專利名稱:經(jīng)翻譯后修飾的有活性的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白亞型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及使用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1翻譯后的各種修飾產(chǎn)物或剪切變體,尤其是可 溶于生理溶液的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型作為藥物,來(lái)治療與認(rèn)知有關(guān)的精神紊亂類疾病,如 精神分裂癥、阿爾茨海默氏癥以及帕金森氏癥。
背景技術(shù):
神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)為突觸信號(hào)傳遞中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)。這種跨膜蛋白由四種基 因編碼(NRG-1、NRG-2、NRG-3和NRG-4),并通過(guò)選擇性的RNA剪接和啟動(dòng)子使用以及尤其 翻譯后修飾(如蛋白水解加工,其可自膜結(jié)合的全蛋白中釋放可溶性的亞型)使其多樣性 進(jìn)一步提高。此外經(jīng)證實(shí)還存在磷酸化與糖基化(Buonanno andFischbach 2001)。它們的 特征在于不同的胞外結(jié)構(gòu)域,且是ErbB受體酪氨酸激酶的配體,其涉及神經(jīng)炎癥以及基因 轉(zhuǎn)錄的下游(Holbroand Hynes 2004)。尤其是,NRG-I的可溶性亞型可由跨膜形式的NRG 在電刺激過(guò)程中經(jīng)蛋白水解切割得到,并隨后分泌為依賴于活性的突觸調(diào)節(jié)物(Ozaki et al. 2004)。包含整個(gè)跨膜蛋白的N端胞外結(jié)構(gòu)域(EOT)的NRG-I的截短亞型(推測(cè)為β 1) 被證實(shí)與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)聯(lián)(Schillo et al. 2005a ;W003/014156) 0對(duì)功能的研究證明, NRG-I直接調(diào)節(jié)NMDA受體亞基組成(Ozaki et al. 1997 ;Eilam et al. 1998)。此外,這類 NRG-I片段由于抗凋亡作用而具有體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)(Xu et al. 2005A ;Xu etal. 2005B ;Xu et al. 2004)。由于NMDA受體的NRG依賴性調(diào)節(jié)(Schrattenholz and Soskic2006),以及隨后 的下游事件(如興奮性中毒、神經(jīng)炎癥以及凋亡)(在
圖1中總結(jié)),人們最近越發(fā)的認(rèn)識(shí) 到NRG-I在人神經(jīng)性疾病中扮演中心角色。有結(jié)果表明NRG-I在從肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿 爾茨海默氏癥和帕金森氏癥至中風(fēng)以及精神分裂癥的疾病中均發(fā)揮著重要作用(Britsch 2007)。NRG-I的這些重要的作用暗示其除了在神經(jīng)保護(hù)以及在與認(rèn)知相關(guān)的學(xué)習(xí)與記憶 中起到積極作用外,NRG-I還是各種特定腦區(qū)和細(xì)胞類型中的各種損傷后神經(jīng)原組織再生 中的重要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。很明顯,它是維持及修復(fù)神經(jīng)元回路的完整性的重要因子神經(jīng)保 護(hù)和功能喪失后的正確再生以及活性依賴型神經(jīng)元可塑性的形成中的作用。在Kastin et al,2004證明調(diào)節(jié)蛋白1 β可穿過(guò)血腦屏障后,對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 β 研究的興趣得到了進(jìn)一步的點(diǎn)燃。其開(kāi)辟了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β的治療應(yīng)用的新途徑。最近的研究證明了其在神經(jīng)保護(hù)方面具有廣泛的應(yīng)用范圍。兩份出版物分別獨(dú)立 的證明了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1還是BACE(i3分泌酶、β淀粉樣蛋白轉(zhuǎn)化酶)的底物,而這意味 著神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1與阿爾茨海默氏癥相關(guān)聯(lián)(Glabe 2006 ;Schubert 2006)。另外,在雪旺氏細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1增加了 3-羥基-3-甲基戊二酰-輔 酶A還原酶(雪旺氏細(xì)胞中膽固醇生物合成的限速酶)的轉(zhuǎn)錄(Pertusa et al. 2007)。這 對(duì)髓鞘受影響的疾病(如神經(jīng)分裂癥和多發(fā)性硬化癥)或涉及所謂的“富含膽固醇的脂筏”的認(rèn)知相關(guān)功能有深遠(yuǎn)意義(Schrattenholz and Soskic 2006)。圍繞軸突的雪旺氏細(xì)胞 在生理狀態(tài)下表達(dá)NRGl受體ErbB2/ErbB3以及可溶性NRGl α和NRGl β。經(jīng)去神經(jīng)處理, 成體的雪旺氏細(xì)胞脫離與軸突的接觸后,改變其形態(tài)學(xué),停止表達(dá)NRGl β,并上調(diào)NRGl α 及 ErbB2/ErbB3 的表達(dá)(Geuna et al. 2007 ;Karoutzou et al. 2007)。此外,遺傳流行病學(xué)研究表明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1與精神分裂癥和阿爾茨海默氏癥 (尤其與其精神病形式)有著明顯的相關(guān)性(Farmer etal.,2007)。一些近期的遺傳群體分析顯示,特定NRG-I-SNP與阿爾茨海默氏癥和精神分裂癥 有關(guān)(Go et al. 2005 ;Scolnick et al. 2006 ;Ross et al. 2006 ;Meeks et al. 2006 ;Farmer et al. 2007)。最近的這些發(fā)現(xiàn)與圖1中其他含有功能的NRG的復(fù)合物的蛋白有關(guān)(ErbB 受體(Benzel etal. 2007 ;Thomson et al. 2007 ;Hahn et al. 2006)。還暗示了 NRG-1 在 多發(fā)性硬化中的作用(Esper et al. 2006)。有結(jié)果提示NRGl的危險(xiǎn)等位基因與精神分裂癥之間相關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制可能包括 α 7亞類煙堿乙酰膽堿受體的下調(diào)(Mathew et al,2007)。根據(jù)本發(fā)明,發(fā)現(xiàn)重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白亞型對(duì)精神分裂癥、阿爾茨海 默氏癥以及帕金森氏癥的動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)和記憶狀況可起到一定的藥效。在靜脈注射后, 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β亞型在顯著低于對(duì)照藥物濃度的濃度有活性。
發(fā)明內(nèi)容
因此,本發(fā)明的第一方面為重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型用于制備治療神 經(jīng)性疾病(特別是與認(rèn)知相關(guān)神經(jīng)性疾病)的藥物的用途。本發(fā)明的另一方面為藥物組合物或試劑盒,其包含(i)重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié) 蛋白-1亞型、和(ii)其他的尤其是用于治療神經(jīng)性疾病(尤其是與認(rèn)知相關(guān)的神經(jīng)性疾 病)的藥物。此外,本發(fā)明另一方面為重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型用于制備增強(qiáng)記憶 和認(rèn)知的藥物的用途。此外,本發(fā)明另一方面為治療神經(jīng)性疾病的方法,包括給有需要的受試者施用藥 學(xué)有效量的重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型。此外,本發(fā)明另一方面為增強(qiáng)記憶和認(rèn)知的方法,包括給有需要的受試者施用藥 學(xué)有效量的重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型。此外,本發(fā)明另一方面為共施用重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型與其他藥物。據(jù)本發(fā)明可知,可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型已被證明對(duì)治療神經(jīng)性疾病(尤其是 疾病(如精神障礙(如精神分裂癥、雙相型障礙和抑郁型)、神經(jīng)退行性疾病(如帕金森氏 癥、阿爾茨海默氏癥、多發(fā)性硬化(MS)、或肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、癲癇)或神經(jīng)性損傷 (如中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷以及脊髓損傷)))有效。優(yōu)選治療精神分裂癥,特別是精神分裂癥 的認(rèn)知相關(guān)方面、帕金森氏癥和阿爾茨海默氏癥。另外,本發(fā)明還涉及重組的可溶性神經(jīng)調(diào) 節(jié)蛋白-1亞型用于增強(qiáng)記憶和認(rèn)知,特別是用于減少和/或抑制與神經(jīng)性疾病(如阿爾茨 海默氏癥和精神分裂癥)相關(guān)的記憶和認(rèn)知缺失的用途。所述重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型優(yōu)選為人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型,即包含 天然的人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型的一級(jí)氨基酸序列或與重組亞型全長(zhǎng)具有至少90%的同一性,優(yōu)選至少95%的同一性,及最優(yōu)選至少98%的同一性的序列的重組亞型。