本發(fā)明是一種具有靶向功能的抗菌脂肽復(fù)合物，涉及一種可用于生物醫(yī)藥等方面的材料，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，隨著抗生素的泛用和濫用，致使多重耐藥菌的產(chǎn)生，而多重耐藥菌引起的感染對人類健康造成了嚴重的威脅。更重要地是，抗生素的研發(fā)速度遠遠趕不上細菌耐藥特性產(chǎn)生的速度。為了解決這一難題，研究者采取的主要措施有研制開發(fā)新型抗生素、尋找新的藥物靶點、利用藥物載體系統(tǒng)等。
抗菌肽是宿主防御體系中天然免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的具有一定殺菌效果的短肽類物質(zhì)，具有廣譜抗菌性。很多抗菌肽不僅對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌具有殺滅作用，而且對某些真菌、原生生物、甚至腫瘤細胞和病毒也具有一定的抑制作用。由于抗菌肽的作用主要針對細胞膜結(jié)構(gòu)，普遍認為具有較低的抗藥性，具有廣泛的應(yīng)用前景?；谥|(zhì)體作為載體在藥物研發(fā)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域研究中取得的進展，目前已有多種抗生素藥物制成脂質(zhì)體藥物傳輸系統(tǒng)用于細胞內(nèi)微生物感染，并取得了較好效果。脂質(zhì)體作為抗生素載體具有緩釋藥物、延長藥物作用時間、通過修飾靶向分子可將藥物輸送到病變部位、增強藥物對細胞內(nèi)、外病原體的抗菌活性，減少藥物劑量，避免耐藥性發(fā)生，降低對正常組織的損傷等優(yōu)點。因此，利用抗菌脂肽靶向載體可能是一種有效并且不易產(chǎn)生耐藥性的治療手段，有望輔助或者替代傳統(tǒng)的抗生素治療。
目前基于載體對細菌細胞膜的靶向研究甚少，Neoh等研究表明以葡萄糖、甘露糖單元為趨化劑，在細菌細胞膜糖轉(zhuǎn)運過程中能有效靶定細菌。(Pharm.Res.,2016,33:1161-1174.)擬糖脂技術(shù)在1985年開始發(fā)展起來，目的是為了進行糖蛋白中寡糖結(jié)合活性研究。擬糖脂，即人工合成的糖脂，將寡糖結(jié)合到脂分子而不是蛋白質(zhì)上，使寡糖以簇的形式展示成為可能。通過還原胺化將寡糖與含有磷酸乙醇銨的氨基脂進行化學(xué)結(jié)合，最為常用的氨基脂是二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺。研究者常常以擬糖脂作為生物探針，研究它們與抗體、植物凝集素等蛋白之間的相互作用。然而，究其本源，擬糖脂技術(shù)是將寡糖與脂分子偶聯(lián)的高效技術(shù)，為制備及應(yīng)用含糖基單元的脂質(zhì)體提供了一種新的途徑。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供一種具有靶向功能的抗菌脂肽復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。本
發(fā)明采用抗菌脂肽和擬糖脂復(fù)合脂質(zhì)體提供一種低劑量、高效抗菌且不易產(chǎn)生耐藥性的治療手
段，有望輔助或者替代傳統(tǒng)的抗生素治療。
技術(shù)方案：一種具有靶向功能的抗菌脂肽復(fù)合物，抗菌脂肽復(fù)合物由脂肽和擬糖脂在溶液中自組裝而成，其中，所述的脂肽包含活性肽和疏水鏈段，所述的擬糖脂包含寡糖和疏水鏈段，所述的疏水鏈段均為C12以上飽和脂肪酸脂質(zhì)部分。
所述活性肽的序列為RLARIVVIRVAR、RIWVIWRR、KRWWKWWRR、IRWRIRVWVRRI、KRWRIRVRVIRK、KKWKIVVIKWKK、WIVVIWRRKRRR中的任意一種。
所述寡糖的單糖單元為葡萄糖、甘露糖中的一種。
所述脂肽的疏水鏈段為月桂酸、肉豆蔻酸、或棕櫚酸脂質(zhì)部分的一種。
所述擬糖脂的疏水鏈段為棕櫚酸脂質(zhì)部分。
制備所述的具有靶向功能的抗菌脂肽復(fù)合物的方法，
第一步，合成活性肽：采用Fmoc固相合成法合成活性肽；
第二步，合成脂肽：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺偶聯(lián)活性肽和疏水鏈段得到脂肽；
第三步，還原胺化制備擬糖脂：采用NaCNBH3為還原劑使寡糖和飽和脂肪酸還原胺化得到相應(yīng)的擬糖脂；
第四步，自組裝得到抗菌脂肽復(fù)合物：脂肽和擬糖脂在溶液中自組裝得到抗菌脂肽復(fù)合物。
第三步中的飽和脂肪酸為二棕櫚?；字Ｒ掖及?。
第三步中的寡糖和飽和脂肪酸的物質(zhì)的量之比為32：1。
