本發(fā)明屬于納米材料技術(shù)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種基于銅死亡的多功能抗腫瘤納米藥物遞送系統(tǒng)及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥發(fā)病率高，死亡率高，是當(dāng)今人類健康面臨的重大威脅，但傳統(tǒng)癌癥治療手段往往受限，為了保障人類生命健康安全，更為有效、更加安全的癌癥治療策略亟待探索。近年來，介孔二氧化硅納米顆粒(msns)由于其可調(diào)節(jié)的孔徑、形態(tài)和表面官能化而在藥物遞送中受到了廣泛關(guān)注，但是在優(yōu)選基質(zhì)降解控制釋放機(jī)制的情況下，其純無機(jī)框架的緩慢生物降解性限制了它們的應(yīng)用。目前有研究表明，在分子水平上將功能化基團(tuán)整合到介孔二氧化硅框架中可以解決這一缺點(diǎn)，其中，二硒鍵的鍵能比較低，容易被氧化形成亞硒酸或還原形成硒醇，表現(xiàn)出良好的氧化還原反應(yīng)生物降解性。

2、培美曲塞(pem)是一種結(jié)構(gòu)核心為吡咯嘧啶基團(tuán)的抗葉酸制劑，它可以通過破壞腫瘤細(xì)胞內(nèi)葉酸依賴性的正常代謝過程，從而抑制腫瘤的復(fù)制、生長和增殖，是多種癌癥的一線化療藥物，然而pem只能通過葉酸載體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)化，難以在腫瘤部位積聚，治療效果往往不理想。此外，單一的化療策略也難以有效地消除腫瘤，而多種治療方法聯(lián)合使用有利于克服單一治療策略的缺陷，達(dá)到更加全面和徹底的治療效果。

3、鐵死亡是一種非凋亡性細(xì)胞死亡方式，相對于細(xì)胞凋亡具有獨(dú)特的優(yōu)勢，它主要依賴于細(xì)胞內(nèi)的鐵超載和抗氧化系統(tǒng)失衡引起的脂質(zhì)過氧化來殺傷腫瘤。然而，腫瘤細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中的抗氧化劑相對于正常細(xì)胞表達(dá)水平顯著上調(diào)，嚴(yán)重限制了活性氧(ros)的生成。其中谷胱甘肽(gsh)不僅可以直接清除ros，還可以作為谷胱甘肽過氧化物酶4(gpx4)的重要底物；而gpx4則具有將有害脂質(zhì)過氧化物還原為無害脂質(zhì)醇的能力，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的傷害，從而有效抑制鐵死亡的發(fā)生。因此，為了引發(fā)對腫瘤具有強(qiáng)大治療效果的鐵死亡，開發(fā)一種既能實現(xiàn)ros的大量積聚，又能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞抗氧化微環(huán)境的策略具有重要意義。