本發(fā)明的可溶性重組神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型優(yōu)選包含相應(yīng)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1胞外結(jié) 構(gòu)域的至少一部分(如人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(如人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 β)胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部 分)。本發(fā)明的重組可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白亞型的長(zhǎng)度優(yōu)選達(dá)250個(gè)氨基酸(如150 250個(gè)氨基酸)。例如通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)測(cè)定的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白亞型的分 子量?jī)?yōu)選為約15KD 約35KD,尤其為約25KD 約32KD。重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白_1 亞型(尤其為重組的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 β亞型)的等電點(diǎn)(Pl)為約4 約9. 5,優(yōu)選為約 4 約6。該亞型可為由未修飾的氨基酸序列構(gòu)成的未修飾多肽或經(jīng)修飾多肽,其中所述修 飾可選自磷酸化、糖基化、甲基化、十四烷基化、氧化及它們的任意組合。在特別優(yōu)選的實(shí) 施方式中,神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-ι亞型包含至少一個(gè)磷酸化的氨基酸殘基。另外,本發(fā)明包含綴 合異源部分,如聚(環(huán)氧烷烴)部分,特別是聚乙二醇部分。該重組的可溶性亞型可通過(guò)任何可有效遞送到目標(biāo)組織(如神經(jīng)系統(tǒng),特別是中 樞神經(jīng)系統(tǒng),如腦和/或脊髓)的途徑施用。已發(fā)現(xiàn),神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白亞型的藥學(xué)有效濃度可 通過(guò)全身給藥達(dá)到。例如,該亞型可通過(guò)注射或輸液(如靜脈注射)施用。該亞型可根據(jù)待 治療疾病的類型和嚴(yán)重程度,優(yōu)選以0. 1 5000ng/kg待治療受試者體重的量,尤其以2 lOOOng/kg待治療受試者體重的量,及更尤其以3 600ng/kg待治療受試者體重的量施用。 在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中,該可溶性亞型還可局部施用,如通過(guò)直接施用于中樞神經(jīng)系 統(tǒng)(如脊髓和/或腦)。還可考慮通過(guò)腹膜內(nèi)注射或皮下注射或吸入設(shè)備以達(dá)到500 μ g/ kg的更高劑量施用。待治療的受試者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物,更優(yōu)選為人患者。該可溶性重組神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型可作為獨(dú)立藥物(即作為單一療法)或組合 藥物(即與其他藥物(特別是其他適合于治療神經(jīng)性疾病的藥物)組合)施用。尤其在治 療阿爾茨海默氏癥和帕金森氏癥、精神分裂癥、雙相型障礙、抑郁癥或其他神經(jīng)性疾病中的 其他藥物的例子是影響兒茶酚胺代謝的化合物、乙酰膽堿脂酶抑制劑,MAO-B-或COMT-抑 制劑,美金剛型通道阻斷劑,多巴胺或血清素受體激動(dòng)劑或拮抗劑,兒茶酚胺或血清素再攝 取抑制劑,以及任何類型的精神抑制藥(如氯氮平、奧氯平或加巴噴丁類藥物)。其他藥物 的其他例是神經(jīng)保護(hù)劑,例如PARP-I抑制劑,如W02006/008118和W02006/008119中所公 開(kāi),所述文獻(xiàn)通過(guò)弓I用并入本文。因此,本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及本文所述的重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞 型與治療精神障礙(如精神分裂癥、雙相型障礙及抑郁癥)的藥物(如奧氮平或氯氮平) 的組合。進(jìn)一步實(shí)施方式涉及重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-ι亞型與治療神經(jīng)退行性疾病 (如帕金森氏癥、阿爾茨海默氏癥、MS或ALS)的藥物的組合。再一實(shí)施方式涉及重組的可 溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型與治療神經(jīng)性損傷(如中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷或脊髓損傷)的藥物 的組合。可通過(guò)將重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型與其他藥物以藥物組合物或試劑盒 的形式共施用來(lái)實(shí)現(xiàn)聯(lián)合治療,其中單個(gè)藥物可分開(kāi)施用或共同施用。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型可為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-II型、II型、III型、IV型、V型或VI型 亞型,優(yōu)選為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 β亞型,神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-Ια亞型或感覺(jué)神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 衍生因子(SMDF)亞型,特別是神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 β亞型,更特別為人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 β亞型。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 β亞型具有穿過(guò)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的活性。正如實(shí)施例中所顯示的一 樣,神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β經(jīng)靜脈注射/腹膜內(nèi)注射后在腦中的優(yōu)秀生物利用度為NRGlii的治 療應(yīng)用鋪平了道路。其抗凋亡、穩(wěn)定髓鞘、抗炎癥特性及與BACE的直接相互作用的組合為治療中風(fēng)、 阿爾茨海默氏癥、MS和精神分裂癥以及其他神經(jīng)性疾病創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。如上所述,本申請(qǐng)包括未經(jīng)修飾的以及經(jīng)修飾的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型(特別是神 經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-Ιβ亞型)的用途。有證據(jù)表明,在神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(特別是其胞外結(jié)構(gòu)域) 的特定氨基酸殘基上發(fā)生翻譯后修飾(像蛋白水解加工、磷酸化和糖基化)。尤其已報(bào)道 了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 可溶性片段的釋放(Buonanno and Fischbach 2001 ;Fischbach2007)。 可能的氧化也已被報(bào)道(Nadri et al. 2007)。本發(fā)明人證明優(yōu)選的具有生理學(xué)活性的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 β亞型包含神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋 白-ι β的胞外結(jié)構(gòu)域或其已經(jīng)翻譯后修飾的一部分。該亞型優(yōu)選被磷酸化修飾,其中1、2、 3個(gè)或者更多個(gè)氨基酸側(cè)鏈殘基(特別是如Tyr、Ser或Thr的有OH-基團(tuán)的側(cè)鏈殘基)被 磷酸化修飾。優(yōu)選的磷酸化位點(diǎn)位于79 82位氨基酸,133 136位氨基酸和/或158 161位氨基酸(根據(jù)Falquet et al.,2002命名)。更優(yōu)選的磷酸化位點(diǎn)位于12 14位氨 基酸,30 32位氨基酸和/或85 87位氨基酸。更潛在的修飾位點(diǎn)是酰胺化位點(diǎn)(優(yōu) 選位于22 25位和/或30 33位);糖基化位點(diǎn)(在150 153位,156 159位和/ 或204 207位);及十四烷基化位點(diǎn)(優(yōu)選位于94 99位,149 154位,168 173位, 175 180位和/或202 207位),以上根據(jù)Falquet et al.,2002命名。以下將使用優(yōu)選的藥物指標(biāo)對(duì)本申請(qǐng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行解釋。精神分裂癥精神分裂癥為一種嚴(yán)重并致殘的精神障礙,具有如幻聽(tīng)、思維混亂以及妄想、情感 缺乏、興趣缺失、感情遲鈍以及冷漠的癥狀。流行病學(xué)、臨床學(xué)、神經(jīng)心理學(xué)以及神經(jīng)生理學(xué) 研究提供了實(shí)質(zhì)性的證據(jù),證明腦發(fā)育以及持續(xù)的神經(jīng)成型異常在其發(fā)病機(jī)理中扮演著重 要的角色(Arnold et al. 2005)。認(rèn)為精神分裂癥包括多巴胺能神經(jīng)傳遞障礙,而由谷氨酸能神經(jīng)傳遞調(diào)節(jié)多巴胺 能系統(tǒng)則扮演著重要的角色。