本發(fā)明涉及一種疫苗及其制備方法，具體為DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗及其制備方法，屬于生物疫苗技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

豬藍(lán)耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，是由PRRS病毒(PRRSV)引起，以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸系統(tǒng)疾病為主要特征的高度接觸性、高致死率烈性傳染病。自美國1987年報(bào)道以來，近年來己經(jīng)遍布全球各個(gè)主要養(yǎng)豬國家，是被國際獸醫(yī)局(OIE)通報(bào)的動(dòng)物A類烈性傳染病之一，為高發(fā)病率和高死亡率的重大傳染病。自從2006年6月起，一場(chǎng)被稱為“高熱病”或“無名高熱癥”的疫病在我國南方一些豬場(chǎng)以不同數(shù)量和規(guī)模呈災(zāi)難性暴發(fā)，以后幾乎席卷全國，2006年入冬至2007年，“豬高熱病”已由急性轉(zhuǎn)為慢性持續(xù)感染，主要侵害母豬和仔豬。至今該病仍然不斷發(fā)生，是目前豬場(chǎng)內(nèi)最難解決的重大疫病。豬藍(lán)耳病的發(fā)生給我國養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，目前還沒有有效的藥物能對(duì)其徹底治愈，對(duì)母豬和仔豬進(jìn)行免疫預(yù)防是控制豬藍(lán)耳病最為經(jīng)濟(jì)有效的方法，但現(xiàn)行的豬藍(lán)耳病滅活疫苗和減毒活疫苗免疫應(yīng)答較遲緩且效果不理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種新型的DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗及其制備方法，能有效防控豬藍(lán)耳病病毒，解決了藍(lán)耳病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗(10頭份)，包括以下物質(zhì)：PRRSV TCID₅₀＝5×10⁵-5×10⁷，甘露糖1-20wt％，PLGA0.01-5wt％，Poly(I:C)0.01-5wt％，PLGA為本領(lǐng)域熟知的聚乳酸-羥基乙酸共聚物。

本發(fā)明同時(shí)請(qǐng)求保護(hù)所述的DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗的制備方法，該方法包括如下步驟：

S1.制備PLGA納米佐劑滅活疫苗；

S2.合成甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。

進(jìn)一步的，所述的步驟S1為：

a.制備W2相：PVA加入到水中，全部溶解；

b.制備O相：PLGA加入到二氯甲烷中，全部溶解；

c.制備W1相：Poly(I:C)與PRRSV混合，溶解充分；

d.將W1相加入到O相中，進(jìn)行超聲波處理得到混合物Ⅰ；

e.將混合物Ⅰ加入到W2相中，進(jìn)行超聲乳化后除去二氯甲烷得到混合物Ⅱ；

f.將混合物Ⅱ離心除去上清液，保留沉淀即為PLGA納米佐劑疫苗。進(jìn)一步的，所述的步驟S2為：

a.向步驟S1得到的PLGA納米佐劑疫苗中分別加入1-10wt％N-羥基琥珀酰亞胺和1-10wt％二環(huán)己基碳二亞胺溶液，混合均勻；

b.將步驟a混合均勻的液體置于透析袋中透析6-8小時(shí)，除去多余的N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺；

c.向經(jīng)透析后的液體中加入乙二胺，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，形成銨化PLGA；

d.將1-20wt％甘露糖溶解于0.1mol/L醋酸鈉溶液中，將甘露糖-醋酸鈉溶液加入到步驟c得到的銨化PLGA中，在37℃震蕩處理2天；

e.將步驟d處理后的液體離心，得到沉淀，用生理鹽水洗滌、重懸沉淀即得甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。

進(jìn)一步的，所述的W2相中PVA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25-1.25％。

