物學(xué)》，Gennaro，A.R.編，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.17975-976，1985)。許多制造廠家以不同的形式銷售鋅-胰島素配合物，例如長效胰島素(Squibb)、超長效胰島素(Lilly)和超長效胰島素/超緩(Squibb-Novo)(出處同上)。1魚精蛋白鋅胰島素是胰島素(鋅-胰島素)和一種堿性蛋白(Salmiridin)的結(jié)晶產(chǎn)物。該產(chǎn)物以幾個不同的商品名制造NPN-Iletin(Lilly)、Insulated(Leo)和Novolin N(Squibb-Novo)(《制藥大全》，Sittig，M.編，1820-822，1988)?？梢杂妹绹鴮＠?,882,203所述的方法形成鋅-干擾素α-2配合物。可用本發(fā)明的方法使干擾素α-2-鋅配合物結(jié)晶。用適當(dāng)?shù)奶砑觿?如對羥基苯甲酸甲酯、氯化鈉和乙酸鈉)配成的結(jié)晶懸浮液(含有大小均勻的晶體)可用于皮下注射。
用本發(fā)明的方法制備的結(jié)晶干擾素α-2，可以按與現(xiàn)有的干擾素α-2材料用于藥物制劑時的方式大體相同的方式使用，例如制成干擾素α-2的貯庫制劑，這種制劑可設(shè)計(jì)成結(jié)晶干擾素α-2的日劑量為約0.1-1.0微克/千克。這種制劑含有生理有效量的結(jié)晶干擾素α-2及常規(guī)藥用載體。
這里所公開的發(fā)明用下列實(shí)施例來舉例說明，但不應(yīng)誤認(rèn)為是限制發(fā)明范圍。本發(fā)明范圍內(nèi)的另一些方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也將是顯而易見的。
所采用的干擾素α-2為如Weissmann等人所述(Science2091343，1980)在大腸桿菌中表達(dá)的重組人干擾素α-2b。按照Leibowitz，P.等人的美國專利4,315,852(1982)以前所報(bào)道的方法對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、收集和提取。所得到的提取液用一系列常規(guī)純化步驟進(jìn)行純化乙醇提取、基質(zhì)凝膠藍(lán)色配體親和層析、離子交換和凝膠過濾層析。所得到的純化干擾素α-2b制備物用反相HPLC法用Rainin Auto Prep層析系統(tǒng)進(jìn)一步純化。純化出的干擾素α-2b(50毫克)在Rainin(4.1×250厘米)C4 300埃柱上進(jìn)行層析，該柱已預(yù)先用27％乙腈、0.1％三氟乙酸(TFA)平衡。用27％-72％乙腈、0.1％ TFA的線性梯度以40毫升/分洗脫30分鐘，從柱中洗脫出干擾素α-2b。用一臺串聯(lián)的Knauer紫外檢測器在280納米處進(jìn)行檢測，根據(jù)所得出的光吸收曲線收集洗脫出的各部分。
采用懸滴、落滴或夾滴技術(shù)，用蒸氣擴(kuò)散法實(shí)現(xiàn)結(jié)晶。懸滴蒸氣擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)在24孔組織培養(yǎng)皿(Becton Dickinson公司，Lincoln park，NJ)中進(jìn)行。夾滴實(shí)驗(yàn)在蛋白質(zhì)結(jié)晶皿Crystalplate(Flow Laboratories，McLean，VA)中進(jìn)行。落滴蒸氣擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)在MVD/24多室蒸氣擴(kuò)散皿(Crychem公司，Riverside，CA)中進(jìn)行。
進(jìn)行懸滴實(shí)驗(yàn)時，取10微升含有20毫克/毫升蛋白質(zhì)、10％水飽和的硫酸銨、40mM磷酸鈉(pH8.0)的液滴，使其從扣在Linbro組織培養(yǎng)皿上的硅化蓋玻片上懸下。使這些液滴與1毫升20％飽和的硫酸銨、40mM磷酸鈉(pH8.0)平衡。在22℃下保溫4 -15天后出現(xiàn)棱狀大單斜晶(0.5×0.5×0.5毫米)。用類似的溶液和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行落滴和夾滴實(shí)驗(yàn)。這些晶體在進(jìn)行X射線衍射分析時很穩(wěn)定，衍射分辨率為6。用不同批次的晶體進(jìn)行X射線分析得到一致的形態(tài)學(xué)結(jié)果。這是首次報(bào)道干擾素α-2的X射線衍射圖案。