此觀點(diǎn)得到神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白和dysbindin基因(其對(duì)谷氨酸 能系統(tǒng)具有功能性影響)的遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)的支持(Muller and Schwarz 2006)。變得越來(lái)越 明晰的是,現(xiàn)象表明,可能包含有導(dǎo)致精神分裂癥的基因(包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)的多個(gè)區(qū) 域也與雙相情感障礙有關(guān),此發(fā)現(xiàn)得到最近兩篇文章的支持(Farmer et al. 2007 ;Owen et al. 2007)。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1,其是精神病易患基因,作用于神經(jīng)元遷移、軸突導(dǎo)向與髓鞘的形 成,可潛在解釋精神分裂癥和雙相型障礙中異常的解剖學(xué)與功能連接的發(fā)現(xiàn)(Mcintosh et al. 2007)。有越來(lái)越多的重要證據(jù)證明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1與精神分裂癥之間存在基因上的聯(lián) 系(綜述Farmer et al. ,2007)。本文提到了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白_1引起的谷氨酸鹽、GABA以 及煙堿神經(jīng)傳遞的增強(qiáng)(Fischbach2007 ;Woo et al. 2007 ;Li et al. 2007)并暗示了與腦 炎相關(guān)聯(lián)(Hanninen et al. 2007)。
推測(cè)3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A還原酶(膽固醇生物合成的限速酶(Pertusa et al.2007))的調(diào)節(jié)(對(duì)于髓鞘形成重要)也與所述疾病相關(guān)。事實(shí)上,在精神分裂癥、雙相型障礙以及抑郁癥共同的遺傳危險(xiǎn)基因中,NRGl扮演 了重要的角色,提示涉及這些精神病的基因(如NRG-1)可為以生物學(xué)為基礎(chǔ)而不是按癥狀 對(duì)疾病進(jìn)行分類,從而針對(duì)這些復(fù)雜的腦部疾病開(kāi)辟出新的治療方法提供基礎(chǔ)(Blackwood etal. 2007 ;Bertram et al. 2007)。本申請(qǐng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了在精神分裂癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭惺┯每扇苄灾亟M神經(jīng)調(diào)節(jié) 蛋白-1β的效力。阿爾茨海默氏癥在本發(fā)明人最初的研究顯示,相比年齡相配的對(duì)照,阿爾茨海默氏癥患者的死后 腦海馬切片中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白ι β減少(Sommer et al.,2004),證明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1的可溶 性片段與徑向迷宮測(cè)試的學(xué)習(xí)表現(xiàn)之間存在著明顯的正向關(guān)聯(lián)(Sommer et al.,2004)。有許多報(bào)道證實(shí)NRG-I在活性依賴型突觸變化中的作用(Xie etal. 2006 ;Kwon et al. 2005 ;Rimer et al. 2005 ;Bao et al. 2004 ;Yang etal. 2005),對(duì)于學(xué)習(xí)和記憶重要 (Ozaki et al. 1997 ;Ozaki et al. 2004 ;Golub et al. 2004 ;Schillo et al. 2005b)。正 如下面所顯示的,含胞外結(jié)構(gòu)域的NRGl β片段與行為動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)明顯相關(guān)。相比年齡 相配的對(duì)照,阿爾茨海默氏癥患者死亡后海馬區(qū)(負(fù)責(zé)短期記憶的形成)腦切片中蛋白表 達(dá)顯示出減少表明,在明顯仍健康的神經(jīng)元區(qū)中缺乏與記憶相關(guān)的突觸活性。最新發(fā)現(xiàn)(Huet al. 2006 ;Glabe 2006 ;Schubert 2006)顯示,NRGl 可被 BACE1(= β分泌酶)(使患阿爾茨海默氏癥的人腦中產(chǎn)生淀粉樣蛋白β的團(tuán)塊的酶) 的加工,這便解釋了其與阿爾茨海默氏癥之間的聯(lián)系及其在與NRGl的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性質(zhì)相 關(guān)的髓鞘形成中的伴隨作用(Hu et al. ,2006 ;Glabe 2006 ;Schubert 2006)。需要酶 BACEl (β-位點(diǎn)淀粉樣前體蛋白-切割酶1)來(lái)從較大的前提切割淀粉樣蛋白。在經(jīng) BACEl介導(dǎo)切割后,含有早老素的復(fù)合物γ分泌酶對(duì)其進(jìn)行最終切割,并釋放出淀粉樣蛋 白-β。由分泌酶對(duì)NRG的切割對(duì)于神經(jīng)髓鞘形成至關(guān)重要。正如淀粉樣蛋白前提蛋白, 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1也被β分泌酶切割。β分泌酶對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1的水解切割對(duì)于外周神 經(jīng)中雪旺氏細(xì)胞的髓鞘形成至關(guān)重要。靶向β分泌酶的藥物可以影響到外周神經(jīng)的發(fā)育 與功能。最初,Haass工作組(Willem et al. 2006)觀測(cè)到并發(fā)現(xiàn)了 BACEl也為髓鞘形成 所需。外周神經(jīng)的髓鞘形成在始于生命早起,故尚不清楚BACEl的抑制如何影響更年長(zhǎng)動(dòng) 物。有跡象表明,BACEl還在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成中發(fā)揮作用。BACE-I有缺陷的轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物在外周神經(jīng)中具有鞘磷脂缺陷。最近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1引起的谷氨酸鹽、GABA以及煙堿酸神經(jīng)傳遞的增強(qiáng) (Fischbach 2007 ;Woo et al. 2007 ;Li et al.2007)也與神經(jīng)退行和阿爾茨海默氏癥有關(guān)。本申請(qǐng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明施用可溶性重組神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 β亞型對(duì)阿爾茨海默氏 癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷男Я?。中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷
美國(guó)獨(dú)立擴(kuò)展研究的一系列與中風(fēng)有關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(本身 是抗凋亡劑)的神經(jīng)保護(hù)作用(Xu et al.,2004,2005和2006 ;Guo et al.,2006)。NRG-I可減少神經(jīng)損傷并改善大腦中動(dòng)脈閉塞(常用的中風(fēng)模型)后的神經(jīng)性結(jié) 果(Xu et al. 2005b ;Xu et al. 2004 ;Xu et al. 2006 ;Guo et al. 2006)。在有關(guān)重組的人NRG-I在減弱缺血/再灌注造成的腦損傷中的治療效力和機(jī)制的 相同研究中發(fā)現(xiàn),NRG是抗凋亡劑。在大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)及隨后的灶性腦缺血90分 鐘,以及再灌注24小時(shí)前10分鐘血管內(nèi)應(yīng)用NRG-I (3. Ong/kg)。本發(fā)明的數(shù)據(jù)證明,以低濃度施用重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型,即可起到 顯著的藥效,因此,推測(cè)其對(duì)中風(fēng)以及創(chuàng)傷性腦損傷模型有效。附圖簡(jiǎn)述以下將通過(guò)下文給出的圖及實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行更詳細(xì)解釋。圖1 對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1的各種綜述和眾多研究文章顯示,NRGl作為一種重要的上 游調(diào)控元件,在神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)障礙以及生理功能的機(jī)制上扮演著重要的角色NRG為一種功能復(fù)合物的關(guān)鍵部分,該復(fù)合物至少包括神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)、受體 酪氨酸激酶(ErbB受體),硫酸乙酰肝素蛋白多糖(h印aransulfate proteoglycans, HSPG) 以及NMDA受體(NMDAR),它們短暫地并依賴活性地組裝于富含膽固醇(CHO)的膜微區(qū)。尤其 是,鈣信號(hào)的整形對(duì)通過(guò)翻譯后修飾與突觸支架蛋白間的相互作用(PSD-95,與特定的磷酸 化結(jié)構(gòu)域(如伴侶蛋白上的PDZ-或SH-結(jié)構(gòu)域)相互作用)重要。PSD-95復(fù)合物直接調(diào) 節(jié)促炎癥酶(如一氧化氮合酶(N0S,iN0S是可誘導(dǎo)型,nNOS為神經(jīng)源型)和Cox-2 (環(huán)氧合 酶-2)),其提高與相關(guān)(但非必需)下游機(jī)制(涉及NAD+-依賴型酶(如PARP-I (聚-ADP-核 糖聚合酶_)和Sir-2(SirtUin-2)))的復(fù)雜關(guān)系中的其作用;PARG是聚(ADP-核糖)糖水 解酶,與RARP-I相互補(bǔ)且拮抗的酶;HDAC為組蛋白去乙?;?