本申請要求2014年2月12日提交的US 61/9 39,092和2014年3月19日提交的US 61/955,463的權(quán)益，所述專利以引用的方式整體并入本文。

通過EFS網(wǎng)提交的序列表的引用

名為“20150211_034044_100WO1_seq_ST25”，大小是1.74kb的序列表的ASCII文本文件的內(nèi)容創(chuàng)建于2015年2月8日，并且通過EFS網(wǎng)與本申請一起電子提交，以引用的方式整體并入本文。

對政府資助的致謝

本發(fā)明根據(jù)由國立衛(wèi)生研究院授予的CA124974和CA149774在政府資助下進(jìn)行。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。

發(fā)明背景

1.發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及治療衰老和與年齡相關(guān)的疾病。

2.相關(guān)技術(shù)的描述

代謝和衰老是密切關(guān)聯(lián)的。相較于隨意喂食，在進(jìn)化上不同的生物體中進(jìn)行膳食限制(DR)或卡路里限制(CR)一致地延長壽命，并且延遲與年齡相關(guān)的疾病。類似營養(yǎng)物限制情況和遺傳或藥理學(xué)營養(yǎng)物或能量代謝擾動也具有長壽益處。已鑒定以基本上未確定的分子機理調(diào)節(jié)衰老的若干化合物。

然而，對針對包括癌癥、糖尿病和心血管疾病的與年齡相關(guān)的疾病，以及延長受試者的壽命的治療仍然存在需要。

發(fā)明概述

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于抑制、減弱、減緩或預(yù)防受試者的衰老的方法，其包括向所述受試者施用一種或多種結(jié)合所述受試者中ATP合成酶(例如ATP5B)的催化核心的β亞單位的化合物。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于抑制、減弱、減緩或預(yù)防受試者的衰老的方法，其包括向所述受試者施用一種或多種抑制或降低所述受試者中ATP合成酶的活性的化合物。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于治療、抑制、減輕或預(yù)防受試者的與年齡相關(guān)的疾病的方法，其包括向所述受試者施用一種或多種結(jié)合所述受試者中ATP合成酶(例如ATP5B)的催化核心的β亞單位和/或抑制或降低所述受試者中所述ATP合成酶的活性的化合物。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于抑制、減弱、減緩或預(yù)防受試者的衰老的方法，其包括向所述受試者施用一種或多種戊二酸化合物、一種或多種谷氨酸化合物或兩者。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于增加受試者的壽命的方法，其包括向所述受試者施用一種或多種結(jié)合所述受試者中ATP合成酶(例如ATP5B)的催化核心的β亞單位和/或抑制或降低所述受試者中所述ATP合成酶的活性的化合物。在一些實施方案中，相較于未治療的受試者，受試者的壽命延長多達(dá)約60％或多達(dá)約70％。在一些實施方案中，受試者是動物，其可為或可不為衰老或與年齡相關(guān)的疾病的動物模型。在一些實施方案中，受試者是線蟲、嚙齒動物或非人靈長類動物。在一些實施方案中，受試者是人。在一些實施方案中，ATP合成酶是哺乳動物ATP合成酶、人ATP合成酶、哺乳動物線粒體ATP合成酶或人線粒體ATP合成酶。

在一些實施方案中，向受試者施用的化合物是戊二酸化合物或谷氨酸化合物。在一些實施方案中，向受試者施用至少一種戊二酸化合物和至少一種谷氨酸化合物。在一些實施方案中，向受試者施用的化合物是α-酮戊二酸(α-KG)化合物。在一些實施方案中，向受試者施用的化合物是2-羥基戊二酸(2-HG)化合物。在一些實施方案中，向受試者施用至少一種α-KG化合物和至少一種2-HG化合物。在一些實施方案中，以有效量或治療有效量施用一種或多種化合物。在一些實施方案中，歷經(jīng)給定時間段以若干劑量(例如每日劑量持續(xù)一周或更久)施用一種或多種化合物的有效量或治療有效量。在一些實施方案中，向受試者施用的一種或多種化合物的量使受試者中α-酮戊二酸水平增加約30-60％，優(yōu)選約45-55％，更優(yōu)選約50％。在一些實施方案中，以每天每千克受試者的重量，約0.25-2、優(yōu)選約0.5-2、更優(yōu)選約1-2、最優(yōu)選約2克的每日劑量施用化合物。在一些實施方案中，受試者是動物，其可為或可不為衰老或與年齡相關(guān)的疾病的動物模型。在一些實施方案中，受試者是線蟲、嚙齒動物或非人靈長類動物。在一些實施方案中，受試者是人。在一些實施方案中，ATP合成酶是哺乳動物ATP合成酶、人ATP合成酶、哺乳動物線粒體ATP合成酶或人線粒體ATP合成酶。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供至少一種結(jié)合ATP合成酶的催化核心的β亞單位或抑制或降低ATP合成酶的活性的化合物用于制造用以(a)抑制、減弱、減緩或預(yù)防受試者的衰老，(b)治療、抑制、減輕或預(yù)防所述受試者的與年齡相關(guān)的疾病，和/或(c)增加所述受試者的壽命的藥劑的用途。在一些實施方案中，本發(fā)明提供戊二酸化合物或谷氨酸化合物，其用于抑制、減弱、減緩或預(yù)防受試者的衰老；治療、抑制、減輕或預(yù)防所述受試者的與年齡相關(guān)的疾病；和/或增加所述受試者的壽命。在一些實施方案中，化合物是戊二酸化合物或谷氨酸化合物。在一些實施方案中，化合物是戊二酸化合物和谷氨酸化合物。在一些實施方案中，化合物是α-KG化合物。在一些實施方案中，化合物是2-HG化合物。在一些實施方案中，化合物是α-KG化合物和2-HG化合物。在一些實施方案中，以有效量或治療有效量提供化合物。在一些實施方案中，以分次劑量提供藥劑。在一些實施方案中，以分次劑量提供有效量或治療有效量。在一些實施方案中，受試者是動物，其可為或可不為衰老或與年齡相關(guān)的疾病的動物模型。在一些實施方案中，受試者是線蟲、嚙齒動物或非人靈長類動物。在一些實施方案中，受試者是人。在一些實施方案中，ATP合成酶是哺乳動物ATP合成酶、人ATP合成酶、哺乳動物線粒體ATP合成酶或人線粒體ATP合成酶。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種治療受試者的癌癥的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的一種或多種戊二酸化合物、一種或多種谷氨酸化合物或兩者。在一些實施方案中，向受試者施用的化合物是戊二酸化合物或谷氨酸化合物。在一些實施方案中，向受試者施用至少一種戊二酸化合物和至少一種谷氨酸化合物。在一些實施方案中，向受試者施用的化合物是α-酮戊二酸(α-KG)化合物。在一些實施方案中，向受試者施用的化合物是2-羥基戊二酸(2-HG)化合物。在一些實施方案中，向受試者施用至少一種α-KG化合物和至少一種2-HG化合物。在其中癌癥是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一些實施方案中，向受試者施用一種或多種α-KG化合物，并且不施用任何2-羥基戊二酸化合物。在一些實施方案中，以有效量或治療有效量施用一種或多種化合物。在一些實施方案中，歷經(jīng)給定時間段以若干劑量(例如每日劑量持續(xù)一周或更久)施用一種或多種化合物的治療有效量。在一些實施方案中，向受試者施用的一種或多種化合物的量使受試者中α-酮戊二酸水平增加約30-60％，優(yōu)選約45-55％，更優(yōu)選約50％。在一些實施方案中，以每天每千克受試者的重量，約0.25-2、優(yōu)選約0.5-2、更優(yōu)選約1-2、最優(yōu)選約2克的每日劑量施用化合物。在一些實施方案中，受試者是動物，其可為或可不為衰老或與年齡相關(guān)的疾病的動物模型。在一些實施方案中，受試者是線蟲、嚙齒動物或非人靈長類動物。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種治療、抑制、減輕或預(yù)防受試者的與年齡相關(guān)的心臟病狀的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的一種或多種戊二酸化合物、一種或多種谷氨酸化合物或兩者。在一些實施方案中，向受試者施用至少一種戊二酸化合物和至少一種谷氨酸化合物。在一些實施方案中，向受試者施用的化合物是α-酮戊二酸(α-KG)化合物。在一些實施方案中，向受試者施用的化合物是2-羥基戊二酸(2-HG)化合物。在一些實施方案中，向受試者施用至少一種α-KG化合物和至少一種2-HG化合物。在一些實施方案中，歷經(jīng)給定時間段以若干劑量(例如每日劑量持續(xù)一周或更久)施用一種或多種化合物的治療有效量。在一些實施方案中，向受試者施用的一種或多種化合物的量使受試者中α-酮戊二酸水平增加約30-60％，優(yōu)選約45-55％，更優(yōu)選約50％。在一些實施方案中，以每天每千克受試者的重量，約0.25-2、優(yōu)選約0.5-2、更優(yōu)選約1-2、最優(yōu)選約2克的每日劑量施用化合物。在一些實施方案中，受試者是動物，其可為或可不為衰老或與年齡相關(guān)的疾病的動物模型。在一些實施方案中，受試者是線蟲、嚙齒動物或非人靈長類動物。

上文一般性描述與下文詳細(xì)描述兩者均僅具有示例性和解釋性，并且意圖提供對如所要求保護(hù)的本發(fā)明的進(jìn)一步解釋。附圖被包括以提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且并入本說明書中并構(gòu)成本說明書的一部分，說明本發(fā)明的若干實施方案，以及連同描述一起用于解釋本發(fā)明的原理。

附圖描述

通過參照附圖，本發(fā)明得以進(jìn)一步理解，其中：

圖1，圖版a-f顯示α-KG使秀麗隱桿線蟲的成體壽命延長。

圖2，圖版a-i顯示α-KG結(jié)合并抑制ATP合成酶。

圖3，圖版a-g顯示α-KG長壽是通過ATP合成酶和DR/TOR軸介導(dǎo)。

圖4，圖版a-e顯示由α-KG抑制ATP合成酶導(dǎo)致TOR路徑活性保守降低。

圖5，圖版a-h顯示補充α-KG使秀麗隱桿線蟲成體壽命延長，但不改變細(xì)菌的生長速率或蠕蟲的食物攝取、咽泵送速率或產(chǎn)卵量。在圖版h中，各組中的第一棒條是媒介物。

圖6，圖版a-h顯示α-KG結(jié)合到ATP合成酶的b亞單位，并且抑制復(fù)合物V而非其它ETC復(fù)合物的活性。

圖7，圖版a-c顯示用寡霉素處理使秀麗隱桿線蟲壽命延長，并且以依賴于let-363的方式增強自體吞噬。

圖8，圖版a-b顯示對用a-KG或atp-2RNAi處理的蠕蟲中的氧化應(yīng)激的分析。

圖9，圖版a-c顯示在不存在aak-2、daf-16、hif-1、vhl-1或egl-9下，α-KG達(dá)成的壽命。

圖10，圖版a-f顯示a-KG降低TOR路徑活性，但不直接與TOR相互作用。

圖11，圖版a-b顯示在用ogdh-1RNAi處理的秀麗隱桿線蟲中，自體吞噬被增強。

圖12是顯示α-KG DARTS樣品中富含的蛋白質(zhì)的表格。僅顯示α-KG樣品中具有至少15個光譜，并且富集至少1.5倍的那些蛋白質(zhì)。

圖13是概述來自α-KG實驗的壽命數(shù)據(jù)的表格。

圖14，圖版A-C顯示2-HG使成體秀麗隱桿線蟲的壽命延長。

圖15，圖版A-D顯示2-HG結(jié)合并抑制ATP合成酶。在圖版B中，上部數(shù)據(jù)點是媒介物，中間數(shù)據(jù)點是(R)-2-HG辛酯，并且下部數(shù)據(jù)點是(S)-2-HG辛酯。

圖16，圖版A-E顯示對IDH1(R132H)細(xì)胞中ATP合成酶的抑制。

圖17A顯示U87/IDH1(R132H)細(xì)胞對葡萄糖饑餓具有增加的敏感性(***P<0.001)。上部線是IDH1(WT)。

圖17B顯示α-KG辛酯處理的U87細(xì)胞在葡萄糖饑餓后展現(xiàn)活力降低(****P<0.0001)。在右側(cè)，從上部至下部的各線是0μΜ、400μΜ和800μΜ。

圖17C顯示(R)-2-HG辛酯處理的U87細(xì)胞在葡萄糖饑餓后展現(xiàn)活力降低(***P<0.001)。在右側(cè)，從上部至下部的各線是0μΜ、400μΜ和800μΜ。

圖17D顯示(S)-2-HG辛酯處理的U87細(xì)胞在葡萄糖饑餓后展現(xiàn)活力降低(*P<0.05)。在右側(cè)，從上部至下部的各線是0μΜ、400μΜ和800μΜ。

圖17E顯示ATP5B敲低抑制U87細(xì)胞生長(***P＝0.0004)。上部線是對照。

圖17F顯示HCT 116IDH1(R132H/+)細(xì)胞展現(xiàn)對補充以(R)-3-羥基丁酸的無葡萄糖培養(yǎng)基的易感性增加(***P<0.001)。利用雙尾、雙樣本不等方差未配對t檢驗。在所有情況下都繪制平均值±s.d.。上部線是IDH1(+/+)。

圖17G顯示ATP5B敲低的U87細(xì)胞在無葡萄糖含半乳糖培養(yǎng)基中展現(xiàn)mTOR復(fù)合物1活性降低。

圖17H顯示用α-KG或2-HG的膜可滲透性酯酶可水解類似物處理的U87細(xì)胞在無葡萄糖含半乳糖培養(yǎng)基中展現(xiàn)mTOR復(fù)合物1活性降低。

圖17I顯示穩(wěn)定表達(dá)IDH1(R132H)的U87細(xì)胞在無葡萄糖含半乳糖培養(yǎng)基中展現(xiàn)mTOR復(fù)合物1活性降低。

圖18，圖版A-B顯示2-HG不影響通過電子傳遞鏈的電子流動，并且不影響ADP輸入。在圖版A中，上部數(shù)據(jù)點是媒介物，中間數(shù)據(jù)點是(R)-2-HG辛酯，并且下部數(shù)據(jù)點是(S)-2-HG辛酯。

圖19，圖版A-C顯示2-HG抑制細(xì)胞呼吸。

圖20，圖版A-D顯示2-HG積累的細(xì)胞的細(xì)胞能量學(xué)和代謝概況。在圖版C和D中，各組中的第一棒條是媒介物。

圖21，圖版A-B顯示HCT 116IDH1(R132H/+)細(xì)胞展現(xiàn)代謝易感性和生長抑制。在圖版A中，**是IDH1(R132H/+)；并且在圖版B中，**是IDH1(R132H/+)。

圖22，圖版A-E顯示在ATP5B敲低、用α-KG辛酯或2-HG辛酯處理或IDH1(R132H)突變后的細(xì)胞生長抑制。在圖版A中，*是ATP5b siRNA；在圖版B中，***是400μΜ，并且****是800μΜ；在圖版C中，***是400μΜ，并且**是800μΜ；在圖版D中，***是400μΜ，并且**是800μΜ；并且在圖版E中，**是IDH1(R132H)。

