本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸及其衍生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種透明質(zhì)酸抗衰組合物，還涉及所述透明質(zhì)酸抗衰組合物的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚老化表現(xiàn)為皮膚體積和彈性的損失。皮膚體積損失是由于皮膚HA缺失而引起膠原等皮膚填充物失水硬化而導(dǎo)致的；而由于皮膚體積的損失導(dǎo)致皮膚變得粗糙、失去彈性、出現(xiàn)皺紋。因此，透明質(zhì)酸對于皮膚的健康年輕至關(guān)重要。

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是一種酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重復(fù)單位構(gòu)成的無分支高分子糖胺聚糖，存在于動物組織細(xì)胞間質(zhì)和某些細(xì)菌的莢膜中。透明質(zhì)酸廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域，分子量一般為10⁵－10⁷Da(道爾頓)。眾所周知，HA是天然保濕因子，分子量高的HA具有保水保濕、成膜、潤滑的優(yōu)良性能。低分子量HA因其相對分子質(zhì)量較小，外用時(shí)可被皮膚更好的吸收，促進(jìn)皮膚營養(yǎng)的供給和廢物排泄，從而防止皮膚老化，達(dá)到深層保濕和美容養(yǎng)顏的效果，而且還可促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖和分化，清除氧自由基，修復(fù)日光或紫外線傷害的皮膚。

現(xiàn)有技術(shù)中亦有不少用于防止皮膚老化，清除氧自由基的透明質(zhì)酸組合物，如下：CN 105233270A公開了一種用于水光治療的藥物組合物，是由高、中、低、寡聚4種分子量的透明質(zhì)酸及膠原蛋白、表皮生長因子和輔劑組成的凝膠。4種分子量分別為1300～2000kDa，500～1000kDa，50～300kDa，3～8kDa，它們在凝膠中的最優(yōu)含量分別為0.1％～0.2％、0.1％～0.2％、0.1％～0.5％、0.2％～0.6％。對比文件組合物還含有膠原蛋白、表皮生長因子兩種眾所周知的抗衰老活性成分。通過面部注射來改善干燥、細(xì)紋、老化等皮膚問題。對比文件通過注射將透明質(zhì)酸、膠原蛋白和表皮生長因子直接輸送到皮膚內(nèi)(水光注射的深度通常在真皮層)，對于皮膚干燥、細(xì)紋、老化等皮膚問題的改善，一定程度上來源于注射填充的作用，通過擴(kuò)充皮膚容積，及直接補(bǔ)充膠原蛋白和生長因子，從而使得皮膚膠原蛋白含量顯著增加，并通過生長因子對細(xì)胞的增殖作用，達(dá)到對抗皮膚老化的效果。

充分利用透明質(zhì)酸本身的性能，研制出一種具有很好抗衰效果的單純的透明質(zhì)酸組合物，對透明質(zhì)酸性能的充分利用和行業(yè)的發(fā)展，都具有更深遠(yuǎn)的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中透明質(zhì)酸在抗衰中的性能發(fā)揮不夠充分的問題，本申請公開一種立體保濕、清除自由基、細(xì)胞修復(fù)、恢復(fù)皮膚彈性等抗衰老作用顯著的透明質(zhì)酸抗衰組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述透明質(zhì)酸抗衰組合物的制備方法。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述透明質(zhì)酸抗衰組合物的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

一種透明質(zhì)酸抗衰組合物，原料重量百分含量如下：

分子量為3～8kDa的水解透明質(zhì)酸或其鹽60％～62％，分子量為300～500kDa的透明質(zhì)酸或其鹽18％～20％，分子量為1000～1200kDa的透明質(zhì)酸或其鹽18％～20％。

所述的透明質(zhì)酸抗衰組合物，原料重量百分含量如下：

分子量為7kDa的水解透明質(zhì)酸或其鹽60％～62％，分子量為320kDa的透明質(zhì)酸或其鹽18％～20％，分子量為1100kDa的透明質(zhì)酸或其鹽18％～20％。

所述的透明質(zhì)酸抗衰組合物，原料重量百分含量如下：

分子量為7kDa的水解透明質(zhì)酸或其鹽62％，分子量為320kDa的透明質(zhì)酸或其鹽18％，分子量為1100kDa的透明質(zhì)酸或其鹽20％。