4、銅超載誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑—銅死亡是一種很有前景的腫瘤治療策略，過量的銅通過促進(jìn)脂酰化蛋白(dlat)在三羧酸循環(huán)中的異常寡聚化以及降低鐵硫(fe-s)簇蛋白水平來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，與被廣泛研究的細(xì)胞凋亡和壞死等程序性細(xì)胞死亡方式有著根本的不同，因此在克服當(dāng)前腫瘤化療的不足方面有著巨大的前景。銅離子載體是一種可以通過結(jié)合cu2+將銅輸送到細(xì)胞中的配體，但其大多是小分子，血液半衰期較短，難以將足夠的銅運(yùn)送到癌細(xì)胞中。為克服上述障礙，銅離子載體和納米平臺已被聯(lián)合應(yīng)用于cu2+的精準(zhǔn)靶向遞送。然而，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)機(jī)制下，過量的銅通常會被atp7a和atp7b(控制銅外排的主要出口者)泵出細(xì)胞。除此之外，gsh也可以作為銅螯合劑抑制銅增生，細(xì)胞內(nèi)的銅被維持在非常低的水平。因此，如何以簡單的方式制備具有可控結(jié)構(gòu)的納米遞送系統(tǒng)，突破該治療策略受到的多方面限制，最終實現(xiàn)細(xì)胞銅沉積仍然是一項艱巨的挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種基于銅死亡的多功能抗腫瘤納米藥物遞送系統(tǒng)及其制備方法與應(yīng)用。該納米藥物遞送系統(tǒng)以氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅(smon)為載體，裝載化療藥物，靜電吸附銅離子與配體3,3'-二硫代雙(丙酰肼)(tph)自組裝形成的銅基外殼(cut)，最外層還進(jìn)行了酸響應(yīng)型脂質(zhì)體膜(chol-spc/dope)的包覆，并搭載著對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glut1)具有高選擇性的小分子抑制劑。該納米藥物遞送系統(tǒng)通過響應(yīng)腫瘤微環(huán)境中的酸性ph以及高濃度gsh，逐步釋放小分子抑制劑、cu2+、tph(具有s-s結(jié)構(gòu))以及化療藥物，從而大量消耗gsh使gpx4活性降低，導(dǎo)致腫瘤抗氧化系統(tǒng)失衡(鐵死亡)，cu2+被還原成cu+破壞線粒體三羧酸循環(huán)(銅死亡)、化療藥物抑制腫瘤的復(fù)制、生長和增殖(化療)等三個方面協(xié)同治療腫瘤。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供的這種基于銅死亡的多功能抗腫瘤納米藥物遞送系統(tǒng)，其包括：負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅，以及包覆在所述負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅表面的銅基外殼，以及包覆在所述銅基外殼表面的載有小分子抑制劑的脂質(zhì)體膜；所述銅基外殼由銅離子與配體3,3'-二硫代雙(丙酰肼)自組裝形成。

4、優(yōu)選的，以氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅的總質(zhì)量為基準(zhǔn)，硒的摻雜量為15～25wt％。

5、優(yōu)選的，所述氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅與化療藥物的質(zhì)量比為(28～32)：(19～21)；所述負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅與cu2+、3，3'-二硫代雙(丙酰肼)的質(zhì)量比為(18～22)：(7～9)：(7～9)；包覆有銅基外殼并負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅與小分子抑制劑的質(zhì)量比為(4～6)：(2～4)。

6、優(yōu)選的，所述氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅的平均粒徑為80～90nm，比表面積為400～450m2/g，孔容為0.2～0.4cm3/g，孔徑為2～4nm。

7、優(yōu)選的，所述化療藥物包括培美曲塞(pem)。

8、優(yōu)選的，所述小分子抑制劑包括雙氯芬酸(dc)。

9、優(yōu)選的，所述脂質(zhì)體膜由磷脂(pc)、膽固醇(chol)、二油?；字掖及?dope)、聚乙二醇4種原料制成；所述磷脂、膽固醇、二油?；字掖及?、聚乙二醇的質(zhì)量比為(3～5)：(2～4)：(7～9)：(4～6)。

10、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述聚乙二醇的平均分子量為1900～2100。

11、在一些具體實施例中，以最終合成的所述多功能抗腫瘤納米藥物遞送系統(tǒng)的質(zhì)量為基準(zhǔn)，所述培美曲塞的負(fù)載率為10～15wt％，cu2+的負(fù)載率為7～9wt％，雙氯芬酸的負(fù)載率為4～7wt％。

12、本發(fā)明還提供一種所述基于銅死亡的多功能抗腫瘤納米藥物遞送系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟：

13、1)將模板劑十六烷基三甲基對甲苯磺酸銨(ctat)和三乙醇胺(teah3)加入去離子水中，然后加熱攪拌，接著滴加正硅酸乙酯(teos)和雙[3-(三乙氧基硅基)丙基]二硒醚(btesepd)，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后離心，得到沉淀物；然后將沉淀物溶解于溶劑1并攪拌回流，去除模板劑，得到二硒鍵摻雜介孔二氧化硅(semsn)；

14、2)對步驟1)獲得的二硒鍵摻雜介孔二氧化硅進(jìn)行氨基化處理，得到氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅(smon)；