包括Sir_2在內(nèi)的一大類 酶)。MPTP為線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔。DRP-2為二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2。還有其他重要的膜 蛋白(如特定煙堿乙酰膽堿受體(nAChRα 7),GABAa受體(GABAaR)、淀粉樣前提蛋白(APP) 以及蛋白酶(PS))短暫在脂筏中組織,并在通常的磷脂(PL)環(huán)境外獲得不同的功能特性, 細(xì)節(jié)見(jiàn)(Schrattenholz andSoskic 2006)。圖2 =Morris水迷宮學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的總結(jié)每日使用3ng/kg(靜脈)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋 白-1β (NRG-Ιβ-Ε⑶)的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域處理的動(dòng)物在學(xué)習(xí)上顯著好于使用媒質(zhì)處理 的動(dòng)物;IAE 進(jìn)入內(nèi)區(qū);IAEF 進(jìn)入內(nèi)區(qū)的頻率;TS 在內(nèi)區(qū)耗費(fèi)的時(shí)間;DT 在內(nèi)區(qū)運(yùn)動(dòng)的距離。圖3 =NRG-I β -ECD引起苯丙胺誘導(dǎo)的機(jī)能亢進(jìn)(一種被廣泛認(rèn)可的精神分裂癥 模型)減弱。濃度范圍為15 600ng/kg(在施用苯丙胺前15分鐘經(jīng)靜脈注射)。包括 0. 125mg/kg氟哌啶醇的陽(yáng)性對(duì)照。然而正如其他非經(jīng)典的以及經(jīng)典的抗精神病藥物一樣, 氟哌啶醇通常會(huì)將活性降到對(duì)照水平以下(以標(biāo)有veh/veh的虛線表示,藍(lán)色的為橫越情 況,洋紅色為進(jìn)食情況)。NRG-I β -E⑶將活性逐漸降低至接近對(duì)照組水平,但并未引起更 進(jìn)一步的降低。NRG-I β -ECD的低有效濃度及無(wú)負(fù)面作用(活性降至低于媒質(zhì)對(duì)照水平) 是本模型的出色的特點(diǎn)。效果以P <0.05顯著。圖4 在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,用腦淀粉樣病變與阿爾茨海默氏癥的APPPS型小 鼠模型的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的總結(jié)每天經(jīng)腹膜內(nèi)注射200ng/kg NRG-I β -ECD治療的動(dòng)物在學(xué)習(xí)上顯著好于經(jīng)媒質(zhì)治療的動(dòng)物;IAE 進(jìn)入內(nèi)區(qū);IAEF 進(jìn)入內(nèi)區(qū)的頻率;TS 在內(nèi)區(qū)耗費(fèi)的 時(shí)間;DT 在內(nèi)區(qū)運(yùn)動(dòng)的距離。圖5 多巴胺及其代謝物的HPLC定量使用星號(hào)標(biāo)記的欄為高度顯著。圖例 S 鹽(對(duì)照)aM急性 MPTPaMN急性 MPTP 和 NRG-1 β -ECDaN急性 NRG-I β -ECDcM慢性 MPTPcMN慢性 MPTP 和 NRG-1 β -ECDcN慢性 NRG-I β -ECD圖6 由MAO-B和COMT的多巴胺代謝。圖7 =MPTP接觸引起黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的顯著損失(aMPTP,ρ = 0. 0005 ;且 cMPTP,p = 0. 0075)。腹膜內(nèi)施用 20ng/kgNRG_l β -ECD 引起 MPTP 損傷的反轉(zhuǎn)(aNR-MPTP ; P = O. 57,即,與媒質(zhì)對(duì)照無(wú)差異)或明顯和顯著的改善(cNR-MPTP ;ρ = 0. 0097);在慢性 模型(連續(xù)5天腹膜內(nèi)施用20ng/kg的NRG-I β-E⑶)中,也有對(duì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的顯 著影響(cNR φ = 0. 0002)。圖例 NaCl 鹽(對(duì)照)aMPTP 急性 MPTPaNR-MPTP 急性 MPTP 禾口 NRG-1 β-ECDaNR急性 NRG-1 β -ECDcMPTP 慢性 MPTPcNR-MPTP 慢性 MPTP 禾口 NRG-1 β-ECDcNR 慢性 NRG-I β -ECD圖8:具有代表性的兩張對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行染色的APPPS小鼠腦蛋白的 2D-蛋白印跡圖,經(jīng)治療的,并且學(xué)習(xí)狀況良好的動(dòng)物(上圖),以及未經(jīng)治療的,學(xué)習(xí)表現(xiàn) 較差的(下圖)。上半部中的數(shù)值為2D膠中的pi值。圖9 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)比較了阿爾茨海默氏癥患者和對(duì)照的死后皮層材料中的 NRG-I β ECD片段豐度。圖10 :2D-PAGE顯示,在這些實(shí)驗(yàn)中,NRG-1 β -ECD的酸性亞型(pi約為5 5. 5, 分子量約為25 32kD)在阿爾茨海默氏癥患者的腦中明顯減少。
實(shí)施例MM在以下實(shí)驗(yàn)中使用了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 β片段,其僅包含人nrg-1基因的整個(gè)轉(zhuǎn)錄 本的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)。依據(jù)磷酸化和/或糖基化狀態(tài),其分子量約為25 32kD,且等電 點(diǎn)介于約5和9. 5之間。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型的生理活性形式具有約5. 5的pi。所述生理活性形式具有 約5. 5的pi (大部分實(shí)驗(yàn)使用由大腸桿菌生產(chǎn)的,分子量約為26kD,pi約為9. 0的商品化亞型進(jìn)行)。本亞型為重組的可溶性NRG-I β片段,其由NRG-I β的前245個(gè)氨基酸組成,購(gòu)自 R&D system公司(產(chǎn)品號(hào)377-HB_CF)。在下文中將稱其為NRG-1 β-E⑶。該活性亞型的 Pl值約為9.0。我們還測(cè)試了相對(duì)應(yīng)的僅含EGF結(jié)構(gòu)域的8kD的NRG-1 β片段,購(gòu)自R&D system 公司(產(chǎn)品號(hào)396-HB)。該片段在體內(nèi)及體外均表現(xiàn)出較好的神經(jīng)保護(hù)作用,但由于其甚 更高的增殖性(引起患癌癥的擔(dān)心)而未深入研究。棚列1 截鴨·_表日月NRGl β (ECD) &浦夕卜麵_
試中無(wú)負(fù)面作用。 在大鼠中未出現(xiàn)急性靜脈毒性所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍然存活。在研究的過(guò) 程中未見(jiàn)臨床體征。動(dòng)物體重在該系與年齡的通常記錄范圍內(nèi)。在尸檢中未記錄肉眼可辨 的發(fā)現(xiàn)。在對(duì)雌性大鼠單次靜脈注射后觀測(cè)14天的NRGl β (ECD)的半數(shù)致死量為雌 件大鼠)大于5000ng/kg體重。 連續(xù)7天以50、200、600ng/kg體重/天的劑量靜脈施用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不導(dǎo)致任
何早產(chǎn)兒死亡。記錄沒(méi)有臨床體征。治療不影響采食量以及體重。在600ng/kg體重/天 處建立了最大無(wú)作用水平(NOEL)。參 f艮據(jù) OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 476 "Invitro Mammalian Cell Gene Mutation Test”,使用細(xì)胞系L5178Y的小鼠淋巴瘤胸苷激酶位點(diǎn)測(cè) 試中,NRGl β (ECD)是非誘變劑。 根據(jù)OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 473,在中國(guó)倉(cāng)鼠V79 細(xì)胞中的染色體畸變測(cè)試中,NRGl β (ECD)不引起染色體結(jié)構(gòu)畸變。此外,未在任何就效力進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中(其中的一些經(jīng)每日靜脈施用持續(xù)了幾 個(gè)月)觀測(cè)到NRGl β (ECD)的負(fù)面作用。下述在各種動(dòng)物模型中NRGl β (Ε⑶)的施用通過(guò)靜脈(iv)注射或腹膜內(nèi)(ip)注 射進(jìn)行;濃度范圍為3 600ng/kg。實(shí)施例2 學(xué)習(xí)與記憶使用及不使用NRG-I β -ECD施用的空間學(xué)習(xí)方法使用Morris水迷宮來(lái)評(píng)估空間學(xué)習(xí)。其要求動(dòng)物在充滿水的水池中游泳,并找到 恰好沒(méi)于水面下的救生平臺(tái)。要求平臺(tái)需要置于遠(yuǎn)離迷宮墻,動(dòng)物有在水面可見(jiàn)的使估計(jì) 位置的參考點(diǎn),但不與目標(biāo)接近到可允許聯(lián)想學(xué)習(xí)。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練為僅可通過(guò)平臺(tái)方可 獲救,也就是說(shuō),將所有未發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的動(dòng)物引導(dǎo)至該平臺(tái),并在被從設(shè)施上取走前允許其在 平臺(tái)休息。因此,對(duì)小鼠最重要的參考點(diǎn)之一即操作人員。本實(shí)驗(yàn)旨在確定與鼠空間回憶相關(guān)的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù),即 小鼠學(xué)習(xí)找到平臺(tái)的速度 短期內(nèi)記憶信息的能力(在訓(xùn)練期間或過(guò)夜)動(dòng)物本研究用兩組 APP/PS 小鼠進(jìn)行(Meyer-Luehmann et al. 2006 ;Radde et al. 2006),一組每日用NRG-I β -E⑶治療而另一組經(jīng)假治療作為對(duì)照。每組由8只在第一 組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)9周齡的雄性小鼠組成。
