本申請是2009年7月17日提交的200980136079.8號同名發(fā)明專利申請的分案申請。【
技術(shù)領(lǐng)域：
】發(fā)明領(lǐng)域涉及治療心力衰竭。更特別是，本發(fā)明針對改善的劑量方案，其維持和/或增強施用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(例如神經(jīng)膠質(zhì)生長因子2(ggf2)或其片段)的治療性益處，而最小化任何潛在副作用。
背景技術(shù)：
：與給有需要的患者施用藥療相關(guān)的根本性的挑戰(zhàn)是耐受性與功效之間的關(guān)系。治療指數(shù)是可施用于患者的物質(zhì)的有效的劑量與檢測到對患者的不期望的副作用的劑量之間的范圍。一般而言，有效的劑量與副作用起始的劑量之間的差異越大，物質(zhì)越是良性，及越可能被患者耐受。心力衰竭(特別是充血性心力衰竭(chf))是工業(yè)化國家中死亡的主導原因之一。成為充血性心力衰竭的基礎(chǔ)的因素包括：高血壓，缺血性心臟病，暴露于心臟毒性化合物(例如蒽環(huán)類抗生素)，輻射暴露，物理創(chuàng)傷及與增加的心力衰竭風險相關(guān)的遺傳缺陷。由此，chf常由由于高血壓，來自慢性缺血，心肌梗塞，病毒疾病，化學毒性，輻射的對心肌的損傷及其他疾病(例如硬皮病)的對心臟的增加的工作負荷所致。這些病情導致心臟的抽泵能力的進行性降低。起初，由高血壓或收縮性組織的損失所致的增加的工作負荷誘導補償性心肌細胞肥大及左心室壁加厚，由此增強收縮性及維持心臟功能。經(jīng)時，但是，左心室膨脹，心臟收縮泵功能惡化，心肌細胞經(jīng)歷凋亡性細胞死亡，及心肌功能進行性惡化。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(nrgs)及nrg受體包括涉及神經(jīng)，肌肉，上皮，及其他組織中器官發(fā)生及細胞發(fā)育的細胞間信號轉(zhuǎn)導的生長因子-受體酪氨酸激酶系統(tǒng)(lemke,mol.cell.neurosci.7:247-262,1996andburdenetal.,neuron18:847-855,1997)。nrg家族由編碼含表皮生長因子(egf)-樣，免疫球蛋白(ig)，及其他可識別結(jié)構(gòu)域的多種配體的4種基因構(gòu)成。多種分泌的及附接膜的異構(gòu)體在此信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)中發(fā)揮配體的作用。人中nrg配體的受體是egf受體(egfr)家族的全部成員，及分別包括egfr(或erbb1)，erbb2，erbb3，及erbb4，也被稱為her1～her4(meyeretal.,development124:3575-3586,1997；orr-urtregeretal.,proc.natl.acad.sci.usa90:1867-71,1993；marchionnietal.,nature362:312-8,1993；chenetal.,j.comp.neurol.349:389-400,1994；corfasetal.,neuron14:103-115,1995；meyeretal.,proc.natl.acad.sci.usa91:1064-1068,1994；andpinkas-kramarskietal.,oncogene15:2803-2815,1997)。4種nrg基因，nrg-1，nrg-2，nrg-3，及nrg-4，定位于不同染色體座位(pinkas-kramarskietal.,proc.natl.acad.sci.usa91:9387-91,1994；carrawayetal.,nature387:512-516,1997；changetal.,nature387:509-511,1997；andzhangetal.,proc.natl.acad.sci.usa94:9562-9567,1997)，及共同編碼nrg蛋白的種種陣列。nrg-1的基因產(chǎn)物，例如，包括一組大致15種不同的結(jié)構(gòu)上-相關(guān)的異構(gòu)體(lemke,mol.cell.neurosci.7:247-262,1996andpelesandyarden,bioessays15:815-824,1993)。首先鑒定的nrg-1的亞型包括neu分化因子(ndf；pelesetal.,cell69,205-216,1992andwenetal.,cell69,559-572,1992)，神經(jīng)生長因子(hrg；holmesetal.,science256:1205-1210,1992)，誘導活性的乙酰膽堿受體(aria；fallsetal.,cell72:801-815,1993)，及神經(jīng)膠質(zhì)生長因子ggf1，ggf2，及ggf3(marchionnietal.nature362:312-8,1993)。nrg-2基因通過同源性克隆(changetal.,nature387:509-512,1997；carrawayetal.,nature387:512-516,1997；andhigashiyamaetal.,j.biochem.122:675-680,1997)及通過基因組方法(busfieldetal.,mol.cell.biol.17:4007-4014,1997)鑒定。nrg-2cdna也已知為神經(jīng)-及胸腺-來源的erbb激酶活化子(ntak；genbank登錄號no.ab005060)，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白趨異劑(don-1)，及小腦-來源的生長因子(cdgf；pct申請wo97/09425)。實驗證據(jù)顯示，表達erbb4或erbb2/erbb4組合的細胞可能顯示針對nrg-2的特別穩(wěn)健的應(yīng)答(pinkas-kramarskietal.,mol.cell.biol.18:6090-6101,1998)。nrg-3基因產(chǎn)物(zhang等人，supra)也已知結(jié)合及活化erbb4受體(hijazietal.,int.j.oncol.13:1061-1067,1998)。egf-樣結(jié)構(gòu)域存在于全部形式的nrg的核心，及需要結(jié)合及活化erbb受體。3種基因中編碼的egf-樣結(jié)構(gòu)域的推斷的氨基酸序列大致是30～40％相同(比對)。而且，nrg-1及nrg-2中似乎有至少2種亞型的egf-樣結(jié)構(gòu)域，其可賦予不同生物活性及組織-特異性潛力。對nrg的細胞應(yīng)答通過表皮生長因子受體家族的nrg受體酪氨酸激酶egfr，erbb2，erbb3，及erbb4介導。全部nrg的高-親和力結(jié)合主要經(jīng)或者erbb3或erbb4介導。nrg配體的結(jié)合導致與其他erbb亞基的二聚化及通過對特異性酪氨酸殘基的磷酸化反式激活。在某些實驗環(huán)境中，erbb受體的幾乎全部組合似乎能響應(yīng)nrg-1異構(gòu)體的結(jié)合形成二聚體。但是，看起來erbb2是可在穩(wěn)定配體-受體復合物中起重要的作用的優(yōu)選的二聚化偶體。erbb2不結(jié)合其自身上的配體，但必需與其他受體亞型之一異源配對。erbb3確實具有酪氨酸激酶活性，但是其他受體的磷酸化的靶。nrg-1，erbb2，及erbb4的表達已知必要于小鼠發(fā)育期間心室心肌的小梁形成。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激補償性肥大性生長及抑制經(jīng)歷生理應(yīng)激的心肌細胞的凋亡。根據(jù)這些觀察，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的施用對于防止，最小化，或翻轉(zhuǎn)由作為基礎(chǔ)的因素(例如高血壓，缺血性心臟病，及心臟毒性)所致的充血性心臟病有用。見，例如，美國專利號(uspn)6,635,249，將其整體并入本文。從一般人群中心力衰竭的高發(fā)病率來看，仍有未滿足的對阻止或最小化此疾病進展(例如通過抑制心臟功能損失或通過改良心臟功能)的需求?！景l(fā)明概述】本發(fā)明包括治療或預防哺乳動物的心力衰竭的方法。方法基于驚人的發(fā)現(xiàn)，包括表皮生長因子-樣(egf-樣)結(jié)構(gòu)域的肽的治療性益處可通過不維持穩(wěn)定-狀態(tài)的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白施用(例如通過用以或超過48，72，96或更多小時的施用間隔給哺乳動物施用治療有效量的肽)的劑量方案實現(xiàn)。因此，本方法要求給哺乳動物含egf-樣結(jié)構(gòu)域的肽的間歇的或不連續(xù)的施用(每48～96小時，或甚至更長間隔)，其中所述egf-樣結(jié)構(gòu)域由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼，及其中肽的施用是以對于治療或預防哺乳動物的心力衰竭有效的量。不維持穩(wěn)定-狀態(tài)濃度的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白施用的劑量方案與更頻繁的劑量方案同樣有效，然而無可產(chǎn)生自更頻繁的施用的不便，成本或副作用。本文所用的術(shù)語，間歇的或不連續(xù)的施用包括以至少48小時，72小時，96小時，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天、1周，2周，4周，1個月，2個月，3個月，4個月，或其任何組合或增量的間隔的施劑方案，只要間隔/方案至少為48小時，72小時，96小時，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天、1周，2周，4周，1個月，2個月，3個月，4個月。本文所用的術(shù)語間歇的或不連續(xù)的施用包括以不小于48小時，72小時，96小時，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天、1周，2周，4周，1個月，2個月，3個月，4個月，或其任何組合或增量的間隔的施劑方案，只要間隔/方案不小于48小時，72小時，96小時，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天、1周，2周，4周，1個月，2個月，3個月，4個月。根據(jù)本發(fā)明，給哺乳動物的含egf-樣結(jié)構(gòu)域的肽的間歇的或不連續(xù)的施用(其中所述egf-樣結(jié)構(gòu)域由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼)針對達到不維持施用的肽的窄穩(wěn)定-狀態(tài)濃度的劑量方案，由此降低哺乳動物將經(jīng)歷可產(chǎn)生自經(jīng)延長的持續(xù)時間維持施用的肽的生理學以上水平的不利的副作用的概率。例如，與外源地施用的nrg的生理學以上水平相關(guān)的副作用包括：神經(jīng)鞘增生，乳腺增生，腎病，精子減少癥，肝臟酶升高，心臟瓣膜變化及注射位點的皮膚變化。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明針對引起或允許包括由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼的egf-樣結(jié)構(gòu)域的肽的血清水平波動的間歇的劑量方案，從而降低與更頻繁的肽施用相關(guān)的不利的副作用的潛力。本發(fā)明的間歇的劑量方案由此賦予給哺乳動物的治療性優(yōu)勢，但不維持穩(wěn)定狀態(tài)治療性水平的包括由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼的egf-樣結(jié)構(gòu)域的肽。如被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員同意，有本發(fā)明的各種實施方式來獲得間歇的施劑；這些實施方式的益處可以各種方式陳述，例如，所述施用不維持穩(wěn)定狀態(tài)治療性水平的所述肽，施用降低與更頻繁地施用nrg肽相關(guān)的不利的副作用的潛力，等。在本發(fā)明的特定實施方式中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可為包含nrg-1，nrg-2，nrg-3或nrg-4，或者基本上由其構(gòu)成或由其構(gòu)成的基因，基因產(chǎn)物或其相應(yīng)亞序列或片段。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的nrg亞序列或片段包括表皮生長因子-樣(egf-樣)結(jié)構(gòu)域或其同系物。如被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員同意，與egf-樣結(jié)構(gòu)域肽的肽同系物通過找結(jié)構(gòu)同源性或如egf-樣肽在功能測定中一樣由同系物肽進行(例如通過結(jié)合及活化erbb受體)來測定。優(yōu)選片段至少為40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85個氨基酸長。本發(fā)明的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白肽可，進而，由這些神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因(或其亞序列)任之一編碼。在更特定的實施方式中，方法中使用的肽是重組人ggf2或其片段或亞序列。見圖8a～8d的全長人ggf2的氨基酸及核酸序列。在本發(fā)明的一個方面，適宜哺乳動物包括但不限于，小鼠，大鼠，兔，狗，猴或豬。在本發(fā)明的一個實施方式中，哺乳動物是人。在本發(fā)明的其他實施方式中，心力衰竭可產(chǎn)生自高血壓，缺血性心臟病，暴露于心臟毒性化合物(例如，可卡因，醇，抗-erbb2抗體或抗-her抗體，例如或蒽環(huán)類抗生素，例如多柔比星或道諾霉素)，心肌炎，甲狀腺疾病，病毒感染，牙齦炎，藥物濫用，酒精濫用，心包炎，動脈粥樣硬化，血管疾病，肥大性心肌病，急性心肌梗塞或之前心肌梗塞，左心室心臟收縮功能障礙，冠狀動脈分流手術(shù)，饑餓，輻射暴露，進食障礙，或遺傳缺陷。在本發(fā)明的另一實施方式中，在蒽環(huán)類抗生素施用之前，期間，或后，將抗-erbb2或抗-her2抗體，例如施用于哺乳動物。在本發(fā)明的其他實施方式中，在暴露于心臟毒性化合物之前，暴露于所述心臟毒性化合物期間，或暴露于所述心臟毒性化合物后施用肽；診斷所述哺乳動物的充血性心力衰竭之前或后施用肽。本發(fā)明的方法可在受試者哺乳動物已經(jīng)歷補償性心臟肥大后進行；本發(fā)明的方法包括，方法的結(jié)果旨在維持左心室肥大或阻止心肌疏伐進展，或抑制心肌細胞凋亡。在本發(fā)明的方法中，肽可包括由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼的egf-樣結(jié)構(gòu)域，或者基本上由其構(gòu)成，或由其構(gòu)成。本發(fā)明的肽在暴露于心臟毒性化合物之前，期間，或后施用。在另一實施方式中，含egf-樣結(jié)構(gòu)域的肽在這些時期中的2個，或全部3個期間施用。根據(jù)本發(fā)明，由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼的含egf-樣結(jié)構(gòu)域的肽以每48～96小時的間隔施用。在本發(fā)明的一個實施方式中，由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼的含egf-樣結(jié)構(gòu)域的肽是ggf2。