15、3)將步驟2)獲得的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅分散于溶劑2中，然后加入化療藥物溶液，在室溫下攪拌設(shè)定時間中，需開蓋攪拌將半數(shù)溶劑揮發(fā)，然后離心收集產(chǎn)物，得到負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅；

16、4)將步驟3)獲得的負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅分散于溶劑3中，然后加入cu2+水溶液、3，3'-二硫代雙(丙酰肼)溶液，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，離心收集產(chǎn)物，得到包覆有銅基外殼的負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅；

17、5)將磷脂、膽固醇、二油?；字掖及?、聚乙二醇和小分子抑制劑溶液混合均勻，在真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，形成薄膜后，加入分散在水中的表面包覆有銅基外殼的負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅，使脂質(zhì)薄膜水化，形成納米粒子包覆層，然后離心收集得到所述納米藥物遞送系統(tǒng)。

18、優(yōu)選的，步驟1)中，十六烷基三甲基對甲苯磺酸銨、三乙醇胺、去離子水的比例為(70～80)mg：(14～18)μl：(4～6)ml；正硅酸乙酯和雙[3-(三乙氧基硅基)丙基]二硒醚的體積比為(400～600)：(100～200)。

19、進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟1)中，十六烷基三甲基對甲苯磺酸銨、三乙醇胺、去離子水的比例為75mg：16.74μl：5ml；正硅酸乙酯和雙[3-(三乙氧基硅基)丙基]二硒醚的體積比為533：100。

20、優(yōu)選的，步驟1)中，反應(yīng)溫度為75～85℃，反應(yīng)時間為3～5h；去除模板劑攪拌回流的溫度為65～75℃，攪拌回流時間為24～48h。

21、進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟1)中，反應(yīng)溫度為80℃，反應(yīng)時間為4h；去除模板劑攪拌回流的溫度為70℃，攪拌回流時間為24h。

22、優(yōu)選的，步驟1)中，所述溶劑1為乙醇和鹽酸的混合物。

23、步驟2)中，為便于后續(xù)藥物裝載以及殼膜包覆，對二硒鍵摻雜介孔二氧化硅進(jìn)行氨基化處理，具體操作為：將二硒鍵摻雜介孔二氧化硅、甲苯與(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)的混合溶液攪拌回流，回流結(jié)束后，離心收集產(chǎn)物、洗滌、真空干燥后獲得氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅。

24、優(yōu)選的，所述二硒鍵摻雜介孔二氧化硅、甲苯和(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的比例為(200～300)mg：(32～48)ml：(0.8～1.2)ml。

25、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述二硒鍵摻雜介孔二氧化硅、甲苯和(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的比例為250mg：40ml：1ml。

26、優(yōu)選的，步驟2)中氨基化處理，攪拌回流的溫度為105～115℃，攪拌回流的時間為23～25h；真空干燥的時間為8～12h。

27、進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟2)中氨基化處理，攪拌回流的溫度為110℃，攪拌回流的時間為24h；真空干燥的時間為10h。

28、優(yōu)選的，步驟3)中，所述溶劑2包括甲醇。

29、優(yōu)選的，步驟3)中，氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅和化療藥物的質(zhì)量比為(28～32)：(19～21)；氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅分散于溶劑2的濃度為5～7mg/ml，化療藥物溶液的濃度為3～5mg/ml；攪拌總時間為22～26h，其中揮發(fā)攪拌時間為11～13h。

30、進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟3)中，氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅和化療藥物的質(zhì)量比為3：2；氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅分散于溶劑2的濃度為6mg/ml，化療藥物溶液的濃度為4mg/ml；攪拌時間為24h，揮發(fā)攪拌時間為12h。

31、優(yōu)選的，步驟3)中，所述化療藥物包括培美曲塞。

32、優(yōu)選的，步驟4)中，所述溶劑3包括乙醇；所述負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅、cu2+、3，3'-二硫代雙(丙酰肼)的質(zhì)量比為(18～22)：(7～9)：(7～9)；負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅分散于溶劑3中的濃度為9～11mg/ml，cu2+水溶液的濃度為32～33mg/ml，3，3'-二硫代雙(丙酰肼)溶液的濃度為0.5～1mg/ml；攪拌時間為18～20h，攪拌溫度為30～37℃。