圖23是顯示α-KG辛酯(200μΜ)完全消除(異丙基去甲腎上腺素)ISO誘發(fā)的肥大(左側(cè)圖版)，以及抑制ISO和(苯腎上腺素)PE誘發(fā)的ANF(心房利鈉因子)(中間圖版)和BNP(腦利鈉肽)(右側(cè)圖版)的過度表達(dá)(上部右側(cè)圖版)的圖。

圖24是顯示從α-KG喂食的小鼠的心臟分離的線粒體(S1、S2)相較于來自對照小鼠的線粒體(C1、C2)展現(xiàn)較低狀態(tài)3呼吸的OCR圖。在狀態(tài)3u下，從上部至下部的數(shù)據(jù)點是C2、C1、S2和S3。

圖25是顯示α-KG在體內(nèi)的心臟保護(hù)作用的圖。

這些附圖中的若干的彩色版本可見于以引用的方式整體并入本文的Chin等,(2014)Nature 510:397-401以及與其相關(guān)的延伸數(shù)據(jù)圖中。

發(fā)明詳述

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療或抑制受試者的衰老和與年齡相關(guān)的疾病的方法，其包括向所述受試者施用至少一種戊二酸化合物、至少一種谷氨酸化合物或兩者。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于增加受試者的壽命的方法，其包括向所述受試者施用至少一種戊二酸化合物、至少一種谷氨酸化合物或兩者。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療或抑制受試者的衰老和與年齡相關(guān)的疾病的組合物，所述組合物包含至少一種戊二酸化合物、至少一種谷氨酸化合物或兩者。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于增加受試者的壽命的組合物，所述組合物包含至少一種戊二酸化合物、至少一種谷氨酸化合物或兩者。在一些實施方案中，受試者是動物，其可為或可不為衰老或與年齡相關(guān)的疾病的動物模型。在一些實施方案中，受試者是線蟲、嚙齒動物或非人靈長類動物。在一些實施方案中，受試者是人。

如本文所用，“與年齡相關(guān)的疾病”是指常與衰老相關(guān)的疾病和病癥，并且包括癌癥(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等)、神經(jīng)退化性疾病(例如帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、癡呆等)、肌肉減少癥、骨量減少、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、心血管疾病、高血壓、白內(nèi)障、老花眼、青光眼、2型糖尿病、代謝綜合征、脫發(fā)、慢性炎癥、免疫衰老、年齡相關(guān)視力下降、年齡相關(guān)毛發(fā)脫落、變稀和/或變灰等。如本文所用，“與年齡相關(guān)的心臟病狀”是指心臟肥大、心肌病變、心臟衰竭、心臟肥大、心肌病變、心臟衰竭和心血管疾病。

如本文所用，治療或抑制受試者的“衰老”的方法和組合物是治療或抑制與衰老相關(guān)的癥狀的那些。與衰老相關(guān)的癥狀包括癌癥、膽固醇積累、動脈壁變硬、血壓增加、免疫衰老、肌肉損失、骨損失、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、記憶力損失、聽力損失、視力下降、皺紋增加、毛發(fā)脫落/變稀/變灰、應(yīng)激抗性降低、癡呆、聽力損失、視力損失、活動性損失、肌肉強度和耐力損失、虛弱、疲勞、對感染的易感性增加、皮膚干燥和/或起皺以及睡眠樣式和晝夜節(jié)律循環(huán)改變。

如本文所用，“戊二酸化合物”是指α-KG化合物、2-HG化合物和具有以下結(jié)構(gòu)式I的化合物：

其中

Ra和Rb各自獨立地是負(fù)電荷、H、直鏈或支鏈C1-C10烷基、或直鏈或支鏈C1-C10烯基，并且

Rc是任選存在的，并且如果存在，那么Rc是H、直鏈或支鏈C1-C10烷基、或直鏈或支鏈C1-C10烯基，并且如果不存在，那么Z是雙鍵，

及其藥學(xué)上可接受的溶劑合物、鹽、前藥和代謝物。

如本文所用，“谷氨酸化合物”是指具有以下結(jié)構(gòu)式II的化合物：

其中

Ra和Rb各自獨立地是負(fù)電荷、H、直鏈或支鏈C1-C10烷基、或直鏈或支鏈C1-C10烯基，并且

及其藥學(xué)上可接受的溶劑合物、鹽、前藥和代謝物。因為α-KG可通過使用谷氨酸脫氫酶進(jìn)行氧化脫氨而從谷氨酸回補產(chǎn)生，以及作為其中谷氨酸是常見氨基供體的磷酸吡哆醛依賴性轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的產(chǎn)物，所以谷氨酸是α-KG的前藥。

如本文所用，“C1-C10烷基”是指具有1-10個碳原子的烷基，并且“C1-C10烯基”是指具有1-10個碳原子的烯基。

如本文所用，“α-KG”化合物是指α-酮戊二酸(α-酮戊二酸鹽(酯))、α-酮戊二酸的衍生物(例如MacKenzie等(2007)Mol Cell Biol 27(9):3282-3289)中闡述的衍生物)、α-酮戊二酸的類似物(例如膦酸酯類似物(例如Bunik等(2005)Biochemistry 44(31):10552-61中敘述的那些))、α-酮戊二酸的酯(例如α-酮戊二酸二甲酯和α-酮戊二酸辛酯)以及各種物種特異性類似物，例如人α-酮戊二酸、豬α-酮戊二酸、鼠類α-酮戊二酸、牛α-酮戊二酸等。如本文所用，縮寫“KG”可用于指代術(shù)語“酮戊二酸”，例如α-酮戊二酸縮寫為α-KG。

如本文所用，“2-HG化合物”是指2-羥基戊二酸、2-羥基戊二酸鹽(酯)、和具有2-羥基戊二酸基作為它的骨架結(jié)構(gòu)的一部分的化合物，并且包括(S)-2-羥基戊二酸1-烷基酯、(R)-2-羥基戊二酸1-烷基酯、(S)-2-羥基戊二酸1-烯基酯、(R)-2-羥基戊二酸1-烯基酯、(S)-2-羥基戊二酸5-烷基酯、(R)-2-羥基戊二酸5-烷基酯、(S)-2-羥基戊二酸5-烯基酯和(R)-2-羥基戊二酸5-烯基酯，其中烷基是直鏈或支鏈C1-C10烷基，并且烯基是直鏈或支鏈C1-C10烯基。在一些實施方案中，2-HG化合物是(S)-2-羥基戊二酸1-辛酯、(R)-2-羥基戊二酸1-辛酯、(S)-2-羥基戊二酸5-辛酯、或(R)-2-羥基戊二酸5-辛酯。如本文所用，縮寫“HG”可用于指代術(shù)語“羥基戊二酸”，例如2-羥基戊二酸縮寫為2-HG。

“藥學(xué)上可接受的溶劑合物”是指指定化合物的保留所述化合物的生物有效性的溶合形式。溶劑合物的實例包括與水、異丙醇、乙醇、甲醇、二甲亞砜、乙酸乙酯、乙酸、乙醇胺或丙酮組合的本發(fā)明化合物。有機化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員將了解許多有機化合物可與它們在其中反應(yīng)或它們從其沉淀或結(jié)晶的溶劑形成復(fù)合物。這些復(fù)合物稱為“溶劑合物”。舉例來說，與水的復(fù)合物稱為“水合物”。式I和式II化合物的溶劑合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。有機化學(xué)技術(shù)人員也將了解許多有機化合物可以超過一種結(jié)晶形式存在。舉例來說，在各溶劑合物之間，結(jié)晶形式可不同。因此，式I和式II化合物的所有結(jié)晶形式或其藥學(xué)上可接受的溶劑合物都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指藥理學(xué)上可接受，并且對用本發(fā)明化合物治療的受試者大致上無毒的鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括由適合無毒有機或無機酸或無機堿形成的常規(guī)酸加成鹽或堿加成鹽。示例性酸加成鹽包括由諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的無機酸獲得的那些，以及由諸如對甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、羥基乙磺酸、草酸、對溴苯磺酸、碳酸、丁二酸、檸檬酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、苯乙酸、丙酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸、順丁烯二酸、羥基順丁烯二酸、谷氨酸、水楊酸、對氨基苯磺酸和反丁烯二酸的有機酸獲得的那些。示例性堿加成鹽包括由氫氧化銨(例如氫氧化季銨，諸如氫氧化四甲銨)獲得的那些，由無機堿，諸如堿金屬或堿土金屬(例如鈉、鉀、鋰、鈣或鎂)氫氧化物獲得的那些，以及由無毒有機堿，諸如堿性氨基酸獲得的那些。

“藥學(xué)上可接受的前藥”是可在生理條件下或通過溶劑分解而轉(zhuǎn)化成指定化合物或所述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽的化合物。“藥物活性代謝物”是指通過指定化合物或其鹽在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的藥理學(xué)活性產(chǎn)物。可使用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)技術(shù)鑒定化合物的前藥和活性代謝物。參見例如Bertolini,G.等,(1997)J.Med.Chem.40:2011-2016；Shan,D.等,J.Pharm.Sci.,86(7):765-767；Bagshawe K.,(1995)Drug Dev.Res.34:220-230；Bodor,N.,(1984)Advances in Drug Res.13:224-331；Bundgaard,H.,Design of Prodrugs(Elsevier Press,1985)以及Larsen,I.K.,Design and Application of Prodrugs,Drug Design and Development(Krogsgaard-Larsen等編,Harwood Academic Publishers,1991)。

在一些實施方案中，向受試者施用的戊二酸化合物的量是治療有效量或有效量。如本文所用，“有效量”是相較于安慰劑產(chǎn)生可觀察差異的劑量?！爸委熡行Я俊笔侵敢环N或多種本發(fā)明化合物的在向受試者施用時，相較于對照，(i)治療或抑制特定疾病、病狀或病癥，(ii)減弱、改善或消除特定疾病、病狀或病癥的一種或多種癥狀，和/或(iii)抑制或延遲特定疾病、病狀或病癥的一種或多種癥狀的發(fā)作的量。一種或多種本發(fā)明化合物的治療有效量將視諸如給定化合物、藥物制劑、施用途徑、疾病或病癥的類型、疾病或病癥的程度、以及所治療受試者的身份的因素而變化，但然而可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。舉例來說，戊二酸化合物、谷氨酸化合物或兩者的“治療有效量”是相較于一個或多個對照受試者，延遲或抑制與年齡相關(guān)的癥狀的發(fā)作和/或延長給定受試者的壽命的量。

在一些實施方案中，以每天每千克受試者的重量，約0.25-2、約0.5-2、約1-2、或約2克的每日劑量施用一種或多種戊二酸化合物和/或一種或多種谷氨酸化合物的治療有效量。熟練技術(shù)人員將了解某些因素可影響為有效治療受試者所需的劑量，所述因素包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重性、先前治療、受試者的總體健康和/或年齡、以及存在的其它疾病。

如本文所示，使受試者中α-KG水平增加約50％的劑量導(dǎo)致最大壽命增加(多達(dá)約70％)。因此，在一些實施方案中，向受試者施用的一種或多種戊二酸化合物和/或一種或多種谷氨酸化合物的量是導(dǎo)致所述受試者中α-KG水平增加約50％的量。

可歷經(jīng)一個時間段以單次劑量或以多次劑量施用治療有效量。舉例來說，受試者可用一種或多種戊二酸化合物和/或一種或多種谷氨酸化合物治療至少一次。然而，受試者可用一種或多種戊二酸化合物和/或一種或多種谷氨酸化合物持續(xù)給定治療時期約每周一次至約每日一次治療。治療時期的時長將取決于多種因素，諸如疾病或病癥的嚴(yán)重性、一種或多種本發(fā)明化合物的濃度和活性、或其組合。也應(yīng)了解一種或多種用于治療的化合物的有效劑量可歷經(jīng)特定治療的過程增加或降低。

可以藥物制劑形式提供待向受試者施用的一種或多種戊二酸化合物和/或一種或多種谷氨酸化合物。藥物制劑可以適于所需施用模式的單位劑型制備。本發(fā)明的藥物制劑可通過任何適合途徑施用，所述途徑包括口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)表面(包括經(jīng)頰和舌下)、經(jīng)陰道和胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))。應(yīng)了解施用途徑可隨接受者的狀況和年齡、待治療的病狀的性質(zhì)、以及本發(fā)明的給定化合物而變化。在一些實施方案中，施用途徑是口服。在一些實施方案中，以食料形式提供一種或多種戊二酸化合物和/或一種或多種谷氨酸化合物。

應(yīng)了解戊二酸化合物和/或谷氨酸化合物的用于藥物制劑中的實際劑量將根據(jù)所使用的特定化合物、配制的特定組合物、施用模式、以及所治療的特定部位、受試者和疾病而變化。用于一組給定病狀的最優(yōu)劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用劑量確定測試鑒于給定化合物的實驗數(shù)據(jù)來確定。前藥的施用可在化學(xué)等效于完全活性形式的重量水平的重量水平下給藥。

本發(fā)明的藥物制劑包含治療有效量的一種或多種本發(fā)明化合物以及惰性藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。如本文所用，措辭“藥學(xué)上可接受的載體”意圖包括可與藥物施用相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包覆劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑等。采用的藥物載體可為固體或液體。固體載體的實例是乳糖、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸等。液體載體的實例是糖漿、花生油、橄欖油、水等。類似地，載體或稀釋劑可包括本領(lǐng)域中已知的延時或定時釋放物質(zhì)，諸如單獨或與蠟一起的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基丙烯酸甲酯等。針對藥物活性物質(zhì)使用所述介質(zhì)和試劑在本領(lǐng)域中是已知的。

戊二酸化合物和谷氨酸化合物的毒性和治療功效可通過在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏羞M(jìn)行的例如用于確定LD₅₀(對群體的50％具有致死性的劑量)和ED₅₀(在群體的50％中具有治療有效性的劑量)的標(biāo)準(zhǔn)藥物程序來測定。毒性作用與治療作用之間的劑量比率是治療指數(shù)，并且它可表示為比率LD₅₀/ED₅₀。展現(xiàn)大治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。盡管可使用展現(xiàn)毒性副作用的化合物，但應(yīng)小心設(shè)計使所述化合物靶向受影響組織的部位的遞送系統(tǒng)以使對未感染細(xì)胞的潛在損害最小，并且由此降低副作用。

由細(xì)胞培養(yǎng)測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制一定范圍的用于人中的劑量。所述化合物的劑量優(yōu)選處于具有少許或不具有毒性的一定范圍的包括ED₅₀的循環(huán)濃度內(nèi)。視采用的劑型和利用的施用途徑而定，劑量可在這個范圍內(nèi)變化。對于用于本發(fā)明方法中的任何化合物，治療有效劑量可初始由細(xì)胞培養(yǎng)測定來估計?？膳渲苿游锬Ｐ椭械膭┝恳詫崿F(xiàn)如在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的循環(huán)血漿濃度范圍，其包括IC₅₀(即測試化合物的實現(xiàn)半數(shù)最大癥狀抑制的濃度)。所述信息可用于更準(zhǔn)確確定適用于人中的劑量?？衫缤ㄟ^高效液相色譜法測量血漿中的水平。