在本發(fā)明的再一實施方式中，在診斷哺乳動物的充血性心力衰竭之前或后施用肽。在本發(fā)明的又一實施方式中，將肽施用于已經(jīng)歷補償性心臟肥大的哺乳動物。在本發(fā)明的其他特定實施方式中，肽的施用維持左心室肥大，阻止心肌疏伐進展，和/或抑制心肌細胞凋亡。本發(fā)明的實施方式包括以下：用于治療哺乳動物的心力衰竭的方法，所述方法包括給所述哺乳動物外源施用包括表皮生長因子-樣(egf-樣)結(jié)構(gòu)域的肽，其中所述以所述間隔的施用降低所述哺乳動物中與所述外源肽的施用相關(guān)的不利的副作用。用于治療哺乳動物的心力衰竭的方法，所述方法包括給所述哺乳動物外源施用包括表皮生長因子-樣(egf-樣)結(jié)構(gòu)域的肽，其中所述egf-樣結(jié)構(gòu)域由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(nrg)-1基因編碼，及所述外源肽以對治療所述哺乳動物的心力衰竭的治療有效量、以至少48小時的間隔施用，其中所述以所述間隔的施用不在所述哺乳動物中維持穩(wěn)定狀態(tài)水平的所述外源肽。用于治療哺乳動物的心力衰竭的方法，所述方法包括給所述哺乳動物外源施用包括表皮生長因子-樣(egf-樣)結(jié)構(gòu)域的肽或其同系物，及所述外源肽以對治療所述哺乳動物的心力衰竭的治療有效量、以至少或不小于48小時的間隔施用，其中所述以所述間隔的施用允許所述哺乳動物中所述外源肽相對基線或施用前水平的血清濃度的劑量內(nèi)波動。本文中的術(shù)語不利的或有害的副作用指醫(yī)學治療的非故意的及不期望的結(jié)果。關(guān)于本發(fā)明，由外源肽的施用所致的不利的或有害的副作用可包括以下任何一種或多種：神經(jīng)鞘增生，乳腺增生，腎病，及注射位點的皮膚變化。本文中的術(shù)語“所述哺乳動物中所述外源肽相對施用前水平的血清濃度的劑量內(nèi)波動”指一劑量的外源肽施用之前的血清濃度水平之間的差異。本文中的術(shù)語“穩(wěn)定狀態(tài)水平”指足以實現(xiàn)施用及消除之間的平衡(在隨后的劑量之間的波動范圍內(nèi)的)的外源試劑(例如，肽)的水平?！熬S持穩(wěn)定狀態(tài)治療性水平”指將外源試劑濃度維持在足以給受試者或患者賦予治療性益處的水平。【附圖說明】圖1顯示描繪如由射血分數(shù)及縮短分數(shù)變化例示的心臟功能的直方圖。如所示，大鼠用0.625mg/kg的ggf2或等摩爾量的egf-樣片段(片段；egf-id)每天(q天)靜脈內(nèi)(iv)處理。圖2顯示描繪如由射血分數(shù)及縮短分數(shù)的變化顯示的心臟功能的線坐標圖。如所示，大鼠用0.625mg/kg或3.25mg/kg的ggf2靜脈內(nèi)處理q天。圖3顯示描繪如由處理時期期間收縮末期容量的顯著的改善顯示的心臟功能的線坐標圖。如所示，大鼠用0.625mg/kg或3.25mg/kg的ggf2靜脈內(nèi)處理q天。圖4顯示描繪如由射血分數(shù)及縮短分數(shù)變化顯示的心臟功能的線坐標圖。如所示，大鼠用3.25mg/kg的ggf2靜脈內(nèi)(iv)處理q24，48或96小時。圖5顯示描繪如由超聲波心動圖射血分數(shù)的變化顯示的心臟功能的線坐標圖。如所示，大鼠用媒質(zhì)或3.25mg/kg的ggf2(有或無bsa)靜脈內(nèi)(iv)處理。圖6顯示描繪靜脈內(nèi)施用后重組人ggf2(rhggf2)的半衰期的線坐標圖。圖7顯示描繪皮下施用后重組人ggf2(rhggf2)的半衰期的線坐標圖。圖8a～d顯示全長ggf2的核酸及氨基酸序列。核酸序列指定seqidno：1及氨基酸序列指定seqidno：2。圖9顯示表皮生長因子-樣(egfl)結(jié)構(gòu)域1的核酸及氨基酸序列。egfl結(jié)構(gòu)域1的核酸序列在本文中指定seqidno：3及egfl結(jié)構(gòu)域1的氨基酸序列在本文中指定seqidno：4。圖10顯示表皮生長因子-樣(egfl)結(jié)構(gòu)域2的核酸及氨基酸序列。egfl結(jié)構(gòu)域2的核酸序列在本文中指定seqidno：5及egfl結(jié)構(gòu)域2的氨基酸序列在本文中指定seqidno：6。圖11顯示表皮生長因子-樣(egfl)結(jié)構(gòu)域3的核酸及氨基酸序列。egfl結(jié)構(gòu)域3的核酸序列在本文中指定seqidno：7及egfl結(jié)構(gòu)域3的氨基酸序列在本文中指定seqidno：8。圖12顯示表皮生長因子-樣(egfl)結(jié)構(gòu)域4的核酸及氨基酸序列。egfl結(jié)構(gòu)域4的核酸序列在本文中指定seqidno：9及egfl結(jié)構(gòu)域4的氨基酸序列在本文中指定seqidno：10。圖13顯示表皮生長因子-樣(egfl)結(jié)構(gòu)域5的核酸及氨基酸序列。egfl結(jié)構(gòu)域5的核酸序列在本文中指定seqidno：11及egfl結(jié)構(gòu)域5的氨基酸序列在本文中指定seqidno：12。圖14顯示表皮生長因子-樣(egfl)結(jié)構(gòu)域6的核酸及氨基酸序列。egfl結(jié)構(gòu)域6的核酸序列在本文中指定seqidno：13及egfl結(jié)構(gòu)域6的氨基酸序列在本文中指定seqidno：14。圖15顯示包括表皮生長因子-樣(egfl)結(jié)構(gòu)域的多肽的氨基酸序列，其在本文中指定seqidno：21。圖16顯示psv-ahsg載體及含人ggf2的編碼序列的pcmggf2載體的模式圖。圖17顯示為增強轉(zhuǎn)錄，ggf2編碼序列放置在ebvbmlf-1干擾序列(mis)后的模式圖?！景l(fā)明詳述】本發(fā)明人作出驚人的發(fā)現(xiàn)，以適當間隔的時間間隔的不連續(xù)的或間歇的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白施用將治療有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白遞送給有需要的患者及所述治療方案對于防止，預防，改善，最小化，治療或逆轉(zhuǎn)心臟病，例如充血性心力衰竭有用。盡管常規(guī)智慧及開發(fā)實踐涉及設(shè)計劑量方案，以維持穩(wěn)定狀態(tài)濃度的最窄范圍，本發(fā)明人在本文中展示，不維持窄穩(wěn)定-狀態(tài)濃度的用于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白施用的劑量方案與更頻繁的劑量方案同樣有效。的確，本發(fā)明人顯示，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白以至少48小時，72小時，96小時，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，1周，2周，4周，1個月，2個月，3個月，4個月，或其任何組合或增量的施劑間隔治療心力衰竭，只要間隔/方案至少為48小時與每天施劑同樣有效。為了評估外源nrg的藥代動力學，本發(fā)明人顯示，作為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的半衰期，當靜脈內(nèi)遞送時是4～8小時，及當經(jīng)皮下遞送時是11～15小時。見，例如，表1和2及圖6和7。以稀少如每第四天的方案的施劑將，因此，在劑量之間不維持任何可檢測的水平至少3天。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明之前，將無法預測到所述峰/谷比例將與一致的治療性益處相關(guān)。值得注意的是，有此量級的半衰期的化合物通常根據(jù)頻繁的劑量方案施用(例如，每天一劑量或每天多個劑量)。的確，基于就ggf2可用的藥物代謝動力學數(shù)據(jù)，傳統(tǒng)開發(fā)將預測，最佳治療將涉及每天皮下施劑。遵循常規(guī)智慧及開發(fā)實踐中，其他對chf的醫(yī)學治療一般以至少每天基礎(chǔ)施用。所述方案的周期性被認為需要，因為chf是通常由心臟的損傷的收縮和/或松弛所致的慢性疾病，而非急性病情。在導致?lián)p傷的松弛及chf的弱心臟的人中，醫(yī)學治療包括阻斷特異性神經(jīng)激素的形成或作用的藥物(例如血管緊張素轉(zhuǎn)變酶抑制劑(ace-抑制劑)，血管緊張素受體拮抗劑(arbs)，醛甾酮拮抗劑及β-腎上腺素能藥物受體阻斷劑)。這些及其他藥療現(xiàn)在是慢性chf中的護理標準，因為它們已展示導致改善的癥狀，生命期望和/或減少住院治療。在急性惡化或慢性癥狀的情況中，患者常用變力性劑(例如多巴酚丁胺，地高辛)處理以增強心臟收縮性，伴隨血管擴張劑(例如硝酸酯，奈西立肽)和/或利尿藥(例如呋塞米)以減少淤血?；几哐獕杭俺溲孕牧λソ叩幕颊哂靡换蚨喾N抗高血壓藥試劑(例如β-阻斷劑，ace-抑制劑及arbs，硝酸酯(硝酸異山梨酯)，肼屈嗪，及鈣通道阻斷劑)處理。由此，盡管關(guān)于治療chf的典型的實踐，本發(fā)明人已展示，新劑量方案導致有效治療chf，而避免不期望的副作用。盡管不愿意被理論束縛，可能是，所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白處理通過刺激心肌細胞肥大，及通過抑制心肌細胞凋亡部分或完全抑制心臟的進一步劣化來加強心臟的抽泵能力。作為額外的背景，施劑的基本原理旨在測定有效循環(huán)濃度及設(shè)計劑量方案來維持那些水平。合并藥物代謝動力學(pk)及藥效學(pd)研究來預測將維持穩(wěn)定-狀態(tài)水平的特定藥物的劑量方案。典型的計劃旨在最小化cmax及cmin之間的差異，由此減少副作用。藥物被它們的‘治療指數(shù)’描述，其為毒性劑量或循環(huán)水平除以有效劑量或循環(huán)濃度的比。當治療指數(shù)大時，有可不接近毒性水平而給予有效劑量的寬安全性范圍。當以太接近于有效濃度的濃度得到不利的效應(yīng)時，治療指數(shù)描述為窄，及藥物難以安全施用。當開發(fā)劑量方案時，將pk/pd數(shù)據(jù)與治療指數(shù)的知識組合來設(shè)計施用的劑量及頻度以至將患者(例如，人)中的化合物維持在一定濃度，以至其為有效濃度以上及毒性濃度以下。如果不誘導不安全的效應(yīng)不可維持藥物的有效濃度，藥物將在開發(fā)期間失敗。涉及藥物開發(fā)的額外的注釋可見于各種參考文獻，包括：藥物開發(fā)中的藥代動力學：臨床研究設(shè)計及分析(2004，peterbonate及dannyhoward，eds。)，將其整體并入本文。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是與結(jié)合erbb受體的表皮生長因子相關(guān)的生長因子。它們已顯示提高心力衰竭，心臟毒性及缺血的多個模型中的心臟功能。它們也已顯示保護中風，脊髓傷害，神經(jīng)試劑暴露，外周神經(jīng)損傷及化學毒性的模型中的神經(jīng)系統(tǒng)。但是，維持超常水平的外源地供給的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白已顯示具有不利的效應(yīng)，包括神經(jīng)鞘增生，乳腺增生及腎病。每天皮下施用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白后觀察這些效應(yīng)。見，例如，表10。如本文所述，由于相比靜脈內(nèi)施用延長的半衰期，且原本相信維持恒定水平的配體將有利，從而探究皮下施用。開發(fā)劑量方案以降低這些效應(yīng)將顯著增強將用作治療劑的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的能力，及本發(fā)明也針對此。展示不維持恒定水平的欠頻繁的施劑也能使此開發(fā)有效。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白：如上所述，由nrg-1，nrg-2，nrg-3及nrg-4基因編碼的肽具有使它們結(jié)合及活化erbb受體的egf-樣結(jié)構(gòu)域。holmes等人(science256:1205～1210，1992)顯示，egf-樣結(jié)構(gòu)域單獨足以結(jié)合及活化p185erbb2受體。因此，由nrg-1，nrg-2，或nrg-3基因編碼的任何肽產(chǎn)物，或任何神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-樣肽，例如，具有由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因或cdna編碼的egf-樣結(jié)構(gòu)域的肽(例如，含nrg-1肽亞結(jié)構(gòu)域c-c/d或c-c/d'的egf-樣結(jié)構(gòu)域，如uspn5,530,109，uspn5,716,930及uspn7,037,888中所述；或如公開于wo97/09425的egf-樣結(jié)構(gòu)域)可用于本發(fā)明的方法來預防或治療充血性心力衰竭。將各uspn5,530,109；uspn5,716,930；uspn7,037,888；及wo97/09425的內(nèi)容均整體并入本文。危險因素：熟知增加個體的發(fā)展充血性心力衰竭的似然性的危險因素。這些包括，及不限于，吸煙，肥胖癥，高血壓，缺血性心臟病，血管疾病，冠狀動脈分流手術(shù)，心肌梗塞，左心室心臟收縮功能障礙，暴露于心臟毒性化合物(醇，藥物(例如可卡因)，及蒽環(huán)類抗生素(例如多柔比星，及柔紅霉素))，病毒感染，心包炎，心肌炎，牙齦炎，甲狀腺疾病，輻射暴露，已知增加心力衰竭的風險的遺傳缺陷(例如bachinskiandroberts,cardiol.clin.16:603-610,1998；siuetal.,circulation8:1022-1026,1999；andarbustinietal.,heart80:548-558,1998中所述)，饑餓，進食障礙(例如厭食癥及貪食癥)，心力衰竭的家族歷史，及心肌肥大。根據(jù)本發(fā)明，可間歇性地施用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，以實現(xiàn)預防，例如通過防止或降低那些鑒定為瀕臨危險者中的充血性心臟病進展速度。例如，給患早期補償性肥大的患者施用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白允許維持肥大性狀態(tài)及阻止進展到心力衰竭。此外，可在發(fā)展補償性肥大之前給予那些鑒定為瀕臨危險者心臟保護性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白治療。在蒽環(huán)類抗生素化學治療或蒽環(huán)類抗生素/抗-erbb2(抗-her2)抗體(例如，)聯(lián)合治療之前及期間給癌患者施用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可阻止患者的心肌細胞經(jīng)歷凋亡，由此保存心臟功能。已患心肌細胞損失的患者也受益于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白治療，因為其余心肌組織通過展示肥大性生長及增加的收縮性響應(yīng)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白暴露。治療：可將神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白及含由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼的egf-樣結(jié)構(gòu)域的肽及藥學-可接受的稀釋劑，載質(zhì)，或賦形劑施用于患者或?qū)嶒瀯游?。