所述的透明質(zhì)酸抗衰組合物，所述的水解透明質(zhì)酸或其鹽為以芽孢桿菌A50CGMCCNO.5744發(fā)酵培養(yǎng)得到的芽孢桿菌透明質(zhì)酸酶對透明質(zhì)酸或其鹽進(jìn)行降解得到的酶切寡聚透明質(zhì)酸或其鹽。

寡聚透明質(zhì)酸是指分子量小于10kDa的透明質(zhì)酸。研究表明，分子量對透明質(zhì)酸的活性有很大影響。寡聚透明質(zhì)酸能滲入真皮，提高皮膚的持久保濕效果，同時(shí)具有輕微擴(kuò)張毛細(xì)血管，增加血液循環(huán)、改善中間代謝、促進(jìn)皮膚營養(yǎng)吸收作用，還具有較強(qiáng)的消皺功能，可增加皮膚彈性，延緩皮膚衰老。此外，寡聚透明質(zhì)酸鹽分子中的羥基、羧基和其他極性基團(tuán)可與水分子形成氫鍵而結(jié)合大量的水分，保水效果明顯，因此寡聚透明質(zhì)酸鹽可用于防曬、抗衰老、保濕化妝品中。

酶切寡聚透明質(zhì)酸即水解透明質(zhì)酸，為華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥公司自主研發(fā)并生產(chǎn)的HA產(chǎn)品，采用微生物發(fā)酵得到的透明質(zhì)酸酶對高分子量透明質(zhì)酸或其鹽進(jìn)行降解，酶活高、條件溫和、操作簡單、無環(huán)境污染；并且得到的酶切寡聚透明質(zhì)酸或其鹽結(jié)構(gòu)完整。與其他廠家化學(xué)法生產(chǎn)的寡聚透明質(zhì)酸相比，酶切寡聚透明質(zhì)酸具有透皮吸收性好、純度高、無細(xì)胞毒性、抗氧化能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。另外，試驗(yàn)證實(shí)，酶切寡聚透明質(zhì)酸還具有清除自由基、修復(fù)曬后細(xì)胞、防曬以及促血管生成等作用，可用在化妝品、食品及醫(yī)藥領(lǐng)域，前景廣闊。

但是，針對皮膚老化，保持及改善皮膚水分、營養(yǎng)皮膚、清除皮膚自由基及改善皮膚彈性都是極為重要的，只有酶切寡聚透明質(zhì)酸并不能完全達(dá)到此目的。所以，本領(lǐng)域迫切需要一種組合物能夠達(dá)到保持及改善皮膚水分、營養(yǎng)皮膚、清除皮膚自由基、修復(fù)損傷細(xì)胞及改善皮膚彈性的抗衰老效用。

所述的透明質(zhì)酸鹽或水解透明質(zhì)酸鹽為透明質(zhì)酸或水解透明質(zhì)酸的鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽或鋅鹽。

所述的透明質(zhì)酸抗衰組合物的制備方法：將兩種分子量的透明質(zhì)酸或其鹽和水解透明質(zhì)酸或其鹽按照重量比混合，攪拌均勻，即得。

所述的透明質(zhì)酸抗衰組合物在制備抗衰老產(chǎn)品中的應(yīng)用。

所述抗衰老為保濕、清除自由基、細(xì)胞修復(fù)、恢復(fù)皮膚彈性。

所述抗衰老產(chǎn)品為柔膚水、精華液、啫喱、乳液、膏霜、面膜、彩妝、香皂、洗面奶或沐浴露。

本發(fā)明的有益效果：

1)透明質(zhì)酸抗衰組合物含有水解透明質(zhì)酸或其鹽和透明質(zhì)酸或其鹽，將不同分子量透明質(zhì)酸或其鹽與水解透明質(zhì)酸或其鹽(即酶切寡聚透明質(zhì)酸或其鹽)組合，既具有高分子HA皮膚防護(hù)、天然保濕的本質(zhì)效用，又具有中分子HA易吸收、營養(yǎng)皮膚的特性，另具有酶切寡聚透明質(zhì)酸透皮吸收、清除自由基、細(xì)胞修復(fù)、抗衰老等生物活性，可透皮吸收，并具有立體保濕、清除自由基、修復(fù)損傷細(xì)胞和恢復(fù)皮膚彈性的抗衰老效用；