進(jìn)一步的，所述超聲乳化的條件為：時(shí)間110s，0.6s/次，55％。

PLGA是無毒的生物可降解聚合物，在美國已被FDA批準(zhǔn)上市，產(chǎn)品用于藥用輔料、生物醫(yī)用材料。包括藥物緩釋劑、控釋制劑載體(包括冠脈支架載藥材料)，如阿霉素緩釋劑，多肽類生物降解緩釋微球等，也用于多種疫苗載體,如HIV、乙肝、口蹄疫等。Poly(I:C)中文名字為聚肌胞苷酸，為多聚肌苷酸的共聚物，藥理研究和臨床工作證實(shí)，聚肌胞是及時(shí)高效的內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑，又是免疫調(diào)節(jié)劑，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤作用、刺激吞噬作用和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能作用。另外，大量實(shí)驗(yàn)證明甘露糖可以靶向結(jié)合樹突狀細(xì)胞的甘露糖受體。故本課題擬采用甘露糖修飾PLGA納米佐劑，加入Poly(I:C)輔佐PRRSV，加快及增強(qiáng)對(duì)PRRSV的細(xì)胞免疫應(yīng)答，以期有效防控豬藍(lán)耳病毒，解決藍(lán)耳病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明利用甘露糖殘基修飾PLGA，輔以Poly(I:C)為刺激劑，制備DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗。利用甘露糖殘基修飾PLGA，旨在構(gòu)建具有甘露糖受體的樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞的靶向性疫苗的輸送系統(tǒng)；加入Poly(I:C)在于增強(qiáng)免疫豬只免疫力，加強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答；采用無毒可降解材料PLGA為載體制備納米疫苗，目的在于延緩病毒的釋放時(shí)間、降低藥物的毒害性、延長藥物的半衰期。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的納米佐劑疫苗激光粒度檢測(cè)結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明的納米佐劑疫苗的病毒釋放曲線圖；

圖3為本發(fā)明的納米佐劑疫苗紅外光譜檢測(cè)圖；

圖4為本發(fā)明硫酸苯酚法測(cè)多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖5為本發(fā)明的納米佐劑疫苗淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明的納米佐劑疫苗ELISPOT檢測(cè)結(jié)果圖。

其中：1、甘露糖修飾PLGA納米佐劑疫苗，2、PLGA納米佐劑疫苗。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，如無特殊說明，所用原料均市售可得，作為優(yōu)選，食用小蘇打購于山東海天生物化工有限公司。按照如下表1配方制備DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗：

表1

實(shí)施例1

制備PLGA納米佐劑疫苗

(1)W2相：用30mL蒸餾水配制0.25wt％的PVA(聚乙烯醇)溶液，放入轉(zhuǎn)子，用封口膜封口，放在恒溫加熱磁力攪拌器中，恒溫加熱磁力攪拌器加水沒過鐵圈，調(diào)節(jié)適宜的轉(zhuǎn)速，調(diào)節(jié)電壓最大，待水沸騰后，調(diào)節(jié)電壓逐漸減小，直至PVA全部溶解后取出。

(2)O相：取5mL離心管，加入2mL二氯甲烷，稱量0.01wt％PLGA(聚乳酸羥基乙酸)加入到二氯甲烷中，在渦旋振蕩器上震蕩，直至PLGA全部溶解。

(3)W1相：稱取0.01wt％Poly(I:C)(聚肌苷酸-聚胞苷酸)放入1mL離心管中，與TCID₅₀＝5×10⁵PRRSV(高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活病毒)混合，將混合體系加入到離心管中，震蕩溶解。

(4)把W1相中的物質(zhì)加入到O相中，放入冰盒中，W1/O于新芝超聲儀1min，振幅80％，2s。

(5)把W1/O相中的物質(zhì)加入到W2相中，放入冰盒中，W1/O/W2超聲乳化110s(UP400型超聲儀，振幅55％，0.6s)。

(6)吸取步驟(5)超聲乳化的液體于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察，W1/O/W2相放在恒溫加熱磁力攪拌器中，室溫?cái)嚢?h以除去二氯甲烷。

(7)W1/O/W2相合并于離心管中，10000rpm離心15min，棄上清，用蒸餾水洗滌，按上述步驟反復(fù)洗滌三次。

合成甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗

(1)稱取1wt％N-羥基琥珀酰亞胺和1wt％二環(huán)己基碳二亞胺分別用蒸餾水溶解，加入PLGA納米佐劑疫苗中混勻。

(2)混勻后置于透析袋中透析6h，除去多余的N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺。

(3)取出透析袋，將液體倒入離心管中，加入96μL乙二胺，此時(shí)PH為9.0，用濃鹽酸調(diào)節(jié)其PH至5.0，形成銨化PLGA。

(4)將1wt％甘露糖溶解于1mL的0.1mol/L醋酸鈉溶液中，加入上述溶液中，37℃震蕩2天。

(5)將上述溶液取出離心8000rpm，10min，棄上清，用生理鹽水洗滌，重復(fù)洗滌兩次。最后用生理鹽水將沉淀重懸，為甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。

實(shí)施例2

制備PLGA納米佐劑疫苗

(1)W2相：用30mL蒸餾水配制0.75wt％的PVA(聚乙烯醇)溶液，放入轉(zhuǎn)子，用封口膜封口，放在恒溫加熱磁力攪拌器中，恒溫加熱磁力攪拌器加水沒過鐵圈，調(diào)節(jié)適宜的轉(zhuǎn)速，調(diào)節(jié)電壓最大，待水沸騰后，調(diào)節(jié)電壓逐漸減小，直至PVA全部溶解后取出。

