本發(fā)明涉及干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液在制備治療口腔潰瘍藥物中的應(yīng)用及漱口液和其制備方法。

背景技術(shù)：

口腔潰瘍俗稱“口瘡”，是一種常見(jiàn)的發(fā)生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥，多見(jiàn)于唇內(nèi)側(cè)、舌頭、舌腹、頰黏膜、前庭溝、軟腭等部位，這些部位的黏膜缺乏角質(zhì)化層或角化較差。舌頭潰瘍指發(fā)生于舌頭、舌腹部位的口腔潰瘍?？谇粷儼l(fā)作時(shí)疼痛劇烈，局部灼痛明顯，嚴(yán)重者還會(huì)影響飲食、說(shuō)話，對(duì)日常生活造成極大不便；可并發(fā)口臭、慢性咽炎、便秘、頭痛、頭暈、惡心、乏力、煩躁、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大等全身癥狀。

口腔潰瘍的病因目前尚未明確，通常認(rèn)為口腔潰瘍的發(fā)生是多種因素綜合作用的結(jié)果。免疫、遺傳和環(huán)境可能是口腔潰瘍發(fā)病的“三聯(lián)因素”，即遺傳背景與適當(dāng)?shù)沫h(huán)境因素可引發(fā)異常的免疫反應(yīng)而出現(xiàn)口腔潰瘍特征性病損。

現(xiàn)有的口腔潰瘍治療藥物主要有：局部抗菌藥物、局部皮質(zhì)類(lèi)固醇、局部止痛劑、局部抗炎制劑或全身的抗菌抗炎用藥。雖然以上治療藥物對(duì)口腔潰瘍可以產(chǎn)生不同程度的治療效果，但也會(huì)引起一定的不良反應(yīng)，如對(duì)口腔粘膜的刺激性，患者感覺(jué)不舒適，不易接受等，還有一些藥物會(huì)產(chǎn)生全身的副作用。在口腔潰瘍的治療過(guò)程中，通常都先采用清凈水或生理鹽水漱口，使口腔保持清潔，然后再涂抹藥物，避免了口腔內(nèi)患處不潔凈而影響藥效。但采用清凈水或生理鹽水漱口僅能使口腔保持清潔，功能單一，目前尚缺乏可以配合藥物治療的合適的漱口液。

徐娜于2015年發(fā)表的《含漱人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清液對(duì)腎移植術(shù)后口腔潰瘍的療效》中報(bào)道了體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清液含有多種細(xì)胞因子，具有抗炎、促進(jìn)血管形成及修復(fù)受損組織的功能。但申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療口腔潰瘍的總有效率僅83％。因此，對(duì)于口腔潰瘍治療總有效率更高的干細(xì)胞制劑仍有需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液在制備治療口腔潰瘍藥物中的應(yīng)用及漱口液和其制備方法。該脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液治療口腔潰瘍的總有效率可高達(dá)90％以上。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液在制備治療口腔潰瘍藥物中的應(yīng)用。

目前有報(bào)道顯示體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清液具有治療口腔潰瘍的作用，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清液相比，體外培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液在治療口腔潰瘍的療效上更為顯著。因此，將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液用于口腔潰瘍的治療或輔助治療具有更為廣闊的前景。

本發(fā)明還提供了一種用于治療口腔潰瘍的漱口液，包括脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液的制備方法為：取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基進(jìn)行第一培養(yǎng)，然后采用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行第二培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液，得到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液。

作為優(yōu)選，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為第3～5代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。

作為優(yōu)選，第一培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的接種密度為(1～10)×10³個(gè)/cm²。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，第一培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的接種密度為7×10³個(gè)/cm²。

作為優(yōu)選，第一培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為20～30小時(shí)。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，第一培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。

作為優(yōu)選，第一培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂、。

作為優(yōu)選，第二培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為40～60小時(shí)。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，第二培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。

作為優(yōu)選，第二培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，收集細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液之后還包括離心、取上清、濾膜過(guò)濾的步驟。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，離心的轉(zhuǎn)速為1000rpm，時(shí)間為5min。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，過(guò)濾所采用的濾膜的孔徑為0.22μm。

作為優(yōu)選，用于治療口腔潰瘍的漱口液還包括藥學(xué)上可接受的輔料。

作為優(yōu)選，得到的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液的存貯溫度為-20～-80℃。

本發(fā)明還提供了該漱口液的制備方法，包括：取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基進(jìn)行第一培養(yǎng)，然后采用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行第二培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液，得到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液。

作為優(yōu)選，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為第3～5代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。

作為優(yōu)選，第一培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的接種密度為(1～10)×10³個(gè)/cm²。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，第一培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的接種密度為7×10³個(gè)/cm²。

作為優(yōu)選，第一培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為20～30小時(shí)。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，第一培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。