第一組實(shí)驗(yàn)在第42周開(kāi)始,將小鼠按8只經(jīng)過(guò)治療,8只未經(jīng)治療分為兩個(gè)小組, 共持續(xù)實(shí)驗(yàn)15天。其他組相同實(shí)驗(yàn)會(huì)在6周,12周等后開(kāi)始。該組實(shí)驗(yàn)的第二小組對(duì)(8只經(jīng)過(guò)治療的與8只未經(jīng)治療的9周齡雄性)在第48 周開(kāi)始,即這些小組實(shí)驗(yàn)較第一小組而言落后6周。用圓形Morris水迷宮來(lái)評(píng)估經(jīng)過(guò)治療的與未經(jīng)治療的APP/PS小鼠學(xué)習(xí)的能力, 所述圓形Morris水迷宮應(yīng)足夠大以提供搜尋空間,同時(shí)又應(yīng)防止小鼠精疲力竭。對(duì)實(shí)驗(yàn)的 每個(gè)細(xì)節(jié)均應(yīng)給予足夠的關(guān)注,以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)設(shè)置盡可能均一。在此實(shí)驗(yàn)中,使用了直徑為120cm的水池,其以總是相同的方向被放置于實(shí)驗(yàn)室 的精確可再現(xiàn)位置。在水池的固定位置放置有一個(gè)白色半透明的,直徑15、10、或5cm的圓 形平臺(tái),其高度剛好到達(dá)水面以下(因此其對(duì)小鼠是不可見(jiàn)的),小鼠可以爬到其上,該圓 盤為在水中唯一可供休息的地方。平臺(tái)涂有易握的薄紗表面以輔助攀爬(見(jiàn)圖11)。為按照下文的要求進(jìn)行救生過(guò)程,圓臺(tái)配備有可以自動(dòng)升降,而無(wú)實(shí)驗(yàn)者直接 操作的裝置。因此,取決于其高度,平臺(tái)是游泳中的小鼠可夠到的,或不是“請(qǐng)求式平 臺(tái)” (Buresova et al. 1985)。平臺(tái)位置總是被設(shè)置在圓形的池中心區(qū),內(nèi)徑和外徑分別為 40cm和 80cm。定 義四個(gè)象限,從而平臺(tái)占據(jù)其中之一的中心區(qū)(靶象限)。關(guān)于平臺(tái)尺寸及位置的進(jìn)一步細(xì) 節(jié)見(jiàn)下文。為確保平臺(tái)位置在整個(gè)組實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確相同,將底座牢固地固定在水池底板,可將 平臺(tái)以最小的空間耐受安置到其上。在平臺(tái)上表面的中心,同樣裝配有伸出水面的提示棒 (近端標(biāo)記),使其在視頻記錄設(shè)備上易見(jiàn),以及在水池中游泳的小鼠易見(jiàn)。在平臺(tái)或攝像 機(jī)均可任意操作后,無(wú)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而僅在平臺(tái)上插有提示棒的情況下先行錄制一段短視頻, 以檢查平臺(tái)的位置。用低脂奶粉使水不透明度。水溫應(yīng)足夠低,以激勵(lì)小鼠盡快找到出口,但又不應(yīng)過(guò) 冷使得小鼠受到損害或精疲力竭。綜合考慮各種因素,在每次實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)控制水溫,并用溫 水或冰片調(diào)節(jié)至18°C。在每個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中,水溫則根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。將四個(gè)遠(yuǎn)端標(biāo)記(不同的簡(jiǎn)單幾何形狀且不同顏色,高約20cm)連接在水池邊緣 上方 20cm,每個(gè)象限一個(gè)。注意在所有的實(shí)驗(yàn)中,將標(biāo)記固定于完全相同的位置。整個(gè)水 池被一白色半透明的布簾遮蓋。燈光昏暗且散射。攝像機(jī)被牢固地安裝于水池中心上方完全垂直的位置,由此水池完全充滿視頻畫 面。至少以PAL分辨率獲得視頻記錄(720 X 576像素,每秒25幀)。視頻使用自動(dòng)追蹤系 統(tǒng)(使隨時(shí)移動(dòng)的動(dòng)物的無(wú)縫檢測(cè))評(píng)估。小鼠使用一種特殊設(shè)備放入水中,該設(shè)備被安裝于一小棒上,使得小鼠可以在指 定位置沿著水池的邊緣進(jìn)入水中,而非由實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入由半透明簾幕組成的空間中。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在每次的實(shí)驗(yàn)中,小鼠在預(yù)先確定的地點(diǎn)被放入到水池中,并讓其游泳60秒鐘。 使用視頻跟蹤系統(tǒng)記錄動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)路徑,并計(jì)算參數(shù)(由此可得出有關(guān)動(dòng)物學(xué)習(xí)能力的結(jié) 論)(最明顯的是,至小鼠第一次接觸到平臺(tái)所用的時(shí)間=“逃逸時(shí)間”;更進(jìn)一步的描述請(qǐng) 見(jiàn)下文)。如果小鼠成功地找到了平臺(tái),則使其在上面休息一小段時(shí)間( 15秒鐘)?;蛘?,在游泳60秒鐘后,由實(shí)驗(yàn)人員引導(dǎo)小鼠找到平臺(tái)并休息 15秒鐘。隨后由實(shí)驗(yàn)人員將 其取走,輕柔的弄干,放回其籠或準(zhǔn)備下次游泳。在每一天的實(shí)驗(yàn)中,于每天早晨對(duì)每只小鼠進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)由連續(xù)的兩 次游泳組成,從非目標(biāo)象限的兩個(gè)不同象限開(kāi)始。每天每次游泳實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確入水點(diǎn)(以及 平臺(tái)位置(如果可應(yīng)用))均隨機(jī)指定,但在當(dāng)天個(gè)小鼠間無(wú)差別。如果小鼠反饋結(jié)果學(xué)習(xí)極其緩慢,則相應(yīng)增加每次實(shí)驗(yàn)的游泳次數(shù)或每天的實(shí)驗(yàn) 次數(shù)(反之亦然)。此外,在許多小鼠系中,較年輕的動(dòng)物學(xué)得非???,所以在4或5天的訓(xùn) 練后,逃逸時(shí)間即可穩(wěn)定在幾秒鐘,僅此在經(jīng)治療以及未經(jīng)過(guò)治療的動(dòng)物間大體相當(dāng)。但是 如果在訓(xùn)練期間逃逸時(shí)間曲線并未達(dá)到飽和,反而單調(diào)下降的話,則其對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估有利。 因此使用了一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),其中隨著訓(xùn)練的進(jìn)行待解決的問(wèn)題將變得越發(fā)困難故在預(yù)先 設(shè)定的幾天中,保持平臺(tái)中心坐標(biāo)不變,而將平臺(tái)用較小的平臺(tái)替代。對(duì)每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立確定 是否需要以及何時(shí)更換平臺(tái),且應(yīng)依據(jù)之前組的結(jié)果。在每組實(shí)驗(yàn)中,小鼠被安排執(zhí)行三種不同類型的任務(wù) 提示位置航行。平臺(tái)使用提示信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記,使小鼠游泳直到找到平臺(tái)。此方 法測(cè)試聯(lián)想學(xué)習(xí),并將小鼠分為學(xué)習(xí)能力盡可能相近的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。此外,在第二以及此后 組實(shí)驗(yàn)中,提示位置航行支持之前組實(shí)驗(yàn)中平臺(tái)位置的消隱信號(hào)回憶。 隱藏平臺(tái)獲得訓(xùn)練。平臺(tái)對(duì)于小鼠不可見(jiàn),且在小鼠進(jìn)行游泳期間位于相同的 位置。本任務(wù)可用于監(jiān)控小鼠回憶起隱藏平臺(tái)的準(zhǔn)確位置的過(guò)程(“空間學(xué)習(xí)”)。 探索實(shí)驗(yàn)。在本任務(wù)中,將請(qǐng)求式平臺(tái)降到水表面下,并使小鼠通過(guò)自由游泳來(lái) 尋找該平臺(tái)。探索實(shí)驗(yàn)用來(lái)評(píng)估動(dòng)物的絕對(duì)記憶,在本文中還可以將其解釋為有關(guān)平臺(tái)位 置的確信、堅(jiān)持或確定性。對(duì)本實(shí)驗(yàn)比較常規(guī)的解釋是,對(duì)于平臺(tái)位置有著確定記憶的動(dòng) 物,將更堅(jiān)持在限定位置中進(jìn)行搜尋,從而在平臺(tái)附近區(qū)域耗費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間。 在探索實(shí)驗(yàn)中,有無(wú)法找到平臺(tái)而游向平臺(tái)區(qū)的動(dòng)力下降的危險(xiǎn)。為盡可能的 減少這種刺激,應(yīng)保證人營(yíng)救的方式不變,以確保在平臺(tái)不存在的情況下空間狀況的一致 性。而在游泳60秒鐘后,將平臺(tái)升到恰恰位于水面以下的位置,并由實(shí)驗(yàn)者將小鼠引導(dǎo)到 平臺(tái)處,并在將其取走前允許小鼠在上方休息約15秒鐘。在每天的探索實(shí)驗(yàn)中,只允許進(jìn)行一次游泳實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)前約60分鐘,對(duì)小鼠每天施用5ng/kg的NRG_1 ^ -EOT (懸浮于黑色6小 鼠血清中,按每只20 y L的體積靜脈注射提供)或者靜脈注射20 y L的媒質(zhì)。在第一組實(shí)驗(yàn)的第1天中,所有的小鼠均僅接受假治療。然后將小鼠分成神經(jīng)調(diào) 節(jié)蛋白組與對(duì)照組,從而逃逸時(shí)間分布在兩組中匹配。在每組實(shí)驗(yàn)中隨附如下時(shí)間表第1天提示平臺(tái)搜索,使用尺寸10cm,并在每次游泳時(shí)改變位置的平臺(tái)。第2天提示平臺(tái)搜索,使用尺寸10cm,并在每次游泳時(shí)改變位置的平臺(tái)。第3天提示平臺(tái)搜索,使用尺寸10cm,并在每次游泳時(shí)改變位置的平臺(tái)。第4天提示平臺(tái)搜索,使用尺寸10cm,且與第三天最后一次位置相同的平臺(tái)。第5天隱藏平臺(tái)搜索,使用尺寸15cm,且相同位置的平臺(tái)。第6天隱藏平臺(tái)搜索,使用尺寸15cm,且相同位置的平臺(tái)。第7天隱藏平臺(tái)搜索,使用尺寸15cm,且相同位置的平臺(tái)。