α-KG使成體秀麗隱桿線蟲(C.elegans)的壽命延長

為獲得對由內(nèi)源性小分子調(diào)控衰老的了解，使用秀麗隱桿線蟲模型，針對正常代謝物和異常疾病相關(guān)代謝物對成體壽命的影響來篩選它們。發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)中間體α-KG(而非異檸檬酸或檸檬酸)使衰老延遲，并且使秀麗隱桿線蟲的壽命延長約50％(圖1，圖版a，圖5，圖版a)。在細(xì)胞中，α-KG(或2-氧代戊二酸，圖1，圖版b)通過由異檸檬酸脫氫酶(IDH)催化的氧化脫羧由異檸檬酸產(chǎn)生。α-KG以濃度依賴性方式使野生型N2壽命延長，其中8mMα-KG產(chǎn)生最大壽命延長(圖1，圖版c)；8mM是用于所有隨后秀麗隱桿線蟲實驗中的濃度。相較于媒介物板上的那些(圖5，圖版b)，8mMα-KG板上的蠕蟲中的α-KG濃度有約50％增加，或在假定均質(zhì)分布的情況下，約160μΜ對約110μΜ。α-KG不僅延長壽命，而且也延遲年齡相關(guān)表型，諸如快速協(xié)調(diào)身體動作衰退(補充性視頻1和2，可在因特網(wǎng)上在WorldWideWeb.natureDOTCOM/nature/journal/v510/n7505/fig_tab/nature13264_SV1.HyperTextMarkupLanguage和WorldWideWeb.natureDOTCOM/nature/journal/v510/n7505/fig_tab/nature13264_SV2.HyperTextMarkupLanguage處獲得，其中“WorldWideWeb”是“www”，“DOTCOM”是“.com”，并且“HyperTextMarkupLanguage”是“html”)。在成體期補充α-KG足以達(dá)成長壽(圖5，圖版c)。

已顯示稀釋或殺滅細(xì)菌性食物會延長蠕蟲壽命，但由α-KG達(dá)成的壽命增加不歸因于細(xì)菌增殖、活力或代謝改變(圖1，圖版d-e，圖5，圖版d)。動物也不將α-KG處理的食物視為不太喜愛的(圖5，圖版e-f)，并且在α-KG存在下，在食物攝取、咽泵送、覓食行為、體格大小、或產(chǎn)卵量方面不存在顯著變化(圖5，圖版e-h，數(shù)據(jù)未顯示)。

在細(xì)胞中，α-KG由α-KG脫氫酶(由ogdh-1編碼)脫羧成丁二酰基-CoA和CO₂，這是TCA循環(huán)中的關(guān)鍵控制點。通過ogdh-1RNAi增加α-KG水平(圖5，圖版b)也使蠕蟲壽命延長(圖1，圖版f)，這與α-KG獨立于細(xì)菌性食物對長壽的直接作用一致。

為探究由α-KG達(dá)成的長壽的分子機理，使用無偏生物化學(xué)方法DARTS。易于培養(yǎng)的人細(xì)胞系(Jurkat)用作DARTS的蛋白質(zhì)來源(圖2，圖版a)。質(zhì)譜測定法鑒定在α-KG處理的樣品中存在的最豐富和富含的蛋白質(zhì)之中的ATP5B，即ATP合成酶的催化核心的β亞單位(圖12)；雖然程度較小，但同源性α亞單位ATP5A也是富含的。使用額外細(xì)胞系驗證α-KG與ATP5B之間的相互作用(圖2，圖版b，數(shù)據(jù)未顯示)，并且關(guān)于秀麗隱桿線蟲直系同源物ATP-2加以確證(圖6，圖版a)。

α-KG抑制來自牛心臟線粒體的復(fù)合物V而非復(fù)合物IV的活性(圖2，圖版c，圖6，圖版b，數(shù)據(jù)未顯示)。這個抑制也易于在活哺乳動物細(xì)胞中(圖2，圖版d，數(shù)據(jù)未顯示)以及活線蟲中(圖2，圖版e)檢測到，如通過ATP水平降低所證實。相伴地，氧消耗速率降低(圖2，圖版f-g)，這類似于atp-2敲低的情況(圖6，圖版c)。復(fù)合物V而非其它ETC復(fù)合物由α-KG特異性抑制進(jìn)一步通過呼吸控制分析來確認(rèn)(圖2，圖版h，圖6，圖版d-h)。

為了解由α-KG達(dá)成的抑制的機理，研究ATP合成酶的酶抑制動力學(xué)。α-KG(從α-KG辛酯釋放)使ATP合成酶的有效V_max與K_m兩者均降低，從而指示無競爭性抑制(圖2，圖版i)。

為確定ATP-2對由α-KG達(dá)成的長壽的重要性，測量被給與α-KG的atp-2(RNAi)成體的壽命。atp-2(RNAi)動物比對照活得更長久(圖3，圖版a)。然而，它們的壽命未由α-KG進(jìn)一步延長(圖3，圖版a)，從而指示ATP-2涉及于α-KG的長壽益處中。相反，活的甚至更長久的胰島素/IGF-1受體daf-2(e1370)突變?nèi)湎x的壽命由α-KG進(jìn)一步增加(圖3，圖版b)。值得注意的是，ATP合成酶的抑制劑寡霉素(oligomycin)也延長成體蠕蟲的壽命(圖7，圖版a)?？傊?，由α-KG直接結(jié)合ATP-2、相關(guān)酶抑制、ATP水平和氧消耗降低、壽命分析以及與atp-2敲低或寡霉素處理的其它類似性(也參見圖8)證明α-KG可能通過靶向ATP-2來延長壽命。

發(fā)現(xiàn)α-KG不延長eat-2(ad1116)動物的壽命(圖3，圖版c)，所述動物是咽泵送受損，并且因此食物攝取降低的DR模型。eat-2突變體的長壽涉及DR對長壽的作用的重要介體TOR/let-363。同樣，α-KG不使CeTOR(RNAi)動物的壽命增加(圖3，圖版d)。AMP活化的蛋白質(zhì)激酶(AMPK)是細(xì)胞能量狀態(tài)的另一保守主要感測體。在喂以稀釋細(xì)菌的秀麗隱桿線蟲中，AMPK/aak-2與FoxO轉(zhuǎn)錄因子DAF-16兩者均介導(dǎo)DR誘導(dǎo)的長壽，但在eat-2模型中，兩者均不為壽命延長所需。發(fā)現(xiàn)在aak-2(圖9，圖版a)和daf-16(圖3，圖版e)突變體中，α-KG的長壽作用小于在N2中(P<0.0001)，從而表明α-KG長壽部分涉及AMPK和FoxO；然而，在aak-2(24.3％，P<0.0001)和daf-16(29.5％，P<0.0001)突變體或RNAi動物中，壽命由α-KG顯著增加(圖3，圖版e，圖9，圖版a-b，數(shù)據(jù)未顯示)，從而指示由α-KG在長壽方面達(dá)成的AMPK-FoxO非依賴性作用。

α-KG不能進(jìn)一步延長CeTOR(RNAi)動物的壽命指示α-KG處理和TOR失活通過相同路徑(其中α-KG作用于TOR或TOR的上游)，或通過集中于下游效應(yīng)物的獨立機理或平行路徑來延長壽命。第一模型預(yù)測在α-KG處理后，TOR路徑的活性將較小，而如果后述模型是真性的，那么TOR將不受α-KG處理的影響。支持第一模型的是，發(fā)現(xiàn)在用α-KG辛酯處理的人細(xì)胞中，TOR路徑活性降低(圖4，圖版a，圖10，圖版a-b)。然而，α-KG不直接與TOR相互作用(圖10，圖版d-e)。與TOR涉及于α-KG長壽中一致，F(xiàn)oxA轉(zhuǎn)錄因子PHA-4同樣涉及于α-KG誘導(dǎo)的長壽中(圖3，圖版f)。此外，在用α-KG(或ogdh-1RNAi)處理的蠕蟲中以及在atp-2(RNAi)動物中，由TOR抑制與DR兩者活化的自體吞噬顯著增加(圖4，圖版b-c，圖10，圖版c，圖11)，如由GFP::LGG-1斑點的盛行所指示。

在用α-KG辛酯處理的哺乳動物細(xì)胞中，自體吞噬也被誘導(dǎo)(圖10，圖版f)。此外，在atp-2(RNAi)或CeTOR(RNAi)蠕蟲中，α-KG不導(dǎo)致顯著更大程度的自體吞噬(圖4，圖版b-c)。數(shù)據(jù)提供進(jìn)一步證據(jù)表明α-KG通過抑制ATP合成酶來使TOR路徑活性降低。類似地，自體吞噬由寡霉素誘導(dǎo)，并且寡霉素不加強CeTOR(RNAi)蠕蟲中的自體吞噬(圖7，圖版b-c)。

α-KG不僅是代謝物，而且也是一大家族雙加氧酶的共同底物。缺氧誘導(dǎo)性因子(HIF-1)由這些酶中的一個(即脯氨?；?-羥化酶(PHD)EGL-9)修飾，并且此后由馮希佩爾-林道(von Hippel-Lindau，VHL)蛋白降解。發(fā)現(xiàn)α-KG使具有hif-1、egl-9和vhl-1功能損失突變的動物的壽命延長(圖3，圖版g，圖9，圖版c)，并且由此表明這個路徑在由α-KG延長壽命方面不起主要作用。然而，其它α-KG結(jié)合靶標(biāo)也可在延長壽命方面起作用。

考查在分離的新生大鼠心肌細(xì)胞中，α-KG辛酯針對異丙基去甲腎上腺素(isoproterenol)誘發(fā)的肥大的保護(hù)作用。通過膠原蛋白酶消化來分離新生大鼠的心肌細(xì)胞，并且在含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM中培養(yǎng)過夜，接著將培養(yǎng)基變換成無血清高葡萄糖胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)。通過用1mM異丙基去甲腎上腺素(ISO)或苯腎上腺素(phenylephrine，PE)處理細(xì)胞48小時來誘發(fā)心肌細(xì)胞的肥大。如圖23中所示，α-KG辛酯(200μΜ)完全消除ISO誘發(fā)的肥大(左側(cè)圖版)，以及抑制ISO和PE誘發(fā)的肥大相關(guān)標(biāo)志物心房利鈉因子(ANF)和腦利鈉肽(BNP)的過度表達(dá)(右側(cè)圖版)，從而指示由α-KG達(dá)成的心臟保護(hù)和抗肥大作用。

為測試α-KG辛酯在動物中的生物可用性和口服可用性，對動物喂以α-KG辛酯，并且評估α-KG辛酯的分子和細(xì)胞作用，特別是它對線粒體ATP合成酶(復(fù)合物V)活性的抑制是否可在體內(nèi)重演。持續(xù)一周對小鼠喂以與α-KG辛酯(1.5mg/g體重)或辛醇(對照)預(yù)混合的食物膳食。在用α-KG辛酯或辛醇喂食5天之后，動物在生理上或在行為上未顯示異常。將小鼠處死，收集心臟，并且分離線粒體。使用Seahorse XF-24分析器(Seahorse Bioscience)測量氧消耗速率(OCR)。如圖24中所示，從α-KG喂食的小鼠分離的線粒體(S1、S2)相較于來自對照小鼠的線粒體(C1、C2)展現(xiàn)較低狀態(tài)3呼吸，從而反映α-KG辛酯對分離的線粒體的直接作用。α-KG辛酯喂食的小鼠中的狀態(tài)3呼吸的降低指示α-KG辛酯可被攝取，吸收，并且分布在體內(nèi)以釋放α-KG來作用于它的細(xì)胞靶標(biāo)。

考查α-KG在體內(nèi)的心臟保護(hù)作用。通過使用滲透小型泵(Alzet，1004型)在每天每克體重30μg的劑量下持續(xù)3周長期輸注異丙基去甲腎上腺素來誘發(fā)肥大和心臟衰竭。8周齡的DBA2/J雌性小鼠用于這個研究。在三周研究期間，對小鼠每日喂以含每克體重0.5mgα-KG辛酯的食物。在實驗結(jié)束時，通過評估心臟大小以及心臟與身體重量比率來確定ISO誘發(fā)的心臟肥大和心肌病變。如圖25的左側(cè)圖版中所示，在實驗結(jié)束時，心臟(mg)/身體(g)比率是5.32±0.26(n＝4)(對于對照組)、7.26±0.12(n＝3)(對于ISO和辛醇處理組)、以及6.81±0.24(n＝6)(平均值，STEDV)(對于ISO和α-KG辛酯處理組)。ISO處理的小鼠顯示心臟大小以及心臟與身體重量比率顯著增加，而ISO處理的小鼠在也用α-KG辛酯治療時展現(xiàn)心臟大小以及心臟與身體重量比率顯著降低。

更重要的是，評估心輸出量，并且通過超聲波心動描記術(shù)來測定心臟射血分?jǐn)?shù)。在處理之前的基礎(chǔ)水平的心臟EF是55.1％±2.6(n＝14)。如圖25的右側(cè)圖版中所示，在研究結(jié)束時(3周)，心臟EF是54.5％+0.9(對于無ISO對照組(n＝2))、49.2％±1.9(對于ISO處理組(與辛醇一起)(n＝3))、以及53.8％±2.3(對于ISO加α-KG辛酯處理(n＝6))。在三周之后，對照組(無ISO，加辛醇)的EF與在處理之前的基礎(chǔ)類似。相較于無ISO組，ISO處理組的EF顯著降低。值得注意的是，ISO加α-KG辛酯的EF被恢復(fù)至無ISO組的水平。這些結(jié)果顯示在實驗性心臟衰竭動物模型中，α-KG可顯著減輕ISO誘發(fā)的心臟肥大，并且恢復(fù)心輸出量。

2-HG使成體秀麗隱桿線蟲的壽命延長

盡管2-HG與α-KG展現(xiàn)結(jié)構(gòu)類似性(圖14，圖版A)，但2-HG與神經(jīng)病癥、癌癥和各種與年齡相關(guān)的疾病相關(guān)聯(lián)。因此，用2-HG進(jìn)行各種實驗以確定2-HG是否導(dǎo)致長壽降低。驚人地，(R)-2-HG與(S)-2-HG兩者均在與α-KG類似的程度上使秀麗隱桿線蟲的壽命增加(圖14，圖版B-C)。

DARTS分析顯示2-HG靶向ATP5B。具體來說，發(fā)現(xiàn)(R)-2-HG與(S)-2-HG兩者均結(jié)合ATP5B(圖15，圖版A，并且數(shù)據(jù)未顯示)。類似于α-KG，2-HG抑制ATP合成酶(復(fù)合物V)(圖15，圖版B)。這個抑制是特異性的，因為2-HG不抑制其它電子傳遞鏈(ETC)復(fù)合物(圖18，圖版A)，或ADP向線粒體中輸入(圖18，圖版B)。由2-HG抑制ATP合成酶也易于在活細(xì)胞中檢測到；用膜可滲透性α-KG辛酯或2-HG辛酯處理U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(野生型IDH1/2)導(dǎo)致在線粒體氧化磷酸化情況下細(xì)胞ATP含量降低(圖15，圖版C)，如同明確確定的ATP合成酶抑制劑寡霉素一樣(圖19，圖版A)。在處理的細(xì)胞中，總體氧消耗速率與ATP合成酶關(guān)聯(lián)的氧消耗速率兩者均降低(圖15，圖版D以及圖19，圖版B-C)。

