本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥以及分析，具體涉及一種基于口腔微生物的食管癌早期篩查模型及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、食管癌是一種由不典型增生發(fā)展至癌前病變、原位癌和轉(zhuǎn)移癌狀態(tài)的上消化道惡性腫瘤。它在全球最常見(jiàn)癌癥中排名第九，在癌癥死亡原因中排名第六。流行病學(xué)研究報(bào)告顯示，2020年全球食管癌新發(fā)病例為604,100例（6.3?/?10萬(wàn)），死亡病例為544,076例（5.6/?10萬(wàn)），到2040年將增加至95.7萬(wàn)例（6.3?/?10萬(wàn)）和88萬(wàn)例（5.6?/?10萬(wàn)），超過(guò)50%的患者發(fā)生在中國(guó)[1-4]。然而，導(dǎo)致食管癌如此高發(fā)病率的原因尚不明確，導(dǎo)致缺乏一級(jí)病因預(yù)防。因此，“篩查”和“早診早治”的二級(jí)預(yù)防成為預(yù)防食管癌的主要途徑[5]。早期篩查是發(fā)現(xiàn)癌癥和挽救生命的最有效方法之一。研究表明，如果在早期得到發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌癥患者可以得到成功治療[5]。遺憾的是，我國(guó)食管癌的早期篩查策略幾十年來(lái)的發(fā)展受限，以上消化道內(nèi)鏡為主要手段的早篩方式仍是當(dāng)下的唯一選擇[1-3]。在上消化道內(nèi)鏡檢查過(guò)程中，通過(guò)一根末端裝有小型攝像機(jī)的細(xì)而柔韌的管子（稱(chēng)為內(nèi)窺鏡）從患者的喉嚨向下進(jìn)入食管，這是一種侵入性檢查方法，受試者依從性差，不易普及，因此不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)食管癌。此外，由于早期無(wú)特異性癥狀，大多數(shù)患者在中晚期才被確診，并迅速進(jìn)展至治療選擇有限，治愈無(wú)望的晚期，導(dǎo)致死亡率居高不下[6,7]。食管癌臨床治療的現(xiàn)狀，加上一級(jí)預(yù)防靶點(diǎn)的缺乏，迫切需要一種易于早篩、早診、早治療的無(wú)創(chuàng)方法來(lái)控制食管癌的進(jìn)展。

2、口腔微生物組作為人體第二大細(xì)菌儲(chǔ)存庫(kù)[8]，被認(rèn)為是預(yù)測(cè)頭頸部癌[9]、肺癌[10]和結(jié)直腸癌[11]的潛在生物標(biāo)志物。雖然既往研究表明食管癌患者也存在口腔菌群失調(diào)[12,13]，且口腔衛(wèi)生不良與食管癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，但由于樣本量較小，且沒(méi)有牙周炎患者作為健康對(duì)照之外的另一對(duì)照，口腔菌群對(duì)食管癌的預(yù)測(cè)價(jià)值尚不明確[14,15]。由于牙周炎是食管癌的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，也可引起口腔菌群失調(diào)[16]。一些牙周炎的致病菌（如牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等）不僅存在于癌癥病灶中，而且可以通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)癌癥進(jìn)展，這是一個(gè)影響診斷/篩查模型準(zhǔn)確性的關(guān)鍵問(wèn)題[17-19]。確定癌癥患者的口腔微生物群是否與牙周炎患者不同至關(guān)重要。如果兩組的口腔菌群基本相同，現(xiàn)有的生物標(biāo)志物可能會(huì)將牙周炎患者錯(cuò)誤地診斷為癌癥患者。因此，不僅需要招募健康人群和癌癥患者，還需要招募牙周炎患者來(lái)構(gòu)建基于口腔菌群的癌癥篩查模型。這是以往研究的主要局限性，也是影響靈敏度和準(zhǔn)確性的最重要因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為了解決目前我國(guó)食管癌患者早期篩查方法受限、受試者依從性差、難以廣泛普及的情況，提供了一種基于口腔微生物的食管癌早期篩查模型及其構(gòu)建方法。

2、本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種基于口腔微生物的食管癌早期篩查模型，所述模型為下述口腔微生物菌群作為標(biāo)志物： prevotella、 granulicatella、 rothia、 prevotellamassilia、 blautia、 abiotrophia、 peptostreptococcus、 actinomyces、 burkholderia、 akkermansia、 fudania、 kineothrix、 bacillus、 duncaniella、 eisenbergiella。