第8天隱藏平臺(tái)搜索,使用尺寸10cm,且相同位置的平臺(tái)。第9天探索實(shí)驗(yàn)。第10天隱藏平臺(tái)搜索,使用尺寸10cm,且相同位置的平臺(tái)。第11天隱藏平臺(tái)搜索,使用尺寸10cm,且相同位置的平臺(tái)。第12天隱藏平臺(tái)搜索,使用尺寸5cm,且相同位置的平臺(tái)。第13天隱藏平臺(tái)搜索,使用尺寸5cm,且相同位置的平臺(tái)。第14天隱藏平臺(tái)搜索,使用尺寸5cm,且相同位置的平臺(tái)。第15天探索實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前,需要通過(guò)使小鼠在無(wú)平臺(tái)存在下自由游泳若干天,以幫助不從之前的 實(shí)驗(yàn)設(shè)置中學(xué)習(xí)平臺(tái)位置。學(xué)習(xí)速率通過(guò)監(jiān)控以下指標(biāo)來(lái)進(jìn)行評(píng)估每一訓(xùn)練/測(cè)試階段,并記錄動(dòng)物找到 平臺(tái)的成功率,及其搜索策略的演變,即從沿水池邊緣游泳到遠(yuǎn)離邊緣到在有平臺(tái)的中心 區(qū)附近搜索的演變。測(cè)量的參數(shù)從動(dòng)物的視頻記錄中提取每只小鼠的運(yùn)動(dòng)路徑,并按一系列x,y,以及時(shí)間坐標(biāo)輸 出以供進(jìn)一步的處理。小心仔細(xì)地辨認(rèn)每條移動(dòng)路徑的起始點(diǎn),并避免移動(dòng)路徑錯(cuò)誤。同 時(shí),對(duì)大量參數(shù)進(jìn)行計(jì)算,由此得到與動(dòng)物學(xué)習(xí)能力相關(guān)的結(jié)論(見(jiàn)下)。60秒鐘后或當(dāng)小 鼠找到平臺(tái)時(shí)(以較早發(fā)生者計(jì))則停止記錄參數(shù)。作為待從動(dòng)物的移動(dòng)路徑記錄中計(jì)算 的參數(shù)的定義,定義以下區(qū)域(見(jiàn)圖12)為保證評(píng)估盡可能的靈活,應(yīng)用了直徑5. 5 30cm的4個(gè)同心的靶區(qū)(以平臺(tái)為 中心)。自動(dòng)物移動(dòng)路徑記錄計(jì)算得到的參數(shù)包括 運(yùn)動(dòng)總距離 總平均速度 進(jìn)入水池中心的數(shù)量 在水池中心中的時(shí)間 第一次進(jìn)入水池中心所用的時(shí)間 第一次進(jìn)入水池中心所運(yùn)動(dòng)的距離 進(jìn)入內(nèi)區(qū)的數(shù)量 在內(nèi)區(qū)中的時(shí)間 在內(nèi)區(qū)中運(yùn)動(dòng)的距離 第一次進(jìn)入內(nèi)區(qū)所用的時(shí)間 第一次進(jìn)入內(nèi)區(qū)所運(yùn)動(dòng)的距離以及靶區(qū)1 4以及靶象限中運(yùn)動(dòng)的距離 進(jìn)入?yún)^(qū)的數(shù)量 在區(qū)中的時(shí)間 在區(qū)中運(yùn)動(dòng)的距離 第一次進(jìn)入?yún)^(qū)所用的時(shí)間 第一次進(jìn)入?yún)^(qū)所運(yùn)動(dòng)的距離 從移動(dòng)路徑起點(diǎn)到最接近區(qū)的點(diǎn)的距離 在區(qū)外時(shí),距離區(qū)的平均距離
在區(qū)外時(shí),距離區(qū)的最短距離 在區(qū)外時(shí),距離區(qū)的最短距離所需時(shí)間 接近區(qū)的時(shí)間 遠(yuǎn)離區(qū)的時(shí)間 朝向區(qū)移動(dòng)的時(shí)間 遠(yuǎn)離區(qū)移動(dòng)的時(shí)間 頭部進(jìn)入?yún)^(qū)的數(shù)量 頭部在區(qū)中的時(shí)間 頭部在區(qū)中移動(dòng)的距離 第一次頭部進(jìn)入?yún)^(qū)前所用時(shí)間 在區(qū)外時(shí),頭部距區(qū)的平均距離 在區(qū)外時(shí),頭部距區(qū)的最小距離 初始朝向的錯(cuò)誤 平均朝向的錯(cuò)誤 從區(qū)出來(lái)的數(shù)量每天的實(shí)驗(yàn)均對(duì)經(jīng)治療組與未經(jīng)治療組小鼠學(xué)習(xí)進(jìn)展的參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。在對(duì)單個(gè)小鼠移動(dòng)路徑的記錄檢測(cè)中,觀測(cè)人員能夠?qū)Σ荒苡蓽y(cè)定的參數(shù)值完全 反應(yīng)的動(dòng)物自主尋找平臺(tái)有相當(dāng)現(xiàn)實(shí)的理解。因此,還要由人工對(duì)移動(dòng)路徑進(jìn)行檢測(cè),并將 動(dòng)物對(duì)平臺(tái)位置的記憶相關(guān)聯(lián)。MM在每天訓(xùn)練前30分鐘靜脈注射3ng/kg NRG-1 ^ -EOT的動(dòng)物在學(xué)習(xí)相關(guān)的參數(shù)方 面顯著好于媒質(zhì)治療組。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不僅改善了學(xué)習(xí)狀況,經(jīng)治療的動(dòng)物還發(fā)展出更高級(jí)的搜索策略 更多的治療組動(dòng)物進(jìn)入水池內(nèi)區(qū)(11比7,p = 0.019),進(jìn)入內(nèi)區(qū)的次數(shù)更為頻繁(2.17比 0. 92次,p = 0. 02),在內(nèi)區(qū)耗費(fèi)的時(shí)間以及在內(nèi)區(qū)移動(dòng)的距離更長(zhǎng)(分別為6. 51秒鐘比 2. 13 秒鐘,p = 0. 09 以及 0. 64m 比 0. 25m, p = 0. 031)。在Morris水迷宮中進(jìn)行學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)于圖2。實(shí)施例3 精神分裂癥大鼠中由苯丙胺誘導(dǎo)的機(jī)能亢進(jìn)方法根據(jù)Costall et al. 1978的檢測(cè)精神抑制活性以及抗帕金森氏癥活性的方法使 用類似于Boissier及Simon 1966所述的活性測(cè)定儀。在本測(cè)試中苯丙胺誘導(dǎo)機(jī)能亢進(jìn)。機(jī)能亢進(jìn)由以邊緣水平作用于多巴胺能系統(tǒng)的 典型的和非典型的抗精神病藥物拮抗,并可作為一種潛在的抗帕金森氏癥的藥物。對(duì)大鼠注射d-苯丙胺(3mg/kg,靜脈),并立即放置于活性測(cè)定儀中。該活性測(cè)定儀由包含于暗箱內(nèi)的12個(gè)帶蓋的樹(shù)脂玻璃的籠子(40X25X25cm)組 成。在每個(gè)籠子兩端各裝有一個(gè)光電管部件,距底面高3cm,以便測(cè)定各動(dòng)物(1只/籠)的 從籠子一端運(yùn)動(dòng)到另一端的運(yùn)動(dòng)次數(shù)。在距底面20cm出還安裝有兩個(gè)光電管部件,以便記 錄進(jìn)食情況。由計(jì)算機(jī)每10分鐘記錄一次活躍度與進(jìn)食的評(píng)分,累計(jì)30分鐘。研究每組15只大鼠。進(jìn)行盲測(cè)。
評(píng)估了苯丙胺前15分鐘靜脈施用的8個(gè)劑量的測(cè)試物質(zhì),并與媒質(zhì)對(duì)照組進(jìn)行比 較。本實(shí)驗(yàn)還包括了一個(gè)未經(jīng)苯丙胺處理的對(duì)照組。將在相同的實(shí)驗(yàn)條件下施用的氟哌啶醇(0. 125mg/kg,靜脈)作為參照物質(zhì)。因此,本實(shí)驗(yàn)共包括16組。通過(guò)用非對(duì)稱t檢驗(yàn)比較經(jīng)治療組與合適的對(duì)照來(lái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果正如圖3中所示,NRG-1 0 -EOT以劑量依賴型方式抑制精神分裂癥動(dòng)物模型中苯 丙胺引起的機(jī)能亢進(jìn)。實(shí)驗(yàn)很明顯的顯示出NRG-1 0 -EOT的出色特性 圖3中顯示的效果在實(shí)驗(yàn)的后半部分(20分鐘 40分鐘)最強(qiáng)。在前20分鐘 中,僅僅可見(jiàn)較少的效果,這種延遲的效果表明蛋白的進(jìn)一步加工。 所用NRG-10-E⑶的有效濃度比所用經(jīng)典的對(duì)照精神抑制藥(如氟哌啶醇 (125u g/kg))低了約 200 1000 倍。 與氟哌啶醇、氯氮平,奧氮平等相反,未見(jiàn)NRG-1 0 -EOT存在負(fù)面作用,即將實(shí) 驗(yàn)組動(dòng)物活性降至媒質(zhì)對(duì)照水平以下。實(shí)施例4 精神分裂癥前沖動(dòng)抑制經(jīng)敲除NRG1基因的嚙齒動(dòng)物顯示出了顯著受損的前沖動(dòng)抑制(PPI),而將NRG1與 精神分裂癥相聯(lián)系。PPI破壞被認(rèn)為是精神分裂癥的內(nèi)在表型,并被廣泛的用作動(dòng)物模型中 精神病的替代測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)報(bào)道,在精神分裂癥與健康對(duì)照群中,在大量基因型分析后,有 NRG1 (rs3924999)上的非同義單核苷酸多態(tài)性的錯(cuò)義突變對(duì)PPI的神經(jīng)生理學(xué)影響(Hong et al. 2007)。我們測(cè)試了 NRG-1 ^ -EOT對(duì)于PPI的影響。目前得到的結(jié)果總結(jié)如下在105dB 時(shí),NRG-1 ^ -ECD 顯示出重建 PPI 的總體趨勢(shì)(在 150ng/kg、300ng/kg 和600ng/kg時(shí)分別為+26%、+23%和+36,盡管該效果為達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著,且并未在 115dB時(shí)觀察到。在150ng/kg或300ng/kg、缺乏刺激物時(shí)其對(duì)自發(fā)運(yùn)動(dòng)無(wú)影響,但在600ng/ kg、缺乏刺激物時(shí)則顯著降低自發(fā)運(yùn)動(dòng)(在平均強(qiáng)度和峰強(qiáng)度時(shí)分別為-20%和-29%,p < 0. 05,其類似于阿立哌唑)。NRG-1 0 -EOT對(duì)僅前沖動(dòng)的反應(yīng)無(wú)影響。