(2)O相：取5mL離心管，加入2mL二氯甲烷，稱量0.5wt％PLGA(聚乳酸羥基乙酸)加入到二氯甲烷中，在渦旋振蕩器上震蕩，直至PLGA全部溶解。

(3)W1相：稱取0.1wt％Poly(I:C)(聚肌苷酸-聚胞苷酸)放入1mL離心管中，與TCID₅₀＝5×10⁶PRRSV(高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活病毒)混合，將混合體系加入到離心管中，震蕩溶解。

(4)把W1相中的物質(zhì)加入到O相中，放入冰盒中，W1/O新芝超聲儀超聲1min，80％振幅，2s。

(5)把W1/O相中的物質(zhì)加入到W2相中，放入冰盒中，W1/O/W2超聲乳化110s(UP400型超聲儀55％振幅，0.6s)。

(6)吸取步驟(5)超聲乳化的液體于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察，W1/O/W2相放在恒溫加熱磁力攪拌器中，室溫?cái)嚢?h以除去二氯甲烷。

(7)W1/O/W2相合并于離心管中，10000rpm離心15min，棄上清，用蒸餾水洗滌，按上述步驟反復(fù)洗滌三次。

合成甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗

(8)稱取3.5wt％N-羥基琥珀酰亞胺和4.5wt％二環(huán)己基碳二亞胺分別用蒸餾水溶解，加入PLGA納米佐劑疫苗中混勻。

(9)混勻后置于透析袋中透析6h，除去多余的N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺。

(10)取出透析袋，將液體倒入離心管中，加入96μL乙二胺，此時(shí)PH為9.0，用濃鹽酸調(diào)節(jié)其pH至5.0，形成銨化PLGA。

(11)將5wt％甘露糖溶解于1mL的0.1mol/L醋酸鈉溶液中，加入上述溶液中，37℃震蕩2天。

(12)將上述溶液取出離心8000rpm，10min，棄上清，用生理鹽水洗滌，重復(fù)洗滌兩次。最后用生理鹽水將沉淀重懸，為甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。

實(shí)施例3

制備PLGA納米佐劑疫苗

(1)W2相：用30mL蒸餾水配制1.25wt％的PVA(聚乙烯醇)溶液，放入轉(zhuǎn)子，用封口膜封口，放在恒溫加熱磁力攪拌器中，恒溫加熱磁力攪拌器加水沒過鐵圈，調(diào)節(jié)適宜的轉(zhuǎn)速，調(diào)節(jié)電壓最大，待水沸騰后，調(diào)節(jié)電壓逐漸減小，直至PVA全部溶解后取出。

(2)O相：取5mL離心管，加入2mL二氯甲烷，稱量5wt％PLGA(聚乳酸羥基乙酸)加入到二氯甲烷中，在渦旋振蕩器上震蕩，直至PLGA全部溶解。

(3)W1相：稱取5wt％Poly(I:C)(聚肌苷酸-聚胞苷酸)放入1mL離心管中，與TCID₅₀＝5×10⁷PRRSV(高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活病毒)混合，將混合體系加入到離心管中，震蕩溶解。

(4)把W1相中的物質(zhì)加入到O相中，放入冰盒中，W1/O新芝超聲儀超聲1min，80％振幅，2s。

(5)把W1/O相中的物質(zhì)加入到W2相中，放入冰盒中，W1/O/W2超聲乳化110s(UP400型超聲儀55％振幅，0.6s)。

(6)吸取步驟(5)超聲乳化的液體于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察，W1/O/W2相放在恒溫加熱磁力攪拌器中，室溫?cái)嚢?h以除去二氯甲烷。

(7)W1/O/W2相合并于離心管中，10000rpm離心15min，棄上清，用蒸餾水洗滌，按上述步驟反復(fù)洗滌三次。

合成甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗

(8)稱取6wt％N-羥基琥珀酰亞胺和8wt％二環(huán)己基碳二亞胺分別用蒸餾水溶解，加入PLGA納米佐劑疫苗中混勻。

(9)混勻后置于透析袋中透析6h，除去多余的N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺。

(10)取出透析袋，將液體倒入離心管中，加入96μL乙二胺，此時(shí)pH為9.0，用濃鹽酸調(diào)節(jié)其pH至5.0，形成銨化PLGA。

(11)將20wt％甘露糖溶解于1mL的0.1mol/L醋酸鈉溶液中，加入上述溶液中，37℃震蕩2天。

(12)將上述溶液取出離心8000rpm，10min，棄上清，用生理鹽水洗滌，重復(fù)洗滌兩次。最后用生理鹽水將沉淀重懸，為甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。