33、進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟4)中，所述負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅、cu2+、3，3'-二硫代雙(丙酰肼)的質(zhì)量比為20：7.8：8；負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅分散于溶劑3中的濃度為10mg/ml，cu2+水溶液的濃度為32.56mg/ml，3，3'-二硫代雙(丙酰肼)溶液的濃度為0.8mg/ml；攪拌時間為19h，攪拌溫度為37℃。

34、優(yōu)選的，步驟5)中，磷脂、膽固醇、二油?；字掖及贰⒕垡叶己托》肿右种苿┑馁|(zhì)量比為(3～5)：(2～4)：(7～9)：(4～6)：(2～4)；磷脂溶液的濃度為9～11mg/ml，膽固醇溶液的濃度為1～3mg/ml，二油酰基磷脂乙醇胺溶液的濃度為3～5mg/ml，聚乙二醇溶液的濃度為2～3mg/ml，小分子抑制劑溶液的濃度為2～4mg/ml；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間為10～20min；表面包覆有銅基外殼的負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅分散在水中的濃度為0.8～1.2mg/ml；表面包覆有銅基外殼的負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅、脂質(zhì)體膜和小分子抑制劑的質(zhì)量比為(4～6)：(16～24)：(2～4)；水化時間為25～35min，水化溫度為36～38℃。

35、進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟5)中，磷脂、膽固醇、二油?；字掖及贰⒕垡叶己托》肿右种苿┑馁|(zhì)量比為4：3：8：5：3；磷脂溶液的濃度為10mg/ml，膽固醇溶液的濃度為為2mg/ml，二油?；字掖及啡芤旱臐舛葹?mg/ml，聚乙二醇溶液的濃度為2.5mg/ml，小分子抑制劑溶液的濃度為3mg/ml；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間為15min；表面包覆有銅基外殼的負(fù)載化療藥物的氨基化二硒鍵摻雜介孔二氧化硅分散在水中的濃度為1mg/ml；水化時間為30min，水化溫度為37℃。

36、優(yōu)選的，步驟5)中，所述小分子抑制劑包括雙氯芬酸。

37、本發(fā)明還提供一種所述基于銅死亡的多功能抗腫瘤納米藥物遞送系統(tǒng)在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用。

38、優(yōu)選的，所述腫瘤為乳腺癌。

39、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種多功能抗腫瘤納米藥物遞送系統(tǒng)，該納米藥物遞送系統(tǒng)可通過epr效應(yīng)(高滲透長滯留)積累并滲透到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，在腫瘤酸性微環(huán)境下最外層脂質(zhì)體膜響應(yīng)裂解，釋放dc抑制葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而切斷atp7a以及atp7b的能量來源(atp)以降低其對cu2+的外排。而暴露的銅基外殼則通過tph中的s-s與gsh反應(yīng)而裂解，大量消耗gsh并釋放cu2+，為實現(xiàn)cu2+的過載創(chuàng)造條件。gsh的過度清除會導(dǎo)致gpx4的活性降低，細(xì)胞抗氧化能力削弱，從而引發(fā)鐵死亡。而cu2+則可被gsh和fdx1還原成更具毒性的cu+，破壞線粒體三羧酸循環(huán)(tca)并造成dlat的聚集以及fe-s簇蛋白的缺失，引發(fā)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生銅死亡。此外，smon也可通過二硒鍵響應(yīng)氧化還原環(huán)境釋放化療藥物pem，抑制腫瘤的復(fù)制、生長和增殖。本發(fā)明有效提高了癌細(xì)胞對銅增生的敏感性，通過鐵死亡、銅死亡與化療多層次、多方位、多角度殺傷腫瘤，有利于克服腫瘤細(xì)胞對常規(guī)化療的耐藥性。此外，本發(fā)明提供的多功能抗腫瘤納米藥物遞送系統(tǒng)對正常細(xì)胞沒有毒副作用，具有良好的生物相容性和降解性。且該納米藥物遞送系統(tǒng)的制備方法簡單易操作。