在約200μΜ的正常細(xì)胞濃度下，(R)-2-HG不大可能導(dǎo)致對ATP合成酶的顯著抑制。然而，在其中(R)-2-HG積累至天然內(nèi)源性水平的10-100倍的具有IDH1或IDH2突變的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中，抑制ATP合成酶將為可能的。為測試這個理念，使用穩(wěn)定表達(dá)IDH1(R132H)(即神經(jīng)膠質(zhì)瘤中最常見的IDH突變)的U87細(xì)胞。類似于上述2-HG辛酯處理的細(xì)胞，U87/IDH1(R132H)細(xì)胞相較于等基因IDH1(WT)表達(dá)性U87細(xì)胞展現(xiàn)ATP含量和氧消耗速率降低(圖16，圖版A-B)。在HCT 116IDH1(R132H/+)細(xì)胞中獲得類似結(jié)果(圖20，圖版A)。在表達(dá)IDH1(R132H)的U87和HCT 116細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)(R)-2-HG水平比對照細(xì)胞高約50-100倍(圖16，圖版C，以及圖20，圖版B)，并且與見于進(jìn)行(R)-2-HG辛酯處理的細(xì)胞(圖16，圖版D)和IDH1突變腫瘤樣品中的(R)-2-HG水平增加類似。這些數(shù)據(jù)與在突變IDH1癌細(xì)胞中，由(R)-2-HG抑制ATP合成酶和線粒體呼吸一致。

代謝物2-HG與TCA循環(huán)和相關(guān)氨基酸代謝路徑相關(guān)聯(lián)(圖16，圖版E)。為探究在2-HG辛酯處理后的潛在代謝變化，通過LC-MS測量2-HG辛酯處理的細(xì)胞中的代謝物水平。發(fā)現(xiàn)在2-HG辛酯處理之后，2-HG積累至約20-100倍(圖16，圖版D，以及圖20，圖版C)。相較于2-HG的積累，TCA循環(huán)代謝物或相關(guān)氨基酸不存在顯著變化(<2倍)(圖16，圖版D，以及圖20，圖版C)。類似地，在α-KG辛酯處理的樣品中，α-KG的積累是代謝概況方面的最深度變化(圖20，圖版D)。靜態(tài)代謝概況支持以下見解：在2-HG(或α-KG)處理的細(xì)胞中觀察的生物能轉(zhuǎn)變(以及信號傳導(dǎo)變化，參見下文)由ATP合成酶受2-HG(或α-KG)直接抑制而非整體代謝效應(yīng)所致。

作為線粒體電子傳遞鏈(ETC)的末端組分(復(fù)合物V)，ATP合成酶是細(xì)胞能量的主要來源以及唯一氧化磷酸化位點。當(dāng)糖酵解受抑制時，諸如在葡萄糖不足的情況下，細(xì)胞被迫依賴于線粒體呼吸作為ATP的來源。因此，固有抑制突變IDH1癌細(xì)胞中的ATP合成酶和線粒體呼吸表明對于這些癌癥來說可能的致命要害(Achilles'heel)。支持這個理念的是，當(dāng)在無葡萄糖的含半乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，例如當(dāng)呼吸是主要能量來源時，IDH1(R132H)細(xì)胞展現(xiàn)細(xì)胞活力劇烈降低(圖17，圖版A以及圖21，圖版A)。這些結(jié)果指示IDH1(R132H)突變細(xì)胞對葡萄糖的剝奪特別敏感。突變細(xì)胞系對FBS剝奪不敏感(數(shù)據(jù)未顯示)，從而指示它對葡萄糖饑餓的增加的易感性是特異性的。在用α-KG辛酯或2-HG辛酯處理的U87細(xì)胞中(圖17，圖版B-D)以及在ATP5B敲低細(xì)胞中(圖17，圖版E)，類似代謝易感性是明顯的。這些研究結(jié)果指示具有IDH1(R132H)突變的癌細(xì)胞歸因于由于ATP合成酶關(guān)閉而不能利用線粒體呼吸，所以也可對與葡萄糖限制類似的營養(yǎng)條件特別敏感。

在復(fù)雜生物體中，葡萄糖限制可通過酮癥來實現(xiàn)，其中細(xì)胞使用酮體(而非葡萄糖)來獲得能量。在長期饑餓(或禁食)后，酮癥被天然誘發(fā)，呈現(xiàn)身體從它的相對持久脂肪儲集庫獲得能量，同時使肌肉和其它組織中的蛋白質(zhì)免受分解代謝的存活模式。酮癥也可通過已顯示抗癌益處的低碳水化合物-高脂肪“生酮膳食”實現(xiàn)。關(guān)于這個的一個原因可為腫瘤細(xì)胞主要依賴于葡萄糖來達(dá)成生長和存活。因為酮體的代謝完全依賴于線粒體氧化磷酸化，所以一個預(yù)測是如果酮體將是癌細(xì)胞的唯一能量來源，那么抑制癌細(xì)胞中的ATP合成酶(或其它ETC組分)將賦予存活劣勢。因為U87細(xì)胞不能利用酮體來獲得能量，所以為直接評估IDH1突變的影響，使用表達(dá)突變IDH1的HCT 116細(xì)胞。當(dāng)在含有酮體(R)-3-羥基丁酸的生酮(無葡萄糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，IDH1突變HCT 116細(xì)胞相較于親本細(xì)胞顯示活力深度降低(圖17，圖版F)，從而確認(rèn)IDH突變細(xì)胞的所聲稱的代謝弱點。這些結(jié)果不僅進(jìn)一步支持2-HG在突變IDH癌細(xì)胞中積累導(dǎo)致ATP合成酶抑制的研究結(jié)果，而且也表明在癌癥治療方面的新型代謝治療策略。

類似于用降低TOR信號傳導(dǎo)的ATP合成酶抑制劑α-KG辛酯或寡霉素處理，發(fā)現(xiàn)在ATP5B敲低細(xì)胞中(圖17，圖版G)，在用2-HG的辛酯處理的細(xì)胞中(圖17，圖版H)，以及在IDH1(R132H)表達(dá)性細(xì)胞中(圖17，圖版I)，包括S6K和4E-BP1的mTOR復(fù)合物1底物的磷酸化被降低。這些結(jié)果指示抑制ATP合成酶導(dǎo)致細(xì)胞中的mTOR活性降低，這與在蠕蟲和蒼蠅中獲得的結(jié)果一致。因為TOR是細(xì)胞生長的主要調(diào)控子，所以ATP合成酶受抑制的細(xì)胞中的mTOR路徑活性降低預(yù)示可能的細(xì)胞生長阻滯。實際上，當(dāng)以半乳糖作為唯一糖源培養(yǎng)ATP5B敲低細(xì)胞時，例如當(dāng)它們被迫依賴于線粒體呼吸來產(chǎn)生ATP時，生長被完全阻滯(圖17，圖版E)。即使在葡萄糖培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長降低也可易于檢測(圖22，圖版A)。用α-KG辛酯或2-HG辛酯處理類似地抑制U87細(xì)胞生長(圖22，圖版B-D)。在測試的其它癌細(xì)胞系(包括A549和Jurkat)中，在永生化非惡性HEK 293細(xì)胞中，以及在正常人二倍體纖維母細(xì)胞WI-38中，也觀察到由2-HG(以及由α-KG)達(dá)成的生長抑制(數(shù)據(jù)未顯示)，從而表明生長抑制的機理可為通用的，并且過量2-HG可充當(dāng)生長抑制性代謝物。在表達(dá)突變IDH1(R132H)的U87細(xì)胞與HCT 116細(xì)胞兩者中，類似生長抑制均是明顯的(圖22，圖版E以及圖21，圖版B)。這些數(shù)據(jù)一起表明突變IDH1細(xì)胞中ATP合成酶和mTOR的一致抑制狀態(tài)。

總之，類似于α-KG，2-HG的兩種對映異構(gòu)體均結(jié)合并抑制ATP合成酶，并且使秀麗隱桿線蟲的壽命延長。由這些相關(guān)代謝物對ATP合成酶的抑制使線粒體呼吸和mTOR信號傳導(dǎo)降低。2-HG與α-KG兩者均展現(xiàn)廣泛生長抑制作用，并且在葡萄糖限制條件下降低癌細(xì)胞活力。本文實驗表明盡管2-HG是干擾各種α-KG結(jié)合因子，在癌癥中具有重要性的致癌性代謝物，但2-HG也-通過抑制ATP合成酶和mTOR信號傳導(dǎo)下游-來起降低腫瘤細(xì)胞生長和活力的作用。

以下實施例意圖說明而非限制本發(fā)明。

實施例

線蟲品系和維持。使用本領(lǐng)域中已知的方法維持秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)品系。使用以下品系：

細(xì)胞培養(yǎng)

在補充以10％胎牛血清(FBS)和10mM葡萄糖的無葡萄糖DMEM(Life technologies,11966-025)中，或當(dāng)指示時在補充以10％FBS和10mM半乳糖的無葡萄糖DMEM中培養(yǎng)U87細(xì)胞。IDH1(R132H)突變或IDH1(WT)表達(dá)性U87細(xì)胞如所報道(Li等Neuro Oncol 15,57-68)。用補充以10％FBS的EMEM(ATCC，30-2003)培養(yǎng)正常人二倍體纖維母細(xì)胞WI-38(ATCC，CCL-75)。用補充以10％FBS的DMEM(Life technologies,11966-065)培養(yǎng)HEK 293、A549和HeLa細(xì)胞。在補充以10％FBS的RPMI(Life technologies,11875-093)中培養(yǎng)Jurkat和HCT 116細(xì)胞。所有細(xì)胞都在37℃和5％CO₂下培養(yǎng)。通過遵循制造商說明書，使用Thermo Scientific DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑1，用指示的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過在生長抑制測定的第一天和最后一天進(jìn)行免疫印跡來確認(rèn)敲低效率。

化合物

使用本領(lǐng)域中已知的方法合成α-KG 1-辛酯、(S)-2-HG辛酯和(R)-2-HG辛酯。參見Jung和Deng,J Org Chem 77,11002-11005(2012)；Albert等.Synthesis-Stuttgart,635-637(1987)；以及Cancer Cell 19,17-30(2011)。對合成方法的修改如下：

合成α-KG辛酯

簡要來說，在0℃下，添加1-辛醇(0.95ml，6.0mmol)、DMAP(37mg，0.3mmol)和DCC(0.743g，3.6mmol)至1-環(huán)丁烯-1-甲酸(0.295g，3.0mmol)于無水CH₂Cl₂(6.0ml)中的溶液中。在已攪拌1小時之后，使溶液升溫至室溫，并且再攪拌8小時。過濾沉淀，并且用乙酸乙酯(3X 100ml)洗滌。合并的有機相用水和鹽水洗滌，并且經(jīng)無水Na₂SO₄干燥。用80/1己烷/乙酸乙酯洗脫的硅膠快速柱色譜法產(chǎn)生呈澄清油狀的環(huán)丁-1-烯甲酸辛酯(0.604g，96％)。向這個油狀物(0.211g，1.0mmol)于CH₂Cl₂(10ml)中的-78℃溶液中鼓泡O₃/O₂直至溶液變藍(lán)。通過用O₂鼓泡來排放殘余臭氧，并且使反應(yīng)升溫至室溫并再攪拌1小時。添加二甲基硫醚(Me₂S，0.11ml，1.5mmol)至混合物中，并且將它再攪拌2小時。在真空中移除CH₂Cl₂，并且將粗產(chǎn)物溶解于2-甲基-2-丁烯(0.8ml)于t-BuOH(3.0ml)中的溶液中。向這個中逐滴添加于H₂O(1.0ml)中含有亞氯酸鈉(0.147g，1.3mmol)和磷酸二氫鈉單水合物(0.179g，1.3mmol)的溶液。將混合物在室溫下攪拌過夜，接著用乙酸乙酯(3X 50ml)萃取。合并的有機相用水和鹽水洗滌，并且經(jīng)無水Na₂SO₄干燥。用5/1己烷/乙酸乙酯洗脫的硅膠快速柱色譜法產(chǎn)生α-KG辛酯，其在于冰箱中儲存時變?yōu)榛野咨腆w(0.216g，84％)。

合成L-Glu 5-辛酯((S)-2-氨基-5-(辛基氧基)-5-氧代戊酸)

將L-谷氨酸(0.147g，1.0mmol)和無水硫酸鈉(0.1g)溶解于辛醇(2.0ml)中，接著添加四氟硼酸-二甲基醚復(fù)合物(0.17ml)。將懸浮混合物在21℃下攪拌過夜。添加無水THF(5ml)至混合物中，并且將它經(jīng)厚活性炭墊過濾。添加無水三乙胺(0.4ml)至澄清濾液中以獲得乳白色漿液。在用乙酸乙酯(10ml)濕磨后，單酯單酸得以沉淀。收集沉淀，用額外乙酸乙酯(2X 5ml)洗滌，并且在真空中干燥以產(chǎn)生呈白色固體狀的所需產(chǎn)物L(fēng)-Glu 5-辛酯(0.249g，96％)。¹H NMR(500MHz,乙酸-d₄):δ4.12(dd,J＝6.6,6.6Hz,1H),4.1 1(t,J＝6.8Hz,2H),2.64(m,2H),2.26(m,2H),1.64(m,2H),1.30(m,10H),0.89(t,J＝7.0Hz,3H)。¹³C NMR(125MHz,乙酸-d₄):175.0,174.3,66.3,55.0,32.7,30.9,30.1 1,30.08,29.3,26.7,26.3,23.4,14.4。

合成D-Glu 5-辛酯((R)-2-氨基-5-(辛基氧基)-5-氧代戊酸)

通過嚴(yán)格相同程序，以D-谷氨酸起始來進(jìn)行相對對映異構(gòu)體(即D-Glu5-辛酯)的合成。光譜數(shù)據(jù)與對映異構(gòu)化合物的光譜數(shù)據(jù)相同。

合成α-KG 5-辛酯(5-(辛基氧基)-2,5-二氧代戊酸)

2-氧代戊二酸1-苯甲酯5-辛酯：向L-Glu 5-辛酯(0.249g)于H₂O(6.0ml)和乙酸(2.0ml)中的冷卻至0℃的溶液中緩慢添加亞硝酸鈉水溶液(0.207g，3.0mmol，于4ml H₂O中)。使反應(yīng)混合物緩慢升溫至室溫并攪拌過夜。濃縮混合物。將所得殘余物溶解于DMF(10ml)中，并且添加NaHCO₃(0.42g，5.0mmol)和苯甲基溴化物(0.242ml，2.0mmol)至混合物中。將混合物在21℃下攪拌過夜，接著用乙酸乙酯(3x 30ml)萃取。合并的有機相用水和鹽水洗滌，并且經(jīng)無水MgSO₄干燥。用7/1己烷/乙酸乙酯洗脫的硅膠快速柱色譜法產(chǎn)生呈無色油狀的混合二酯(S)-2-羥基戊二酸1-苯甲酯5-辛酯。向溶解于二氯甲烷(10.0ml)中的這個油狀物中添加NaHCO₃(0.42g，5.0mmol)和戴斯-馬丁(Dess-Martin)過碘烷(0.509g，1.2mmol)，并且在室溫下攪拌混合物1小時，接著用乙酸乙酯(3x 30ml)萃取。合并的有機相用水和鹽水洗滌，并且經(jīng)無水MgSO₄干燥。用5/1己烷/乙酸乙酯洗脫的硅膠快速柱色譜法產(chǎn)生呈白色固體狀的所需2-氧代戊二酸1-苯甲酯5-辛酯(0.22g，66％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):7.38(m,5H),5.27(s,2H),4.05(t,J＝6.5Hz,2H),3.14(t,J＝6.5Hz,2H),2.64(t,J＝6.5Hz,2H),1.59(m,2H),1.28(m,10H),0.87(t,J＝7.0Hz,3H)。¹³C NMR(125MHz,CDCl₃):192.2,171.9,160.1,134.3,128.7,128.6,128.5,67.9,65.0,34.2,31.7,29.07,29.05,28.4,27.5,25.7,22.5,14.0。

