專利名稱：促結(jié)合組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于促使礦物化組織各部分之間結(jié)合的組合物，其方法為至少在一個(gè)部位，也可能在另一部位上形成新的礦物化組織。本發(fā)明還涉及促使此種結(jié)合的方法，例如為了牙周炎的治療。
本發(fā)明涉及用于促使礦物化組織各部分(例如牙齒和骨骼)結(jié)合的新生物技術(shù)。雖然本發(fā)明通常能用于此種結(jié)合，但本公開主要解釋有關(guān)松動(dòng)牙齒，即所謂的牙周炎的治療，然而應(yīng)指出本發(fā)明的主要解釋決不能以限定的方式予以理解。在更準(zhǔn)確地描述本發(fā)明技術(shù)之前，為了便于理解，有必要簡述一下與牙齒以及相關(guān)疾病有關(guān)的生物學(xué)狀態(tài)的背景。在正常牙齒狀態(tài)下，牙齒被固定于頜骨上的特殊腔內(nèi)，稱之為牙槽。在齒根與頜骨之間有一所謂的牙周膜。牙根主要由稱為牙質(zhì)的物質(zhì)構(gòu)成。牙質(zhì)周邊包繞了一層薄的牙骨質(zhì)，大約0.01-1mm厚。首先，在牙骨質(zhì)上可以見到從牙骨質(zhì)延伸至牙周膜的膠原纖維，它固定于頜骨上，因此，牙骨質(zhì)對(duì)于牙齒與頜骨的連接極為重要。牙周膜厚約0.2mm，由上述膠原纖維和位于所述纖維之間的血管和神經(jīng)以及屬于這些組織的細(xì)胞構(gòu)成。
頜骨并不一直延伸至牙冠。無頜骨復(fù)蓋的牙根部位有來自根部牙骨質(zhì)的纖維延伸至周圍的牙齦(齒齦)，這些纖維有助于支撐牙齒，進(jìn)而穩(wěn)定牙齦。牙齦以及整個(gè)口腔復(fù)蓋著一層薄上皮。此上皮形成圍繞牙齒的圈或套筒，在牙齒與上皮之間，緊貼牙齒處形成一個(gè)淺溝。
連接牙齒與頜骨組織的炎性疾病經(jīng)常發(fā)生，世界上大多數(shù)人都受到不同程度的侵襲。迄今所采用的治療方法主要針對(duì)阻止疾病的發(fā)展過程及盡可能地防止牙齒松動(dòng)。目前，臨床尚無有效的方法，即以此種方式治療從而能使牙齒重新連接于頜骨。
在此類炎性疾病中的另一個(gè)問題是牙齒連接的先天性缺陷。有些缺陷的疾人在早年即出現(xiàn)牙周炎的癥狀，稱為幼年性牙周炎。治療常常是拔牙，并以昂貴的價(jià)格用某種齒橋結(jié)構(gòu)代替。
牙齒表面的細(xì)菌引起牙周齒齦的慢性炎癥。炎性細(xì)胞分泌酶企圖殺死細(xì)菌，但在這一過程中也破壞了連接牙齒與牙齦及頜骨的膠原纖維，因此，牙根或牙骨表面的細(xì)胞常遭破壞，口腔粘膜的上皮沿牙齦逐漸受損，形成稱之為牙齦裂隙的病變。在裂隙中，新的細(xì)菌有了適宜的生長條件，新的炎性細(xì)胞侵入此區(qū)，產(chǎn)生牙周膜組織的分解。牙骨質(zhì)細(xì)胞死亡，牙齦區(qū)骨骼破壞。這一過程通常發(fā)展很慢，但在某些階段卻發(fā)展很快，經(jīng)過一段時(shí)間后，患病牙齒將完全失去與頜骨的連接。
目前的治療主要是去除沉積在牙齒表面的細(xì)菌。細(xì)菌去除后，牙齦和牙周膜的炎癥消失，分解過程就會(huì)停止。治療還針對(duì)防止在牙齒表面形成新的細(xì)菌沉積物。這樣就可阻止牙齒與頜骨連接的破壞，但在治療過程中并不形成新的牙周膜或新的牙骨質(zhì)。
關(guān)于本發(fā)明的研究是基于這一理論牙骨質(zhì)的形成始于一層薄的釉質(zhì)前體物，在牙根發(fā)育時(shí)，它沿所有牙根表面形成。應(yīng)該指出質(zhì)前體物可以促使牙骨質(zhì)的形成，這一觀點(diǎn)并未得到公認(rèn)。然而這一理論在共同未決的專利申請(qǐng)中被描述，例如歐洲專利申請(qǐng)書№878502640。對(duì)牙骨質(zhì)形成機(jī)理的進(jìn)一步研究和試驗(yàn)驚人地揭示出牙釉質(zhì)前體(所謂的釉質(zhì)基質(zhì))含有一種蛋白成份(作為活性成份)，它可從該釉質(zhì)基質(zhì)的有機(jī)部分中獲得。當(dāng)人們確認(rèn)構(gòu)成該蛋白成份的蛋白生物功能為牙齒釉質(zhì)形成以及特別是牙釉質(zhì)的礦物化時(shí)，這一發(fā)現(xiàn)更加令人驚奇(參考文獻(xiàn)Fischer，L.andTermine，D，ClinicalOrthopaedics200，1985，362-85)。釉質(zhì)基質(zhì)蛋白由一個(gè)高分子量部分和一個(gè)低分子量部分構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)，它們的活性構(gòu)成物不僅由同一低分子量部分構(gòu)成，而且可轉(zhuǎn)由其活性因子構(gòu)成。該釉質(zhì)基質(zhì)蛋白的低分子量部分由醋酸可提取蛋白構(gòu)成，該蛋白通常稱為釉質(zhì)生成素(amelogenin)，它的分子量高達(dá)約40，000，但主要在約5000至25000范圍內(nèi)。
