本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及五味子乙素在制備治療糖尿病并發(fā)癥藥物中的用途。另外，本發(fā)明還涉及五味子乙素在制備具有抗炎活性的myd88抑制劑中的用途。

背景技術(shù)：

糖尿病作為世界性的流行性疾病導(dǎo)致了嚴(yán)重的全球健康問題，中國的糖尿病患者占全部人口的9.7％。糖尿病的并發(fā)癥可遍及全身各重要器官，大多數(shù)糖尿病患者死于心、腦血管或腎臟并發(fā)癥。糖尿病的器官并發(fā)癥是多因素綜合作用引起的，涉及炎癥反應(yīng)、ras激活、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及終末糖基化產(chǎn)物(ages)等多種因素，但是近年來的證據(jù)顯示炎癥反應(yīng)與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)。高血糖誘導(dǎo)的各器官組織炎癥信號(hào)激活、炎癥因子釋放、趨化粘附因子水平上升以及炎性細(xì)胞浸潤和聚集，隨后導(dǎo)致組織發(fā)生一系列的損傷性病理改變?？梢?，炎癥反應(yīng)在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

髓樣分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88，myd88)是tlrs介導(dǎo)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)接分子，是信號(hào)向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵靶分子。研究表明tlr2，3，4，7及9的信號(hào)傳導(dǎo)均通過myd88途徑完成信號(hào)傳導(dǎo)：tlrs激活后,其tir結(jié)構(gòu)域與myd88的羧基末端相互作用，從而激活myd88依賴性信號(hào)通路，隨后，mapks及nf-κb信號(hào)通路也被激活，共同開啟下游的炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)13。可見，myd88在lps誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

五味子乙素(schisandrinb，schb)是從五味子果中提取的一種木脂素，具有抗炎、抗氧化、護(hù)肝、保護(hù)心血管等功效。針對(duì)五味子乙素在緩解代謝性疾病中作用的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素主要通過抗氧化來治療疾病。但是，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素除了其抗氧化能力外還可以顯著地抑制lps誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

目前，關(guān)于五味子乙素的直接抗炎靶點(diǎn)尚不清楚，另外，其在糖尿病并發(fā)癥中的作用尚未見報(bào)道。本發(fā)明人經(jīng)過艱苦努力，發(fā)現(xiàn)五味子乙素可以通過靶向抑制炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白myd88發(fā)揮抗炎活性，從而用于治療糖尿病并發(fā)癥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種五味子乙素在治療或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥(尤其是糖尿病心肌病及糖尿病腎病)方面的新用途和/或提供其通過靶向抑制myd88蛋白緩解炎癥反應(yīng)的新用途。

本發(fā)明提供了一種五味子乙素在藥物制備中的應(yīng)用，所述的藥物用于治療或者預(yù)防糖尿病并發(fā)癥。

在本發(fā)明中，我們首先發(fā)現(xiàn)了五味子乙素對(duì)糖尿病心肌病(dcm)的治療效果。我們利用stz造成1型糖尿病小鼠模型并給于小鼠灌胃五味子乙素(20及40mg/kg/day)16周。結(jié)果表明五味子乙素顯著緩解stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心臟以及腎臟組織纖維化及細(xì)胞凋亡以及心腎功能不全(詳情見實(shí)施例1)。同時(shí)，口服五味子乙素并不影響1型糖尿病小鼠的高血糖水平，說明其作用不是通過降血糖而引起的。

糖尿病并發(fā)癥包括但不局限于糖尿病心肌病、糖尿病相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和糖尿病足病中的一種或者多種。作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述的糖尿病并發(fā)癥為糖尿病心肌病和/或糖尿病腎病。

作為更進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的五味子乙素用于改善心臟及腎臟組織纖維化、較少心臟及腎臟細(xì)胞凋亡、提高心腎功能。

作為優(yōu)選，所述的五味子乙素是通過抑制或降低高血糖在并發(fā)癥病灶部位誘導(dǎo)的慢性炎癥而發(fā)揮治療或者預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的作用。在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)五味子乙素可以抑制高糖(hg33mm葡萄糖)誘導(dǎo)的h9c2及大鼠原代心肌細(xì)胞中的炎癥信號(hào)通路(mapks及nf-κb)激活及炎癥因子(tnf-α和il-6)釋放。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述的五味子乙素是通過直接靶向抑制炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白----髓樣分化因子88(myd88)發(fā)揮治療或者預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的作用。在經(jīng)典的lps刺激的炎癥信號(hào)通路中，tlr4是lps的主要受體。lps與tlr4結(jié)合，形成胞膜復(fù)合物，該胞膜復(fù)合物進(jìn)一步招募下游胞內(nèi)接頭蛋白,如：myd88依賴的炎癥因子轉(zhuǎn)錄途徑。我們首先通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)五味子乙素可以特異性地抑制該炎癥信號(hào)通路中tlr4與myd88蛋白的復(fù)合(詳情見實(shí)施例3)。為了進(jìn)一步確證五味子乙素對(duì)tlr4和myd88的選擇性，我們利用重組人tlr4蛋白、重組人myd88蛋白及spr實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測了五味子乙素與這兩個(gè)蛋白的相互作用關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)五味子乙素與myd88蛋白能發(fā)生直接相互作用,但是與tlr4的結(jié)合很弱。同時(shí)，利用bis-ans競爭性置換實(shí)驗(yàn)考察五味子乙素與myd88的結(jié)合率可見五味子乙素劑量依賴性地降低myd88蛋白的熒光吸收強(qiáng)度，提示五味子乙素與myd88蛋白有直接的結(jié)合作用(詳情見實(shí)施例4)。