作為優(yōu)選，第一培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂。

作為優(yōu)選，第二培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為40～60小時(shí)。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，第二培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。

作為優(yōu)選，第二培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，收集細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液之后還包括離心、取上清、濾膜過(guò)濾的步驟。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，離心的轉(zhuǎn)速為1000rpm，時(shí)間為5min。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，過(guò)濾所采用的濾膜的孔徑為0.22μm。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法為：

取脂肪組織用PBS清洗后，用無(wú)菌組織剪刀，剪碎后按照1:1體積加入0.5％I型膠原酶，在37攝氏度搖床消化30～45min，再以1500rpm離心10分鐘，去除組織液，用PBS重懸細(xì)胞沉淀2次后，接種于在培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基，放置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5～7天后，當(dāng)鏡下觀察到5～6個(gè)細(xì)胞集落，去除組織塊；當(dāng)貼壁細(xì)胞匯合度達(dá)80％～90％后，用0.1％～0.25％胰蛋白酶消化,用含血清的培養(yǎng)基中止消化后，將細(xì)胞懸液以1000～1500rpm離心5min，按照(0.5～1)×10⁴cells/cm²細(xì)胞密度傳代，取用3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明提供了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液在制備治療口腔潰瘍藥物中的應(yīng)用及漱口液和其制備方法。該漱口液包括脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液。本發(fā)明至少具有如下有益效果之一：

1、本發(fā)明研究顯示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液治療口腔潰瘍的總有效率可高達(dá)90％以上，試驗(yàn)結(jié)果表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清對(duì)口腔潰瘍的療效要顯著好于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清的療效；

2、本發(fā)明提供的漱口液對(duì)口腔黏膜無(wú)刺激，不會(huì)引起任何不良反應(yīng)，患者容易接受。

附圖說(shuō)明

圖1示流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)結(jié)果；其中，1-1～1-6分別示CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR的表達(dá)情況；

圖2示流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)結(jié)果；其中，2-1～2-6分別示CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR的表達(dá)情況。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開(kāi)了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液在制備治療口腔潰瘍藥物中的應(yīng)用及漱口液和其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

術(shù)語(yǔ)解釋?zhuān)?/p>

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于脂肪組織中的一類(lèi)具有自我更新、增殖能力強(qiáng)，及多向分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明提供的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清液在制備治療口腔潰瘍藥物中的應(yīng)用及漱口液和其制備方法中的應(yīng)用及藥物中所用生物材料、試劑、儀器等均可由市場(chǎng)購(gòu)得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1：

1、分離培養(yǎng)及鑒定脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞：

取脂肪組織用PBS清洗后，用無(wú)菌組織剪刀，剪碎后按照1:1體積加入0.5％I型膠原酶，在37攝氏度搖床消化30min，再以1500rpm離心10分鐘，去除組織液，用PBS重懸細(xì)胞沉淀2次后，接種于培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基，放置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5～7天后，當(dāng)鏡下觀察到5～6個(gè)細(xì)胞集落，去除組織塊；當(dāng)貼壁細(xì)胞匯合度達(dá)90％后，用0.1％-0.25％胰蛋白酶消化,用含血清的培養(yǎng)基中止消化后，將細(xì)胞懸液以1500rpm離心5min，按照1×10⁴cells/cm²細(xì)胞密度傳代，取用3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

取P3細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80％-90％，用0.25％胰酶消化離心細(xì)胞，并計(jì)數(shù)后每管加入2×10⁵細(xì)胞數(shù)，染色緩沖液洗1次，1000rpm離心5min；棄上清，用染色緩沖液吹打混勻細(xì)胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、及HLA-DR抗體各2μL，并設(shè)一管為空白對(duì)照；在4℃下，避光反應(yīng)15-20min；染色緩沖液洗一次，1000rpm離心5min；直接標(biāo)記的細(xì)胞棄上清，避光加入500μL的上樣緩沖液，混勻，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞樣品，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性表面標(biāo)記物CD73、CD90、CD105的表達(dá)量均大于95％，而陰性表面標(biāo)記物CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)量均小于2％，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物特征。說(shuō)明分離培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞保持間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。

2、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清的收集：

取第3代脂肪干細(xì)胞，先按照7×10³/cm²細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿，完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)后，用生理鹽水清洗后，加入無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，將上清分裝于50mL離心管，以1000pm離心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取條件培養(yǎng)基，用0.22μm濾膜過(guò)濾，收集在無(wú)菌培養(yǎng)瓶中。放置在-20℃培養(yǎng)箱保存6個(gè)月-12個(gè)月左右或放置在-80℃保存1年以上。