關(guān)于本文所用的名詞“釉質(zhì)前體物”(Precursortoenamel)和“釉質(zhì)基質(zhì)”(enamelmatrix)參考了兩篇文獻(xiàn)，其中對(duì)上述兩個(gè)名詞的定義給予了充分而清楚的表達(dá)，這兩篇文獻(xiàn)是A.R.TenCate，OralHistology，Development，StrucreandFunction，TheC.V.MosbyCo.，StLouis，USA(1980)pp182-83.
I.A.Mjor，O.Fejerskov，HumanOralEmbryologyandHistology，Munksyaard，Copenhagen(1986)pp44-45。
這些文獻(xiàn)本文引作對(duì)比文獻(xiàn)。
關(guān)于本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)如果牙質(zhì)被暴露于牙周膜細(xì)胞(例如通過在牙根表面磨一個(gè)洞)，在缺乏連接健康牙齒與周圍組織的纖維的骨樣組織形成時(shí)，愈合出現(xiàn)。然而，如果人工產(chǎn)生的洞穴表面復(fù)蓋有來自牙釉質(zhì)前體物的活性蛋白部分(下文將牙釉質(zhì)前體稱為釉質(zhì)基質(zhì))時(shí)，則可見到粘附組織的正常牙骨質(zhì)的生成。
釉質(zhì)基質(zhì)從哺乳動(dòng)物中提取更好，如?；蜇i種屬。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，給猴和人類用從其它種屬的釉質(zhì)基質(zhì)中提取的蛋白部分復(fù)蓋牙根表面磨的洞穴，可以促使骨質(zhì)形成。
因此，下述的本發(fā)明提供了一個(gè)通過至少在一個(gè)部位形成新鮮礦物化組織來促使活的礦物化組織之間結(jié)合的新技術(shù)。這些技術(shù)的特征在于，應(yīng)用來自牙釉質(zhì)前體即所謂的釉質(zhì)基質(zhì)的釉質(zhì)基質(zhì)蛋白促使結(jié)合。于是，本發(fā)明還提供一種用于此用途的組合物，該組合物含有活性組成成份，如釉質(zhì)基質(zhì)蛋白或活性因子。
如前所述，本發(fā)明特別用于牙科治療，例如牙周炎，即牙齒松動(dòng)的治療，牙齒移植或意外所致牙齒脫落的再置入。然而，本發(fā)明尚可促進(jìn)人工植入物的連接，例如，牙齒植入或人造髖關(guān)節(jié)。本發(fā)明還可用于促使在希望提供腱連接的人工植入物上礦物化組織的形成。
根據(jù)本發(fā)明技術(shù)，應(yīng)用的蛋白成份最好從某種哺乳動(dòng)物的釉質(zhì)基質(zhì)中獲取(如未發(fā)育成熟的牙齒)。釉質(zhì)基質(zhì)的一個(gè)理想來源的屠宰的動(dòng)物，例如豬和小牛。常應(yīng)宰殺牙齒尚未發(fā)育完全的動(dòng)物(例如豬應(yīng)在約半歲時(shí))。優(yōu)先選擇的動(dòng)物為牛或豬屬(即?；蜇i)但其它種屬亦可，如仍在長牙的羊和鼠類。培養(yǎng)的細(xì)胞或用重組DNA技術(shù)修飾的細(xì)菌(例如，美國專利№4，672，032)也可作為這種蛋白成份的補(bǔ)充來源。