實(shí)施例4-納米粒徑的檢測(cè)

取上述甘露糖修飾的PLGA納米佐劑疫苗。用激光粒度分析儀測(cè)定粒徑及分布，見圖1。激光粒度儀檢測(cè)，DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗粒度為434.8nm。

實(shí)施例5-包封率、載藥量測(cè)定

包封率(EE％)＝W_包/W_藥×100％

載藥量(DL％)＝W_包/W_總×100％

式中W_藥：投入的總藥量(mg)

W_總：納米粒的總重量(mg)

W_包：納米粒中包裹的藥物量(mg)

結(jié)果：包封率約為46.9％，載藥量約為6.36％。

實(shí)施例6-安全性檢測(cè)

分別給50只小白鼠腹腔注射上述樣品，正常飼養(yǎng)一個(gè)月，觀察其生長狀況，結(jié)果未表現(xiàn)體溫、采食、精神等方面的異常反應(yīng)。

實(shí)施例7-二喹啉甲酸法(BCA法)蛋白測(cè)定

(1)將實(shí)施例1得到的DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗離心3次后得到的沉淀加蒸餾水，定容至10ml。

(2)取3個(gè)1.5ml離心管，每個(gè)加入步驟(1)所得溶液0.5ml，離心10000rpm，10min，去上清，各加入0.1mol/L NaOH 1ml，吹散沉淀，置于37℃搖床1h，BCA法測(cè)定。

(3)取3個(gè)1.5mL離心管，編號(hào)1、2、3，每個(gè)加入步驟(2)所得溶液1.5ml，置于37℃搖床，每天取80微升，離心10000rpm，10min，BCA法測(cè)定上清蛋白含量，觀察病毒釋放曲線，結(jié)果見圖2。

實(shí)施例8-紅外光譜分析

(1)將實(shí)施例1得到的DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗冷凍干燥處理。

(2)研磨溴化鉀和DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗凍干粉直至粉狀。

(3)粉末壓片機(jī)排氣：使用時(shí)首先將手輪調(diào)節(jié)壓力絲杠頂好，并將放油閥手輪順時(shí)針擰好，不要擰的過緊，上下擺動(dòng)手把，待壓力表指針向上運(yùn)動(dòng)后停止加壓，壓力不要過高，松開排氣閥后會(huì)聽到排氣聲，然后將排氣閥擰緊，逆時(shí)針開放油閥手輪，松開壓力絲杠。

(4)將模具放在壓片機(jī)工作空間中央位置，上下擺動(dòng)手把。同時(shí)觀察壓力表示值讀數(shù)，當(dāng)達(dá)到所需壓力后停止加壓，保持1min，取出壓制好的樣品。

(5)記錄數(shù)據(jù)，并整理分析，見圖3。

實(shí)施例9-硫酸苯酚法測(cè)多糖含量

精密量取D-甘露糖對(duì)照品溶液50μg/ml 0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1ml，再加3％苯酚溶液1ml，搖勻，迅速加入硫酸4.5ml，搖勻，放置至室溫，以0管為空白，于200-650nm波長之間掃描，D-甘露糖衍生物在490nm處有最大吸收，故選擇490nm為檢測(cè)波長。在490nm處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝16.284x-0.0685(r＝0.9991)。結(jié)果表明D-甘露糖衍生物濃度在10.2～51μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，符合Lambert‐Beer定律，說明根據(jù)吸光度來計(jì)算供試品中D-甘露糖含量是可靠的。

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，如圖4所示。

(2)疫苗中甘露糖的測(cè)定結(jié)果見表2。

表2樣品總糖含量測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例10-DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗免疫臨床觀察

在規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)取5頭母豬窩產(chǎn)仔豬，每窩8頭，共40頭17-22日齡仔豬，分三組，分別注射DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗2ml(含1頭份)、市售豬藍(lán)耳病減毒活疫苗2ml(含1頭份)和生理鹽水2ml，進(jìn)行臨床觀察，結(jié)果：免疫納米佐劑滅活疫苗和市售減毒活疫苗豬與對(duì)照組比較，在體溫、采食、生產(chǎn)速度等臨床表現(xiàn)方面沒有明顯區(qū)別。說明免疫納米佐劑滅活疫苗和市售減毒活疫苗未表現(xiàn)副作用。