α-KG 5-辛酯(5-(辛基氧基)-2,5-二氧代戊酸)：向2-氧代戊二酸1-苯甲酯5-辛酯(0.12g，0.344mmol)于乙酸乙酯(15ml)中的溶液中添加5％Pd/C(80mg)。使氬氣流在混合物上通過，接著用氫氣替換氬氣，并且劇烈攪拌混合物15分鐘?；旌衔锝?jīng)厚硅藻土墊過濾以產(chǎn)生呈白色固體狀的所需產(chǎn)物α-KG5-辛酯(0.088g，99％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):8.16(br s,1H),4.06(t,J＝6.5Hz,2H),3.18(t,J＝6.5Hz,2H),2.69(t,J＝6.0Hz,2H),1.59(m,2H),1.26(m,10H),0.85(t,J＝7.0Hz,3H).。¹³C NMR(125MHz,CDC l₃):193.8,172.7,160.5,65.5,33.0,31.7,29.08,29.06,28.4,27.8,25.8,22.5,14.0。

合成(S)2-羥基戊二酸1-辛酯((S)-2-HG辛酯)

(S)-2-氨基-5-(苯甲基氧基)-5-氧代戊酸：將L-谷氨酸(2.0g，13.6mmol)和無水硫酸鈉(2.0g)溶解于苯甲醇(25ml)中，接著添加四氟硼酸乙醚復(fù)合物(3.7ml，27.2mmol)。將懸浮混合物在21℃下攪拌過夜。添加無水THF(75ml)至混合物中，并且將它經(jīng)厚活性炭墊過濾。添加無水三乙胺(4.1ml)至澄清濾液中以獲得乳白色漿液。在用乙酸乙酯(100ml)濕磨后，單酯單酸得以沉淀。將它收集，用額外乙酸乙酯(2x 10ml)洗滌，并且在真空中干燥以產(chǎn)生呈白色固體狀的所需產(chǎn)物(S)-2-氨基-5-(苯甲基氧基)-5-氧代戊酸(3.07g，95％)。¹H NMR(500MHz,乙酸-d₄):δ7.41-7.25(m,5H),5.14(s,2H),4.12(m,1H),2.75-2.60(m,2H),2.27(m,2H)。¹³C NMR(125MHz,乙酸-d₄):δ174.6,174.4,136.9,129.5,129.2,129.1,67.7,55.0,30.9,26.3。

(S)-2-羥基戊二酸5-苯甲酯1-辛酯：向(S)-2-氨基-5-(苯甲基氧基)-5-氧代戊酸(1.187g，5.0mmol)于H₂O(25ml)和乙酸(10ml)中的冷卻至0℃的溶液中緩慢添加亞硝酸鈉水溶液(1.07g于15ml H₂O中)。使反應(yīng)混合物緩慢升溫至室溫并攪拌過夜。濃縮混合物。將所得殘余物溶解于DMF(15ml)中，并且添加NaHCO₃(1.26g，15mmol)和1-碘辛烷(1.84ml，10mmol)至混合物中。將混合物在21℃下攪拌過夜，接著用乙酸乙酯(3x 50ml)萃取。合并的有機相用水和鹽水洗滌，并且經(jīng)無水MgSO₄干燥。用7/1己烷/乙酸乙酯洗脫的硅膠快速柱色譜法產(chǎn)生呈無色油狀的所需混合二酯(S)-2-羥基戊二酸5-苯甲酯1-辛酯(0.785g,45％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ7.37-7.28(m,5H),5.12(s,2H),4.26-4.19(m,1H),4.16(t,J＝6.8Hz,2H),3.11(d,J＝4.1Hz,1H),2.61-2.46(m,2H),2.26-2.14(m,1H),1.95(dtd,J＝14.2,8.3,6.1Hz,1H),1.71-1.57(m,2H),1.39-1.20(m,10H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H)。¹³C NMR(125MHz,CDCl₃):δ174.6,172.8,135.8,128.4,128.1,128.0,69.3,66.2,65.8,31.6,29.6,29.2,29.0(2C's),28.4,25.6,22.5,13.9。

(S)2-羥基戊二酸1-辛酯((S)-2-羥基戊二酸辛酯；(S)-2-HG辛酯)：向(S)-2-羥基戊二酸5-苯甲酯1-辛酯(0.71g，2.0mmol)于MeOH(50ml)中的溶液中添加5％Pd/C(80mg)。使氬氣條件在混合物上通過，接著用氫氣替換氬氣，并且劇烈攪拌混合物1小時?；旌衔锝?jīng)厚硅藻土墊過濾，并且蒸發(fā)有機相。通過用25/1CH₂Cl₂/MeOH洗脫的硅膠快速柱色譜法純化殘余物以產(chǎn)生呈白色固體狀的(S)-2-HG辛酯(0.495g，48％)。¹H NMR(500MHz,CDC l₃):δ4.23(dd,J＝8.0,4.2Hz,1H),4.16(t,J＝6.8Hz,2H),2.60-2.42(m,2H),2.15(m,1H),1.92(dtd,J＝14.2,8.2,6.1Hz,1H),1.69-1.59(m,2H),1.38-1.16(m,10H),0.86(t,J＝7.0Hz,3H)。¹³C NMR(125MHz,CDC l₃):δ178.8,174.8,69.3,66.1,31.7,29.4,29.1(2C's),28.9,28.4,25.7,22.5,14.0。

合成(R)2-羥基戊二酸1-辛酯((R)-2-HG辛酯)

通過嚴(yán)格相同程序，以D-谷氨酸起始來進(jìn)行相對對映異構(gòu)體(即(R)-2-HG辛酯)的合成。光譜數(shù)據(jù)與對映異構(gòu)化合物的光譜數(shù)據(jù)相同。

秀麗隱桿線蟲中的RNAi

通過對蠕蟲喂以從pL4440載體表達(dá)靶標(biāo)基因雙鏈RNA(dsRNA)的HT115(DE3)細(xì)菌來實現(xiàn)秀麗隱桿線蟲中的RNAi。參見Timmons和Fire,Nature 395,854(1998)。在含有1mM IPTG的板上過夜誘導(dǎo)dsRNA產(chǎn)生。除非另外陳述，否則所有RNAi喂食克隆都從秀麗隱桿線蟲ORF-RNAi文庫(Thermo Scientific/Open Biosystems)獲得。秀麗隱桿線蟲TOR(CeTOR)RNAi克隆(Long等.Curr Biol 12,1448-1461(2002))從Joseph Avruch(MGH/Harvard)獲得。通過相應(yīng)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡或通過mRNA的qRT-PCR來確認(rèn)高效敲低。用于qRT-PCR的引物序列如下：

atp-2正向：TGACAACATTTTCCGTTTCACC(SEQ ID NO:1)

atp-2反向：AAATAGCCTGGACGGATGTGAT(SEQ ID NO:2)

let-363/CeTOR正向：GATCCGAGACAAGATGAACGTG(SEQ ID NO:3)

let-363/CeTOR反向：ACAATTTGGAACCCAACCAATC(SEQ ID NO:4)

ogdh-1正向：TGATTTGGACCGAGAATTCCTT(SEQ ID NO:5)

ogdh-1反向：GGATCAGACGTTTGAACAGCAC(SEQ ID NO:6)

通過定量RT-PCR驗證ogdh-1與atp-2兩者的RNAi敲低，并且也通過蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)驗證atp-2敲低。在表達(dá)相應(yīng)dsRNA的細(xì)菌上培養(yǎng)的幼體中，ogdh-1的轉(zhuǎn)錄物降低85％，并且atp-2的轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)水平分別降低52％和83％。此外，發(fā)現(xiàn)atp-2的RNAi與延遲的胚后期發(fā)育和幼體阻滯相關(guān)聯(lián)，此與atp-2(ua2)動物的表型一致。通過qRT-PCR進(jìn)行的分析指示在經(jīng)受RNAi的幼體中，CeTOR的轉(zhuǎn)錄物適度但顯著降低26％；此外，在這些動物中，自體吞噬的分子標(biāo)志物被誘導(dǎo)，并且成體的壽命被延長，此與激酶的部分失活一致。

在壽命實驗中，RNAi用于在存在或不存在外源性α-KG下失活成熟動物中的atp-2、ogdh-1和CeTOR。憑經(jīng)驗確定用于這些實驗中的α-KG的濃度(8mM)最有益于野生型動物(圖1，圖版c)。這個方法使得能夠評估必需蛋白質(zhì)和路徑對由補充性α-KG賦予的長壽的作用。具體來說，實質(zhì)性而非完全失活已完成胚胎和幼體發(fā)育的成體動物中的atp-2是可能的。如本文所述，補充以8mMα-KG不進(jìn)一步延長(并且實際上，有一次甚至降低)atp-2(RNAi)動物的壽命(圖13)，由此指示atp-2被涉及。在另一方面，完全失活atp-2將具有致死性，并且由此掩蔽由α-KG抑制ATP合成酶的益處。

壽命分析

使用標(biāo)準(zhǔn)方案在20℃下在固體線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)上進(jìn)行壽命測定，并且在至少兩個獨立實驗中重復(fù)。通過進(jìn)行定時產(chǎn)卵(Sutphin和Kaeberlein,J Vis Exp(2009))或進(jìn)行卵制備(在70μl M9緩沖液、25μl漂白劑(10％次氯酸鈉溶液)和5μl 10N NaOH中溶解約100個妊娠蠕蟲(Brenner Genetics 77,71-94(1974)))來使秀麗隱桿線蟲同步。將幼小成體動物挑選于含有1.5％二甲亞砜(DMSO；Sigma,D8418)、49.5μΜ5-氟-2’-脫氧尿苷(Sutphin和Kaeberlein,J Vis Exp(2009))(FUDR；Sigma,F0503)、D-2-HG(Sigma,H8378)或L-2-HG(Sigma,90790)和α-KG(Sigma,K1128)或媒介物對照(H₂O)的NGM測定板上。FUDR被包括來防止子代產(chǎn)生。通過添加NaOH來調(diào)整含有α-KG的培養(yǎng)基至pH 6.0(與對照板相同的pH)。在熱壓處理之后以及在培養(yǎng)基固化之前，將所有化合物混入NGM培養(yǎng)基中。用OP50(或指定RNAi喂食克隆，參見下文)接種測定板。每4天將蠕蟲移動至新測定板(以確保一直存在足夠食物以及降低霉菌污染的風(fēng)險)。為評估蠕蟲的存活，每2-3天用鉑線刺戳動物，并且將未能響應(yīng)的那些記為死亡。對于涉及突變品系的分析，相應(yīng)親本品系在相同實驗中用作對照。

對于涉及RNAi的壽命實驗，各板也含有1mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG；Acros,CAS 367-93-1)和50μg/ml氨芐青霉素(Fisher,BP1760-25)。通過對N2蠕蟲喂以從pL4440表達(dá)靶標(biāo)基因dsRNA的HT115(DE3)細(xì)菌來實現(xiàn)RNAi(Timmons和Fire,Nature 395,854(1998))；對于每個實驗，通過對N2蠕蟲喂以表達(dá)GFP dsRNA或空載體(其給出相同壽命結(jié)果)的HT115(DE3)細(xì)菌來平行進(jìn)行對照RNAi。

如對于α-KG所述用寡霉素(Cell Signaling Technology,9996)進(jìn)行壽命實驗(具有1.5％DMSO和49.5μΜF(xiàn)UDR的NGM板；N2蠕蟲；OP50細(xì)菌)。

對于涉及smg-1(cc546ts)；pha-4(zu225)和smg-1(cc546ts)的壽命實驗(Timmons和Fire,Nature 395,854(1998)；以及Gaudet和Mango,Science 295,821-825(2002))，使品系在24℃下從卵生長至L4期，這使smg-1溫度敏感性等位基因失活，防止了含有提前終止密碼子的pha-4(zu225)mRNA的mRNA監(jiān)督介導(dǎo)的降解，并因此產(chǎn)生截短但功能齊全的PHA-4轉(zhuǎn)錄因子(Gaudet和Mango,Science 295,821-825(2002))。接著在L4期，使溫度變換至20℃，此恢復(fù)smg-1功能，并且由此導(dǎo)致pha-4(zu225)mRNA降解。用α-KG處理開始于L4期。

壽命數(shù)據(jù)提供于圖13中，包括樣本大小?；诔霭娴氖指逯性谝巴鈭?zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)來選擇樣本大小。無統(tǒng)計方法用于預(yù)先確定樣本大小。將動物隨機分配至實驗組中。破裂、袋狀化(例如展現(xiàn)內(nèi)部子代孵化)或爬出板的蠕蟲被刪截。使用GraphPad Prism分析壽命數(shù)據(jù)；使用對數(shù)秩(曼特爾-考克斯(Mantel-Cox))檢驗計算P值。

食物偏好測定

如下進(jìn)行從Abada等(Mol Cells 28,209-213(2009))改編的方案。用兩個OP50斑點接種10cm NGM板，如圖5，圖版e中所示。在讓OP50菌苔在室溫下歷經(jīng)2天干燥之后，添加媒介物(H₂O)或α-KG(8mM)至菌苔的上部，并且使其在室溫下歷經(jīng)2天干燥。將約50-100個同步成體第1天蠕蟲放置于板的中心上，并且在室溫下3小時之后記錄它們對任一細(xì)菌菌苔的偏好。

使用藥物親和力響應(yīng)性靶標(biāo)穩(wěn)定性(DARTS)進(jìn)行靶標(biāo)鑒定

根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法使用DARTS進(jìn)行靶標(biāo)鑒定。參見例如Lomenick等PNAS USA 106,21984-21989(2009)。對于無偏靶標(biāo)ID(圖2，圖版a)，使用M-PER(Thermo Scientific,78501)，在添加蛋白酶抑制劑(Roche,11836153001)和磷酸酶抑制劑(Lomenick等Curr Protoc Chem Biol 3,163-180(2011))下溶解人Jurkat細(xì)胞。添加TNC緩沖液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM NaCl、10mM CaCl₂)至溶解產(chǎn)物中，并且接著使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce,23227)測定蛋白質(zhì)濃度。使細(xì)胞溶解產(chǎn)物與媒介物(H₂O)或α-KG一起在冰上孵育1小時，隨后在室溫下再孵育20分鐘。使用鏈霉蛋白酶(Pronase)(Roche,10165921001)在室溫下進(jìn)行30分鐘消化，并且使用過量蛋白酶抑制劑以及立刻轉(zhuǎn)移至冰中來終止。所得消化物通過SDS-PAGE分離，并且使用SYPRO Ruby蛋白凝膠染色劑(Invitrogen,S12000)觀察。將來自α-KG泳道的染色增加的條帶(對應(yīng)于由于α-KG的結(jié)合而被保護(hù)免遭蛋白水解的潛在蛋白質(zhì)靶標(biāo))和對照泳道的匹配區(qū)域切除，進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化，并且如所述(Lomenick等PNAS USA 106,21984-21989(2009)；以及Lomenick等ACS Chem Biol 6,34-46(2011))經(jīng)受LC-MS/MS分析。使用2.3.0版Mascot，以所有肽都滿足顯著性閾值0.05，相對于人Swissprot數(shù)據(jù)庫(57.15發(fā)布版)搜索質(zhì)譜測定法結(jié)果。