本發(fā)明的組合物可以單元劑型提供。采用常規(guī)藥學實踐來提供適宜制劑或組合物，及將所述組合物施用給患者或?qū)嶒瀯游铩１M管優(yōu)選靜脈內(nèi)施用，可采用任何適當?shù)氖┯猛緩剑?，腸胃外，皮下，肌內(nèi)，經(jīng)皮，心內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，氣霧劑，口服，或局部(例如，通過施加帶能交叉真皮及進入血流的制劑的粘合貼劑)施用。治療性制劑可取液體溶液或懸浮液形式；對于口服施用，制劑可取片劑或膠囊形式；及對于鼻內(nèi)制劑，以粉末，鼻滴液，或氣霧劑的形式。本領(lǐng)域中熟知的制備制劑的方法見于，例如，"remington'spharmaceuticalsciences"。用于腸胃外施用的制劑可，例如，含賦形劑，無菌水，或鹽水，聚烯基甘醇，例如聚乙二醇，蔬菜來源的油，或氫化萘。用于施用本發(fā)明的分子的其他潛在地有用的腸胃外遞送系統(tǒng)包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子，滲透泵，可植入的輸注系統(tǒng)，及脂質(zhì)體。用于吸入的制劑可含賦形劑，例如，乳糖，或可為含，例如，聚氧乙烯-9-月桂醚，甘膽酸鹽及脫氧膽酸鹽的水溶液，或可為以鼻滴液，或作為凝膠的形式施用的油性溶液。作為本發(fā)明的其他方面，提供了將本化合物用作藥學，尤其是在治療或預防前述病情及疾病。本文也提供的是本化合物在制備用于治療或預防前述病情及疾病之一的藥物中的用途。關(guān)于靜脈內(nèi)注射，劑量水平變動于約0.001mg/kg，0.01mg/kg～至少10mg/kg，以如本文所述從至少約每24，36，48小時～約每96小時及尤其是每48，72，或96小時或以上的規(guī)則的時間間隔。在特定實施方式中，靜脈內(nèi)注射劑量水平變動于約0.1mg/kg～約10mg/kg，以如本文所述從約每48小時～約每96小時及尤其是每48，72，或96小時或以上的規(guī)則的時間間隔。在另一特定實施方式中，靜脈內(nèi)注射劑量水平變動于約1mg/kg～約10mg/kg，以如本文所述從約每48小時～約每96小時及尤其是每48，72，或96小時或以上的規(guī)則的時間間隔。在再一特定實施方式中，靜脈內(nèi)注射劑量水平變動于約0.01mg/kg～約1mg/kg，以如本文所述從約每48小時～約每96小時及尤其是每48，72，或96小時或以上的規(guī)則的時間間隔。在再一特定實施方式中，靜脈內(nèi)注射劑量水平變動于約0.1mg/kg～約1mg/kg，以如本文所述從約每48小時～約每96小時及尤其是每48，72，或96小時或以上的規(guī)則的時間間隔。關(guān)于皮下注射，劑量水平變動于約0.01mg/kg～至少10mg/kg，以如本文所述從約每48小時～約每96小時及尤其是每48，72，或96小時或以上的規(guī)則的時間間隔。在特定實施方式中，注射劑量水平變動于約0.1mg/kg～約10mg/kg，以如本文所述從約每48小時～約每96小時或以上的規(guī)則的時間間隔，及尤其是每48，72，或96小時。在另一特定實施方式中，注射劑量水平變動于約1mg/kg～約10mg/kg，以如本文所述從約每48小時～約每96小時或以上的規(guī)則的時間間隔，及尤其是每48，72，或96小時。在再一特定實施方式中，注射劑量水平變動于約0.01mg/kg～約1mg/kg，以如本文所述從約每48小時～約每96小時或以上的規(guī)則的時間間隔，及尤其是每48，72，或96小時。在再一特定實施方式中，注射劑量水平變動于約0.1mg/kg～約1mg/kg，以如本文所述從約每48小時～約每96小時或以上的規(guī)則的時間間隔，及尤其是每48，72，或96小時。通常選擇經(jīng)皮劑量以提供相比使用注射劑量實現(xiàn)的類似或更低血水平。本發(fā)明的化合物可作為單獨的活性劑施用，或它們可與其他試劑組合施用，包括展示相同或類似治療性活性及對于所述組合的施用測定為安全的及有效的其他化合物。其他用于治療chf的所述化合物包括：腦促尿鈉排泄肽(bnp)，阻斷特異性神經(jīng)激素的形成或作用的藥物(例如血管緊張素轉(zhuǎn)變酶抑制劑(ace-抑制劑)，血管緊張素受體拮抗劑(arbs)，醛甾酮拮抗劑及β-腎上腺素能藥物受體阻斷劑)，增強心臟收縮性的變力性劑(例如多巴酚丁胺，地高辛)，減少淤血的血管擴張劑(例如硝酸酯，奈西立肽)和/或利尿藥(例如呋塞米)，及一或多種抗高血壓藥試劑(例如β-阻斷劑，ace-抑制劑及arbs)，硝酸酯(硝酸異山梨酯)，肼屈嗪，及鈣通道阻斷劑。如上所述，醫(yī)學干擾涉及藥物治療要求選擇適當?shù)乃幬锛捌湟宰銐虻膭┝糠桨高f送。足夠的劑量方案涉及治療的足夠的劑量，途徑，頻度，及持續(xù)時間。藥物治療的根本目標是在作用位點獲取最佳藥物濃度，以致使經(jīng)治療的患者克服使需要治療的病理學過程。廣義地說，藥物處置的原理的基礎(chǔ)知識輔助適當?shù)膭┝糠桨傅倪x擇。但是，可在這里使用治療性藥物監(jiān)控(tdm)作為輔助主治醫(yī)師確定用于個體患者的醫(yī)學治療的選定的藥物的有效及安全的劑量方案的補充性工具。靶濃度及治療性窗：最佳藥物濃度的定義變化取決于特定藥物的藥效學特征。用于時間-依賴性抗生素(如青霉素)的最佳治療，例如，與達到2～4的峰濃度和mic(最小抑制性濃度)的比例及等于75％的劑量間隔的mic以上的時間相關(guān)。濃度-依賴性抗生素(如慶大霉素)，例如，功效與獲得約8～10的峰濃度和mic比例相關(guān)。與特定藥物的施用相關(guān)的細微差別無關(guān)地，藥物治療旨在在已于之前基于靶物種中藥物的藥物代謝動力學，藥效學及毒性特征測定的“治療性窗”的限制內(nèi)達到靶血漿濃度(其常反映作用位點的濃度)。此窗的寬度就不同藥物及物種而變化。當最小有效的濃度和最小毒性濃度之間的差異小(2～4倍)時，治療性窗被稱為窄。相反，當有效和毒性濃度之間有大的差異時，藥物視為具有寬治療性窗。有窄治療性窗的藥物之一例為地高辛，其中平均有效和毒性濃度之間的差異為2或3倍。另一方面，阿莫西林具有寬治療性范圍，及患者的過量施劑通常不與毒性問題相關(guān)。藥物應(yīng)答中的存活力：有相應(yīng)藥物應(yīng)答的相同物種的健康受試者中的顯著的存活力是共同的。而且，疾病狀態(tài)具有影響器官系統(tǒng)及功能(例如，腎，肝臟，含水量)(可進而影響藥物應(yīng)答)的潛力。進而，此貢獻于施用藥物的患病個體中藥物應(yīng)答的增加的差異。然而另一相關(guān)問題涉及以其導致可導致對一或兩種藥物應(yīng)答的改變的藥物代謝動力學相互作用的時間施用多于一種藥物?？傊?例如，年齡)，病理(例如，疾病效應(yīng))，及藥理學(例如，藥物相互作用)因素可改變動物中的藥物處置。隨其發(fā)生的個體中增加的存活力可導致有窄治療指數(shù)的藥物的治療性失敗或毒性。將受益于本發(fā)明的治療方案的患者群相當?shù)囟鄻?，例如，患損傷的腎功能的患者是良好的候選，因為連續(xù)的水平的蛋白治療劑常相關(guān)于腎血管球沉著物。因此，如描述于本發(fā)明的不維持恒定血漿水平的治療性方案的實用性將對于患既有的功能的任何減少可有害的緩和的腎功能的患者非常有益。類似地，如本文所述短暫的及間歇的暴露于治療劑(例如ggf2)可有益于患響應(yīng)用生長因子的慢性及連續(xù)的刺激的腫瘤類型的患者。其他可特異性地受益于如本文所述的間歇的治療的患者是患許旺細胞瘤及其他外周神經(jīng)病的患者。這是本發(fā)明的優(yōu)勢，即間歇的施劑可在不維持各組織的連續(xù)的副作用-相關(guān)的刺激中具有顯著的優(yōu)點。以確定血清藥物水平，以及報告的水平的解釋的目的采血的恰當?shù)臅r機要求考慮藥物測量的藥代動力學性質(zhì)。將這些性質(zhì)的討論中使用的一些術(shù)語在以下段落定義。半衰期：間隔開始時存在的血清濃度降低50％需要的時間。知曉近似的半衰期必要于臨床醫(yī)師，由于其決定口服試劑的最佳施劑日程表，血清濃度的劑量內(nèi)波動，及需要于達到穩(wěn)定狀態(tài)的時間。簡言之，已對ggf2進行多個藥物代謝動力學研究。ggf2的典型的半衰期就靜脈內(nèi)(iv)途徑，在4和8小時之間，然而經(jīng)皮下(皮下)施用的ggf2的半衰期在11和15小時之間。cmax，auc，tmax及t1/2顯示于以下表1和2。當半衰期對于通過這些方法精確測定過長時，分幾次代替一次。表1及表2附錄7單個靜脈內(nèi)或皮下劑量的125i-rhggf2后雄性sprague-dawley大鼠血漿中125i-rhggf2-來源的放射性的平均藥代動力學單個靜脈內(nèi)或皮下劑量的125i-rhggf2后雄性sprague-dawley大鼠血漿中125i-rhggf2-來源的放射性的平均藥代動力學附錄9對于靜脈內(nèi)及皮下施用，施用后血漿濃度分別顯示于圖6和7。如圖6和7中所示，cmax，指最大血漿濃度(在施用后任何時間血漿中測量的最大濃度)；aucinf，指對時間無限大的濃度對比時間曲線下面積(該方法用于預期測定具有檢測限制)；auc0-t，指血漿濃度下面積(從計時起點到最后可測量的濃度的時間曲線)；通過任何方法的auc指總暴露于動物的估計值；及tmax，指最大血漿濃度的中位時間。如由表及圖證明，不可能通過以每第四天，每隔一天或每天施劑的施劑途徑維持穩(wěn)定狀態(tài)治療性水平。一天后及甚至之前久，水平不可測量，如由表11所示的數(shù)據(jù)反映。*由從通過elisa所測的血漿ggf2濃度獲得的數(shù)據(jù)獲取。報告的數(shù)據(jù)是平均值±sd。穩(wěn)定狀態(tài)：穩(wěn)定狀態(tài)血清濃度是用各劑量回到的那些值及代表藥物施用的量及以給定時間間隔消除的量之間的平衡的狀態(tài)。用任何藥物的長期劑量期間，其平均穩(wěn)定狀態(tài)血清濃度的2種主要決定因素是特定患者中藥物施用的速度及藥物的總清除率。峰血清濃度：血清濃度-對比-時間曲線上的最大濃度點。由于其代表輸入及輸出速度之間的復雜的關(guān)系，峰血清濃度的確切的時間難以預測。谷血清濃度：施劑間隔期間發(fā)現(xiàn)的最小血清濃度。谷濃度理論上存在于施用下一劑量立即之前的時期。吸收：藥物進入身體的過程。血管內(nèi)施用的藥物總地吸收，但血管外施用產(chǎn)生吸收的變化的程度及速度。吸收速度和消除速度之間的關(guān)系是血流中藥物濃度的主要決定子。分布：全身可用的藥物從血管內(nèi)空間到血管外流體及組織的擴散，從而到靶受體位點。治療性范圍：與高程度的功效及劑量-相關(guān)的毒性的低風險相關(guān)的血清藥物濃度范圍。治療性范圍是統(tǒng)計學概念：其是與大部分患者中的治療性應(yīng)答相關(guān)的濃度范圍。結(jié)果，一些患者以范圍下限以下的血清水平呈現(xiàn)治療性應(yīng)答，而其他要求超過對于治療性益處上限的血清水平。樣品收集的正確時機重要，由于藥物治療?；谘鍧舛葴y定修正。吸收及分布期應(yīng)完全，及在樣品抽出之前達到穩(wěn)定-狀態(tài)濃度。穩(wěn)定-狀態(tài)濃度存在之前得到的水平可錯誤地低；基于所述結(jié)果的增加劑量可產(chǎn)生毒性濃度。此外，當進行比較性測量時，采樣時間一致是重要的。與劑量相關(guān)的采血時機對于血清濃度結(jié)果的正確的解釋關(guān)鍵。與藥物施用相關(guān)的樣品抽出時間的選擇應(yīng)基于藥物的藥代動力學性質(zhì)，其劑型及測定樣品的臨床原因(例如，功效評定或可能的藥物-誘導的毒性的闡明)。對于有短半衰期的藥物的常規(guī)血清水平監(jiān)控，可收集穩(wěn)定狀態(tài)峰及谷樣品，以表征血清濃度特征；對于有長半衰期的藥物而言，穩(wěn)定-狀態(tài)谷樣品單獨通常足夠。"充血性心力衰竭"是指致使心臟在靜止時或運動時不能維持正常血輸出，或在正常心臟填充壓力的情況中不能維持正常心臟輸出的損傷的心臟功能。約40％或以下的左心室射血分數(shù)指示充血性心力衰竭(作為比較，約60％的射血分數(shù)是正常)。充血性心力衰竭的患者顯示良好-已知的臨床癥狀及跡象，例如呼吸急促，胸腔積液，靜止時或運動時疲乏，收縮性功能障礙，及水腫。充血性心力衰竭通過熟知的方法容易診斷(見，例如，"consensusrecommendationsforthemanagementofchronicheartfailure."am.j.cardiol.,83(2a):1a-38-a,1999)。相對嚴重性及疾病進展使用熟知的方法評定，例如物理檢查，超聲波心動圖記術(shù)，放射性核素成像，侵襲性血液動力學監(jiān)控，磁共振血管照影術(shù)，及與氧攝取研究偶聯(lián)的鍛煉踏車測試。"缺血性心臟病"是指由心肌需要氧及適當?shù)难豕┙o之間的不平衡所致的任何病癥。缺血性心臟病的多數(shù)病例產(chǎn)生自如在動脈粥樣硬化或其他血管病癥中出現(xiàn)的冠狀動脈縮小。"心肌梗塞"是指缺血性疾病導致被瘢痕組織取代的心肌區(qū)的過程。"心臟毒性"是指通過直接或間接損害或殺傷心肌細胞降低心臟功能的化合物。"高血壓"是指被醫(yī)學專業(yè)者(例如，醫(yī)師或護士)認為是高于正常及帶了發(fā)展充血性心力衰竭的增加的風險的血壓。"治療"是指施用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-樣肽在治療期間，相對于將在無治療的情況下發(fā)生的疾病進展，以統(tǒng)計學顯著的方式減緩或抑制充血性心力衰竭進展。熟知的標志(例如左心室射血分數(shù)，鍛煉表現(xiàn)，及其他上列臨床測試)，以及存活率及住院治療速度可用于評定疾病進展。治療是否以統(tǒng)計學顯著的方式減緩或抑制疾病進展可通過本領(lǐng)域熟知的方法測定(見，例如，solvdinvestigators,n.engl.j.med.327:685-691,1992andcohnetal.,n.engl.jmed.339:1810-1816,1998)。"預防"是指最小化或部分或完全抑制處于發(fā)展充血性心力衰竭的風險的哺乳動物的充血性心力衰竭發(fā)展(如在"consensusrecommendationsforthemanagementofchronicheartfailure."am.j.cardiol.,83(2a):1a-38-a,1999中指定的)。確定是否通過施用通過已知的方法制備的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-樣肽最小化或預防充血性心力衰竭，例如solvdinvestigators，supra，及cohn等人，supra中所述的那些。術(shù)語"治療有效量"旨在表示引起由研究者，獸醫(yī)，醫(yī)學醫(yī)生或其他臨床醫(yī)師觀察的組織，系統(tǒng)，動物或人的生物或醫(yī)學應(yīng)答的藥物或藥學試劑的量。治療性變化是以期望減輕疾病或解決病情的方向所測的生物化學特征性中的變化。更具體而言，"治療有效量"是足以降低與醫(yī)學病情或虛弱相關(guān)的癥狀，以標準化導致特異性身體功能損傷的疾病或病癥中的身體功能，或提供一或多種臨床上所測的疾病參數(shù)的改善的量。術(shù)語"預防性有效量"旨在表示將預防或降低被研究者，獸醫(yī)，醫(yī)學醫(yī)生或其他臨床醫(yī)師觀察到預防組織，系統(tǒng)，動物或人中的生物或醫(yī)學事件的發(fā)生的風險的藥學藥物的量。術(shù)語"治療性窗"旨在表示實現(xiàn)任何治療性變化的最小的量與導致對患者的毒性立即之前的應(yīng)答的最大量之間的劑量范圍。"處于充血性心力衰竭的風險"是指個體who吸煙，肥胖(即，超過它們的理想重量20％或以上)，已或?qū)⒈┞队谛呐K毒性化合物(例如蒽環(huán)類抗生素)，或患有(或患過)高血壓，缺血性心臟病，心肌梗塞，已知增加心力衰竭風險的遺傳缺陷，心力衰竭家族歷史，心肌肥大，肥大性心肌病，左心室心臟收縮功能障礙，冠狀動脈分流手術(shù)，血管疾病，動脈粥樣硬化，酒精中度，心包炎，病毒感染，牙齦炎，或進食障礙(例如，神經(jīng)性厭食癥或貪食癥)，或是酒精或可卡因成癮。"