根據(jù)本發(fā)明，用于治療的組合物可只由蛋白組份或其活性因子(用水適當(dāng)混合)構(gòu)成，但組合物也可包含與載體、稀釋劑或粘合劑(例如適合于本技術(shù)的改良的纖維素、瓊脂、藻酸鹽或明膠)結(jié)合的蛋白成份。將它應(yīng)用于牙科時(shí)，則采用牙科能接受的載體或稀釋劑較為合適。目前最好使用由水溶性聚合物組成的載體。這樣的聚合物的例子(而不是加以限制)是羧甲基纖維素鈉，微晶纖維素，羥甲基纖維素，羥丙基纖維素，甲基纖維素，高分子量的聚丙烯酸，藻酸鈉，藻酸丙二醇酯，黃嗜膠，瓜耳膠，洋槐豆膠，改良的淀粉，明膠，果膠或它們的結(jié)合物。這些水溶性聚合物與活性蛋白成份結(jié)合后，可任意地被轉(zhuǎn)變成膠體或膜，得到具有優(yōu)良物理性質(zhì)容易應(yīng)用的組合物。為了增加儲(chǔ)存的穩(wěn)定性，該組合物可任意含有穩(wěn)定劑或防腐劑。
本發(fā)明還提供治療牙周病的方法，包括通過促使牙根牙骨質(zhì)和頜骨以及連接它們的生理性膠原纖維的形成而重新獲得牙齒連接。此方法的特征在于其上皮(如果出現(xiàn))從齒根被去除，而后，牙根復(fù)蓋一層從釉質(zhì)基質(zhì)中獲取的有關(guān)蛋白成份。
本發(fā)明應(yīng)用于牙周炎治療時(shí)，最好切開鄰近患病牙齒區(qū)域的膠原纖維以暴露牙根表面。除去上皮(如果出現(xiàn)的話)，然后在清潔的牙根表面涂一層上述蛋白成份或含有這種蛋白成份作為活性成分的組合物，此后，膠原纖維(牙齦)復(fù)位，任意縫合，以便愈合。
如前所述，本發(fā)明除能應(yīng)用于牙周炎的治療外，尚可用于牙齒的再置入或移植。十歲以下的兒童因意外導(dǎo)致一或數(shù)個(gè)牙齒脫落，這是相當(dāng)常見的，主要見于前牙。迅速將脫落牙齒放回原位可獲得愈合，并可與頜骨正常連接。但在許多情況下，脫落的牙齒沒能迅速放回原位，牙齒在口腔外不適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中存放一段時(shí)間(例如空氣)，這將破壞牙根表面的牙周膜細(xì)胞。牙齒放回口腔時(shí)，它將不能獲得生理性連接，最終產(chǎn)生松動(dòng)。迄今，尚無通過連接組織再生而達(dá)到永久性牙齒連接的方法。
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)，采用機(jī)械或化學(xué)方法，以適當(dāng)?shù)姆绞?，除去脫落牙齒死掉的牙周膜，而后，在裸露的牙齒表面施用含有或由上述蛋白成份組成的組合物，再將牙齒放回牙槽，輕輕固定數(shù)周。由于牙根表面施用了蛋白成份或其組合物，牙根表面就會(huì)產(chǎn)生新的牙骨質(zhì)，從而牙齒形成新的連接。
關(guān)于牙齒移置，即某一個(gè)體的牙齒移植給另一個(gè)體，已發(fā)現(xiàn)移植牙齒的組織可被受體的免疫防御系統(tǒng)攻擊，并在很短時(shí)期內(nèi)被分解。人們?cè)噲D在免疫相合的個(gè)體之間進(jìn)行移植，但其結(jié)果令人失望。長期免疫抑制劑治療以維持一個(gè)或數(shù)個(gè)牙齒會(huì)帶來危險(xiǎn)的結(jié)果，所以目前尚無有效的、長期預(yù)后良好的牙齒移植方法。
然而，采用本發(fā)明的技術(shù)，所設(shè)計(jì)的方法可以解決這一問題。即從供者體拔出要移植的牙齒，去除牙髓，清潔髓腔，在牙髓腔內(nèi)用牙根充填劑。用機(jī)械或化學(xué)方法去除牙周膜，用含有活性蛋白成份的組合物復(fù)蓋牙根，然后將牙齒放入受者口腔內(nèi)的新位置，固定牙齒一段時(shí)間。由于有蛋白成份的存在就會(huì)促使復(fù)蓋移植的牙齒并起固定作用的內(nèi)源性礦物化組織再形成。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)越方面，含有活性蛋白成份的組合物可用基于纖維蛋白原，ⅩⅢ因子(它是一種血漿凝血因子)和凝血酶的一種組織粘附物來補(bǔ)充。這種補(bǔ)充組合物由釉質(zhì)基質(zhì)、纖維蛋白，ⅩⅢ因子的預(yù)混合物構(gòu)成，而凝血酶則是在施用組合物于外科部位之前立即加入預(yù)混合物中。預(yù)混合物中可隨意加入抑肽酶，以降低分解速率。此種補(bǔ)充組合物的一個(gè)有用的商品為Tisseel，它是一種含兩種成份的纖維蛋白密封劑，由奧地利維也納的IMMUNOAG生產(chǎn)和銷售。在應(yīng)用此組織粘附物時(shí)，將蛋白成份、纖維蛋白朊、ⅩⅢ因子以及任意加入的抑肽酶的預(yù)混合物與凝血酶溶液混合，然后速將此組合物施用于外科部位。在治療牙周炎時(shí)，這一技術(shù)非常利于手術(shù)，并且增加了組合物與牙根的粘附，出血停止，粘膜-骨膜片的復(fù)位大大簡化，且不用縫合。