第四步中的溶液為氯仿甲醇混合溶液。
所述的具有靶向功能的抗菌脂肽復(fù)合物在制備靶向抗菌藥物或材料中的應(yīng)用。
有益效果：
1.本發(fā)明以擬糖脂中糖基單元為趨化劑，在細菌細胞膜糖轉(zhuǎn)運過程中有效靶定細菌細胞膜，由脂肽發(fā)揮抗菌作用，是一種具有靶向功能的抗菌體系。
2.本發(fā)明抗菌脂肽和擬糖脂復(fù)合脂質(zhì)體具有抗菌活性高、作用時間長、劑量低等特點，可避免耐藥性發(fā)生、降低對正常組織的損傷等。
3.本發(fā)明采用擬糖脂技術(shù)將寡糖與脂分子偶聯(lián)，為制備及應(yīng)用含糖基單元的脂質(zhì)體提供了一種新的途徑。
具體實施方式
本發(fā)明由結(jié)構(gòu)相似的脂肽和擬糖脂在溶液中自組裝得到抗菌脂肽復(fù)合物，其中，脂肽包含活性肽和疏水鏈段，擬糖脂包含寡糖和相似的疏水鏈段。本發(fā)明具有靶向功能的抗菌脂肽復(fù)合物由擬糖脂中糖基單元為趨化劑靶定細菌細胞膜，由抗菌脂肽發(fā)揮抗菌作用。
通過固相合成法合成抗菌脂肽，脂肽包含活性肽和疏水鏈段，其中活性肽序列為RLARIVVIRVAR，RIWVIWRR，KRWWKWWRR，IRWRIRVWVRRI，KRWRIRVRVIRK，KKWKIVVIKWKK，WIVVIWRRKRRR中的一種，疏水鏈段為月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、或棕櫚酸(C16)脂質(zhì)部分的一種。通過還原胺化將寡糖與含有磷酸乙醇銨的氨基脂偶聯(lián)制備擬糖脂。擬糖脂包含寡糖和疏水鏈段，其中寡糖的單糖單元為葡萄糖、甘露糖中的一種，疏水鏈段為棕櫚酸(C16)脂質(zhì)部分。具有靶向功能的抗菌脂肽復(fù)合物由結(jié)構(gòu)相似的脂肽和擬糖脂在溶液中自組裝而成。
實施例1
通過Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相合成法合成活性肽(RLARIVVIRVAR)，采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶聯(lián)活性肽-棕櫚酸(Palm)，得到脂肽產(chǎn)物RLARIVVIRVAR-Palm。通過還原胺化將寡糖與二棕櫚酸酯磷酯酰乙醇胺(DHPE購自sigma公司)偶聯(lián)制備擬糖脂。取四糖溶液加至聚四氟乙烯瓶中，加入DHPE，兩者摩爾比為32:1。加入氯仿/甲醇/水混合溶液，水浴超聲后加入新配制的NaCNBH3，繼續(xù)反應(yīng)72小時。取適量脂肽和擬糖脂，加入氯仿/甲醇混合溶劑，探頭超聲間歇處理30分鐘，制得抗菌脂肽復(fù)合物。
實施例2
通過固相合成法合成活性肽(RIWVIWRR)，采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶聯(lián)活性肽-硬脂酸(Stearic)，得到脂肽產(chǎn)物RIWVIWRR-Stearic。取六糖溶液加至聚四氟乙烯瓶中，加入DHPE，兩者摩爾比為32:1。加入氯仿/甲醇/水混合溶液，水浴超聲后加入新配制的NaCNBH3，繼續(xù)反應(yīng)48小時。取適量脂肽和擬糖脂，加入氯仿/甲醇混合溶劑，探頭超聲間歇處理15分鐘，制得抗菌脂肽復(fù)合物。
以濁度法和平板涂布法評價脂肽-擬糖脂復(fù)合脂質(zhì)體對不同菌種的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)果見表1，采用脂肽脂質(zhì)體為對照組。
表1抗菌脂肽復(fù)合物對不同菌種的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)
實施例3
通過固相合成法合成活性肽(KRWWKWWRR)，采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶聯(lián)活性肽-月桂酸(Lauric)，得到脂肽產(chǎn)物KRWWKWWRR-Lauric。取四糖溶液加至聚四氟乙烯瓶中，加入DHPE，兩者摩爾比為32:1。加入氯仿/甲醇/水混合溶液，水浴超聲后加入新配制的NaCNBH3，繼續(xù)反應(yīng)72小時。取適量脂肽和擬糖脂，加入氯仿/甲醇混合溶劑，探頭超聲間歇處理30分鐘，制得抗菌脂肽復(fù)合物。
序列表
SEQNO.1: RLARIVVIRVAR
SEQNO.2: RIWVIWRR
SEQNO.3: KRWWKWWRR
SEQNO.4: IRWRIRVWVRRI
SEQNO.5: KRWRIRVRVIRK
SEQNO.6: KKWKIVVIKWKK
SEQNO.7: WIVVIWRRKRRR