降低心肌疏伐進展"是指維持心室心肌細胞肥大以至于心室壁厚度維持或增加。"抑制心肌凋亡"是指神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白處理相比未處理的心肌細胞，抑制心肌細胞死亡至少10％，更優(yōu)選至少15％，再更優(yōu)選為至少25％，甚至更優(yōu)選至少50％，再更優(yōu)選至少75％，及最優(yōu)選至少90％。"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白"或"nrg"是指由nrg-1，nrg-2，或nrg-3基因或核酸(例如，cdna)編碼，及結(jié)合及活化erbb2，erbb3，或erbb4受體，或其組合的肽。"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1"，"nrg-1"，"神經(jīng)生長因子"，"ggf2"，或"p185erbb2配體"是指當與另一受體(erbb1，erbb3或erbb4)成對時結(jié)合erbb2受體，及由p185erbb2配體基因編碼的肽，描述于美國專利no.5,530,109；美國專利no.5,716,930；及美國專利no.7,037,888，將其各均通過引用整體并入本文。"神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-樣肽"是指具有由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因編碼的egf-樣結(jié)構(gòu)域，及結(jié)合及活化erbb2，erbb3，erbb4，或它們的組合的肽。"表皮生長因子-樣結(jié)構(gòu)域"或"egf-樣結(jié)構(gòu)域"是指結(jié)合及活化erbb2，erbb3，erbb4，或其組合，及與如公開于holmes等人，science256:1205～1210，1992年；美國專利no.5,530,109；美國專利no.5,716,930；美國專利no.7,037,888；hijazietal.,int.j.oncol.13:1061-1067,1998；changetal.,nature387:509-512,1997；carrawayetal.,nature387:512-516,1997；higashiyamaetal.,jbiochem.122:675-680,1997；及wo97/09425的egf受體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域帶有結(jié)構(gòu)相似性的由nrg-1，nrg-2，或nrg-3基因編碼的肽基序。對于對應(yīng)于由nrg-1基因編碼的egfl結(jié)構(gòu)域1～6的核酸及氨基酸序列見圖9～14。"抗-erbb2抗體"或"抗-her2抗體"是指特異性結(jié)合erbb2(在人中也被稱為her2)受體的細胞外結(jié)構(gòu)域及通過神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合阻止erbb2(her2)-依賴性信號轉(zhuǎn)導起始的抗體。"轉(zhuǎn)化的細胞"是指已利用重組dna技術(shù)或已知的基因治療技術(shù)導入編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或具有神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白egf-樣結(jié)構(gòu)域的肽的dna分子的細胞(或細胞后代)。"啟動子"是指足以指導轉(zhuǎn)錄的最小的序列。也包括在本發(fā)明的是足以致使啟動子-依賴性基因表達基于細胞類型或生理狀態(tài)(例如，含氧量低的對比含氧量正常的條件)可控制的，或可被外部信號或試劑誘導的啟動子元件；所述元件可位于天然的基因的5'或3'或內(nèi)部區(qū)中。"運作性連接的"是指編碼肽的核酸(例如，cdna)及一或多個調(diào)控序列以當適當?shù)姆肿?例如，轉(zhuǎn)錄活化子蛋白)結(jié)合到調(diào)控序列時以使基因表達的方式連接。"表達載體"是指源于，例如，噬菌體，腺病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒，痘病毒，皰疹病毒，或人工染色體的，用于轉(zhuǎn)移運作性連接到啟動子的肽(例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)編碼序列到宿主細胞，以至于編碼的肽或肽在宿主細胞內(nèi)表達的遺傳加工的質(zhì)?；虿《?。除非另有定義，本文所用的全部技術(shù)及科學術(shù)語與被本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的具有相同含義。包括在此說明書中的文獻，法案，材料，裝置，物品的討論等僅旨在提供本發(fā)明的背景。其不推薦或代表任何或全部這些形式部分基于現(xiàn)有技術(shù)形成的或是本申請的各權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前的與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的共知常識?！酒渌麑嵤┓绞健勘景l(fā)明已聯(lián)系其特定實施方式描述，需知，其能進一步修飾，及本申請旨在覆蓋任何變化，用途，或適應(yīng)本發(fā)明，一般而言，遵循本發(fā)明的原理及包括所述從本公開內(nèi)容脫離，在本發(fā)明所屬領(lǐng)域中已知的或習慣的實踐內(nèi)，及可將其應(yīng)用于前述必要的特征，及落入隨附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。以下實施例將輔助本領(lǐng)域技術(shù)人員更佳了解本發(fā)明及其原理及優(yōu)點。期望這些實施例為闡明本發(fā)明，及不限制其范圍?！緦嵤├咳绫疚闹幸陨纤?，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是結(jié)構(gòu)上與表皮生長因子(egf)相關(guān)的生長因子家族，及對于心臟正常發(fā)育必要。證據(jù)提示，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是治療心臟病(包括心力衰竭，心肌梗塞，化學治療劑毒性及病毒心肌炎)的潛在治療劑。本文所述的研究用于定義大鼠中充血性心力衰竭左前降支(lad)動脈結(jié)扎模型中的施劑。多個神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白剪接變體克隆及產(chǎn)生。將由來自之前報道(liu等人，2006)的egf-樣結(jié)構(gòu)域(egf-ld)構(gòu)成的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白片段與稱為神經(jīng)膠質(zhì)生長因子2(ggf2)的全長神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白及域有ig結(jié)構(gòu)域的egf-樣結(jié)構(gòu)(egf-ig)比較。雄性及雌性sprague-dawley大鼠經(jīng)歷lad動脈結(jié)扎。在結(jié)扎后7天，大鼠每天用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白靜脈內(nèi)(iv)處理。心臟功能通過超聲波心動圖記術(shù)監(jiān)控。第一研究比較了用等摩爾量的egf-ld或ggf2施劑10天(對于ggf2，此計算為0.0625和0.325mg/kg)。ggf2處理導致，相比施劑時期末的egf-ld，射血分數(shù)(ef)及縮短分數(shù)(fs)的顯著(p<0.05)更大改善。第二研究比較了用egf-ld及egf-ig以等摩爾濃度施20天ggf2。ggf2處理導致顯著改善的ef，fs及l(fā)vesd(p<0.01)。用egf-ld或egf-ig心臟生理的改善不維持此時期。第三研究每天(q24小時)，每隔一天(q48小時)及每第四天(q96小時)比較用ggf2(3.25mg/kg)施劑20天。全部3種ggf2治療方案導致顯著的心臟生理的改善，包括ef，esv及edv，及效應(yīng)維持終止施劑后10天。本文呈現(xiàn)的研究確認ggf2為主要神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白化合物，及建立施用其的最佳劑量方案。如所示本文中，本研究建立相比公開的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白片段的ggf2的相對功效(liu等人，2006)，起始劑量范圍及劑量頻度研究，及測定是否如之前報道需要bsa賦形劑。【方法和材料】【ggf2(egf-ig)的igegf(ig154y)結(jié)構(gòu)域的克隆，表達及純化】dna：從既有的ggf2cdna擴增igegf結(jié)構(gòu)域及使用nde1及bamh1限制性位點克隆進pet15b載體(novagencat#69661～3)中。得到的蛋白是21.89kda+～3kdahis標簽(＝～25kda)igegfpet15克隆的dna序列：有下劃線的序列是用于擴增的引物。以粗體顯示的序列是用于將序列插入pet載體的克隆位點(nde1及bamh1)。最終從pet15b載體翻譯的蛋白示于下。載體部分加了下劃線?！镜鞍妆磉_】將克隆使用過夜表達自動誘導系統(tǒng)(novagen)在lb培養(yǎng)基中于25℃轉(zhuǎn)化進用于蛋白表達的bl21細胞24小時。【蛋白再折疊】從novagen蛋白再折疊試劑盒，70123-3適應(yīng)?！镜鞍准兓縣istrap柱-根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明【蛋白印跡】蛋白表達通過蛋白印跡評定。得到的有his標簽的條帶以約25kd運行。將4～20％標準凝膠(biorad)用于蛋白分辨，然后是轉(zhuǎn)移到protran硝酸纖維素紙(來自schliecher及schull的0.1μm孔徑)。印跡在tbs-t(0.1％)中5％乳中封閉。將在tbs-t中的5％乳中的第一抗體(來自r&d系統(tǒng)的抗egf人nrg1-α/hrg1-α親和力純化的多克隆abcat#af-296-na)的1:1000稀釋液液于室溫1小時(也于4℃工作過夜)。以在tbs-t中的5％乳中的1:10,000稀釋液使用兔抗山羊hrp第二抗體于室溫1小時。全部洗滌在tbs-t中進行?！緄g154y的純化流程】將培養(yǎng)物在來自novagen的過夜表達自動誘導系統(tǒng)1(cat#71300-4)中于25℃生長。將培養(yǎng)物離心沉降及將沉淀提取，溶解及再折疊，以在純化可發(fā)生之前獲取ig154y?！居糜谔崛。鋈芗霸僬郫B的物質(zhì)】10×洗滌緩沖液：200mmtris-hcl，ph7.5，100mmedta，10％tritonx-10010×增溶緩沖液：500mmcaps，ph11.050×透析緩沖液：1mtris-hcl，ph8.530％n-月桂基肌氨酸-添加as粉末(sigma61739-5g)1mdtt還原的谷胱甘肽(novagen3541)氧化的谷胱甘肽(novagen3542)【a.細胞裂解及包含體的制備】-將細胞沉淀解凍及重懸浮于30ml1×洗滌緩沖液。-將蛋白酶抑制劑(25μl的10×/50ml)，dna酶(200μl的1mg/ml/50ml)及mgcl2(500μl的1m/50ml)加入懸浮液。-細胞通過伴隨在冰上冷卻超聲處理來裂解。-超聲處理后通過以10000×g離心12分鐘來收集包含體。-除去上清，及將沉淀充分重懸浮于30ml的1×洗滌緩沖液。-重復步驟4。-將沉淀充分重懸浮于30ml的1×洗滌緩沖液。-通過以10000×g離心10分鐘來收集包含體?！綽.增溶及再折疊】-從待處理的包含體的濕重，計算對于以10～15mg/ml的濃度重懸浮包含體必需的1×增溶緩沖液的量。如果計算的體積大于250ml，使用250ml。-于室溫，制備計算的體積的補充了0.3％n-月桂基肌氨酸(如果在進一步優(yōu)化中需要，可使用達2％)(300mg/100ml緩沖液)及1mmdtt的1×增溶緩沖液。-將來自步驟2的計算的量的1×增溶緩沖液添加到包含體，及輕輕混合?？蓪⒋蟮乃槠ㄟ^重復的移液打碎。-在冰箱搖床中于25℃，以50～100rpm溫育4～5小時(或更長，如果在進一步優(yōu)化中需要)。-通過于室溫以10000×g離心10分鐘來澄清。-將含可溶性蛋白的上清轉(zhuǎn)移到清潔管。【c.用于蛋白再折疊的透析流程】-制備所需的體積的緩沖液用于溶解的蛋白的透析。透析應(yīng)用大于樣品體積的50倍的至少2次緩沖液更換來進行。將50×透析緩沖液稀釋到1×以期望的體積及補充0.1mmdtt。-于4℃透析至少4小時。更換緩沖液及持續(xù)。透析額外的4或以上小時。-制備如步驟1中測定的額外的透析緩沖液，但省略dtt。-通過用缺少dtt的透析緩沖液2次額外的更換(各分鐘4hr)持續(xù)透析?！綿.促進二硫鍵形成的氧化還原再折疊緩沖液】-制備在1×透析緩沖液中含1mm還原的谷胱甘肽(1.2g/4l)及0.2mm氧化的谷胱甘肽(0.48g/4l)的透析緩沖液。體積應(yīng)為25倍大于溶解的蛋白樣品的體積。冷卻至4℃。-將來自步驟1的再折疊的蛋白于4℃過夜透析?！居糜诩兓奈镔|(zhì)】全部過程于4℃進行?！净瘜W品】氨基丁三醇鹽酸鹽(sigmat5941-500g)氯化鈉5m溶液(sigmas6546-4l)氫氧化鈉10n(jtbaker5674-02)咪唑(jtbakern811-06)【a.在hisprepff16/10柱-20ml(gehealthcare)上的純化】緩沖液a：20mmtris-hcl+500mmnaclph7.5緩沖液b：緩沖液+500mm咪唑ph7.5柱平衡：緩沖液a-5cv，緩沖液b-5cv，緩沖液a-10cv負荷20ml的樣品每次以0.5ml/分鐘在20ml柱上運行用5cv的緩沖液a洗滌柱用5cv的280mm咪唑洗脫柱。用10cv的100％緩沖液b清潔。用15cv的緩沖液a平衡用sds-page銀染色分析級分用ig154y合并級分【b.his-標簽去除】去除his-標簽用來自novagen的凝血酶切割捕獲試劑盒(cat#69022～3)進行?；谥皽y試，最佳條件是對于每10μg的ig154y蛋白，以0.005u的酶/μl用凝血酶室溫4小時。溫育4小時后，添加16μl的鏈霉親和素瓊脂糖漿/單元的凝血酶。于室溫搖動樣品30分鐘。通過自旋-過濾或無菌過濾(取決于體積)回收ig154y。全切割通過egf及抗-his蛋白印跡確定?！綾.ig154y濃度】用milliporecentriprep3000mwco15ml濃縮機(ultracelym-3，4320)調(diào)節(jié)到期望的濃度【d.最終緩沖液中的儲存】存儲在20mmtris+500mmnaclph7.5和1×pbs+0.2％bsa?！?56q(egf-id)[nrg1b2egf結(jié)構(gòu)域(156q)]的克隆，表達及純化】dna：將nrg1b2egf結(jié)構(gòu)域從人腦cdna克隆及使用nde1及bamh1限制性位點克隆進pet15b載體(novagencat#69661～3)。得到的蛋白是6.92kda+～3kdahis標簽(＝9.35kda)nrg1b2egfpet15克隆的dna序列有下劃線的序列是克隆位點(nde1及bamh1)從pet15b載體最終翻譯的蛋白示于下。egf結(jié)構(gòu)域以綠色亮顯。