可用于本發(fā)明所述充組合物的現(xiàn)有優(yōu)選產(chǎn)品包括纖維素衍生物和藻酸酯(鹽)，例如，羧甲基纖維素，藻酸鈉或丙二醇藻酸酯。
下文的特殊實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。根據(jù)在猴和人身上進(jìn)行的牙科實(shí)驗(yàn)完成這一舉例中所參照的附圖
代表SDS-Page，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。根據(jù)分子量從釉質(zhì)基質(zhì)得到的兩個(gè)主要蛋白質(zhì)部分稱作成釉質(zhì)素(amelogwin)(低分子量)和釉質(zhì)素(enamelin)(高分子量)。
實(shí)施例1制備用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的提取物為了滿足在動(dòng)物模型中有活性的釉質(zhì)基質(zhì)中的成份，制備了下列實(shí)驗(yàn)物質(zhì)。所有物質(zhì)均來源于豬釉質(zhì)基質(zhì)。
E1，將0.3g基質(zhì)(蛋白成份27+4%)在3ml0.9%NaCl中成漿，并在冰水冷卻下與Polythrone均漿1分鐘，時(shí)間間隔為10秒。然后將均漿液冷凍干燥，得量199mg，根據(jù)半空細(xì)胞法(Lowry)蛋白成份為47%+2%。
E2，將0.3g基質(zhì)成漿，并按上述方法均漿，然后在水浴上加熱4分鐘。冷凍干燥，得量為199mg，可溶性蛋白成份為13%+3%。
E3，將0.3g基質(zhì)在3ml0.5M乙酸(P.a)中成漿，按前述方法均漿，然后為提取蛋白質(zhì)將該漿在4℃攪拌24小時(shí)。冷卻下，以10，000rpm離心10分鐘?；厥粘恋砦?，冷凍，將上清液冷凍干燥，得到68mg冷凍干燥物，蛋白成份29%+3%。
E4，在3ml10%EDTA的0.03M三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(PH7.4)中，將0.3g基質(zhì)成漿，并在冷卻下按前述方法均漿。在冷卻下將該均漿攪拌24小時(shí)，然后將該均漿液進(jìn)行冰凍離心進(jìn)行提取。上清液進(jìn)行反蒸餾水滲析，并經(jīng)冷凍干燥。得量11mg，蛋白質(zhì)成份33%+2%。
E5，提取經(jīng)離心(E4)后的沉淀物，具體方法為在冷卻下，用約10倍體積的0.5M乙酸慢攪拌24小時(shí)。然后再進(jìn)行一次離心，將上清液冷凍干燥，得量109mg，蛋白質(zhì)成份15%+3%。
E6，將按前述E5離心而得的沉淀冷凍干燥，得量37mg蛋白質(zhì)成份18%+4%。
E7，將0.7g基質(zhì)在3ml10%EDTA的0.03M三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(PH7.4)中和0.4mM蛋白酶抑制劑PMSF(苯基甲基磺酰氟)一起成漿，均漿，按前述E4方法提取。離心，并將上清液滲析后進(jìn)行冷凍干燥，得量1.1mg，蛋白質(zhì)成份41%+2%。
E8，在低溫下，用0.5M乙酸提取由按前述E7離心而得的沉淀，時(shí)間為48小時(shí)，離心，將上清液冷凍干燥，得量101mg，蛋白質(zhì)成份17%+1%。
E9，將按前述E8離心而得的沉淀冷凍干燥，得量40mg，蛋白質(zhì)成份30%+3%。
由上述E1-9而得的物質(zhì)的特征在于蛋白質(zhì)成份，蛋白質(zhì)分子量分布(SDS-Pagewithphast)，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和碳水化合物成份。
附圖中示出了豬釉質(zhì)基質(zhì)提取物的顯而易見的分子量組成。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺膠電泳(SDS-8-25%，Phast，Pharmacia)后，通過激光掃描(LKBUHroscanXL)，蛋白帶已移至峰位。根據(jù)蛋白(14-90kDa)和多肽(2-14kDa)校準(zhǔn)參數(shù)(Pharmacia)估計(jì)分子量。給出提取物E4和E5的線圖，提取物E4和E5及其它提取物摘要如下。