截止目前的結(jié)果提示,在大鼠中進(jìn)行的前沖動(dòng)抑制(PPI)實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于PropsylOO 而言,在藥劑范圍為150 300ng/kg時(shí),對(duì)阿樸嗎啡引起的PPI短缺無(wú)顯著影響;在靜脈注 射600ng/kg時(shí)則會(huì)減弱自發(fā)運(yùn)動(dòng),并趨于重建PPI (由阿樸嗎啡引起短缺)。在這組實(shí)驗(yàn)中,在腹膜內(nèi)注射3mg/kg時(shí),參照物阿立哌唑有著弱但顯著的活性, 而在同一測(cè)試中腹膜內(nèi)注射10mg/kg時(shí)則并非如此。總之,在所用條件下,NRG-10-ECD在較高濃度的約600ng/kg表現(xiàn)出影響PPI。這 些結(jié)果對(duì)最近的神經(jīng)生物學(xué)研究中提出了新的解釋,暗示(NRG1)可能為導(dǎo)致精神分裂癥 的重要候選基因之一。實(shí)施例5 對(duì)阿爾茨海默氏癥動(dòng)物模型(APPPS dt小鼠)中的學(xué)習(xí)和記憶對(duì)腦淀粉樣病變的轉(zhuǎn)基因小鼠模型(APPPS小鼠(Meyer-Luehmann et al. 2006 ; Radde et al.2006))重復(fù)了在上述對(duì)正常小鼠進(jìn)行的Morris水迷宮測(cè)試中用和不用可溶 性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白胞外結(jié)構(gòu)域(NRG-10-ECD)測(cè)試學(xué)習(xí)和記憶的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。同上,每日在訓(xùn)練前30分鐘以日劑量的NRG-10-E⑶(在此腹膜內(nèi)應(yīng)用了 200ng/kg)治療的動(dòng)物在與學(xué)習(xí)相關(guān)的參數(shù)上顯著好于媒質(zhì)治療組。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白不僅改善學(xué)習(xí),且經(jīng)治療的動(dòng)物還發(fā)展出更高級(jí)的搜索策略更多 經(jīng)治療的動(dòng)物進(jìn)入到水池的內(nèi)區(qū)(12比7,p = 0. 009);更頻繁地進(jìn)入到內(nèi)區(qū)(2. 0比0. 7 次,p = 0.03);在內(nèi)區(qū)耗費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間并在內(nèi)區(qū)移動(dòng)更長(zhǎng)距離(5. 3秒鐘對(duì)2. 1秒鐘,p = 0.09 以及 0. 7m 對(duì) 0. 3m, p = 0. 025)。在Morris水迷宮中用患腦淀粉樣病變和阿爾茨海默氏癥的APPPS小鼠模型進(jìn)行 的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖4中總結(jié)。實(shí)施例6 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1- 13 MPTP帕金森氏癥小鼠樽型方法使用10周齡的雄性C57B1/6小鼠作為MPTP(1_甲基-4苯基_1,2,3,6-四氫吡 啶)帕金森氏癥的模型。10周齡雄性C57B16小鼠(N = 10只/每組)在使用NaCl (對(duì)照組)或MPTP (急 性以及亞慢性模型)處理后不同時(shí)間(0、1、3、7、21天)解剖腦組織(黑質(zhì)、紋狀體、皮質(zhì))。 方法依照已發(fā)表的方法(Hoglinger et al. 2007 ;Hoglinger et al. 2004)。 總計(jì)N=110將MPTP粉末溶解于0. 9%的NaCl中,腹膜內(nèi)注射(急應(yīng)用4X20mg/kg,間隔時(shí)間 2小時(shí);慢應(yīng)用:5X30mg/kg,間隔時(shí)間24小時(shí))。注射過(guò)程約10秒鐘,并在定義的時(shí)間點(diǎn) (見(jiàn)表)頸椎脫臼處死動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)按照已發(fā)表的步驟(Hoglinger et al. 2007 ;Hoglinger et al. 2004 ;Liberatore et al. 1999 ;Przedborski and Vila 2003 ;Vila andPrzedborski 2003)進(jìn)行。最后一次施用MPTP后0天紋狀體多巴胺能神經(jīng)缺失最后一次施用MPTP后1天開(kāi)始小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化最后一次施用MPTP后3天小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化最大最后一次施用MPTP后7天星形膠質(zhì)細(xì)胞活化最大最后一次施用MPTP后21天細(xì)胞死亡最大在使用Alzet微型泵腦內(nèi)輸注NRG_1 ^ -EOT和對(duì)照肽后21天,進(jìn)行MPTP處理 (急性與慢性),按立體學(xué)原理進(jìn)行中腦多巴胺能神經(jīng)元的組織學(xué)定量。使用HPLC對(duì)紋 狀體中多巴胺及其代謝物進(jìn)行生物化學(xué)定量。實(shí)驗(yàn)按照已發(fā)表的步驟(Hoglinger er et al. 2007 ;Hoglinger et al. 2004)進(jìn)行。 總計(jì)N= 80結(jié)果正如在圖5所示,多巴胺及其代謝物的HPLC測(cè)定結(jié)果顯示,在MPTP發(fā)作期間,對(duì) 帕金森氏癥模型施用NRG-1 0 -EOT的明顯效果。這些作用都是非經(jīng)典的不論在MPTP發(fā)作,還是急性或慢性施用NRG-1 ^ -EOT的 對(duì)照期間,對(duì)多巴胺水平均無(wú)顯著的影響,但對(duì)D0PAC和HVA的濃度則表現(xiàn)出了顯著而明顯 的影響。在無(wú)MPTP發(fā)作時(shí),慢性施用NRG-1 0 -EOT導(dǎo)致其代謝物明顯且顯著降低,而在急 性方案中,僅觀測(cè)到輕微的下降。在MPTP發(fā)作的慢性情況期間,NRG-1 0-ECD導(dǎo)致高香草 酸(HVA)顯著增加,而此作用在無(wú)MPTP發(fā)作的情況下更為明顯。這些結(jié)果可解釋為施用NRG-1 3 -EOT期間MA0-B的下調(diào)和/或C0MT的上調(diào)。在所 應(yīng)用的條件下觀察到對(duì)多巴胺能神經(jīng)元存活的巨大而顯著的正面影響。NRG-1 0 -EOT在本 模型中還有高度的神經(jīng)保護(hù)性。由于本組實(shí)驗(yàn)使用腹膜內(nèi)注射,故再次證明了 NRG-1 0 -EOT 具有高效的穿過(guò)血腦屏障的能力。圖6顯示了似乎受了 NRG-10-E⑶影響的代謝方案多巴胺可經(jīng)MA0-B轉(zhuǎn)化為 D0PAC,以及經(jīng)C0MT轉(zhuǎn)化為3-MT ;隨即由C0MT從D0PAC,及由MA0-B從3-MT這兩種代謝物 產(chǎn)生高香草酸;NRG-1 0 -EOT施用明顯調(diào)節(jié)兩種酶的活性。更為重要的是圖7中顯示的,在MPTP帕金森氏癥模型中,通過(guò)對(duì)中腦多巴胺能 神經(jīng)元的組織學(xué)定量,清晰的顯示出NRG-10-E⑶在神經(jīng)保護(hù)方面明顯而顯著的效果。 立體學(xué)方法的描述見(jiàn)于(Liberatore et al.,1999,Przedborski & Vila,2003 ;Vila &Przedborski,2003 ;H6glinger et al.,2004 ; Hoglinger et al. ,2007)等文章。總而言之,在MPTP帕金森氏癥動(dòng)物模型中有出奇明顯而有益的神經(jīng)保護(hù)功效 所述功效再次證明,以極低濃度腹膜內(nèi)施用NRG-1 0 -E⑶(如20ng/kg)足以達(dá)到功效,且 NRG-1 0 -EOT穿過(guò)血腦屏障。此外,對(duì)多巴胺代謝物的復(fù)雜影響(HPLC結(jié)果;圖5)表明了 NRG-1和NRG-1 3 -ECD對(duì)MA0-B以及C0MT的調(diào)節(jié)作用。
實(shí)施例7 鑒定NRG-1 P -ECD的酸件翻i圣后亞型作為活件物質(zhì)我們已經(jīng)發(fā)表了相關(guān)的證據(jù),表明NRG-1 0 -EOT的特定的翻譯后酸性亞型為學(xué)習(xí) 和記憶中的活性形式(Schillo et al. 2005a)。在阿爾茨海默氏癥的動(dòng)物模型和阿爾茨海 默氏癥及帕金森氏癥患者的死后腦組織中發(fā)現(xiàn)了相似模式。我們得出了該酸性亞型為活性 物質(zhì)的結(jié)論。方法為染色蛋白印跡,我們使用了如下抗體抗-NRG1-E⑶,兔多克隆(sc-28916 Lot I 2905 Santa Cruz ;H-210)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(H_210)為兔多克隆抗體,抗人源神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋 白-1亞型HRG-a的N端胞外結(jié)構(gòu)域中21 230位氨基酸。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白_1(H_210)適 用于通過(guò)蛋白印跡(初始稀釋1 200,稀釋范圍1 100 1 1000),免疫沉淀[1 2iig/100 500iig的總蛋白(1ml細(xì)胞裂解液)]以及免疫熒光發(fā)(初始稀釋1 50, 稀釋范圍1 50 1 500)來(lái)檢測(cè)小鼠、大鼠及人源的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型HRG-a、 HRG- a 1A、HRG- a 2B、HRG- a 3、HRG- 3 1、HRG- 3 2、HRG- 3 3 (GGF)、GGF2 以及 SMDF。第二抗體為抗山羊,HRPsc-2922 Lot :C1405 Santa Cruz抗兔,HRPSc-2054 Lot :G 2005 Santa Cruz在免疫染色后,我們進(jìn)行MALDI-T0F及Q-T0F質(zhì)譜分析來(lái)確定NRG-1 ^ -ECD。如圖8所示,我們?cè)谀X淀粉樣病變以及阿爾茨海默氏癥的APPPS小鼠模型中發(fā)現(xiàn) 了非常相似的模式。在經(jīng)治療的APPPS小鼠中NRG-1 0 -EOT的特定酸性亞型(pi值約為 5.0)的濃度顯著更高,所述在經(jīng)治療的APPPS小鼠也同時(shí)是更好的學(xué)習(xí)者。。