3、進(jìn)一步的，所述口腔微生物菌群的相對(duì)豐富信息作為模型自變量，是否為食管癌患者為因變量，運(yùn)用logistic回歸模型進(jìn)行建模，logistic回歸構(gòu)建的模型的公式為：y?=1?/?(1?+?e^(2.89285631363524?+?-0.130555223035498?* prevotella+?-0.234624415130977?* granulicatella+?-0.123421428328489?* rothia+0.0305284360696491?* prevotellamassilia+?2.72774911990433?* blautia+?-0.671714432121879?* abiotrophia+?-0.643868902165489?* peptostreptococcus+1.81604325065481?* actinomyces+?9.28516953416389?* burkholderia+?-3.52739890519049?* akkermansia+?9.46455532514789?* fudania+?-7.93770666127306?* kineothrix+?-127.099900821647?* bacillus+?-93.3296419351167?* duncaniella+?-37.9213542816937?* eisenbergiella))；公式中菌群名稱(chēng)指代菌群的相對(duì)豐度信息。

4、本發(fā)明還提供了所述基于口腔微生物的食管癌早期篩查模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

5、（1）收集健康口腔拭子樣本、牙周炎口腔拭子樣本以及食管癌患者口腔拭子樣本，作為分析樣本；

6、（2）將分析樣本提取dna并建庫(kù)，使用qubit3.0?fluorometer和femto?pulsesystem進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)，合格的文庫(kù)使用pacbio?sequel?platform進(jìn)行測(cè)序；

7、（3）對(duì)于合格文庫(kù)進(jìn)行口腔菌群的組成和結(jié)構(gòu)的差異分析：采用bray-curtis的樣本距離

8、（4）構(gòu)建早篩模型（初始模型）：利用excel中的“rand”函數(shù)將隊(duì)列分成發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列。首先，基于發(fā)現(xiàn)隊(duì)列，利用隨機(jī)森林方法randomforest?v4.6.12，參數(shù)：randomforest?obs?~?.,?data?=?data,?importance?=?t篩選區(qū)分食管癌患者的物種，利用logistic回歸算法r-3.6.3?函數(shù)glm?參數(shù)：glm?(obs?~?.,?family?=?binomial()，data)構(gòu)建模型，利用受試者工作曲線（roc）中的曲線下面積（auc）、準(zhǔn)確度（specificities）、靈敏度（sensitivities）判定該初始模型的分類(lèi)效果。

9、（5）模型的簡(jiǎn)化：通過(guò)“逐一剔除”的方法，考察剔除單一物種對(duì)食管癌早篩模型（初始模型）的評(píng)效指標(biāo)的影響，最終嘗試剔除mean?decrease?gini指數(shù)較低、剔除后對(duì)模型評(píng)效指標(biāo)影響不大的4個(gè)物種后，再次通過(guò)logistic算法構(gòu)建早篩模型作為終極簡(jiǎn)化模型，并將該終極簡(jiǎn)化模型在驗(yàn)證隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證，同樣受試者工作曲線（roc）中的曲線下面積（auc）、準(zhǔn)確度（specificities）、靈敏度（sensitivities）作為模型的評(píng)效指標(biāo)。

10、該模型有較好的食管篩查效果。具體參數(shù)如下：該模型在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中的準(zhǔn)確度為0.839，靈敏度為0.911，受試者工作曲線下面積為0.932，95%置信區(qū)間為0.900-0.965。經(jīng)受試者工作曲線評(píng)估，模型在驗(yàn)證隊(duì)列中的準(zhǔn)確度為0.768，靈敏度為0.820，曲線下面積為0.856,?95%置信區(qū)間為0.806-0.906。

11、本發(fā)明方法僅需采集患者的口腔拭子（唾液）樣本，通過(guò)專(zhuān)業(yè)人員完成后續(xù)的測(cè)序、分析和診斷流程，即可實(shí)現(xiàn)食管癌的篩查。本發(fā)明方法，具有無(wú)創(chuàng)、便捷、易普及的優(yōu)勢(shì)，受試者在家自行操作即可完成樣本的采集工作，可以實(shí)現(xiàn)食管癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療。

12、本發(fā)明通過(guò)明確食管癌患者與健康人、牙周炎患者口腔菌群的差異，進(jìn)而識(shí)別食管癌患者特定的菌群特征，開(kāi)發(fā)一種高效、特異、敏感的食管癌早期篩查方法。通過(guò)在全國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)山西省招募109名年齡匹配的健康志愿者、138名牙周炎患者和224名食管癌患者，收集受試人群的口腔拭子樣本，采用16s-rdna測(cè)序并分析樣本的菌群特征。隨后，通過(guò)指標(biāo)菌群相對(duì)豐度構(gòu)建基于口腔菌群的早篩模型，并采用受試者工作特征（roc）分析評(píng)價(jià)指標(biāo)菌群的診斷效果，使得該早篩模型可成功地從健康人群和牙周炎患者中篩選出食管癌患者。本發(fā)明為食管癌的篩查和早期診斷提供了一種無(wú)創(chuàng)的篩查方法，從而為患者提供早期治療的機(jī)會(huì)。本發(fā)明通過(guò)識(shí)別非侵入性生物標(biāo)志物，以發(fā)現(xiàn)早期無(wú)癥狀的食管癌患者，從而改善其不良預(yù)后，挽救生命。