提取物蛋白成份(SDS-Page分子量)No5/12＊6/14＊10/15＊16222467kDaE1xxxxXxXE3xxxX(x)E4xxXE5xxX(x)E7xxXE8xxX(x)
＊在采用多肽校準(zhǔn)kit時(shí)所得到的較低分子量和在采用蛋白校準(zhǔn)kit時(shí)所得到的較高分子量。
X＝大量，x＝小量，(x)＝較小量本實(shí)施例的目的是說明由牙釉質(zhì)(釉質(zhì)基質(zhì))的母體組織經(jīng)分步提取而得的E1-E9物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的邊緣牙周傷口治療的影響。在猴牙齒的邊緣牙周組織造成損傷的方法是用(牙科)圓頭銼除去牙骨質(zhì)，牙周膜和邊緣牙槽骨，形成一個(gè)約5mm的頸頂距離(cervico-apicaldistance)。然后將所述物質(zhì)施用于實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的損傷部位，并使傷口愈合。對(duì)照組也同樣損傷，但不施用任何物質(zhì)讓其愈合。經(jīng)過8周的愈和期后，對(duì)產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。
以原牙骨質(zhì)和骨復(fù)蓋的百分比表示該治愈過程結(jié)果(表1)。該治愈過程包括形成新牙骨質(zhì)粘連層，牙周膜和牙槽骨(新的連接)。
表1物質(zhì)對(duì)照E1E2E3E4E5E6E7E8E9治愈(%)59337944920485因此，在施用物質(zhì)E1，E3，E5，E8后產(chǎn)生了新的連接。在對(duì)照組和用物質(zhì)E2，E4，E6，E7，E7處理的牙齒則不出現(xiàn)上述效果，損傷依舊，并且只有口腔上皮組織復(fù)蓋牙齒。這些結(jié)果表明在牙周炎的治療中，施用釉質(zhì)基質(zhì)蛋白的低分子量物質(zhì)促進(jìn)組織連接。
實(shí)施例2
由釉質(zhì)基質(zhì)制備脫鹽的酸提取物將類似于前述實(shí)施例(E3)制劑的冷凍干燥制劑溶解在0.1M乙酸中，并移(144mg/12ml)至含有SephadexG25細(xì)粉和0.1M乙酸的15×540mm柱上。收集第一份富蛋白組份(E10)，冷凍干燥。得到34mg含約72%蛋白質(zhì)的物質(zhì)，后者相當(dāng)于起始原料中的85%蛋白。其余蛋白質(zhì)存在于鹽組份中(63mg冷凍干燥物含有約7%的蛋白質(zhì))。
將按這種方法制得的冷凍干燥蛋白質(zhì)裝入10ml的小瓶中(每瓶20mg)，在用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行幅射消毒(35kGy)。
按前述實(shí)施例所述方法分析該制劑。結(jié)果列于表2。
表2物質(zhì)對(duì)照E10治愈(%)472實(shí)施例3制備純化蛋白質(zhì)將200mg冷凍制劑E3(相同于實(shí)施例2中所采用的制劑)溶解在20ml0.1M乙酸中，并將其加到含有于0.1M乙酸中的SephadexG-75的25×780mm柱上，溫度為4℃。以55ml/h的速度洗脫該柱，收集4ml樣品。在280nm(紫外)監(jiān)測(cè)洗脫液，將含有主要洗脫物的樣品合并，得到5個(gè)組份，后者經(jīng)電泳分析(SDS-Page)，得出如下所示的分子量分布情況。在洗脫色譜中出現(xiàn)5個(gè)峰(0-1A)。
洗脫樣品
(1)50-60高分子量蛋白質(zhì)，“釉質(zhì)素(enamelins)”(MW)40，000(2)62-80高分子量成釉質(zhì)素(amelogenin)(MW，約25千道爾頓)。
(3)90-100中等分子量成釉質(zhì)素(amelogenin)(MW約14千道爾頓)(4)110-125低分子量成釉質(zhì)素(amelogenin)(MW約5-10千道爾頓)(5)130-160鹽將(2)，(3)，(4)峰的洗脫物冷凍干燥后，分別得到10mg，7mg，12mg高分子量，中等分子量和低分子量的成釉質(zhì)素蛋白質(zhì)(蛋白成份＞90%)。