實(shí)施例11-淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

按上述免疫一個(gè)月后采血，分離單個(gè)核淋巴細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T細(xì)胞病原特異性增殖和非特異性增殖。

1)豬外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離。將新鮮采集的豬外周靜脈血，用肝素抗凝。用1.5倍體積的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，之后按l：l比例將其沿管壁緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液液面上，2000r/min離心20分鐘。之后細(xì)胞分為四層，第一層為血漿或者組織勻漿液層；第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞富集層；第三層為透明分離液層：第四層為紅細(xì)胞層。吸出中間環(huán)狀乳白色PBMC富集層，加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行漂洗，2000r/min離心10分鐘，漂洗2次后獲得PBMC。把新鮮分離的PBMC使用1ml RPMI-1640培養(yǎng)基重懸。

2)豬外周血單個(gè)核細(xì)胞的染色與計(jì)數(shù)。細(xì)胞懸液與0.08wt％的臺(tái)盼藍(lán)溶液按照1:1的比例充分混勻(終濃度為0.04wt％)，之后置于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

3)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

a.利用動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞分離液提取淋巴細(xì)胞。

b.1000rpm離心10min，棄去上清，用紅細(xì)胞裂解液重懸。

c.洗滌，1000rpm離心6min，重復(fù)兩次。

d.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分別加入96孔板中，5×10⁵個(gè)/孔。

e.加入刺激物，分別為TJM-F92(MOI＝0.01)、PRRSV(MOI＝0.01)、陽性對(duì)照PHA(20μg/mL)、陰性對(duì)照LPS(10ng/mL)、空白對(duì)照，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)70h。

f.加入MTT溶液10μL/孔，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育4h。

g.終止孵育，小心吸去孔內(nèi)液體，加入二甲亞砜100μL/孔，輕輕震蕩是充分混勻后在490nm和630nm處檢測(cè)吸光度。結(jié)果見圖5，DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗免疫豬后，其淋巴細(xì)胞對(duì)于非特異性刺激物L(fēng)PS和PHA及特異性抗原高致病性藍(lán)耳病疫苗毒株(TJM-F92)和野毒株(TJ-F10毒株)的細(xì)胞免疫反應(yīng)都明顯好于市售疫苗和對(duì)照組(*p<0.05，**p<0.01)。

實(shí)施例12-ELISPOT檢測(cè)

上述試驗(yàn)豬群在免疫一個(gè)月后采血，分離單個(gè)核淋巴細(xì)胞，用ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFNγ分泌水平。

1)藍(lán)耳病病毒多肽池設(shè)計(jì)與合成

選用NetMHC4服務(wù)器多肽MHCI類分子結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)預(yù)測(cè)。多肽序列來自于NCBI中查找的病毒蛋白氨基酸序列，利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，選出nm最小的，以及rank值最小的，即為最可能有效的多肽表位。

2)ELISpot檢測(cè)方法

a.取出市售已包被IFNγ抗體的PVDF膜板，用無菌PBS/HBSS洗板5次，200μl/孔。

b.封閉，加入含有10wt％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫孵育30min。

c.將細(xì)胞調(diào)整至2×10⁵個(gè)/孔，100μl/孔，檢測(cè)孔分別加入10μl不同濃度稀釋的病毒刺激物，陽性對(duì)照加PHA，濃度10μg/ml；陰性對(duì)照每孔加入110μl的細(xì)胞液，空白對(duì)照每孔加入110μl的RPMI-1640培養(yǎng)基；均設(shè)復(fù)孔。

d.將培養(yǎng)板放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。

e.棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS/HBSS洗板5次，200μl/孔。

f.用含0.5％胎牛血清的PBS/HBSS稀釋生物素標(biāo)記抗IFNγ至1μg/ml，100μl/孔，室溫2h。

g.棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS/HBSS洗板5次，200μl/孔，用含0.5％胎牛血清的PBS/HBSS稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素至1g/ml，100μl/孔，室溫2h。

h.棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS/HBSS洗板5次，200μl/孔，加入底物顯色15min，直至斑點(diǎn)出現(xiàn)。結(jié)果見圖6，表明DC靶向豬藍(lán)耳病PLGA納米佐劑滅活疫苗免疫豬后，其淋巴細(xì)胞對(duì)藍(lán)耳病GP5蛋白多肽池產(chǎn)生較強(qiáng)的反應(yīng)，表現(xiàn)在產(chǎn)生IFNγ明顯增多(*p<0.001)。