具體應(yīng)用時(shí)，所述的藥物為五味子乙素和藥學(xué)上可接受的輔劑配制而成的制劑。其中優(yōu)選于用于口服的散劑、片劑、丸劑、膠囊及口服液。本發(fā)明的藥物組合物可以是將五味子乙素和藥學(xué)上可接受的輔劑組合在一起而配制成的各種制劑，優(yōu)選為固體制劑和液體制劑。本發(fā)明的制劑可以為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續(xù)釋放或延遲釋釋放形式)、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑、等劑型以及各種緩釋劑型，從而適合各種給藥方式，例如口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)過皮膚等的給藥形式(其中優(yōu)選于用于口服的散劑、片劑、丸劑、膠囊(包括持續(xù)釋放或延遲釋釋放形式)及口服液)。

本發(fā)明還提供了一種五味子乙素在藥物制備中的應(yīng)用，所述的藥物為myd88抑制劑，該藥物可以用于所有與myd88有關(guān)的疾病。

本發(fā)明取得的有益效果在于：發(fā)現(xiàn)五味子乙素，具有優(yōu)異的抑制炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白myd88的作用及緩解高血糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)效果，從而可以高效地治療糖尿病并發(fā)癥。

為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說明書中重復(fù)敘述過一樣。

附圖說明

圖1五味子乙素對(duì)stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠心臟并發(fā)癥的影響。

圖2五味子乙素對(duì)stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠腎臟并發(fā)癥的影響。

圖3五味子乙素對(duì)hg誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的緩解作用。

圖4五味子乙素特異性地抑制lps誘導(dǎo)炎癥信號(hào)通路中tlr4與myd88蛋白的復(fù)合。

圖5五味子乙素與myd88蛋白有直接的結(jié)合作用。

具體實(shí)施方式

通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1五味子乙素對(duì)stz誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠臟器并發(fā)癥的影響

雄性c57bl/6小鼠從溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心獲得。小鼠用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物食物和水飼養(yǎng)在恒溫晝夜12-12h節(jié)律的動(dòng)物房內(nèi)。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)開始前至少花一周時(shí)間進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性生長。涉及到動(dòng)物使用的協(xié)議都獲得溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物政策與福利委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文件:2009/apwc/0031)。在實(shí)驗(yàn)中所用的五味子乙素為制成的可溶于水的劑型。溶液的ph值為7.36并經(jīng)0.22的微孔濾膜過濾。8-10周齡雄性c57bl/6小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、五味子乙素單純處理組(schb)、糖尿病組(dm)、糖尿病組合并五味子乙素(20、40mg/kg/d兩個(gè)劑量)處理組，每組8只。低劑量50mg/kg/d尿鏈佐菌素(stz,sigma)腹腔注射，連續(xù)注射5天造模1型糖尿病模型，72小時(shí)后，血糖儀測定空腹血糖(禁食4-6小時(shí))，血糖值≥12mmol/l時(shí)認(rèn)為1型糖尿病小鼠模型已建立。每周監(jiān)測血糖和體重，連續(xù)喂養(yǎng)4個(gè)月。各組小鼠處死前，利用多普勒超聲檢測儀記錄心功能指標(biāo)。石蠟包埋心臟組織，通過馬松及he染色檢測心臟及腎臟形態(tài)學(xué)改變，通過tunel技術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡改變。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖1和圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)五味子乙素顯著緩解stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心臟及腎臟組織纖維化及細(xì)胞凋亡以及心腎功能不全。