2)充分利用不同分子量段HA的不同的護(hù)膚作用，經(jīng)過皮膚水分含量、皮膚彈性和皺紋深度等多項(xiàng)測試，最終確定了具有顯著抗衰功效的最佳配比，充分挖掘透明質(zhì)酸的抗衰功效，為透明質(zhì)酸制品研制提供了更多的可能性。

附圖說明

圖1皮膚水分增加量測定結(jié)果，

圖2皮膚水分流失降低量測定結(jié)果，

圖3皺紋平均深度測試結(jié)果，

圖4在使用實(shí)施例2組合物前和使用后8周的原始照片，

圖5為在使用實(shí)施例2組合物前的3D照片，

圖6為在使用實(shí)施例2組合物后的3D照片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1：

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)6.0kg，分子量5.4kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ2.0kg，分子量480kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ2.0kg，分子量1050kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)?；靹蚝蟮漠a(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

實(shí)施例2：

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)6.2kg，分子量7.0kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ1.8kg，分子量320kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ2.0kg，分子量1100kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)?；靹蚝蟮漠a(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

實(shí)施例3：

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)6.2kg，分子量8.5kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ2.0kg，分子量230kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ1.8kg，分子量1500kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)。混勻后的產(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

實(shí)施例4：

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)6.2kg，分子量3.5kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ1.9kg，分子量120kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ1.9kg，分子量1010kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)?；靹蚝蟮漠a(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

實(shí)施例5：

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)6.1kg，分子量9.5kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ1.9kg，分子量580kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ2.0kg，分子量1760kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)?；靹蚝蟮漠a(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

對比例1：

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)2.0kg，分子量7.0kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ2.0kg，分子量320kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ6.0kg，分子量1100kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)。混勻后的產(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

對比例2：

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)8.0kg，分子量7.0kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ1.0kg，分子量320kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ1.0kg，分子量1100kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)。混勻后的產(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

對比例3：

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)5.0kg，分子量7.0kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ2.5kg，分子量320kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ2.5kg，分子量1100kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)?；靹蚝蟮漠a(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

對比例4

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)5.8kg，分子量7.0kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ2.1kg，分子量320kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ2.1kg，分子量1100kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)?；靹蚝蟮漠a(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

對比例5：

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)6.7kg，分子量7.0kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ1.6kg，分子量320kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ1.7kg，分子量1100kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)?；靹蚝蟮漠a(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行

對比例6：

精確稱量水解透明質(zhì)酸鈉(酶切寡聚透明質(zhì)酸鈉，商品名為HA)6.0kg，分子量8.5kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅰ2.0kg，分子量900kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ2.0kg，分子量2000kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)?；靹蚝蟮漠a(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

對比例7：

精確稱量透明質(zhì)酸鈉Ⅰ5.0kg，分子量240kDa；透明質(zhì)酸鈉Ⅱ5.0kg，分子量1150kDa；分別投入雙錐回轉(zhuǎn)真空干燥機(jī)，開啟機(jī)器，旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)?；靹蚝蟮漠a(chǎn)品裝入已滅菌的包裝材料內(nèi)(瓶裝、袋裝、鋁塑裝等)。以上操作均在潔凈車間進(jìn)行。

試驗(yàn)例1：透明質(zhì)酸組合物的保濕功效

以化妝品乳液基礎(chǔ)配方做為對照組，加入0.2％透明質(zhì)酸組合物的樣品作為實(shí)驗(yàn)組，通過測定涂抹后皮膚水分含量與皮膚水分流失量來比較樣品間保濕效果的差異。

1、乳液基礎(chǔ)配方制備工藝

表1 乳液基礎(chǔ)配方

注：A相為油相，B相為水相

1)首先A相加入油相罐，加熱至70-75℃，攪拌至完全熔解備用。

2)B相加入乳化罐，升溫至80-85℃，用7把8分散均勻，再加入罐中，保溫，攪拌至完全溶解。

3)A相加入B相，混勻后開均質(zhì)2分鐘。然后加入C相，攪拌均勻。降溫至40-45℃之間加入D相，混合均勻，38-40℃出料。

2、試驗(yàn)方法：

受試者年齡為22－55歲，共12人。在左右手前臂內(nèi)側(cè)標(biāo)記4×4cm²試驗(yàn)區(qū)域，按3mg樣品/cm²的用量，將試樣均勻涂布于試驗(yàn)區(qū)內(nèi)。分別使用皮膚水分測試儀CorneometerCM825(Courage+Khazaka公司，德國)和皮膚水分流失測試儀Tewanmeter TM300(Courage+Khazaka公司，德國)測量涂抹前及涂抹后1h、2h、4h、6h時(shí)受試區(qū)域和空白對照區(qū)域的皮膚含水量和皮膚水分流失量。同一個(gè)志愿者的測試由同一個(gè)測量人員完成。前后測定時(shí)測定部位和室內(nèi)溫度濕度保持一致。