實(shí)施例2：

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清的收集：

取實(shí)施例1中第4代脂肪干細(xì)胞，先按照7×10³/cm²細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿，完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)后，用生理鹽水清洗后，加入無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，將上清分裝于50mL離心管，以1000pm離心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取條件培養(yǎng)基，用0.22μm濾膜過(guò)濾，收集在無(wú)菌培養(yǎng)瓶中。放置在-20℃培養(yǎng)箱保存6個(gè)月-12個(gè)月左右或放置在-80℃保存1年以上。

實(shí)施例3：

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清的收集：

取實(shí)施例1中第5代脂肪干細(xì)胞，先按照7×10³/cm²細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿，完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)后，用生理鹽水清洗后，加入無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，將上清分裝于50mL離心管，以1000pm離心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取條件培養(yǎng)基，用0.22μm濾膜過(guò)濾，收集在無(wú)菌培養(yǎng)瓶中。放置在-20℃培養(yǎng)箱保存6個(gè)月-12個(gè)月左右或放置在-80℃保存1年以上。

對(duì)比例1：

1、分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法：

從醫(yī)院取正常人的骨髓樣本在無(wú)菌環(huán)境下，在骨髓中加入等體積的生理鹽水，輕輕混勻，得到骨髓混合液A；在新的離心管中加入骨髓混合液(A)等體積的淋巴細(xì)胞分離液；用注射器吸取骨髓混合液(A)緩慢沿著管壁加入到淋巴細(xì)胞分離液中；以300-400g離心10-15min，離心后可見(jiàn)液體分層用巴氏吸管吸取中間層的單核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移到含有5-10ml Hanks緩沖溶液的離心管中，輕輕混勻；以200-300g離心5-15min，去上清，用Hanks再次清洗1-2次；用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(無(wú)血清培養(yǎng)，含10ng/ml bFGF，10ng/ml EGF)重懸細(xì)胞，并接種中培養(yǎng)皿中；放置在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48小時(shí)后，去除培養(yǎng)上清，重新?lián)Q上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基；每3天換液，4-8天即可見(jiàn)細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90％；細(xì)胞傳代操作：用0.25％-0.125％胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，以200-300g離心5-10min,用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按照5000-10000/cm²細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿中，傳代至P3-P5代。

2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記物的鑒定：

取P3細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80％-90％，用0.25％胰酶消化離心細(xì)胞，并計(jì)數(shù)后每管加入2×10⁵細(xì)胞數(shù)，染色緩沖液洗1次，1000rpm離心5min；棄上清，用染色緩沖液吹打混勻細(xì)胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、及HLA-DR抗體各2μL，并設(shè)一管為空白對(duì)照；在4℃下，避光反應(yīng)15-20min；染色緩沖液洗一次，1000rpm離心5min；直接標(biāo)記的細(xì)胞棄上清，避光加入500μL的上樣緩沖液，混勻，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞樣品，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性表面標(biāo)記物CD73、CD90、CD105的表達(dá)量均大于95％，而陰性表面標(biāo)記物CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)量均小于2％，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物特征。說(shuō)明分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保持間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。

2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清的收集：

取第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，先按照7×10³/cm²細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿，完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)后，用生理鹽水清洗后，加入無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，將上清分裝于50mL離心管中，1000pm離心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取條件培養(yǎng)基，用0.22μm濾膜過(guò)濾，收集在無(wú)菌培養(yǎng)瓶中。放置在-20℃培養(yǎng)箱保存6-12個(gè)月左右或放置在-80℃保存1年以上。

試驗(yàn)例 干細(xì)胞上清對(duì)口腔潰瘍模型的小鼠的療效

用0.025g/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用NaOH晶體在雙側(cè)下唇靠口角粘膜處燒灼5～8s，生理鹽水沖洗后形成潰瘍。選取60只健康小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組30只。

實(shí)驗(yàn)組：口腔潰瘍用生理鹽水清潔潰瘍表面后，用棉簽蘸取實(shí)施例1～3的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清液涂抹潰瘍處。

對(duì)照組：口腔潰瘍用生理鹽水清潔潰瘍表面后，用棉簽蘸取對(duì)比例1的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清液涂抹潰瘍處。

連續(xù)給藥7天，每日記錄潰瘍變化情況，按以下標(biāo)準(zhǔn)判讀療效：

(1)顯效：潰瘍面積明顯縮小，疼痛感明顯減輕，患者可以正常進(jìn)食；

(2)有效：潰瘍面積較前有縮小，疼痛較前減輕；

(3)無(wú)效：瘍面積未縮小甚至擴(kuò)大，臨床癥狀無(wú)改善甚至惡化。

各組療效結(jié)果如下：

表1各組干細(xì)胞上清對(duì)小鼠口腔潰瘍的治療效果

如表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清在治療口腔潰瘍的總有效率更高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清對(duì)口腔潰瘍的療效要顯著好于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清的療效。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。