本實(shí)驗(yàn)的目的是揭示下列物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)性邊緣牙周傷口治療的影響。這些物質(zhì)包括由母體組織至釉質(zhì)基質(zhì)(enamlelmatrix)提取的高，中，低分子量成釉質(zhì)素(Amelogenin)物質(zhì)。在猴子牙齒的邊緣牙周組織造成創(chuàng)傷的具體方法是用(牙科)圓頭銼除去牙骨質(zhì)，牙周膜和邊緣牙槽骨，形成約5mm的頸頂距離。然后將所述物質(zhì)施用于實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的創(chuàng)口并使之治愈。同時(shí)對(duì)照組也同樣造成創(chuàng)面，并在不施用任何物質(zhì)的條件下使之治愈。經(jīng)8周的治愈期后，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)(表3)。
表3物質(zhì)對(duì)照成釉質(zhì)素高分子量中等分子量低分子量治愈(%)4782115
因此，施用高分子量成釉質(zhì)素后出現(xiàn)新的連接，而施用中等分子量成釉質(zhì)素和低分子量成釉質(zhì)素則治愈水平較低。這些結(jié)果表明在牙周炎的治療中，施用由釉質(zhì)基質(zhì)(enanelmatrix)而得的高分子量組份成釉質(zhì)素可十分有效地促進(jìn)組織連接。
實(shí)施例4制備釉質(zhì)基質(zhì)的酸提取物將屠殺豬(約6個(gè)月，屠殺體重約80kg)的低位頜骨上的軟組織剔凈，并在屠殺間內(nèi)冷凍。在出現(xiàn)部分解凍后，從凍結(jié)的頜骨中切除適宜的牙胚，并分離釉質(zhì)基質(zhì)。
在780ml0.5M乙酸(PH4.1)中使38g釉質(zhì)基質(zhì)成漿，并在冰冷卻下均漿化(HomogenisatorPolytronPT10-30)。將該均漿在冷卻下攪拌22小時(shí)，并于約PH4提取可溶蛋白。將不溶物通過離心除去，并將乙酸溶液冷凍干燥。
得到8.5g含有約20%蛋白質(zhì)成份的凍干物，其相應(yīng)蛋白質(zhì)收率約為50%。
分析冷凍干燥提取物的下列數(shù)據(jù)水份，乙酸鹽，蛋白質(zhì)成份(Lowry)，碳水化合物成份(Antron試劑)，氨基酸成份，元素分析，蛋白質(zhì)分子量分布(SDS-Page)，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。
在用于臨床試驗(yàn)前，將含蛋白質(zhì)的乙酸溶液經(jīng)過消毒過濾裝入10ml的無菌小瓶中，并在無菌條件下冷凍干燥。
本實(shí)施例的目的是揭示E3物質(zhì)對(duì)治愈人類邊緣性牙周炎的影響。經(jīng)SwedishMedicalBoard和TheRegionalEthicsComittee批準(zhǔn)后，在對(duì)邊緣牙周炎患者的常規(guī)外科治療中，將所述組合物用作輔助治療劑。通過手術(shù)除去患者的牙垢和顆粒組織。將E3物質(zhì)“涂”在裸露的牙根表面，并用粘膜骨膜片復(fù)蓋。通過定期臨床檢查，記錄袋深，附著水平和齦指數(shù)以及口腔內(nèi)立體X光片檢查評(píng)價(jià)治療結(jié)果。將該結(jié)果與早期采用慣用牙周手術(shù)和同類患者的相似對(duì)照面積所得的定量研究結(jié)果比較。
結(jié)果表明E3物質(zhì)使邊緣牙槽骨高度明顯增加(4-8mm)，使附著水平明顯增加(5-9mm)。這是在慣用牙周外科手術(shù)后從未見過的結(jié)果。與對(duì)慣用牙周外科手術(shù)的早期研究相比，這種治療一般不僅更迅速地改善臨床表現(xiàn)，而且還迅速降低邊緣袋深。這些結(jié)果表明由釉質(zhì)基質(zhì)而得的低分子量蛋白組份具有促進(jìn)人體新牙周組織附著的能力，這是常規(guī)治療不會(huì)出現(xiàn)的結(jié)果。
表4對(duì)釉質(zhì)基質(zhì)均漿和由釉質(zhì)均漿而得的蛋白組份的分析分析釉質(zhì)基質(zhì)均化物酸提取物脫鹽提取物鹽組分(E1) (E3) (E10) (實(shí)施例2)元素分析(%W/W)C11.33150.4NDH1.74.46.8NDN3.94.515.50.7O9.427.521NDS0.20.351.30.1Cl5.50.6＜0.11.3P8.83.50.14.3Ca11.912＜0.131.6K0.20.4＜0.1ND