其中，圖1a表示的是tunel染色試驗(yàn)結(jié)果，上部為染色圖片，下部為各組tunel陽性細(xì)胞占比的統(tǒng)計(jì)圖，其中，藍(lán)色熒光點(diǎn)定位細(xì)胞核，位于細(xì)胞核處的綠色熒光點(diǎn)為tunel陽性點(diǎn)。圖1a的結(jié)果表明，糖尿病組(dm)心臟細(xì)胞大量調(diào)亡，而糖尿病組合并五味子乙素處理組心臟細(xì)胞調(diào)亡明顯改善，與正常對(duì)照組接近，可見，五味子乙素可以明顯改善心臟細(xì)胞凋亡。

圖1b表示的是masson染色試驗(yàn)結(jié)果，上部為染色圖片，下部為心臟組織纖維化占比的統(tǒng)計(jì)圖，其中，心肌纖維為紅色，間質(zhì)中藍(lán)色為膠原纖維堆積。圖1b的結(jié)果表明，糖尿病組(dm)心臟組織纖維化嚴(yán)重，而糖尿病組合并五味子乙素處理組心臟組織纖維化明顯改善，與正常對(duì)照組解決，可見，五味子乙素可以明顯改善心臟組織纖維化。

圖1c～1d為各組小鼠處死前，用多普勒超聲檢測儀記錄心功能指標(biāo)，圖1c和1d表明糖尿病組(dm)心臟功能變差，而糖尿病組合并五味子乙素處理組心臟功能良好。

其中，圖2a-c分別表示的是尿、血中的尿素氮(bun)含量及血肌酐(cr)含量，該結(jié)果說明糖尿病組(t1dm)腎功能變差，而糖尿病組合并五味子乙素處理組腎臟功能良好。圖2d為he染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明，t1dm組腎小球腫脹，而糖尿病組合并五味子乙素處理組腎小球大小無明顯改善，與正常對(duì)照組接近，可見，五味子乙素可以明顯改善腎小球腫脹。圖2e表示的是siriusred染色試驗(yàn)結(jié)果，粉紅色為腎組織，深紅色為膠原纖維堆積，結(jié)果表明，t1dm組腎臟組織纖維化嚴(yán)重，而糖尿病組合并五味子乙素處理組腎臟組織纖維化明顯改善，與正常對(duì)照組接近，可見，五味子乙素可以明顯改善腎臟組織纖維化。圖2f為westernblot實(shí)驗(yàn)檢測腎纖維化標(biāo)志蛋白col-4及tgf-β，結(jié)果表明類似圖2e。

實(shí)施例2五味子乙素可以緩解hg誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)

采用五味子乙素對(duì)hg刺激h9c2及大鼠原代心肌細(xì)胞中釋放炎癥因子(tnf-α和il-6)抑制的方法測試了五味子乙素的體外抗炎活性，具體方法如下：1.2×10^{^6}個(gè)h9c2或大鼠原代心肌細(xì)胞用dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃，24小時(shí)后更新培養(yǎng)液，并加入受測五味子乙素(終濃度為2.5、5及10μm)預(yù)處理1小時(shí)，再用高糖(hg33mm葡萄糖)繼續(xù)處理24小時(shí)，收集培養(yǎng)液用elisa法檢測tnf-α和il-6含量；收集細(xì)胞檢測總蛋白濃度，elisa結(jié)果用相應(yīng)的總蛋白濃度相除較準(zhǔn)，以hg對(duì)照組的tnf-α和il-6含量定標(biāo)為100；每個(gè)化合物重復(fù)測試3次，計(jì)算平均值和誤差值。五味子乙素對(duì)tnf-α和il-6釋放的抑制活性見圖3。

其中，圖3a表示五味子乙素對(duì)tnf-α的抑制活性，由圖3可知，五味子乙素可以降低tnf-α因子的含量，并且，隨著五味子乙素用量增加，tnf-α因子含量逐漸降低，表明具有較好的劑量依耐性。

圖3c表示五味子乙素對(duì)il-6的抑制活性，由圖3可知，五味子乙素可以降低il-6因子的含量，并且，隨著五味子乙素用量增加，il-6因子含量逐漸降低，表明具有較好的劑量依耐性。

同時(shí)，采用五味子乙素對(duì)hg刺激h9c2及大鼠原代心肌細(xì)胞中炎癥信號(hào)通路(mapks及nf-κb)激活抑制的方法測試了五味子乙素的體外抗炎活性，具體方法如下：1.2×10^6個(gè)h9c2或大鼠原代心肌細(xì)胞用dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃，24小時(shí)后更新培養(yǎng)液，并加入受測五味子乙素(終濃度為2.5、5及10μm)預(yù)處理1小時(shí)，再用高糖(hg33mm葡萄糖)繼續(xù)處理1小時(shí)，收集培養(yǎng)液用westernblot法檢測mapk(erk、p38、jnk)活化及iκb-α降解的情況；每個(gè)化合物重復(fù)測試3次，計(jì)算平均值和誤差值。五味子乙素對(duì)炎癥信號(hào)通路(mapks及nf-κb)激活的抑制活性見圖3。實(shí)驗(yàn)顯示五味子乙素可以有效緩解hg誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