計算的pi/mw：7.69/9349.58【蛋白表達】將克隆使用過夜表達自動誘導系統(tǒng)(novagen)在lb培養(yǎng)基中于25℃轉(zhuǎn)化進用于蛋白表達的bl21細胞24小時。表達主要在不溶性包含體中?！镜鞍自僬郫B】從novagen蛋白再折疊試劑盒，70123-3適應(yīng)?！镜鞍准兓繉⒌鞍滓?.5ml/分鐘裝在陰離子交換柱deae。egf-id片段留在流通中，然而混入物以更高鹽結(jié)合及洗脫。裝載及洗滌緩沖液是50mmtrisph7.9及洗脫緩沖液是有1mnacl的50mmtrisph7.9。將流通合并及用來自millipore的centriprepym-3濃縮?！镜鞍子≯E】通過蛋白印跡評定蛋白表達。得到的條帶以約10kd運行。將4～20％標準凝膠(biorad)用于蛋白分辨，然后是轉(zhuǎn)移到protran硝酸纖維素紙(0.1μm孔徑來自的schliecher及schull)。將印跡在tbs-t(0.1％)中的5％乳中封閉。使在tbs-t中的5％乳中的第一抗體(來自r&d系統(tǒng)的抗egf人nrg1-α/hrg1-α親和力純化的多克隆abcat#af-296-na)的1:1000稀釋液于室溫1小時(也于4℃工作過夜)。以在tbs-t中的5％乳中的1:10,000稀釋液使用兔抗山羊hrp第二抗體于室溫1小時。全部洗滌在tbs-t中進行?！緉rg-156q的純化流程】在來自novagen的過夜表達自動誘導系統(tǒng)1(cat#71300-4)中于25℃生長培養(yǎng)物。有非常少的可溶性nrg-156q(egf-id)存在。將培養(yǎng)物離心沉降及提取沉淀，溶解及再折疊，以在純化可進行之前獲取nrg-156q。【用于提取，增溶及再折疊的物質(zhì)】10×洗滌緩沖液：200mmtris-hcl，ph7.5，100mmedta，10％tritonx-10010×增溶緩沖液：500mmcaps，ph11.050×透析緩沖液：1mtris-hcl，ph8.530％n-月桂基肌氨酸-作為粉末添加(sigma61739-5g)1mdtt還原的谷胱甘肽(novagen3541)氧化的谷胱甘肽(novagen3542)【a.細胞裂解及包含體的制備】-在30ml1×洗滌緩沖液中解凍及重懸浮細胞沉淀。根據(jù)需要全部重懸浮。-將蛋白酶抑制劑(25μl的10×/50ml)，dna酶(200μl的1mg/ml/50ml)及mgcl2(500μl的1m/50ml)添加到懸浮液。-通過超聲處理裂解細胞。a.貫穿此步驟在冰上冷卻細胞。b.使用方形端，在水平6，10倍超聲處理30秒鐘，直到懸浮液粘度變輕。在各超聲處理之間使懸浮液在冰上冷卻60秒鐘。當超聲處理時，在50ml圓錐形管中保持體積不高于40ml。-當完成時，將各懸浮液轉(zhuǎn)移到250ml曲頸離心機瓶，用于以f-16/250轉(zhuǎn)子使用。-通過以10,000×g離心12分鐘來收集包含體。-去除上清(保留用于可溶性蛋白分析的樣品)及在30ml的1×洗滌緩沖液中充分重懸浮沉淀。-如步驟4中重復離心及保留沉淀。-再次，在30ml的1×洗滌緩沖液中充分重懸浮沉淀。-通過以10,000×g離心10分鐘來收集包含體。倒出上清，及通過在紙巾上敲打顛倒的管來去除最后痕量的液體?！綽.增溶及再折疊】-從待處理的包含體的濕重，計算對于以10～15mg/ml的濃度重懸浮包含體必需的1×增溶緩沖液的量。如果計算的體積大于250ml，使用250ml。-于室溫，制備計算的體積的補充了0.3％n-月桂基肌氨酸(可使用達2％，如果在進一步優(yōu)化中需要)(300mg/100ml緩沖液)及1mmdtt的1×增溶緩沖液。-將計算的量的來自步驟2的1×增溶緩沖液添加到包含體及輕輕混合?？蓪⒋蟮乃槠ㄟ^重復的移液打碎。-在冰箱搖床中于25℃，以50～100rpm溫育4～5小時。-通過于室溫以10,000×g離心10分鐘來澄清。【c.用于蛋白再折疊的透析流程】-制備所需的體積的緩沖液用于溶解的蛋白的透析。透析應(yīng)用大于樣品的50倍體積的至少2次緩沖液更換來進行。-將50×透析緩沖液以期望的體積稀釋到1×，及補充0.1mmdtt。-于4℃透析至少4小時。更換緩沖液及持續(xù)。透析額外的4或以上小時。-制備額外的如步驟1中測定的透析緩沖液，但省略dtt。-用缺少dtt的透析緩沖液，通過2次額外的更換(各分鐘4小時)持續(xù)透析?！綿.促進二硫鍵形成的氧化還原再折疊緩沖液】-制備在1×透析緩沖液中含1mm還原的谷胱甘肽(1.2g/4l)及0.2mm氧化的谷胱甘肽(0.48g/4l)的透析緩沖液。體積應(yīng)為25倍大于溶解的蛋白樣品的體積。冷卻至4℃。-于4℃過夜透析來自步驟1的再折疊的蛋白?！居糜诩兓奈镔|(zhì)】全部過程于4℃進行?！净瘜W品】氨基丁三醇鹽酸鹽(sigmat5941-500g)氯化鈉5m溶液(sigmas6546～4l)氫氧化鈉10n(jtbaker5674-02)【e.在deaehiprep16/10陰離子柱-20ml(gehealthcare)上的純化】緩沖液a：50mmtris-hclph8.0緩沖液b：50mmtris-hcl，有1mnaclph8.0柱平衡：緩沖液a-5cv，緩沖液b-5cv，緩沖液a-10cv-以2.0ml/分鐘(nrg-156(egf-id)在流通中)在20ml柱上每次運行負荷50ml的樣品。-20ml柱用5cv的緩沖液a洗滌20ml柱用有5cv的至100％b的梯度。這是為了洗脫下混入物。-用10cv的100％緩沖液b清潔。-用15cv的緩沖液a平衡-用sds-page銀染色分析級分-用nrg-156q(10kda)合并級分【f.nrg-156(egf-id)的濃度】-用milliporecentriprep3000mwco15ml濃縮機(ultracelym-3，4320)濃縮-使用修飾的lowry蛋白測定來測定濃度。【g.his-標簽去除】his-標簽的去除用來自novagen的凝血酶切割捕獲試劑盒(cat#69022～3)進行?；谥皽y試，最佳條件是用凝血酶以0.005u的酶/μl對于每10μg的nrg-156q(egf-id)蛋白室溫4小時。溫育4小時后，添加16μl的鏈霉親和素瓊脂糖漿/單元的凝血酶。于室溫搖動樣品30分鐘。通過自旋-過濾或無菌過濾(取決于體積)回收nrg-156q。完全切割用egf及抗-his蛋白印跡確定。【h.最終緩沖液中的儲存】于4℃儲存在有0.2％bsa的1×pbs中。【ggf2的表達及純化】對于ggf2的克隆及背景信息，見uspn5,530,109。細胞系描述于uspn6,051,401。各uspn5,530,109及uspn6,051,401的整個內(nèi)容均通過引用整體并入本文?！綾ho-(alpha2hsg)-ggf細胞系】設(shè)計此細胞系，以產(chǎn)生足夠的量的胎球蛋白(人alpha2hsg)，以支持無血清條件中rhggf2的高產(chǎn)生速度。cho(dhfr-)細胞用圖16中顯示的表達載體(psv-ahsg)轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定的細胞在氨芐西林選擇下生長。指定細胞系(dhfr-/α2hsgp)。dhfr-/α2hsgp細胞然后用圖16中顯示的含人ggf2的編碼序列的pcmggf2載體使用陽離子脂質(zhì)dmrie-c試劑(生命technologies#10459～014)轉(zhuǎn)染。在標準流程下使用甲氨喋呤(100nm，200nm，400nm，1μm)以4～6周間隔衍生穩(wěn)定的及高產(chǎn)生細胞系。使細胞從含血清的培養(yǎng)基逐漸脫離。克隆通過標準限制稀釋方法分離。培養(yǎng)基要求之細節(jié)見于上述報道。為增強轉(zhuǎn)錄，ggf2編碼序列放置在ebvbmlf-1干擾序列(mis)后。見圖17的模式圖。mis序列(seqidno：20)cgat[aactagcagcatttcctccaacgaggatcccgcag(gtaagaagctacaccggccagtggccggggcccgataactagcagcatttcctccaacgaggatcccgcag(gtaagaagctacaccggccagtggccggggccgtggagccgggggcatccggtgcctgagacagaggtgctcaaggcagtctccaccttttgtctcccctctgcag)agagccacattctggaa]gtggf2編碼序列(seqidno：1)ggf2蛋白序列(seqidno：2)mrwrraprrsgrpgpraqrpgsaarsspplpllplllllgtaalapgaaagneaapagasvcyssppsvgsvqelaqraavviegkvhpqrrqqgaldrkaaaaageagawggdreppaagpralgppaeepllaangtvpswptapvpsagepgeeapylvkvhqvwavkagglkkdslltvrlgtwghpafpscgrlkedsryiffmepdanstsrapaafrasfppletgrnlkkevsrvlckrcalppqlkemksqesaagsklvlrcetsseysslrfkwfkngnelnrknkpqnikiqkkpgkselrinkasladsgeymckvisklgndsasanitivesnatststtgtshlvkcaekektfcvnggecfmvkdlsnpsrylckcpneftgdrcqnyvmasfyststpflslpeggf2產(chǎn)生：將一瓶以2.2×106細胞/ml的ggf2解凍到100ml的acorda培養(yǎng)基1(見表3)，及擴展直到達到足夠數(shù)到種子產(chǎn)生容器。細胞在2l通氣的滾瓶中以1.0×105細胞/ml接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基acorda培養(yǎng)基2(見表4)。滾瓶維持于37℃5天，然后降低到27℃26天。監(jiān)控滾瓶的細胞計數(shù)及總體外觀，但它們不進料。一旦活力在10％以下，將細胞旋轉(zhuǎn)出，及收獲條件培養(yǎng)基，及無菌過濾。表3：培養(yǎng)基1項目供應(yīng)商貨號終濃度cd-choinvitrogen10743-029-去除50ml，然后添加以下成分feso4.edtasigmaf-05181×(10ml/l)l-谷氨酰胺cellgro25-005-ci4mm(20ml/l)重組人胰島素sigmai-9278290u/l(1ml/l)非-必要的氨基酸cellgro25-025-ci1×(10ml/l)胨4型大豆-hysoysigmap052120×cd-cho(50ml/l)中制成的粉末慶大霉素invitrogen15750-078100μg(2ml/l)表4：培養(yǎng)基2項目供應(yīng)商貨號終濃度cd-choinvitrogen10743-02950％(-50ml第一)hyqsfx-chohyclonesh30187.0250％(-50ml第一)feso4.edtasigmaf-05181×(10ml/l)l-谷氨酰胺cellgro25-005-ci4mm(20ml/l)重組人胰島素sigmai-9278290u/l(1ml/l)非-必要的氨基酸cellgro25-025-ci1×(10ml/l)胨4型大豆-hysoysigmap052120×cd-cho(50ml/l)中制成的粉末慶大霉素invitrogen15750-078100μg(2ml/l)【ggf2的純化流程】全部過程于4℃進行?；瘜W品：乙酸鈉冰醋酸(用于ph調(diào)節(jié))10nnaoh(用于ph調(diào)節(jié))nacl硫酸鈉l-精氨酸(jtbakercat#：2066-06)甘露糖醇(jtbakercat#：2553-01)原材料：條件培養(yǎng)基上清。調(diào)整ph到6.5?！静襟E1】捕獲-陽離子交換層析hiprepsp16/10(amershambiosciences)柱平衡：緩沖液a-5cv，緩沖液b-5cv，緩沖液15％b-5cv緩沖液a：20mm乙酸鈉，ph6.0緩沖液b：20mm乙酸鈉，ph6.0，1mnacl以2ml/分鐘用連續(xù)的負荷過夜(如果可能)來負荷樣品。結(jié)合以連續(xù)的負荷更佳。起始樣品的最大容量：5mgggf2/ml培養(yǎng)基流速：3ml/分鐘首次洗滌：15％b，10cv第二次洗滌：35％b，10cvggf2洗脫：60％b，8cv柱洗滌：100％b，8cv【步驟2】精制-凝膠過濾層析聚丙烯酰胺葡聚糖s20026/60洗脫緩沖液：20mm乙酸鈉，100mm硫酸鈉，1％甘露糖醇，10mml-精氨酸，ph6.5緩沖液導電性：樣品：spggf2洗脫合并濃縮達～au2801.0流速：1.3ml/分鐘峰洗脫：以從注射開始～0.36cv【步驟3】dna及內(nèi)毒素去除-通過interceptq膜過濾。預平衡緩沖液：20mm乙酸鈉，100mm硫酸鈉，1％甘露糖醇，10mml-精氨酸，ph6.5收集流通【步驟4】最終制劑及樣品制備將額外的90mml-精氨酸添加到樣品濃縮無菌過濾本文所用的媒質(zhì)/對照物品是0.2％牛血清白蛋白(bsa)，0.1m磷酸鈉，ph7.6。本文中使用大鼠株[crl：(sd)/myoinfarct]及幼稚的spraguedawley。這些株從charlesriver實驗室獲得。測試動物在到達時大致是6～7周齡，及在手術(shù)過程時大致160～200g重。實際范圍可變化及記錄在數(shù)據(jù)中。研究接受的全部幼稚的spraguedawley動物，及分配到組1。處理之前稱重認為適宜于研究的動物。將全部[crl：/myoinfarct]接受的動物使用基于來自在charlesriver實驗室進行的手術(shù)過程后第7天進行的超聲波心動圖檢查的計算的射血分數(shù)的簡單隨機化過程隨機化到處理組(組2～5)。進行簡單隨機化以導致各處理組(組2～5)由可應(yīng)用的數(shù)的動物構(gòu)成，導致跨組2～5大致相等的組平均射血分數(shù)(±3％)。根據(jù)實驗室的標準運作過程使組2～6中的全部動物適應(yīng)charlesriver實驗室的環(huán)境。隨后將動物隨機化到處理組。在它們的初次超聲波心動圖檢查之前，使組1中全部幼稚的動物在接受后適應(yīng)環(huán)境大致24小時。動物在懸浮的，不銹鋼，金屬絲網(wǎng)類型籠中個別籠養(yǎng)，一般而言不使用實底籠，因為嚙齒動物是食糞性的，及攝入含排泄的測試品及代謝產(chǎn)物的糞便，或攝入墊層本身，這可導致此毒性研究解釋混淆。經(jīng)自動計時器提供熒光照明大致12小時/天。有時，由于研究-相關(guān)的活性間歇性地打斷暗循環(huán)。監(jiān)控溫度及濕度，及每天記錄及分別盡可能維持到64～79°f及30～70％之間?；A(chǔ)攝食是經(jīng)嚙齒動物攝食#5002，pminutritioninternational,inc檢驗的塊狀實驗室此攝食隨意可用，除非另有指定。研究記錄中鑒定使用的各批號。給全部動物經(jīng)自動水系統(tǒng)隨意供給自來水，除非另有說明?！狙芯吭O(shè)計】表5：ggf2對比egf-ld片段(liu等人，2006)lad后第7天起始施劑10天表6：相比egf-ld及egf-ig的ggf2更高劑量lad后第7天起始施劑20天。清洗10天。表7：ggf2劑量頻度ta1-測試品1；m＝雄性；f＝雌性。表8：有及無bsa的ggf2【測試及對照物品施用】【施用途徑】測試及對照品通過靜脈內(nèi)注射施用。分配到組1的動物未用媒質(zhì)或測試品處理；這些動物作為未處理的年齡匹配的對照。施用頻度，持續(xù)時間，及劑量如表5～8中所述。劑量體積大致是1ml/kg。【測試品施用】測試及對照品經(jīng)尾靜脈施用。個體劑量基于最新近體重。劑量通過推注施用，除非發(fā)起者另有說明?！緶y試系統(tǒng)的制備】【手術(shù)過程-左前降支動脈結(jié)扎】如charlesriver實驗室手術(shù)能力參照論文，vol.13，no.1，2005年中所述在charlesriver實驗室進行手術(shù)過程。簡言之，在胸中，稍微到胸骨左，通過皮膚及胸部肌肉進行顱-尾切開。橫斷第三及第四肋骨，及鈍器解剖肋間肌肉?？