對于通過DARTS-蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行的靶標(biāo)驗證(圖2，圖版b)，在M-PER緩沖液(Thermo Scientific,78501)中，在添加蛋白酶抑制劑(Roche,11836153001)和磷酸酶抑制劑(50mM NaF、10mMβ-甘油磷酸酯、5mM焦磷酸鈉、2mM Na₃VO₄)下溶解HeLa細(xì)胞。添加冷卻TNC緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8.0、50mM NaCl、10mM CaCl₂)至蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)物中，并且通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce,23227)測量溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度。接著使蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)物與媒介物對照(H₂O)或不同濃度的α-KG一起在室溫下在600rpm下振蕩下在Eppendorf熱混合器中孵育3小時。在室溫下進(jìn)行20分鐘鏈霉蛋白酶(Roche,10165921001)消化，并且通過添加SDS裝載緩沖液以及立刻在70℃下加熱10分鐘來終止。使樣品在4-12％Bis-Tris梯度凝膠(Invitrogen,NP0322BOX)上經(jīng)受SDS-PAGE，并且針對ATP合成酶亞單位ATP5B(Sigma,AV48185)、ATP5O(Abcam,ab91400)和ATP5A(Abcam,ab110273)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。通過DARTS確認(rèn)α-KG與α-KG是其共同底物(Stubbs等J Med Chem 52,2799-2805(2009))的PHD-2/Egln1(D31E11)兔mAb(Cell Signaling Technology,4835)之間的結(jié)合。GAPDH(Ambion,AM4300)用作陰性對照。

對于使用秀麗隱桿線蟲進(jìn)行的DARTS(圖6，圖版a)，使各種齡期的野生型動物在NGM/OP50板上生長，用M9緩沖液洗滌4次，并且立刻放置在-80℃冷凍器中。使用溶解基質(zhì)C管(MP Biomedicals,6912-100)和FastPrep-24(MP Biomedicals)高速臺式均質(zhì)器在4℃室中在HEPES緩沖液(40mM HEPES pH 8.0、120mM NaCl、10％甘油、0.5％Triton X-100、10mMβ-甘油磷酸酯、50mM NaF、0.2mM Na₃VO₄、蛋白酶抑制劑(Roche,11836153001))中溶解動物(在6.5m/s下破壞蠕蟲20秒，在冰上靜息1分鐘；重復(fù)兩次)。在4℃下在14,000rpm下離心溶解的動物10分鐘以集結(jié)蠕蟲碎片，并且收集上清液供DARTS使用。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce,23223)來測定蛋白質(zhì)濃度。1.13μg/μl的蠕蟲溶解產(chǎn)物濃度用于DARTS實驗。所有步驟都在冰上或在4℃下進(jìn)行以幫助防止過早蛋白質(zhì)降解。添加TNC緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8.0、50mM NaCl、10mM CaCl₂)至蠕蟲溶解產(chǎn)物中。使蠕蟲溶解產(chǎn)物與媒介物對照(H₂O)或α-KG一起在冰上孵育1小時，接著在室溫下孵育50分鐘。

在室溫下進(jìn)行30分鐘鏈霉蛋白酶(Roche,10165921001)消化，并且通過添加SDS裝載緩沖液以及在70℃下加熱10分鐘來終止。接著使樣品在NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris梯度凝膠(Invitrogen,NP0322BOX)上經(jīng)受SDS-PAGE，并且用針對ATP5B，也識別ATP-2的抗體(Sigma,AV48185)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。

對于2-HG實驗，如上所述進(jìn)行DARTS。簡要來說，在M-PER緩沖液(Thermo Scientific,78501)中，在添加蛋白酶(Roche,11836153001)和磷酸酶(50mM NaF、2mM Na₃VO₄)抑制劑下溶解U87細(xì)胞。添加冷卻TNC緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8.0、50mM NaCl、10mM CaCl₂)至溶解產(chǎn)物中，并且通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce,23227)對等分試樣測量溶液的蛋白質(zhì)濃度。接著使剩余溶解產(chǎn)物與媒介物對照(H₂O)或不同濃度的2-HG或α-KG一起在室溫下孵育0.5小時。接著使樣品經(jīng)受鏈霉蛋白酶消化(Roche,10165921001，在室溫下5分鐘)，所述消化通過添加SDS裝載緩沖液以及立刻加熱(95℃，5分鐘)來終止。使樣品在4-12％Bis-Tris梯度凝膠(Invitrogen,NP0322BOX)上經(jīng)受SDS-PAGE，并且用針對ATP5B(Sigma,AV48185)或GAPDH(Santa Cruz,SC25778)的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。

復(fù)合物V活性測定

使用MitoTox OXPHOS復(fù)合物V活性試劑盒(Abcam,ab109907)測定復(fù)合物V活性。在添加磷脂之前使媒介物(H₂O)或α-KG與酶混合。在使用α-KG辛酯的實驗中，媒介物(1％DMSO)或α-KG辛酯與磷脂一起添加。將相對復(fù)合物V活性與媒介物進(jìn)行比較。寡霉素(Sigma,O4876)作為陽性對照用于測定。

從小鼠肝分離線粒體

根據(jù)核準(zhǔn)的UCLA動物研究方案進(jìn)行動物研究。如所述(Rogers等PLoS One 6,e21746(2011))從3個月齡的C57BL/6小鼠分離線粒體。簡要來說，將肝提取，在4℃下于MSHE+BSA(70mM蔗糖、210mM甘露糖醇、5mM HEPES、1mM EGTA和0.5％無脂肪酸BSA，pH 7.2)中切碎，并且沖洗數(shù)次以移除血液。所有隨后步驟都在冰上或在4℃下進(jìn)行。用玻璃Dounce均質(zhì)器于10體積的MSHE+BSA中破壞組織(5-6次沖擊)，并且在800x g下離心勻漿10分鐘以移除組織碎片和核。將上清液傾析通過細(xì)胞濾網(wǎng)，并且在8,000x g下離心10分鐘。將深色線粒體集結(jié)塊再懸浮于MSHE+BSA中，并且在8,000x g下再離心10分鐘。最終線粒體集結(jié)塊用于如下所述的各種測定。

亞線粒體粒子(SMP)ATP酶測定

使用亞線粒體粒子測量由ATP合成酶達(dá)成的ATP水解(參見Alberts,B.Molecular Biology of the Cell.第3版,(Garland Pub.,1994)以及其中參考文獻(xiàn))。如上所述從小鼠肝分離線粒體。將最終線粒體集結(jié)塊在10μg/μl下再懸浮于緩沖液A(250mM蔗糖、10mM Tris-HCl、1mM ATP、5mM MgCl₂和0.1mM EGTA，pH 7.4)中，在冰上經(jīng)受超聲處理(Fisher Scientific 550型聲波分離粉碎機；中等功率，在10秒間隔的超聲處理與在冰上靜息之間交替，持續(xù)總計60秒超聲處理)，接著在4℃下在18,000x g下離心10分鐘。收集上清液，并且在4℃下在100,000x g下離心45分鐘。將最終集結(jié)塊(亞線粒體粒子)再懸浮于緩沖液B(250mM蔗糖、10mM Tris-HCl和0.02mM EGTA，pH 7.4)中。

使用復(fù)合物V活性緩沖液如上測定SMP ATP酶活性。ADP的產(chǎn)生通過丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶偶聯(lián)于NADH氧化成NAD⁺。當(dāng)添加外部ADP時，添加α-KG(多達(dá)10mM)不影響丙酮酸激酶或乳酸脫氫酶的活性。在340nm下NADH的吸光度降低與ATP酶活性相關(guān)。在添加活性緩沖液之前，使SMP(2.18ng/μl)與媒介物或α-KG一起在室溫下孵育90分鐘，接著持續(xù)1小時每1分鐘測量在340nm下NADH的吸光度降低。寡霉素(Cell Signaling Technology,9996)作為陽性對照用于測定。

針對ATP水平的測定

將正常人二倍體纖維母細(xì)胞WI-38(ATCC,CCL-75)細(xì)胞在每孔2x 10⁴個細(xì)胞下接種于96孔板中。用DMSO(媒介物對照)或α-KG辛酯在不同濃度下一式三份處理細(xì)胞2小時。使用CellTiter-Glo發(fā)光ATP測定(Promega,G7572)測量ATP水平；使用Analyst HT(Molecular Devices)讀取發(fā)光。平行地，在M-PER(Thermo Scientific,78501)中溶解同等處理的細(xì)胞以通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce,23223)獲得蛋白質(zhì)濃度。相對于蛋白質(zhì)含量使ATP水平標(biāo)準(zhǔn)化。使用GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計分析(未配對t檢驗)。

針對秀麗隱桿線蟲中ATP水平的測定。將同步第1天成體野生型秀麗隱桿線蟲放置在含有媒介物或8mMα-KG的NGM板上。在成體期的第2和8天，從α-KG或媒介物對照板分別收集9個重復(fù)樣品和4個重復(fù)樣品，各重復(fù)樣品具有約100個蠕蟲，在M9緩沖液中洗滌4次，并且冷凍在-80℃中。使用溶解基質(zhì)C管(MP Biomedicals,6912-100)和FastPrep-24(MP Biomedicals)高速臺式均質(zhì)器溶解動物(在6.5m/s下破壞蠕蟲20秒，在冰上靜息1分鐘；重復(fù)兩次)。在4℃下在14,000rpm下離心溶解的動物10分鐘以集結(jié)蠕蟲碎片，并且保存上清液以根據(jù)制造商說明書，使用Kinase-Glo發(fā)光激酶測定平臺(Promega,V6713)進(jìn)行ATP定量。在白色不透明96孔組織培養(yǎng)板(Falcon,353296)中進(jìn)行測定，并且使用Analyst HT(Molecular Devices)測量發(fā)光。相對于蠕蟲的數(shù)目使ATP水平標(biāo)準(zhǔn)化。使用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析(t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。

對于2-HG實驗，將U87細(xì)胞在每孔2x 10⁴個細(xì)胞下接種于96孔板中，并且用指示的化合物一式三份處理2小時。使用CellTiter-Glo發(fā)光ATP測定(Promega,G7572)測量ATP水平；使用Analyst HT(Molecular Devices)讀取發(fā)光。為確認(rèn)在各處理之間的細(xì)胞數(shù)目是一致的，使用QuantiFluor dsDNA系統(tǒng)(Promega)使細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)受dsDNA染色。使用GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計分析(未配對t檢驗)。

測量氧消耗速率(OCR)和細(xì)胞外酸化速率(ECAR)

使用Seahorse XF-24分析器(Seahorse Bioscience)進(jìn)行OCR測量(Wu等Am J Physiol Cell Physiol 292,C125-136(2007))。將細(xì)胞于補充以10％FBS和10mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中在50,000個細(xì)胞/孔下接種在Seahorse XF-24細(xì)胞培養(yǎng)微板中，并且在37℃和5％CO₂下孵育過夜。用α-KG辛酯或DMSO(媒介物對照)進(jìn)行的處理持續(xù)1小時。就在測量之前于未緩沖的DMEM培養(yǎng)基(pH 7.4，10mM葡萄糖)中洗滌細(xì)胞，并且維持在具有指示濃度的α-KG辛酯的這個緩沖液中。在基礎(chǔ)條件下測量氧消耗速率3次，并且相對于每孔蛋白質(zhì)濃度加以標(biāo)準(zhǔn)化。使用GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計分析。

使用從Yamamoto等(Cell 147,827-839(2011))和Pathare等(PLoS Genet8,e1002645(2012))改編的方案對活秀麗隱桿線蟲中氧消耗速率(OCR)進(jìn)行測量。將野生型第1天成體N2蠕蟲放置在含有8mMα-KG或H₂O(媒介物對照)，用OP50或HT115大腸桿菌(E.coli)接種的NGM板上。在成體期的第2天評估OCR。在成體期的第2天，收集蠕蟲，并且用M9洗滌4次以除去細(xì)菌樣品(我們進(jìn)一步驗證α-KG不影響細(xì)菌的氧消耗-因此，即使在洗滌之后存在任何殘留細(xì)菌，觀察到的OCR變化也將仍然是蠕蟲特異性的)，接著將動物于200μl M9中在每孔約200個蠕蟲下一式四份接種于Seahorse XF-24細(xì)胞培養(yǎng)微板(Seahorse Bioscience,V7-PS)中。在基礎(chǔ)條件下測量氧消耗速率7次，并且相對于每孔計數(shù)的蠕蟲數(shù)目加以標(biāo)準(zhǔn)化。將實驗重復(fù)兩次。使用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析(t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。

對于2-HG實驗，使用Seahorse XF-24分析器(Seahorse Bioscience)進(jìn)行OCR和ECAR測量(Wu等Am J Physiol Cell Physiol 292,C125-136(2007))。將U87細(xì)胞于補充以10％FBS和10mM葡萄糖或10mM半乳糖的DMEM中在每孔50,000個細(xì)胞下接種于Seahorse XF-24細(xì)胞培養(yǎng)微板中，并且在37℃下在5％CO₂中孵育O/N。用α-KG辛酯、(R)-2-HG辛酯、(S)-2-HG辛酯或DMSO(媒介物對照)進(jìn)行的處理持續(xù)1小時。在測量之前即刻于未緩沖的DMEM(pH 7.4，10mM葡萄糖)中洗滌細(xì)胞，并且維持在具有指示濃度的化合物的這個緩沖液中。在基礎(chǔ)條件下測量OCR或ECAR 3次，并且相對于每孔蛋白質(zhì)濃度加以標(biāo)準(zhǔn)化。使用GraphPad Prism進(jìn)行統(tǒng)計分析(未配對t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。

測量線粒體呼吸控制比率(RCR)

使用分離的小鼠肝線粒體分析線粒體RCR(參見Brand等Biochem J435,297-312(2011)以及其中參考文獻(xiàn))。如上所述從小鼠肝分離線粒體。將最終線粒體集結(jié)塊再懸浮于30μl MAS緩沖液(70mM蔗糖、220mM甘露糖醇、10mM KH₂PO₄、5mM MgCl₂、2mM HEPES、1mM EGTA和0.2％無脂肪酸BSA，pH 7.2)中。