3、計(jì)算方法：

4、測試結(jié)果：

人體皮膚水分測試結(jié)果如圖1和圖2所示。

從圖1、圖2可知，各實(shí)施例組皮膚水分含量比對比例組明顯提高，水分流失量情況也明顯改善。各實(shí)施例相比，實(shí)施例1～2優(yōu)于實(shí)施例3～5。因此，透明質(zhì)酸組合物能夠在短時(shí)間內(nèi)提高皮膚的水分含量，同時(shí)皮膚屏障也能維持較好的狀態(tài)，保水保濕的效果好。

試驗(yàn)例2：透明質(zhì)酸組合物自由基清除能力研究

分別精密量取0.1mM DPPH(2-甲基-2,3-二氫-5,6-二苯基吡嗪)乙醇溶液5.0mL和0.5％各實(shí)施例與比較例樣品溶液5.0mL置具塞試管中，混勻。以等體積的水與95％乙醇混合溶液為空白對照。室溫放置30分鐘，于523nm處分別測定溶液吸光度值。自由基清除劑的能力越強(qiáng)，吸光度越小。

透明質(zhì)酸組合物的清除自由基能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 透明質(zhì)酸組合物的清除自由基能力

實(shí)施例1、2、4的自由基清除率明顯高于各對比例，因此，透明質(zhì)酸組合物具有較好的清除自由基的能力，從而對皮膚起到和抗氧化的作用，延緩皮膚衰老。

試驗(yàn)例3：透明質(zhì)酸組合物對皮膚彈性的影響

按照試驗(yàn)例1中的方法配制實(shí)施例樣品和比較例樣品。

皮膚彈性測試方法：每個(gè)樣品招募受試者10人，樣品涂抹在面頰部處，輕輕按摩至全部吸收。每天早晚各一次，持續(xù)8周。分別于涂抹前及涂抹后2周、4周、8周用皮膚彈性測定儀MPA580(Courage+Khazaka公司，德國)測定面頰部位(蘋果肌)的彈性變化狀況。測試兩次，求平均值。

常用彈性指數(shù)有以下三種：

粗彈性：R2＝Ua/Uf；

凈彈性：R5＝Ur/Ue；

生物彈性：R7＝Ur/Uf；

結(jié)果：涂抹8周后皮膚彈性的測定結(jié)果見表3。

表3 含透明質(zhì)酸組合物涂抹8周后對皮膚彈性的影響

從表3可以看出，與對比例相比，連續(xù)使用8周后，本發(fā)明實(shí)施例樣品可以明顯提高皮膚的彈性，恢復(fù)皮膚彈力。

試驗(yàn)例4：透明質(zhì)酸組合物對皮膚皺紋的影響

按照試驗(yàn)例1中的方法配制實(shí)施例2樣品、對比例4和對比例5樣品。

測試方法：每個(gè)樣品招募受試者10人，樣品涂抹在眼角處，每天早晚各一次，持續(xù)8周。分別在使用后2周、4周、8周用人體皮膚快速三維成像系統(tǒng)(Primos)對受試者右眼角皺紋深度進(jìn)行評估。

評價(jià)方法：

a通過拍攝涂抹前后照片進(jìn)行評價(jià)

b用三維快速成像系統(tǒng)對皺紋深度進(jìn)行評價(jià)

從圖3可以看出，與對比例相比，連續(xù)使用8周后，使用本發(fā)明實(shí)施例2樣品的受試者，其眼角皺紋深度明顯減輕。圖4是其中一名使用實(shí)施例2樣品的受試者眼角照片，使用8周后，從原始照片上其皺紋改善情況肉眼可見，從3D照片(圖5、6)可以看出皺紋溝壑明顯減少。

因此，綜合以上功效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以表明，本發(fā)明透明質(zhì)酸組合物充分利用了不同分子量段HA的不同的護(hù)膚作用，通過對自由基的清除作用，及對皮膚水分、彈性和皺紋等多方面的改善，從而表現(xiàn)出顯著的抗衰老效果。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。