焖龠M入胸腔，及完全打開心包。通過切開取出心臟。鑒定肺部錐及左心耳。用小彎針于使一塊5～0絲縫線在左前降支冠狀動脈下。系繃帶，及心臟再放入胸部。輕輕擠壓出胸腔中的空氣而閉合胸壁及皮膚切口。使用正壓通氣及放入富氧環(huán)境使動物恢復意識?！臼中g(shù)后恢復】由charlesriver實驗室如charlesriver實驗室手術(shù)能力參照論文，vol.13，no.1，2005年中所述進行手術(shù)后短期監(jiān)控及施用適當?shù)逆?zhèn)痛藥。進行手術(shù)后長期監(jiān)控，以評定動物的疼痛或感染跡象。接受動物后每天觀察切開位點持續(xù)7天。如需要施用補充性疼痛管理及抗微生物治療。表9.計劃的藥療及劑量*-通過如以下所示的動物組分配指定的echo過程天?！舅狼把芯吭u估】【籠側(cè)觀察】全部動物一天至少兩次觀察病態(tài)，死亡率，傷害，及食品及水的利用度。鑒定任何健康差的動物用于進一步監(jiān)控及可能的安樂死。【體重】測量體重，及在隨機化之前及研究期間每周記錄至少一次?！臼称废M】不測量食品消費，但記錄食欲不振?！境暡ㄐ膭訄D檢查】在接受(第0天)后第1天，12，22及第32天對分配到組1的全部動物進行超聲波心動圖檢查。在charlesriver實驗室進行的手術(shù)過程(第0天)后第7天，18，28及第38天對分配到組2～5的全部動物進行超聲波心動圖檢查。對于超聲波心動圖檢查，各動物根據(jù)表5麻醉及從其胸部剪毛。將耦合凝膠應(yīng)用于超聲波心動圖變換器，及得到圖像以測量多個水平的心臟功能。對各動物以短軸觀得到圖像(以中-乳頭水平，或其他取決于通過超聲波心動圖記術(shù)觀察的梗塞區(qū)位置)?！境暡ㄐ膭訄D參數(shù)】以中-乳頭肌肉水平，或其他取決于通過超聲波心動圖記術(shù)觀察的梗塞區(qū)位置采取左心室的echo圖像。記錄m-模式及2-d圖像，及儲存在cd和/或mod。用echo得到的測量參數(shù)包括：心室內(nèi)中隔壁厚度(心舒期)；單元＝cm；心室內(nèi)中隔壁厚度(心縮期)；單元＝cm；左心室內(nèi)部尺度(心舒期)；單元＝cm；左心室內(nèi)部尺度(心縮期)；單元＝cm；左心室乳頭壁厚度(心舒期)；單元＝cm；左心室乳頭壁厚度(心縮期)；單元＝cm；端心臟舒張體積；單元＝ml；收縮末期容量；單元＝ml；射血分數(shù)；報道為百分率；中風體積；單元＝ml；及％縮短分數(shù)；報道為百分率【安樂死】【垂死性】使如通過測試設(shè)備標準運作過程指定的任何垂死動物以人道的理由安樂死。使瀕死或發(fā)現(xiàn)死亡的安樂死的全部動物經(jīng)歷常規(guī)尸檢?！景矘匪婪椒ā客ㄟ^將飽和的氯化鉀注射到大靜脈，然后是獲得批準的確保死亡的方法，例如驅(qū)血法進行安樂死。【最終處置】使研究的全部存活的動物在它們的計劃的尸檢時安樂死或，如果必需，在瀕死時安樂死。研究1-用ggf2以0.625mg/kg靜脈內(nèi)處理大鼠q天導致如在本文通過射血分數(shù)及縮短分數(shù)變化顯示的心臟功能的顯著的改善。egf-1d片段未導致相同程度的改善。見表5。研究2-用ggf2以0.625和3.25mg/kg靜脈內(nèi)處理大鼠q天導致如在本文通過射血分數(shù)及縮短分數(shù)變化顯示的心臟功能的顯著的改善。顯著的改善也見于處理期間收縮末期容量及舒張末期容量。見表6。研究3結(jié)果-用ggf以23.25mg/kg靜脈內(nèi)處理大鼠q24，48或96小時導致如在本文通過射血分數(shù)及縮短分數(shù)變化顯示的心臟功能的顯著的改善。顯著的改善也見于處理期間收縮末期容量及舒張末期容量。見表7。之前報道(liuetal)顯示，為最佳神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性及活性，需要載質(zhì)蛋白(例如bsa)。ggf2展示無需載質(zhì)(例如bsa)的穩(wěn)定性。設(shè)計此實驗以測試是否ggf2穩(wěn)定，及在無bsa的治療性方案中活躍。處理10天后，含bsa及不含bsa的ggf2制劑導致相比媒質(zhì)對照的射血分數(shù)改善類似于見于之前研究的那些。因此，從此研究明白，chf處理用ggf2制劑不需要bsa或其他載質(zhì)蛋白。見表8。表10：病理學發(fā)現(xiàn)施劑坐骨神經(jīng)鞘增生(nsh)乳腺nsh注射位點/皮膚變化心臟效應(yīng)每天皮下+++++++每天靜脈內(nèi)++++/-48小時間隔靜脈內(nèi)+/---+/--96小時間隔靜脈內(nèi)----++常存在；+存在；+/-偶爾觀察的，-罕見的或未觀察到如表10中所示，ggf2的間歇的施劑降低與超常水平的外源地施用的ggf2相關(guān)的副作用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，此發(fā)現(xiàn)與將ggf2靜脈內(nèi)或經(jīng)皮下施用無關(guān)地真實。用每隔一天施劑有時觀察到增生及心臟效應(yīng)。我們用欠頻繁的施劑未觀察到。本申請中參考幾個出版物及專利文獻，以便更完全說明本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)。此說明書中提及的全部出版物及專利申請通過引用并入本文，如各獨立性出版物或?qū)＠暾執(zhí)禺愋缘丶皞€別通過引用并入一樣。本說明書還包括以下內(nèi)容：1.治療或預防哺乳動物心力衰竭的方法，所述方法包括：提供包括表皮生長因子-樣(egf-樣)結(jié)構(gòu)域的肽；以至少48小時的間隔給哺乳動物施用治療有效量的所述肽，其中所述治療有效量對于治療或預防所述哺乳動物的心力衰竭有效。2.實施方式1的方法，其中所述施用每48小時進行。3.實施方式1的方法，其中所述施用每96小時進行。4.實施方式1的方法，其中所述施用以選自下列的方案進行：每4天，每周，每10天，每14天，每個月，每2個月，每3個月或每4個月。5.實施方式1的方法，其中所述哺乳動物是人。6.實施方式1的方法，其中所述肽是重組人ggf2。7.實施方式的方法，其中所述肽是：shlvkcaekektfcvnggecfmvkdlsnpsrylckcpneftgdrcqnyvmasfykaeelyq。8.實施方式的方法，其中所述肽是：shlvkcaekektfcvnggecfmvkdlsnpsrylckcpneftgdrcqnyvmasfykaeely。9.實施方式1的方法，其中所述肽由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(nrg)-1基因，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(nrg)-2基因，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(nrg)-3基因，或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(nrg)-4基因編碼。?序列表<110>caggiano,anthonyiaci,jenniferganguly,aninditaparry,tom<120>用于治療或預防心力衰竭的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其亞序列的治療性施劑<130>acor.p0040wo<140>pct/us2009/004130<141>2009-07-17<150>61/135,171<151>2008-07-17<160>33<170>patentinversion3.5<210>1<211>2003<212>dna<213>智人（homosapiens）<220><221>misc_feature<222>(31)..(32)<223>n是a,c,g,或t<220><221>cds<222>(265)..(1530)<400>1ggaattcctttttttttttttttttttcttnntttttttttgcccttatacctcttcgcc60tttctgtggttccatccacttcttccccctcctcctcccataaacaactctcctacccct120gcacccccaataaataaataaaaggaggagggcaaggggggaggaggaggagtggtgctg180cgaggggaaggaaaagggaggcagcgcgagaagagccgggcagagtccgaaccgacagcc240agaagcccgcacgcacctcgcaccatgagatggcgacgcgccccgcgccgc291metargtrpargargalaproargarg15tccgggcgtcccggcccccgggcccagcgccccggctccgccgcccgc339serglyargproglyproargalaglnargproglyseralaalaarg10152025tcgtcgccgccgctgccgctgctgccactactgctgctgctggggacc387serserproproleuproleuleuproleuleuleuleuleuglythr303540gcggccctggcgccgggggcggcggccggcaacgaggcggctcccgcg435alaalaleualaproglyalaalaalaglyasnglualaalaproala455055ggggcctcggtgtgctactgctccccgcccagcgtgggatcggtgcag483glyalaservalcystyrcysserproproservalglyservalgln606570gagctagctcagcgcgccgcggtggtgatcgagggaaaggtgcacccg531gluleualaglnargalaalavalvalilegluglylysvalhispro758085cagcggcggcagcagggggcactcgacaggaaggcggcggcggcggcg579glnargargglnglnglyalaleuasparglysalaalaalaalaala9095100105ggcgaggcaggggcgtggggcggcgatcgcgagccgccagccgcgggc627glyglualaglyalatrpglyglyasparggluproproalaalagly110115120ccacgggcgctggggccgcccgccgaggagccgctgctcgccgccaac675proargalaleuglyproproalaglugluproleuleualaalaasn125130135gggaccgtgccctcttggcccaccgccccggtgcccagcgccggcgag723glythrvalprosertrpprothralaprovalproseralaglyglu140145150cccggggaggaggcgccctatctggtgaaggtgcaccaggtgtgggcg771proglygluglualaprotyrleuvallysvalhisglnvaltrpala155160165gtgaaagccgggggcttgaagaaggactcgctgctcaccgtgcgcctg819vallysalaglyglyleulyslysaspserleuleuthrvalargleu170175180185gggacctggggccaccccgccttcccctcctgcgggaggctcaaggag867glythrtrpglyhisproalapheprosercysglyargleulysglu190195200gacagcaggtacatcttcttcatggagcccgacgccaacagcaccagc915aspserargtyrilephephemetgluproaspalaasnserthrser205210215cgcgcgccggccgccttccgagcctctttcccccctctggagacgggc963argalaproalaalapheargalaserpheproproleugluthrgly220225230cggaacctcaagaaggaggtcagccgggtgctgtgcaagcggtgcgcc1011argasnleulyslysgluvalserargvalleucyslysargcysala235240245ttgcctccccaattgaaagagatgaaaagccaggaatcggctgcaggt1059leuproproglnleulysglumetlysserglngluseralaalagly250255260265tccaaactagtccttcggtgtgaaaccagttctgaatactcctctctc1107serlysleuvalleuargcysgluthrserserglutyrserserleu270275280agattcaagtggttcaagaatgggaatgaattgaatcgaaaaaacaaa1155argphelystrpphelysasnglyasngluleuasnarglysasnlys285290295ccacaaaatatcaagatacaaaaaaagccagggaagtcagaacttcgc1203proglnasnilelysileglnlyslysproglylyssergluleuarg300305310attaacaaagcatcactggctgattctggagagtatatgtgcaaagtg1251ileasnlysalaserleualaaspserglyglutyrmetcyslysval315320325atcagcaaattaggaaatgacagtgcctctgccaatatcaccatcgtg1299ileserlysleuglyasnaspseralaseralaasnilethrileval330335340345gaatcaaacgctacatctacatccaccactgggacaagccatcttgta1347gluserasnalathrserthrserthrthrglythrserhisleuval350355360aaatgtgcggagaaggagaaaactttctgtgtgaatggaggggagtgc1395lyscysalaglulysglulysthrphecysvalasnglyglyglucys365370375ttcatggtgaaagacctttcaaacccctcgagatacttgtgcaagtgc1443phemetvallysaspleuserasnproserargtyrleucyslyscys380385390ccaaatgagtttactggtgatcgctgccaaaactacgtaatggccagc1491proasngluphethrglyaspargcysglnasntyrvalmetalaser395400405ttctacagtacgtccactccctttctgtctctgcctgaataggagcatg1540phetyrserthrserthrpropheleuserleuproglu410415420ctcagttggtgctgctttcttgttgctgcatctcccctcagattccacctagagctagat1600gtgtcttaccagatctaatattgactgcctctgcctgtcgcatgagaacattaacaaaag1660caattgtattacttcctctgttcgcgactagttggctctgagatactaataggtgtgtga1720ggctccggatgtttctggaattgatattgaatgatgtgatacaaattgatagtcaatatc1780aagcagtgaaatatgataataaaggcatttcaaagtctcacttttattgataaaataaaa1840atcattctactgaacagtccatcttctttatacaatgaccacatcctgaaaagggtgttg1900ctaagctgtaaccgatatgcacttgaaatgatggtaagttaattttgattcagaatgtgt1960tatttgtcacaaataaacataataaaaggaaaaaaaaaaaaaa2003<210>2<211>422<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>2metargtrpargargalaproargargserglyargproglyproarg151015alaglnargproglyseralaalaargserserproproleuproleu202530leuproleuleuleuleuleuglythralaalaleualaproglyala354045alaalaglyasnglualaalaproalaglyalaservalcystyrcys505560serproproservalglyservalglngluleualaglnargalaala65707580valvalilegluglylysvalhisproglnargargglnglnglyala859095leuasparglysalaalaalaalaalaglyglualaglyalatrpgly100105110glyasparggluproproalaalaglyproargalaleuglypropro115120125alaglugluproleuleualaalaasnglythrvalprosertrppro130135140thralaprovalproseralaglygluproglygluglualaprotyr145150155160leuvallysvalhisglnvaltrpalavallysalaglyglyleulys165170175lysaspserleuleuthrvalargleuglythrtrpglyhisproala180185190pheprosercysglyargleulysgluaspserargtyrilephephe195200205metgluproaspalaasnserthrserargalaproalaalaphearg210215220alaserpheproproleugluthrglyargasnleulyslysgluval225230235240serargvalleucyslysargcysalaleuproproglnleulysglu245250255metlysserglngluseralaalaglyserlysleuvalleuargcys260265270gluthrserserglutyrserserleuargphelystrpphelysasn275280285glyasngluleuasnarglysasnlysproglnasnilelysilegln290295300lyslysproglylyssergluleuargileasnlysalaserleuala305310315320aspserglyglutyrmetcyslysvalileserlysleuglyasnasp325330335seralaseralaasnilethrilevalgluserasnalathrserthr340345350serthrthrglythrserhisleuvallyscysalaglulysglulys355360365thrphecysvalasnglyglyglucysphemetvallysaspleuser370375380asnproserargtyrleucyslyscysproasngluphethrglyasp385390395400argcysglnasntyrvalmetalaserphetyrserthrserthrpro405410415pheleuserleuproglu420<210>3<211>198<212>dna<213>智人（homosapiens）<220><221>cds<222>(1)..(195)<400>3agccatcttgtcaagtgtgcagagaaggagaaaactttctgtgtgaat48serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015ggaggcgagtgcttcatggtgaaagacctttcaaatccctcaagatac96glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530ttgtgcaagtgcccaaatgagtttactggtgatcgctgccaaaactac144leucyslyscysproasngluphethrglyaspargcysglnasntyr354045gtaatggccagcttctacagtacgtccactccctttctgtctctgcct192valmetalaserphetyrserthrserthrpropheleuserleupro505560gaatag198glu65<210>4<211>65<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>4serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530leucyslyscysproasngluphethrglyaspargcysglnasntyr354045valmetalaserphetyrserthrserthrpropheleuserleupro505560glu65<210>5<211>192<212>dna<213>智人（homosapiens）<220><221>cds<222>(1)..(192)<400>5agccatcttgtcaagtgtgcagagaaggagaaaactttctgtgtgaat48serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015ggaggcgagtgcttcatggtgaaagacctttcaaatccctcaagatac96glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530ttgtgcaagtgccaacctggattcactggagcgagatgtactgagaat144leucyslyscysglnproglyphethrglyalaargcysthrgluasn354045gtgcccatgaaagtccaaacccaagaaaaagcggaggagctctactaa192valprometlysvalglnthrglnglulysalaglugluleutyr505560<210>6<211>63<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>6serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530leucyslyscysglnproglyphethrglyalaargcysthrgluasn354045valprometlysvalglnthrglnglulysalaglugluleutyr505560<210>7<211>183<212>dna<213>智人（homosapiens）<220><221>cds<222>(1)..(183)<400>7agccatcttgtcaagtgtgcagagaaggagaaaactttctgtgtgaat48serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015ggaggcgagtgcttcatggtgaaagacctttcaaatccctcaagatac96glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530ttgtgcaagtgcccaaatgagtttactggtgatcgctgccaaaactac144leucyslyscysproasngluphethrglyaspargcysglnasntyr354045gtaatggccagcttctacaaagcggaggagctctactaa183valmetalaserphetyrlysalaglugluleutyr505560<210>8<211>60<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>8serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530leucyslyscysproasngluphethrglyaspargcysglnasntyr354045valmetalaserphetyrlysalaglugluleutyr505560<210>9<211>210<212>dna<213>智人（homosapiens）<220><221>cds<222>(1)..(210)<400>9agccatcttgtcaagtgtgcagagaaggagaaaactttctgtgtgaat48serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015ggaggcgagtgcttcatggtgaaagacctttcaaatccctcaagatac96glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530ttgtgcaagtgcccaaatgagtttactggtgatcgctgccaaaactac144leucyslyscysproasngluphethrglyaspargcysglnasntyr354045gtaatggccagcttctacaagcatcttgggattgaatttatggagaaa192valmetalaserphetyrlyshisleuglyilegluphemetglulys505560gcggaggagctctactaa210alaglugluleutyr65<210>10<211>69<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>10serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530leucyslyscysproasngluphethrglyaspargcysglnasntyr354045valmetalaserphetyrlyshisleuglyilegluphemetglulys505560alaglugluleutyr65<210>11<211>267<212>dna<213>智人（homosapiens）<220><221>cds<222>(1)..(267)<400>11agccatcttgtcaagtgtgcagagaaggagaaaactttctgtgtgaat48serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015ggaggcgagtgcttcatggtgaaagacctttcaaatccctcaagatac96glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530ttgtgcaagtgccaacctggattcactggagcgagatgtactgagaat144leucyslyscysglnproglyphethrglyalaargcysthrgluasn354045gtgcccatgaaagtccaaacccaagaaaagtgcccaaatgagtttact192valprometlysvalglnthrglnglulyscysproasngluphethr505560ggtgatcgctgccaaaactacgtaatggccagcttctacagtacgtcc240glyaspargcysglnasntyrvalmetalaserphetyrserthrser65707580actccctttctgtctctgcctgaatag267thrpropheleuserleuproglu85<210>12<211>88<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>12serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530leucyslyscysglnproglyphethrglyalaargcysthrgluasn354045valprometlysvalglnthrglnglulyscysproasngluphethr505560glyaspargcysglnasntyrvalmetalaserphetyrserthrser65707580thrpropheleuserleuproglu85<210>13<211>252<212>dna<213>智人（homosapiens）<220><221>cds<222>(1)..(252)<400>13agccatcttgtcaagtgtgcagagaaggagaaaactttctgtgtgaat48serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015ggaggcgagtgcttcatggtgaaagacctttcaaatccctcaagatac96glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530ttgtgcaagtgccaacctggattcactggagcgagatgtactgagaat144leucyslyscysglnproglyphethrglyalaargcysthrgluasn354045gtgcccatgaaagtccaaacccaagaaaagtgcccaaatgagtttact192valprometlysvalglnthrglnglulyscysproasngluphethr505560ggtgatcgctgccaaaactacgtaatggccagcttctacaaagcggag240glyaspargcysglnasntyrvalmetalaserphetyrlysalaglu65707580gagctctactaa252gluleutyr<210>14<211>83<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>14serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530leucyslyscysglnproglyphethrglyalaargcysthrgluasn354045valprometlysvalglnthrglnglulyscysproasngluphethr505560glyaspargcysglnasntyrvalmetalaserphetyrlysalaglu65707580gluleutyr<210>15<211>498<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>15catatgttgcctccccaattgaaagagatgaaaagccaggaatcggctgcaggttccaaa60ctagtccttcggtgtgaaaccagttctgaatactcctctctcagattcaagtggttcaag120aatgggaatgaattgaatcgaaaaaacaaaccacaaaatatcaagatacaaaaaaagcca180gggaagtcagaacttcgcattaacaaagcatcactggctgattctggagagtatatgtgc240aaagtgatcagcaaattaggaaatgacagtgcctctgccaatatcaccatcgtggaatca300aacgctacatctacatccaccactgggacaagccatcttgtaaaatgtgcggagaaggag360aaaactttctgtgtgaatggaggggagtgcttcatggtgaaagacctttcaaacccctcg420agatacttgtgcaagtgcccaaatgagtttactggtgatcgctgccaaaactacgtaatg480gccagcttctacggatcc498<210>16<211>162<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>16leuproproglnleulysglumetlysserglngluseralaalagly151015serlysleuvalleuargcysgluthrserserglutyrserserleu202530argphelystrpphelysasnglyasngluleuasnarglysasnlys354045proglnasnilelysileglnlyslysproglylyssergluleuarg505560ileasnlysalaserleualaaspserglyglutyrmetcyslysval65707580ileserlysleuglyasnaspseralaseralaasnilethrileval859095gluserasnalathrserthrserthrthrglythrserhisleuval100105110lyscysalaglulysglulysthrphecysvalasnglyglyglucys115120125phemetvallysaspleuserasnproserargtyrleucyslyscys130135140proasngluphethrglyaspargcysglnasntyrvalmetalaser145150155160phetyr<210>17<211>198<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>17metglyglyserhishishishishishisglymetalasermetthr151015glyglythralaasnglyvalglyaspleutyraspaspaspasplys202530valproglyserleuproproglnleulysglumetlysserglnglu354045seralaalaglyserlysleuvalleuargcysgluthrserserglu505560tyrserserleuargphelystrpphelysasnglyasngluleuasn65707580arglysasnlysproglnasnilelysileglnlyslysproglylys859095sergluleuargileasnlysalaserleualaaspserglyglutyr100105110metcyslysvalileserlysleugluasnaspseralaseralaasn115120125ilethrilevalgluserasnalathrserthrserthrthrglythr130135140serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn145150155160glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr165170175leucyslyscysproasngluphethrglyaspargcysglnasntyr180185190valmetalaserphetyr195<210>18<211>198<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>18catatgagccatcttgtaaaatgtgcggagaaggagaaaactttctgtgtgaatggaggg60gagtgcttcatggtgaaagacctttcaaacccctcgagatacttgtgcaagtgcccaaat120gagtttactggtgatcgctgccaaaactacgtaatggccagcttctacaaggcggaggag180ctgtaccagtaaggatcc198<210>19<211>82<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>19metglyserserhishishishishishisserserglyleuvalpro151015argglyserhismetserhisleuvallyscysalaglulysglulys202530thrphecysvalasnglyglyglucysphemetvallysaspleuser354045asnproserargtyrleucyslyscysproasngluphethrglyasp505560argcysglnasntyrvalmetalaserphetyrlysalaglugluleu65707580tyrgln<210>20<211>236<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>20cgataactagcagcatttcctccaacgaggatcccgcaggtaagaagctacaccggccag60tggccggggcccgataactagcagcatttcctccaacgaggatcccgcaggtaagaagct120acaccggccagtggccggggccgtggagccgggggcatccggtgcctgagacagaggtgc180tcaaggcagtctccaccttttgtctcccctctgcagagagccacattctggaagtt236<210>21<211>60<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>21serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530leucyslyscysproasngluphethrglyaspargcysglnasntyr354045valmetalaserphetyrlysalaglugluleutyr505560<210>22<211>61<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>22serhisleuvallyscysalaglulysglulysthrphecysvalasn151015glyglyglucysphemetvallysaspleuserasnproserargtyr202530leucyslyscysproasngluphethrglyaspargcysglnasntyr354045valmetalaserphetyrlysalaglugluleutyrgln505560<210>23<211>1269<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>23atgagatggcgacgcgccccgcgccgctccgggcgtcccggcccccgggcccagcgcccc60ggctccgccgcccgctcgtcgccgccgctgccgctgctgccactactgctgctgctgggg120accgcggccctggcgccgggggcggcggccggcaacgaggcggctcccgcgggggcctcg180gtgtgctactcgtccccgcccagcgtgggatcggtgcaggagctagctcagcgcgccgcg240gtggtgatcgagggaaaggtgcacccgcagcggcggcagcagggggcactcgacaggaag300gcggcggcggcggcgggcgaggcaggggcgtggggcggcgatcgcgagccgccagccgcg360ggcccacgggcgctggggccgcccgccgaggagccgctgctcgccgccaacgggaccgtg420ccctcttggcccaccgccccggtgcccagcgccggcgagcccggggaggaggcgccctat480ctggtgaaggtgcaccaggtgtgggcggtgaaagccgggggcttgaagaaggactcgctg540ctcaccgtgcgcctggggacctggggccaccccgccttcccctcctgcgggaggctcaag600gaggacagcaggtacatcttcttcatggagcccgacgccaacagcaccagccgcgcgccg660gccgccttccgagcctctttcccccctctggagacgggccggaacctcaagaaggaggtc720agccgggtgctgtgcaagcggtgcgccttgcctccccaattgaaagagatgaaaagccag780gaatcggctgcaggttccaaactagtccttcggtgtgaaaccagttctgaatactcctct840ctcagattcaagtggttcaagaatgggaatgaattgaatcgaaaaaacaaaccacaaaat900atcaagatacaaaaaaagccagggaagtcagaacttcgcattaacaaagcatcactggct960gattctggagagtatatgtgcaaagtgatcagcaaattaggaaatgacagtgcctctgcc1020aatatcaccatcgtggaatcaaacgctacatctacatccaccactgggacaagccatctt1080gtaaaatgtgcggagaaggagaaaactttctgtgtgaatggaggggagtgcttcatggtg1140aaagacctttcaaacccctcgagatacttgtgcaagtgcccaaatgagtttactggtgat1200cgctgccaaaactacgtaatggccagcttctacagtacgtccactccctttctgtctctg1260cctgaatag1269<210>24<211>422<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>24metargtrpargargalaproargargserglyargproglyproarg151015alaglnargproglyseralaalaargserserproproleuproleu202530leuproleuleuleuleuleuglythralaalaleualaproglyala354045alaalaglyasnglualaalaproalaglyalaservalcystyrser505560serproproservalglyservalglngluleualaglnargalaala65707580valvalilegluglylysvalhisproglnargargglnglnglyala859095leuasparglysalaalaalaalaalaglyglualaglyalatrpgly100105110glyasparggluproproalaalaglyproargalaleuglypropro115120125alaglugluproleuleualaalaasnglythrvalprosertrppro130135140thralaprovalproseralaglygluproglygluglualaprotyr145150155160leuvallysvalhisglnvaltrpalavallysalaglyglyleulys165170175lysaspserleuleuthrvalargleuglythrtrpglyhisproala180185190pheprosercysglyargleulysgluaspserargtyrilephephe195200205metgluproaspalaasnserthrserargalaproalaalaphearg210215220alaserpheproproleugluthrglyargasnleulyslysgluval225230235240serargvalleucyslysargcysalaleuproproglnleulysglu245250255metlysserglngluseralaalaglyserlysleuvalleuargcys260265270gluthrserserglutyrserserleuargphelystrpphelysasn275280285glyasngluleuasnarglysasnlysproglnasnilelysilegln290295300lyslysproglylyssergluleuargileasnlysalaserleuala305310315320aspserglyglutyrmetcyslysvalileserlysleuglyasnasp325330335seralaseralaasnilethrilevalgluserasnalathrserthr340345350serthrthrglythrserhisleuvallyscysalaglulysglulys355360365thrphecysvalasnglyglyglucysphemetvallysaspleuser370375380asnproserargtyrleucyslyscysproasngluphethrglyasp385390395400argcysglnasntyrvalmetalaserphetyrserthrserthrpro405410415pheleuserleuproglu420<210>25<211>11<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>25valcysleuleuthrvalalaalaleupropro1510<210>26<211>15<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>26alaserprovalservalglyservalglngluleuvalglnarg151015<210>27<211>8<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>27trpphevalvalilegluglylys15<210>28<211>9<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>28lysvalhisgluvaltrpalaalalys15<210>29<211>7<212>prt<213>智人（homosapiens）<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>xaa可為任何天然存在的氨基酸<400>29aspleuleuleuxaavalleu15<210>30<211>12<212>prt<213>智人（homosapiens）<220><221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>xaa可為任何天然存在的氨基酸<400>30glyalatrpglyproproalapheprovalxaatyr1510<210>31<211>13<212>prt<213>智人（homosapiens）<220><221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>xaa可為任何天然存在的氨基酸<400>31tyrilephephemetgluproglualaxaasersergly1510<210>32<211>4<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>32leuvalleuarg1<210>33<211>13<212>prt<213>智人（homosapiens）<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>xaa可為任何天然存在的氨基酸<400>33lysalaserleualaaspserglyglutyrmetxaalys1510當前第1頁12