表4(續(xù))對(duì)釉質(zhì)基質(zhì)均漿和由釉質(zhì)均漿而得的蛋白組份的分析分析釉質(zhì)基質(zhì)均化物酸提取物脫鹽提取物鹽組分(E1) (E3) (E10) (實(shí)施例2)蛋白質(zhì)組份(%W/W)Lowry分析232072＜4氨基酸分析＜23＜26＜90ND碳水化合物組份(%W/W)Antron試劑ND0.41.3ND水份(%W/W)KarlFischer滴定ND26ND乙酸鹽組份(%W/W)GC-方法ND384ND
表4(續(xù))對(duì)釉質(zhì)基質(zhì)均漿和由釉質(zhì)均漿而得的蛋白組份的分析分析釉質(zhì)基質(zhì)酸提取物脫鹽提取物鹽提取物均漿(E1)(E3)(E10)(實(shí)施例2)氨基酸分析(殘余物%W/W總殘留物)ProND18.019.0NDGlu″17.819.0″Leu″9.09.1″His″8.79.2″Ser″4.84.6″Gly″3.22.8″Tyr″6.45.3″Thr″3.63.4″Val″3.63.5″Met″4.35.3″Ile″3.53.6″Asp″3.63.0″Phe″3.83.7″Ala″1.61.5″Lys″2.51.8″Arg″3.02.5″Trp″2.62.5″Cys″00″
改善骨骼治療根據(jù)成年大鼠下頜和股骨的實(shí)驗(yàn)洞穴測(cè)定“釉質(zhì)基質(zhì)低分子量蛋白質(zhì)”的骨骼治療作用。在皮膚和咬肌作垂直外科切口使頜骨的角形部分暴露。在恒定的生理鹽水流下，在下頜骨上鉆一個(gè)小孔(直徑為2mm)。以與頜骨同樣的方法，在股骨側(cè)遠(yuǎn)部分的致密骨鉆幾個(gè)同樣大小的洞。在右頜骨和右股骨施用“釉質(zhì)基質(zhì)低分子量蛋白質(zhì)”，與此同時(shí)將左頜骨和左股骨用作對(duì)照洞穴。
在這些洞穴中施用的“釉質(zhì)基質(zhì)低分子量蛋白質(zhì)”既可采用冷凍干燥海棉樣材料的形式，也可采用小明膠圓柱體的形式。用沒有“釉質(zhì)基質(zhì)低分子量蛋白質(zhì)”的明膠圓柱體填充這些大鼠左側(cè)頜骨和股骨上的對(duì)照洞穴。在大鼠左側(cè)頜骨和股骨對(duì)照洞穴不施用任何干燥，冷凍干燥“釉質(zhì)基質(zhì)低分子量蛋白質(zhì)”。
施用上述物質(zhì)1-5周后將大鼠處死。取出實(shí)驗(yàn)和對(duì)照的觀察部位并作顯微鏡檢查。
在鉆空中施用釉質(zhì)低分子量蛋白僅1周后，這個(gè)空洞就會(huì)完全被骨質(zhì)充滿，另外，已形成明顯的骨膜對(duì)合。在未用本發(fā)明方法處理的對(duì)照組，也長出新骨，但明顯要少許多，且并不能使鉆空治愈。
權(quán)利要求
1.一種用于促進(jìn)各活體礦物化組織之間結(jié)合的組合物，其結(jié)合方法為在至少一個(gè)上述組織上再生礦物化組織，該組合物的特征在于，它含有一種可從牙釉質(zhì)前體，即，所謂釉質(zhì)基質(zhì)獲得的，作為活性成份的蛋白質(zhì)組份。
2.權(quán)利要求1所述用于治療牙周炎的組合物。
3.權(quán)利要求2所述用于人類的組合物。
4.任一前述權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于所述釉質(zhì)基質(zhì)產(chǎn)生于哺乳動(dòng)物。
5.權(quán)利要求4所述組合物，其特征在于所述釉質(zhì)基質(zhì)產(chǎn)生于牛和豬。
6.前述任一權(quán)利要求所述組合物，其特征在于它是由所述蛋白質(zhì)成份組成的。
7.前述任一權(quán)利要求所述組合物，其特征在于由所述蛋白質(zhì)成份的低分子部分或其活性決定因子構(gòu)成所述活性成份。
8.權(quán)利要求7所述組合物，其特征在于由一般被認(rèn)為是成釉質(zhì)素的乙酸可提取蛋白質(zhì)構(gòu)成所述活性成份。
9.權(quán)利要求7所述組合物，其特征在于所述活性成份的分子量高達(dá)約40，000。
10.權(quán)利要求9所述組合物，其特征在于所述活性成份的分子量在約5000和約25000之間。