通過如所述(Rogers等PLoS One 6,e21746(2011))操作偶聯(lián)和電子流動測定來測量分離的線粒體呼吸。對于偶聯(lián)測定，通過在4℃下在2,000x g下離心20分鐘來將20μg線粒體于完全MAS緩沖液(MAS緩沖液補充以10mM丁二酸鹽和2μΜ魚藤酮)中接種至XF24Seahorse板中。就在測定之前，將線粒體補充以完全MAS緩沖液以達(dá)到總計500μl(具有1％DMSO、辛醇、α-KG辛酯或2-HG辛酯)，并且在37℃下溫?zé)?0分鐘，隨后開始氧消耗速率測量。線粒體呼吸開始于偶聯(lián)狀態(tài)2；狀態(tài)3由2mM ADP引發(fā)；狀態(tài)4o(寡霉素不敏感性，即復(fù)合物V非依賴性)由2.5μΜ寡霉素誘導(dǎo)，并且狀態(tài)3u(FCCP解偶聯(lián)的最大呼吸量)由4μΜF(xiàn)CCP誘導(dǎo)。最后，在測定結(jié)束時注射1.5μg/ml抗霉素A(antimycin A)。狀態(tài)3/狀態(tài)4o比率給出呼吸控制比率(RCR)。

對于電子流動測定，將MAS緩沖液補充以10mM丙酮酸鈉(復(fù)合物I底物)、2mM蘋果酸鹽(復(fù)合物II抑制劑)和4μΜF(xiàn)CCP，并且以與對于偶聯(lián)測定所述相同的方式接種線粒體。在基礎(chǔ)讀取之后，依序注射如下：2μΜ魚藤酮(復(fù)合物I抑制劑)、10mM丁二酸鹽(復(fù)合物II底物)、4μΜ抗霉素A(復(fù)合物III抑制劑)和10mM/100μΜ抗壞血酸鹽/四甲基苯二胺(復(fù)合物IV底物)。

ATP合成酶抑制動力學(xué)

使用分離的線粒體進(jìn)行ATP合成酶抑制動力學(xué)分析。如上所述從小鼠肝分離線粒體。將最終線粒體集結(jié)塊再懸浮于補充以5mM抗壞血酸鈉(Sigma,A7631)和5mM TMPD(Sigma,T7394)的MAS緩沖液中。

在含有5mM抗壞血酸鈉、5mM TMPD、熒光素酶試劑(Roche,11699695001)、辛醇或α-KG辛酯、可變量的ADP(Sigma,A2754)和3.75ng/μl線粒體的MAS緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)。通過光度計(Analyst HT，Molecular Devices)根據(jù)發(fā)光隨時間增加來監(jiān)測ATP合成。由寡霉素不敏感性發(fā)光獲得的ATP合成酶非依賴性ATP形成作為背景被扣除。由在速度開始降低之前的前3分鐘反應(yīng)的斜率計算初始ATP合成速度。通過使用GraphPad Prism進(jìn)行非線性回歸最小二乘擬合來分析酶抑制動力學(xué)。

針對哺乳動物TOR(mTOR)路徑活性的測定

通過包括S6K(T389)、4E-BP1(S65)、AKT(S473)和ULK1(S757)的已知mTOR底物的磷酸化水平來確定用α-KG辛酯、2-HG或寡霉素處理的細(xì)胞中的mTOR路徑活性(Pullen和Thomas,FEBS Lett 410,78-82(1997)；Burnett等PNAS USA 95,1432-1437(1998)；Gingras等Genes Dev 15,2852-2864(2001)；Sarbassov等Science 307,1098-1101(2005)；以及Kim等Nat Cell Biol 13,132-141(2011))。使用的特異性抗體：P-S6K T389(Cell Signaling Technology,9234)、S6K(Cell Signaling Technology,9202S)、P-4E-BP1S65(Cell Signaling Technology,9451S)、4E-BP1(Cell Signaling Technology,9452S),P-AKT S473(Cell Signaling Technology,4060S),AKT(Cell Signaling Technology,4691S),P-ULK1S757(Cell Signaling Technology,6888),ULK1(Cell Signaling Technology,4773S)和GAPDH(Santa Cruz Biotechnology,25778)。

針對自體吞噬的測定

攜帶整合GFP::LGG-1翻譯融合基因的DA2123動物(Kang等Genes Dev 21,2161-2171(2007)；Hansen等PLoS Genet 4,e24(2008)；以及Alberti等Autophagy 6,622-633(2010))用于定量自體吞噬的水平。為獲得DA2123的同步群體，制備妊娠成體的卵制備物(通過于70μl M9緩沖液、25μl漂白劑和5μl 10N NaOH中溶解約100個妊娠蠕蟲)，并且使卵在M9中孵化過夜，從而導(dǎo)致饑餓誘導(dǎo)的L1滯育。將L1幼體放置于含有媒介物、8mMα-KG或40μΜ寡霉素，并且用大腸桿菌OP50、具有空載體的HT115(DE3)、或表達(dá)如所指示的靶向atp-2、CeTOR/let-363或ogdh-1的dsRNA的HT115(DE3)接種的NGM處理板上。當(dāng)給定樣品中大多數(shù)動物首先到達(dá)中間L3期時，將個別L3幼體封固于顯微鏡載片上，并且用1.6mM左旋咪唑(Sigma,31742)加以麻醉。使用具有LSM5Pascal激光器的Axiovert 200M Zeiss共焦顯微鏡觀察線蟲，并且使用LSM Image Examiner(Zeiss)捕集圖像。對于各試樣，使用ImageJ中的分析粒子(analyze particles)在三個140.97μm²的單獨區(qū)域中計數(shù)包括側(cè)向縫線細(xì)胞和Hyp7的表皮中的GFP::LGG-1斑點(自噬體)(Schneider等Nat Methods 9,671-675(2012))。使測量就基因型與補充物兩者來說是盲性的。使用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析(t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。

針對哺乳動物細(xì)胞中的自體吞噬的測定。將HEK-293細(xì)胞于補充以10％FBS和10mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中在2.5x 10⁵個細(xì)胞/孔下接種于6孔板中，并且孵育過夜，隨后用辛醇(媒介物對照)或α-KG辛酯處理72小時。在具有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的M-PER緩沖液中溶解細(xì)胞。使溶解產(chǎn)物在4-12％Bis-Tris梯度凝膠上在MES操作緩沖液下經(jīng)受SDS-PAGE，并且針對LC3(Novus,NB100-2220)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。LC3是蠕蟲LGG-1的哺乳動物同源物，并且例如在饑餓后，在自體吞噬中使可溶性LC3-I向脂質(zhì)化LC3-II的轉(zhuǎn)化活化(Kabeya等EMBO J 19,5720-5728(2000))。

用8mMα-KG處理的秀麗隱桿線蟲的咽泵送速率

評估每種條件20個野生型N2蠕蟲的咽泵送速率。使用Zeiss M2BioDiscovery顯微鏡和附接的Sony NDR-XR500V攝像機在12倍光學(xué)變焦下持續(xù)1分鐘記錄咽收縮。使用MPlayerX在0.3x速度下重放所得視頻，并且計數(shù)咽泵送數(shù)。使用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析(t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。

針對秀麗隱桿線蟲中α-KG水平的測定

從具有媒介物(H₂O)或8mMα-KG的板收集同步成體蠕蟲，用M9緩沖液洗滌3次，并且快速冷凍。使用溶解基質(zhì)C管(MP Biomedicals,6912-100)和FastPrep-24(MP Biomedicals)高速臺式均質(zhì)器在4℃室中在M9中溶解蠕蟲(在6.5m/s下破壞蠕蟲20秒，在冰上靜息1分鐘；重復(fù)三次)。在4℃下在14,000rpm下離心溶解的動物10分鐘以集結(jié)蠕蟲碎片，并且保存上清液。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce,23223)測定上清液的蛋白質(zhì)濃度；在α-KG處理和媒介物處理的動物中，每個蠕蟲的蛋白質(zhì)水平不存在差異(數(shù)據(jù)未顯示)。如先前所述(MacKenzie等Mol Cell Biol 27,3282-3289(2007))在進(jìn)行修改下評估α-KG含量。在37℃下在100mM KH₂PO₄(pH 7.2)、10mM NH₄Cl、5mM MgCl₂和0.3mM NADH中孵育蠕蟲溶解產(chǎn)物10分鐘。接著添加谷氨酸脫氫酶(Sigma,G2501)以達(dá)到最終濃度1.83單位/ml。在這些條件下，谷氨酸脫氫酶使用α-KG和NADH來制備谷氨酸。在340nm下監(jiān)測到吸光度降低。由NADH吸光度降低來測定細(xì)胞內(nèi)α-KG水平。使用平均蛋白質(zhì)含量(約245ng/蠕蟲，根據(jù)BCA測定)和體積(對于長度是1.1mm，并且直徑是60μm的成體蠕蟲，約3nL)(WorldWideWeb.wormatlasDOTORG/hermaphrodite/introduction/Introfram eset.Hyper TextMarkupLanguage，其中“WorldwideWeb”是“www”，“DOTORG”是“.org”，并且“HyperTextMarkupLanguage”是“html”)估計動物內(nèi)部存在的α-KG的近似體積摩爾濃度。

對于使用UHPLC-ESI/MS/MS定量分析蠕蟲中的α-KG，將同步第1天成體蠕蟲放置在具有或不具有細(xì)菌的媒介物板上24小時，接著收集，并且以與以上相同的方式溶解。在Agilent 1290Infinity UHPLC系統(tǒng)和使用電噴霧離子化(ESI)源以及Agilent射流技術(shù)的6460三重四極質(zhì)譜儀(Agilent Technologies)上進(jìn)行LC/MS/MSα-KG分析。用B.06.00版Agilent MassHunter數(shù)據(jù)獲取軟件獲取數(shù)據(jù)，并且處理以進(jìn)行前體和產(chǎn)物離子選擇(用B.06.00版MassHunter定性分析軟件)，以及進(jìn)行校正和定量(用B.06.00版針對QQQ的MassHunter定量分析軟件)。

對于UHPLC，將3μl校正標(biāo)準(zhǔn)物和樣品注射于UHPLC系統(tǒng)上，所述系統(tǒng)包括具有嵌入式真空脫氣器的G4220A二元泵和恒溫G4226A高性能自動取樣器。使用50/50/0.04乙腈/水/具有10mM乙酸銨的氫氧化銨作為流動相A，以及95/5/0.04乙腈/水/具有10mM乙酸銨的氫氧化銨作為流動相B，在0.6ml/min的流速下使用來自Waters Corporation的ACQUITY UPLC BEH酰胺分析柱(2.1x 50mm，1.7μm)和VanGuard BEH酰胺預(yù)柱(2.1x5mm，1.7μm)。將柱維持在室溫下。應(yīng)用以下梯度：0-0.41分鐘：100％B等度；0.41-5.30分鐘：100-30％B；5.3-5.35分鐘：30-0％B；5.35-7.35分鐘：0％B等度；7.35-7.55分鐘：0-100％B；7.55-9.55分鐘：100％B等度。

對于MS檢測，通過MRM以負(fù)離子化模式記錄ESI質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用1-分鐘37％B等度UHPLC方法，通過柱在0.6ml/min的流速下測定α-KG和它的ISTD ¹³C₄-α-KG(Cambridge Isotope Laboratories)的MRM躍遷。觀察到前體離子[M-H]^-和產(chǎn)物離子[M-CO₂-H]^-具有最高信噪比。前體離子和產(chǎn)物離子對于AKG分別是145.0和100.9，并且對于ISTD ¹³C₄-α-KG分別是149.0和104.9。氮氣用作干燥、套管和碰撞氣體。所有源和分析器參數(shù)都分別使用Agilent MassHunter Source and iFunnel Optimizer和Optimizer軟件優(yōu)化。源參數(shù)如下：干燥氣體溫度120℃，干燥氣體流速13L/min，霧化器壓力55psi，套管氣體溫度400℃，套管氣體流速12L/min，毛細(xì)管電壓2000V，以及噴嘴電壓0V。分析器參數(shù)如下：碎裂器電壓55V，碰撞能量2V，以及池加速器電壓1V。使在1分鐘之前以及在5.3分鐘之后的UHPLC洗脫液轉(zhuǎn)向廢物。

α-KG的膜可滲透性酯

α-KG辛酯，即α-KG的一種膜可滲透性酯(MacKenzie等Mol Cell Biol27,3282-3289(2007)；Zhao等Science 324,261-265(2009)；Xu等Cancer Cell 19,17-30(2011)；以及Jin等Cancer Res 73,496-501(2013))在使用細(xì)胞和線粒體的實驗中用于跨越脂質(zhì)膜遞送α-KG。在由細(xì)胞酯酶水解后，α-KG辛酯產(chǎn)生α-KG和副產(chǎn)物辛醇。發(fā)現(xiàn)盡管辛醇對照不具有作用(圖6，圖版e-f以及圖10，圖版a)，但單獨α-KG可結(jié)合并抑制ATP合成酶(圖2，圖版a-b，圖6，圖版a-b，并且數(shù)據(jù)未顯示)，降低ATP和OCR(圖2，圖版e，以及圖2，圖版g)，誘導(dǎo)自體吞噬(圖4，圖版b)，并且增加秀麗隱桿線蟲壽命(圖1、圖3、圖5、圖9和圖13)。使用在水解后發(fā)熒光的酯酶底物鈣黃綠素(calcein)AM(C1430,Molecular Probes)，并且也通過質(zhì)譜測定法來確認(rèn)酯酶在線粒體和細(xì)胞培養(yǎng)實驗中的存在性和活性(數(shù)據(jù)未顯示)。由酯酶達(dá)成的水解解釋為何α-KG的不同酯(諸如α-KG 1-辛酯、α-KG 5-辛酯和α-KG二甲酯)對α-KG具有類似作用(圖6，圖版g-h，以及圖13)。

細(xì)胞生長和活力測定

將細(xì)胞接種于12孔板中，并且在過夜孵育之后，用指示濃度的各化合物處理。在收集之后，用吖啶橙(Acridine Orange，AO)和DAPI染色細(xì)胞?；谧裱圃焐陶f明書，通過NC3000(Chemometec)測量的AO和DAPI熒光來衡量細(xì)胞數(shù)目和活力。

代謝概況分析

培養(yǎng)細(xì)胞24小時，用PBS沖洗，并且添加含有[1,2-¹³C]葡萄糖(1g/L)的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)24小時之后，用冰冷150mM NH₄AcO(pH 7.3)沖洗細(xì)胞，隨后添加400ml冷甲醇和400ml冷水。將細(xì)胞刮除，轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，并且添加10nmol正纈氨酸以及400ml氯仿至各樣品中。對于代謝物提取，將樣品在冰上渦旋5分鐘，短暫離心，并且將水層轉(zhuǎn)移至玻璃小瓶中并干燥。將代謝物再懸浮于70％ACN中，并且將5ml樣品裝載于Phenomenex Luna 3u NH2 100A(150x 2.0mm)柱上。在UltiMate300RSLC(Thermo Scientific)上在流動相A(5mM NH₄AcO，pH 9.9)和B(ACN)以及300毫升/分鐘的流速下進(jìn)行色譜分離。操作的梯度是歷經(jīng)18分鐘從15％A至95％A，在95％A下9分鐘等度，以及再平衡7分鐘。用以極性轉(zhuǎn)換模式(+3.0kV/-2.25kV)操作的Thermo Scientific Q Exactive質(zhì)譜儀實現(xiàn)代謝物檢測。TraceFinder 3.1(Thermo Scientific)用于使用保留時間和準(zhǔn)確質(zhì)量測量結(jié)果(<3ppm)將代謝物定量為曲線下面積。通過加和給定代謝物的所有同位素異位體來計算代謝物的相對量。