實(shí)施例3五味子乙素特異性地抑制lps誘導(dǎo)炎癥信號(hào)通路中tlr4與myd88蛋白的復(fù)合

在經(jīng)典的lps刺激的炎癥信號(hào)通路中，tlr4是lps的主要受體。但tlr4與lps的結(jié)合需要髓樣分化蛋白2(md2)的參與，形成lps-tlr4-md2復(fù)合物，該胞膜復(fù)合物進(jìn)一步招募下游胞內(nèi)接頭蛋白,如：myd88依賴的炎癥因子轉(zhuǎn)錄途徑和trif依賴的干擾素-β(ifn-β)轉(zhuǎn)錄途徑。其中，md2與tlr4復(fù)合以及tlr4招募下游接頭蛋白myd88是該炎癥通路激活的重要標(biāo)志，我們利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測了五味子乙素對(duì)這兩種蛋白復(fù)合體的體外抑制活性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖4。實(shí)驗(yàn)表明五味子乙素抑制raw264.7巨噬細(xì)胞中l(wèi)ps誘導(dǎo)的tlr4對(duì)下游myd88的招募，但是對(duì)md2與tlr4復(fù)合的抑制活性很弱。此外，我們也檢測五味子乙素對(duì)tlr4下游另一街頭蛋白trif的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖4。實(shí)驗(yàn)表明五味子乙素對(duì)tlr4與trif復(fù)合的抑制活性很弱，且對(duì)lps誘導(dǎo)的trif依賴的ifn-γ增高無明顯影響。

實(shí)施例4五味子乙素與myd88蛋白有直接的結(jié)合作用

利用光學(xué)表面等離子共振(spr)技術(shù)檢測五味子乙素與myd88蛋白有直接的結(jié)合作用：利用標(biāo)準(zhǔn)氨基化學(xué)偶聯(lián)法固定myd88蛋白于cm5傳感芯片表面，以hbs-ep作為流動(dòng)緩沖液(0.01mhepes(ph7.4),0.15mnacl,3mmedta,0.005％surfactantp20)，將5μl/min的恒定流速持續(xù)流過cm5傳感芯片，傳感芯片先以35μl的0.05mnhs和0.2medc混合溶液活化，反應(yīng)了7min以激活表面的羧基基團(tuán)。用適宜的ph，10mm乙酸緩沖溶液配制成1mm的myd88注射于活化的傳感芯片表面進(jìn)行固定，最后用50μl1m乙醇胺封閉未反應(yīng)的活性羧基基團(tuán)并洗去非共價(jià)吸附的物質(zhì)。hbs-ep緩沖液沖洗直至基線穩(wěn)定。取出cm5芯片備用。動(dòng)力學(xué)測定時(shí)，五味子乙素用hbs-ep稀釋成不同濃度(含dmso的濃度不高于5％)，分別注射到已固定myd88的cm5傳感芯片上，每次注射20μl，測定3次。每次測定后，用含10mm醋酸鈉的1mnacl(ph4.5)溶液再生傳感芯片，然后進(jìn)行下一次測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用評(píng)估軟件biaevaluation進(jìn)行動(dòng)力學(xué)常數(shù)的計(jì)算和評(píng)估，并計(jì)算它們的結(jié)合常數(shù)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖5a。結(jié)果發(fā)現(xiàn)五味子乙素與myd88蛋白能發(fā)生直接相互作用,但是與tlr4的結(jié)合很弱。

利用bis-ans競爭性置換實(shí)驗(yàn)考察五味子乙素與myd88的結(jié)合率：將rhmyd88(5nm)與1,1’-bis(ignali)-4,4’-bis(naphthalene)-8,8’-disulfonate(bis-ans，5μm)在pbs中混合，熒光檢測儀檢測混合物在激發(fā)光385nm，發(fā)射光在430-590nm的發(fā)射光強(qiáng)度。設(shè)置bis-ans組、bis-ans+myd88組、bisans+myd88+schb(2.5um)組、bis-ans+myd88+schb(5um)組、bis-ans+myd88+schb(10um)組、bis-ans+myd88+schb(20um)組、bis-ans+myd88+schb(40um)組。先檢測rhmyd88與bis-ans混合物達(dá)到穩(wěn)定時(shí)的發(fā)生波長，然后加入不同濃度的schb孵育5min。再次檢測激發(fā)光385nm，發(fā)射光在430-590nm的發(fā)射光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖5b。結(jié)果顯示五味子乙素劑量依賴性地降低myd88蛋白的熒光吸收強(qiáng)度，提示五味子乙素與myd88蛋白有直接的結(jié)合作用。