在圖8中的兩個(gè)代表圖顯示了經(jīng)治療的、學(xué)習(xí)好的動(dòng)物(上方)以及未經(jīng)治療的, 學(xué)習(xí)表現(xiàn)差的動(dòng)物(下方)。圖9顯示了使用已死亡的9個(gè)阿爾茨海默氏癥患者以及年齡相配的對(duì)照的皮質(zhì)材 料的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其清楚地表明,NRG-10-ECD片段在阿爾茨海默氏癥病例中的豐 度顯著較低。作為內(nèi)部對(duì)照,測(cè)量了不受疾病相關(guān)的記憶喪失影響的NRG-12的豐度。圖9中另一項(xiàng)通過(guò)對(duì)所用相同的死亡后人腦材料的2維凝膠蛋白印跡(2D-PAGE) 來(lái)對(duì)這種特定的與阿爾茨海默氏癥以及與記憶相關(guān)的NRG-1 0 -ECD亞型進(jìn)行的研究如圖 10中的代表性實(shí)施例所示,其的確是在阿爾茨海默氏癥中減少的NRG-1 0 -ECD的酸性亞 型。Mrk我們?cè)诖说谝淮物@示了 nrg-1基因轉(zhuǎn)錄本的翻譯后修飾(尤其是由蛋白水解切割 產(chǎn)生的截短型)(包含NRG-1 0胞外結(jié)構(gòu)域,分子量15 35,pi為4 10)的體內(nèi)作用的 有效證據(jù);更具體地,我們?cè)诰穹至寻Y動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)了可能基于MA0-B與C0MT調(diào)節(jié),在 濃度為5 600ng/kg(靜脈)的精神抑制活性。與以100 1000倍更高濃度使用的對(duì)照 神經(jīng)安定藥相反,未觀察到負(fù)面作用。此外,我們發(fā)現(xiàn)在濃度3 300ng/kg(靜脈)時(shí),對(duì)于MPTP帕金森氏癥模型的神 經(jīng)保護(hù)作用。
此外我們發(fā)現(xiàn)了在相應(yīng)的學(xué)習(xí)、腦淀粉樣病變以及阿爾茨海默氏癥動(dòng)物模型 (Morris水迷宮)中對(duì)記憶與學(xué)習(xí)的正面效果。鑒于許多現(xiàn)在使用的非典型抗精神病藥物的負(fù)面影響(Haddadand Sharma 2007),我們判斷可溶性NRG-1-E⑶片段(具有SMDF的EGF結(jié)構(gòu)域,NRG-1 a,但尤其為 NRG-1 ^ )可能作為單獨(dú)施用或共同施用的,用于治療精神分裂癥、雙相型障礙以及抑郁癥 的藥物。其還可以相同的方式被用于其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,例如神經(jīng)退行性疾病,如阿 爾茨海默氏癥和帕金森氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、多發(fā)性硬化、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷和脊髓 損傷??扇苄訬RG-1-E⑶蛋白具有如此眾多的作用,主要由于其在神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程 (尤其是介導(dǎo)谷氨酸鹽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及興奮性中毒(在上述提到的所有適應(yīng)癥中有起著中心作 用))中所扮演著中心角色(Schrattenholz and Soskic 2006)。參考文獻(xiàn)1. Arnold SE,Talbot K, Hahn CG(2005)Neurodevelopment,neuroplasticity,and new genes for schizophrenia. Prog Brain Resl47 :319_3452. Bao J, Lin H, Ouyang Y, Lei D, Osman A, Kim Tff, Mei L, Dai P, Ohlemiller KK, Ambron RT(2004)Activity-dependenttranscription regulation of PSD-95 by neuregulin-1 and Eos.NatNeurosci 7:1250-12583. 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重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 1亞型用于制備治療神經(jīng)性疾病的藥物的用途。
2.權(quán)利要求1的用途,用于治療精神分裂癥,特別是精神分裂癥的認(rèn)知相關(guān)方面、雙相 型障礙和抑郁癥、帕金森氏癥、阿爾茨海默氏癥、癲癇、MS、ALS、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷以及脊 髓損傷。
3.權(quán)利要求1或2的用途,其中所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型為重組的可溶性人神經(jīng)調(diào)節(jié) 蛋白-1亞型。
4.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)的用途,其中所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋 白-1β亞型、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-Ια亞型或SMDF亞型。
5.權(quán)利要求4的用途,其中所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白亞型。
6.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)的用途,其中所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型至少包含胞外結(jié)構(gòu) 域的一部分。
7.權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)的用途,其中所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型具有通過(guò)SDS-PAGE 測(cè)定的約15kD 約35kD的分子量。
8.權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)的用途,其中所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型的等電點(diǎn)(pi)為 約4 約10,優(yōu)選約4 約6。
9.權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)的用途,其中所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型為經(jīng)修飾的多肽, 其中所述修飾選自磷酸化、糖基化、甲基化、十四烷基化、氧化及它們的任何組合。
10.權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)的用途,與其他藥物聯(lián)用。
11.權(quán)利要求10的用途,其中所述其他藥物是用于治療神經(jīng)性疾病的藥物。
12.權(quán)利要求11的用途,其中在治療阿爾茨海默氏癥和帕金森氏癥、精神分裂癥、雙相 型障礙、抑郁癥或其他神經(jīng)性疾病中的所述其他藥物選自影響兒茶酚胺代謝的化合物、乙 酰膽堿酯酶抑制劑,MAO-B-或COMT-抑制劑,美金剛型通道阻斷劑、多巴胺或血清素受體激 動(dòng)劑或拮抗劑、兒茶酚胺或血清素再攝取抑制劑或者任何類型的精神抑制藥,如氯氮平或 奧氮平或加巴噴丁類藥物。
13.權(quán)利要求10或11的用途,其中所述其他藥物是用于治療精神障礙的藥物,如奧氮 平或氯氮平;所述精神障礙如精神分裂癥、雙相型障礙及抑郁癥。
14.權(quán)利要求10或11的用途,其中所述其他藥物是用于治療帕金森氏癥的藥物。
15.權(quán)利要求10或11的用途,其中所述其他藥物是用于治療阿爾茨海默氏癥的藥物。
16.權(quán)利要求10或11的用途,其中所述其他藥物是用于治療多發(fā)性硬化(MS)的藥物。
17.權(quán)利要求10或11的用途,其中所述其他藥物是用于治療肌萎縮性側(cè)索硬化癥 (ALS)的藥物。
18.權(quán)利要求10或11的用途,其中所述其他藥物是用于治療癲癇的藥物。
19.權(quán)利要求10或11的用途,其中所述其他藥物是用于治療中風(fēng)的藥物。
20.權(quán)利要求10或11的用途,其中所述其他藥物是用于治療創(chuàng)傷性腦損傷的藥物。
21.權(quán)利要求10或11的用途,其中所述其他藥物是用于治療脊髓損傷的藥物。
22.藥物組合物或試劑盒,其包含(i)重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型、以及( )其他的尤其是用于治療神經(jīng)性疾病的藥物。
23.重組的可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型用于制備增強(qiáng)記憶和認(rèn)知的藥物的用途。
24.權(quán)利要求21的用途,用于降低和/或抑制與神經(jīng)性疾病有關(guān)的記憶及認(rèn)知缺失,所 述神經(jīng)性疾病如阿爾茨海默氏癥。
25.權(quán)利要求21或22的用途,其中所述神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型如權(quán)利要求1 9中任 一項(xiàng)所定義。
26.治療神經(jīng)性疾病的方法,包括給有需要的受試者施用藥學(xué)有效量的重組的可溶 性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型。
27.增強(qiáng)記憶和認(rèn)知的方法,包括給有需要的受試者施用藥學(xué)有效量的重組的可溶 性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型。
全文摘要
本發(fā)明涉及到使用以可溶性神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1亞型為代表的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1翻譯后修飾的亞型作為藥物,治療認(rèn)知相關(guān)的神經(jīng)性疾病,尤其是精神分裂癥、阿爾茨海默氏癥以及帕金森氏癥。
文檔編號(hào)A61K38/18GK101903036SQ200880121853
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2008年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日
發(fā)明者A·施拉滕赫爾茲 申請(qǐng)人:普羅迪奧塞斯股份公司