進(jìn)行X射線研究時，把晶體裝在玻璃毛細(xì)管中，在22℃下用回?cái)[相機(jī)利用由Rigaku RU-300旋轉(zhuǎn)陽極發(fā)生器發(fā)出的CuKα輻射進(jìn)行拍照，陽極發(fā)生器的操作電壓為40kV，電流為100mA。在Nicolet X-100A特定范圍放射線檢測器上用相同的輻射源讀取原始數(shù)據(jù)。
定性鑒定1.生物測定用注射器從懸滴中吸出分散的結(jié)晶，然后在22℃下重新懸浮于100微升由35％飽和的硫酸銨、40mM磷酸鈉(pH8.0)組成的洗滌液中。將該懸浮液離心，用巴氏吸管吸出洗滌液。將洗滌過的結(jié)晶在22℃下重新溶解于100微升20mM磷酸鈉(pH7.5)、0.15M氯化鈉中。
用經(jīng)過修改的Bradford測定法測定蛋白質(zhì)，用純凈的人干擾素α-2b作參考標(biāo)準(zhǔn)。用細(xì)胞病抑制測定法，利用人包皮二倍體成纖維細(xì)胞和腦心肌炎病毒(ATCC-VR-129)測定抗病毒活性。該測定法的詳細(xì)敘述見S.Rubinstein、P.C.Familletti和S.Pestka，J.Virol.37755-758，1981。重新溶解后得到的溶液的比活為2.0×108國際單位/毫克。此數(shù)值在該測定法的誤差范圍內(nèi)與對結(jié)晶前的原始干擾素α-2b制備物所預(yù)計(jì)的數(shù)值相同((一般在1×108-3×108國際單位/毫克范圍內(nèi))。
2.HPLC對一個重新溶解的干擾素晶體樣品進(jìn)行分析高效液相層析(HPLC)(Waters Ass.Milford，MA)。將樣品加到RaininDynamax C4300埃柱(4.6×250毫米)上，然后用含0.1％三氟乙酸的27-72％乙腈線性梯度洗脫30分鐘。用靈敏度為0.02吸收單位的Gilson可變波長檢測器在280納米處監(jiān)測流出液。重新溶解的晶體溶液和結(jié)晶前的原始干擾素α-2b制備物的保留時間和層析圖譜都相同。
3.SDS-PAGE分析用Laemmli，U.K.(Natue 227680，1970)所述的單向15％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)，對結(jié)晶前后的干擾素α-2b進(jìn)行比較。當(dāng)樣品在同一凝膠上的平行泳道中進(jìn)行比較時，相對遷移率沒有變化。
由以上的1、2和3可以明顯看出，沒有任何理由認(rèn)為蛋白質(zhì)在結(jié)晶或再生過程中發(fā)生了任何化學(xué)變化或任何變性。
雖然已結(jié)合上述具體實(shí)施方案敘述了本發(fā)明，但許多變換、修改和變動對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說都將是顯而易見的。所有這些變換、修改和變動都將落在本發(fā)明的要旨和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.使干擾素α-2結(jié)晶的方法，其特征在于，用包括如下步驟的方法得到的晶體作晶種在能使干擾素α-2溶液變得更濃從而形成干擾素α-2結(jié)晶的條件下，使含有干擾素α-2的第一硫酸銨溶液與一種抗衡硫酸銨溶液平衡，其中第一溶液中硫酸銨的初始濃度為約10％，首次形成結(jié)晶時第一溶液中干擾素α-2的濃度為10-約80mg/ml；抗衡溶液中硫酸銨的初始濃度為約20％飽和度；第一溶液和抗衡溶液的pH均為8.0；結(jié)晶過程在15-37℃范圍的溫度下進(jìn)行。
全文摘要
公開了一種制備干擾素α-2晶體的方法及其在貯庫制劑中的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/00GK1132212SQ9512131
公開日1996年10月2日 申請日期1995年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1990年6月4日
發(fā)明者P·賴歇特, G·S·哈蒙德, H·V·李, T·L·納加布胡山, P·P·特羅塔 申請人:先靈公司