11.權(quán)利要求8所述組合物，其特征在于由釉質(zhì)基質(zhì)的成釉質(zhì)素中的高分子量組份構(gòu)成所述活性成份。
12.權(quán)利要求1至5中任一權(quán)利要求及從屬于權(quán)利要求1至5的權(quán)利要求7和11所述的組合物，其特征在于它含有所述蛋白質(zhì)組份和適用于該目的的載體，稀釋劑或粘合劑。
13.權(quán)利要求12所述組合物，其特征在于所述載體，稀釋劑或粘合劑是牙科或生理上可以接受的。
14.權(quán)利要求13所述組合物，其特征在于所述載體，稀釋劑或粘合劑包括水溶性聚合物。
15.權(quán)利要求14所述組合物，其特征在于所述水溶性聚合物由纖維素衍生物或藻酸鹽構(gòu)成。
16.用于治療的可從牙釉質(zhì)前體，即所謂釉質(zhì)基質(zhì)獲得的蛋白質(zhì)組份。
17.一種從牙釉質(zhì)前體，即所謂釉質(zhì)基質(zhì)獲得的蛋白質(zhì)組份，該蛋白質(zhì)組份用于制備用于治療需要再生礦物化組織的疾病或癥狀的藥物。
18.一種可從牙釉質(zhì)前體，即所謂釉質(zhì)基質(zhì)獲得的蛋白質(zhì)組份，該蛋白質(zhì)組份用于制備治療牙周炎的藥物。
19.一種用于治療牙周炎的藥用組合物，該組合物包括可從牙釉前體，即所謂釉質(zhì)基質(zhì)獲得的作為活性成份的蛋白質(zhì)組份。
20.一種用于治療需要再生礦物化組織的疾病或癥狀的藥用組合物，該組合物包括可從牙釉質(zhì)前體，即所謂釉質(zhì)基質(zhì)獲得的作為活性成份的蛋白質(zhì)組份。
21.一種用于促進(jìn)活體礦物化組織各部分間的結(jié)合的方法，即在至少一個(gè)部分上再生礦物化組織，該方法的特征在于，從至少一個(gè)部分的連接部位除去可能存在的軟組織，在至少一個(gè)部分施用含有作為活性成份，可從牙釉質(zhì)前體，即釉質(zhì)基質(zhì)獲得的蛋白質(zhì)組份的組合物，然后使各部分貼近，以便能夠通過再生礦物化組織而進(jìn)行結(jié)合。
22.權(quán)利要求21所述用于治療牙周炎的方法，其特征在于通過下述方法治療患病牙齒，即，使牙根表面暴露，與此同時(shí)盡可能除去上皮組織，用所述組合物涂敷經(jīng)過清潔的牙根表面，使復(fù)蓋軟組織復(fù)位，并隨意縫合，以便促進(jìn)治愈。
23.權(quán)利要求21所述方法，其特征在于從哺乳動(dòng)物源分離釉質(zhì)基質(zhì)。
24.權(quán)利要求23所述方法，其中從牛和豬身上分離所述釉質(zhì)基質(zhì)。
25.權(quán)利要求21所述方法，其特征在于通過重組DNA技術(shù)或通過培養(yǎng)二倍體細(xì)胞獲得蛋白質(zhì)組份或其活性決定因子。
26.一種用于制備用于促使礦物化組織各部分間結(jié)合的組合物的方法，所述結(jié)合方法是在至少一個(gè)部分上再生礦物化組織，該方法的特征在于從哺乳動(dòng)物頜骨分離牙胚，從牙齒上分離所述牙胚，從所述游離牙胚中回收釉質(zhì)基質(zhì)，使釉質(zhì)基質(zhì)均漿化，從經(jīng)均漿化的釉質(zhì)基質(zhì)中分離蛋白質(zhì)組份，并任意地將該組份與適用于該目的的載體，稀釋劑或粘合劑混合。
27.類似于權(quán)利要求26所述的方法，其中從?；蜇i體內(nèi)進(jìn)行所述分離。
28.類似于權(quán)利要求26或27所述的方法，其中所述載體，稀釋劑或粘合劑是牙科或生物上可以接受的。
全文摘要
一種用于促進(jìn)礦物化組織各部分間結(jié)合的組合物，其結(jié)合方法是在至少一個(gè)部分上再生礦物化組織，該組合物含有作為活性成分的由牙釉質(zhì)前體，即所謂釉質(zhì)基質(zhì)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組分；一種采用上述組合物通過在至少一個(gè)部分上再生礦物化組織促進(jìn)活體礦物化組織各部分間結(jié)合的方法。
文檔編號(hào)A61K35/32GK1035773SQ8910158
公開日1989年9月27日 申請(qǐng)日期1989年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1988年3月17日
發(fā)明者拉斯·哈馬施特羅姆, 利夫·布洛姆洛夫, 斯文·林斯科格 申請(qǐng)人:比奧拉公司