針對ADP輸入的測定

將新鮮制備的小鼠肝線粒體在1μg/μl下懸浮于由220mM甘露糖醇、70mM蔗糖、2mM HEPES、2.74μΜ抗霉素A、5μΜ魚藤酮、1mM EGTA和10mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.4組成的培養(yǎng)基中。使線粒體懸浮液與指定藥物一起在37℃中孵育30分鐘。在孵育之后，將懸浮液轉(zhuǎn)移至冰中以孵育10分鐘。之后，添加100μΜ[³H]ADP(比放射性185kBq/pmol)，并且立刻渦旋混合物并在冰上孵育20秒。通過添加10μΜ羧基蒼術(shù)苷終止反應(yīng)，并且在4℃下在10,000g下離心混合物10分鐘。在離心之后，收集上清液以進(jìn)行讀取，并且用補充以10μΜ羧基蒼術(shù)苷的相同培養(yǎng)基洗滌集結(jié)塊兩次。在洗滌之后，通過添加0.2ml 1％SDS來溶解集結(jié)塊。通過TRI-CARB 2300TR液體閃爍分析器測定溶解產(chǎn)物和上清液的放射性。通過集結(jié)塊相對于集結(jié)塊和上清液的總和讀數(shù)的比率來確定ADP-ATP轉(zhuǎn)移率。

統(tǒng)計分析

所有實驗都重復(fù)至少兩次，獲得相同或類似結(jié)果。數(shù)據(jù)代表生物重復(fù)實驗。適當(dāng)統(tǒng)計檢驗用于每個圖。數(shù)據(jù)滿足對于各圖所述的統(tǒng)計檢驗的假設(shè)。除非另外陳述，否則將平均值±s.d.繪制于所有圖中。

結(jié)果

如圖1中所示，α-KG使秀麗隱桿線蟲的成體壽命延長。圖版a顯示在代謝物長壽篩選中，α-KG使成體蠕蟲的壽命延長。8mM用于所有代謝物。圖版b顯示α-KG的結(jié)構(gòu)。圖版c顯示α-KG在長壽方面的劑量響應(yīng)。圖版d-e顯示α-KG使喂以氨芐青霉素阻滯的(圖版d)或γ輻照殺滅的(圖版e)細(xì)菌的蠕蟲的壽命延長(P<0.0001)。圖版f顯示α-KG不進(jìn)一步延長ogdh-1(RNAi)蠕蟲的壽命(P＝0.65)。

如圖2中所示，α-KG結(jié)合并抑制ATP合成酶。圖版a是在使用DARTS下將ATP5B鑒定為α-KG結(jié)合蛋白的Sypro Ruby染色凝膠。箭頭＝受保護(hù)條帶。圖版b是在使用DARTS和蛋白質(zhì)印跡下確認(rèn)α-KG特異性結(jié)合ATP5B的凝膠。圖版c是顯示ATP合成酶受α-KG(從α-KG辛酯釋放)抑制的圖。這個抑制是可逆的(未顯示)。圖版d-g顯示(圖版d)α-KG辛酯處理的正常人纖維母細(xì)胞(**P＝0.0016，****P<0.0001)和(圖版e)α-KG處理的蠕蟲(第2天，P＝0.969；第8天，*P＝0.012)中的ATP水平降低。氧消耗速率降低顯示于圖版f(對于α-KG辛酯處理的細(xì)胞)(***P＝0.0004，****P<0.0001)和圖版g(對于α-KG處理的蠕蟲)(P<0.0001)中。RLU，相對發(fā)光單位。圖版h顯示從α-KG辛酯(800μΜ)釋放的α-KG使從小鼠肝分離的線粒體中狀態(tài)3而非狀態(tài)4o或3u(P＝0.997)呼吸降低。相對于媒介物(5.2±1.0)，在α-KG辛酯(3.1±0.6)的情況下，呼吸控制比率降低(*P＝0.015)。圖版i是由α-KG(通過原位水解α-KG辛酯產(chǎn)生)對ATP合成酶達(dá)成的穩(wěn)態(tài)抑制動力學(xué)的Eadie-Hofstee圖。[S]是底物(ADP)濃度，并且V是在200μΜ辛醇(媒介物對照)或α-KG辛酯存在下的初始ATP合成速度。根據(jù)非線性回歸最小二乘擬合，α-KG(由α-KG辛酯產(chǎn)生)使表觀V_max(53.9至26.7)和K_m(25.9至15.4)降低。圖版c-i獨立實驗數(shù)目：2。繪制平均值±s.d.。利用雙尾、雙樣本不等方差t檢驗。對于圖版e，各組中的第一棒條是媒介物。

如圖3中所示，α-KG長壽是通過ATP合成酶和DR/TOR軸介導(dǎo)。顯示α-KG對以下蠕蟲的壽命的影響：atp-2(RNAi)(圖版a)、daf-2(e1370)(圖版b)、eat-2(ad1116)(圖版c)、CeTOR(RNAi)(圖版d)、daf-16(mu86)(圖版e)、pha-4(zu225)(圖版f)或hif-1(ia4)(圖版g)蠕蟲。獨立實驗數(shù)目：RNAi對照(6)、atp-2(2)、CeTOR(3)、N2(5)、daf-2(2)、eat-2(2)、pha-4(2)、daf-16(2)、hif-1(5)。

如圖4中所示，由α-KG抑制ATP合成酶導(dǎo)致TOR路徑活性保守降低。圖版a顯示在用α-KG辛酯或寡霉素處理的U87細(xì)胞中，mTOR底物磷酸化降低。在HEK-293、正常人纖維母細(xì)胞和MEF中獲得類似結(jié)果(未顯示)。圖版b顯示在用α-KG或針對atp-2或CeTOR的RNAi處理的動物中，自體吞噬增加。圖版c顯示使用ImageJ定量的GFP::LGG-1斑點。2-3個獨立實驗。棒條指示平均值。****P<0.0001；NS，不顯著。圖版d顯示在饑餓蠕蟲中，α-KG水平增加(**P<0.01)。繪制平均值±s.d.。在圖版c-d中，利用雙尾、雙樣本不等方差t檢驗。圖版e是α-KG介導(dǎo)的長壽的圖解模型。因為饑餓秀麗隱桿線蟲中的α-KG水平升高(圖版d)，所以α-KG可通過與饑餓/DR路徑類似的機理來介導(dǎo)壽命延長(圖版e)。

如圖5中所示，補充α-KG使秀麗隱桿線蟲成體壽命延長，但不改變細(xì)菌的生長速率或蠕蟲的食物攝取、咽泵送速率或產(chǎn)卵量。圖版a顯示由α-KG在成體秀麗隱桿線蟲中達(dá)成的穩(wěn)健壽命延長。在三個獨立實驗中，8mMα-KG使N2的平均壽命增加平均47.3％(根據(jù)對數(shù)秩檢驗，對于每個實驗，P<0.0001)。1號實驗，m_veh＝18.9(n＝87)，m_α-KG＝25.8(n＝96)；2號實驗，m_veh＝17.5(n＝119)，m_α-KG＝25.4(n＝97)；3號實驗，m_veh＝16.3(n＝100),m_α-KG＝26.1(n＝104)。m，平均壽命(成體期的天數(shù))；n，測試動物的數(shù)目。圖版b顯示補充以8mMα-KG的蠕蟲和RNAi敲低α-KGDH(由ogdh-1編碼)的蠕蟲具有增加的α-KG水平。將幼小成體蠕蟲放置在用對照HT115大腸桿菌或表達(dá)ogdh-1dsRNA的HT115接種的處理板上，并且在24小時之后測定α-KG含量。圖版c顯示在卵期開始以及在成體期開始的α-KG處理產(chǎn)生相同壽命增加。媒介物，媒介物，用媒介物對照在整個幼體期和成體期期間處理(m＝15.6，n＝95)；媒介物，α-KG，用媒介物在幼體期期間以及用8mMα-KG在成體期處理(m＝26.3，n＝102)，P<0.0001(對數(shù)秩檢驗)；α-KG，α-KG，用8mMα-KG在整個幼體期和成體期期間處理(m＝26.3，n＝102)，P<0.0001(對數(shù)秩檢驗)，m，平均壽命(成體期的天數(shù))；n，測試動物的數(shù)目。圖版d顯示α-KG不改變作為線蟲的標(biāo)準(zhǔn)實驗室食物來源的OP50大腸桿菌的生長速率。添加α-KG(8mM)或媒介物(H₂O)至標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基中，并且通過添加NaOH來調(diào)整pH至6.6。在1:40稀釋度下添加來自相同過夜OP50培養(yǎng)物的細(xì)菌細(xì)胞至LB±α-KG混合物中，接著放置在處于300rpm下的37℃孵育振蕩器中。在1小時時間間隔下讀取595nm下的吸光度以產(chǎn)生生長曲線。圖版e是食物偏好測定的圖示。圖版f是顯示N2蠕蟲在用媒介物或α-KG處理的OP50大腸桿菌食物之間不顯示偏好(P＝0.85，根據(jù)雙尾、雙樣本不等方差t檢驗)，在同等處理的OP50大腸桿菌之間也不顯示偏好的圖。圖版g顯示在8mMα-KG的情況下，秀麗隱桿線蟲的咽泵送速率不顯著改變(根據(jù)雙尾、雙樣本不等方差t檢驗)。圖版h顯示用8mMα-KG處理的秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵量。在20℃下進(jìn)行產(chǎn)卵量分析。將10個L4野生型蠕蟲各自單獨放置于含有媒介物或8mMα-KG的NGM板上。每天將蠕蟲以每板一個轉(zhuǎn)移于新板上，并且使產(chǎn)下的卵在先前板上孵化和發(fā)育。當(dāng)使用真空來將孵化體從板移除時，對它們計數(shù)。相較于媒介物板上的動物，在8mMα-KG的情況下的動物在產(chǎn)卵量方面不顯示顯著差異(P＝0.223，根據(jù)雙尾、雙樣本不等方差t檢驗)。在所有情況下都繪制平均值±s.d.。

如圖6中所示，α-KG結(jié)合ATP合成酶的β亞單位，并且抑制復(fù)合物V而非其它ETC復(fù)合物的活性。圖版a是顯示在DARTS測定中在α-KG結(jié)合后ATP-2蛋白被保護(hù)免遭鏈霉蛋白酶消化的蛋白質(zhì)印跡。針對人ATP5B的抗體(Sigma,AV48185)識別與秀麗隱桿線蟲ATP-2具有90％同一性的表位₁₄₄IMNVIGEPIDERGPIKTKQFAPIHAEAPEFMEMSVEQEILVTGIKVVDLL₁₉₃(SEQ ID NO:7)?？拷?0kDa的較低分子量條帶是全長蛋白質(zhì)的對應(yīng)于由α-KG直接結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白水解片段。圖版b顯示α-KG不影響復(fù)合物IV活性。使用MitoTox OXPHOS復(fù)合物IV活性試劑盒(Abcam,ab109906)測定復(fù)合物IV活性。將相對復(fù)合物IV活性與媒介物(H₂O)對照進(jìn)行比較。氰化鉀(Sigma,60178)作為陽性對照用于測定。使用MitoTox復(fù)合物VOXPHOS活性微板測定(Abcam,ab109907)來測定復(fù)合物V活性。圖版c顯示atp-2(RNAi)蠕蟲相較于對照(gfp于RNAi載體中)具有較低氧消耗，對于整個時間序列，P<0.0001(t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)(2個獨立實驗)；與圖2，圖版g中所示的α-KG處理的蠕蟲類似。圖版d顯示α-KG不影響通過電子傳遞鏈的電子流動。OCR來自在基礎(chǔ)條件下(在FCCP存在下，丙酮酸鹽和蘋果酸鹽分別作為復(fù)合物I底物和復(fù)合物II抑制劑)以及響應(yīng)于依序注射魚藤酮(Rote；復(fù)合物I抑制劑)、丁二酸鹽(Succ；復(fù)合物II底物)、抗霉素A(AA；復(fù)合物III抑制劑)、抗壞血酸鹽/四甲基苯二胺(Asc/TMPD；細(xì)胞色素c(復(fù)合物IV)底物)的分離的小鼠肝線粒體。在用800μΜα-KG辛酯處理30分鐘之后，未觀察到復(fù)合物I(C I)、復(fù)合物II(C II)或復(fù)合物IV(CIV)呼吸差異，而復(fù)合物V受相同處理抑制(參見圖2，圖版h)(2個獨立實驗)。圖版e-f顯示在辛醇或DMSO媒介物對照的情況下未觀察到偶聯(lián)(圖版e)或電子流動(圖版f)的顯著差異。圖版g-h顯示用α-KG 1-辛酯或α-KG 5-辛酯處理在偶聯(lián)(圖版g)或電子流動(圖版h)測定中產(chǎn)生相同結(jié)果。在所有情況下都繪制平均值±s.d.。

如圖7中所示，用寡霉素處理使秀麗隱桿線蟲壽命延長，并且以依賴于let-363的方式增強自體吞噬。圖版a顯示寡霉素以濃度依賴性方式使成體秀麗隱桿線蟲的壽命延長。用寡霉素處理開始于幼小成體期。40μΜ寡霉素使N2蠕蟲的平均壽命增加32.3％(P<0.0001，根據(jù)對數(shù)秩檢驗)；對于細(xì)節(jié)，參見圖13。圖版b顯示在媒介物、寡霉素(40μΜ)或α-KG(8mM)的情況下秀麗隱桿線蟲的L3表皮的GFP::LGG-1斑點的共焦圖像，以及使用ImageJ定量的含有GFP::LGG-1的斑點的數(shù)目。棒條指示平均值。用寡霉素或α-KG處理的秀麗隱桿線蟲中的自體吞噬顯著高于媒介物處理的對照動物中(t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。圖版c顯示在用寡霉素處理的對照蠕蟲與用媒介物處理的CeTOR(RNAi)蠕蟲之間不存在顯著差異(n.s.)，在媒介物處理的CeTOR(RNAi)蠕蟲與α-KG處理的CeTOR(RNAi)蠕蟲之間也不存在顯著差異，這與圖4，圖版b-c中的獨立實驗一致；此外，寡霉素不加強CeTOR(RNAi)蠕蟲中的自體吞噬(如果有的話，那么可存在小幅降低*)；根據(jù)雙尾、雙樣本不等方差t檢驗。棒條指示平均值。

圖8顯示對用a-KG或atp-2RNAi處理的蠕蟲中的氧化應(yīng)激的分析。圖版a顯示atp-2(RNAi)蠕蟲比gfp對照蠕蟲具有更高DCF熒光水平(P<0.0001，根據(jù)雙尾、雙樣本不等方差t檢驗)。補充α-KG也導(dǎo)致在HT115(用于RNAi)喂食的蠕蟲與OP50喂食的蠕蟲兩者中，DCF熒光均較高(分別是P＝0.0007以及P＝0.0012)。使用二乙酸2',7'-二氯二氫熒光素(H₂DCF-DA)測量ROS水平。因為使用整個蠕蟲溶解產(chǎn)物，所以此處測量總體細(xì)胞氧化應(yīng)激。將H₂DCF-DA(Molecular Probes,D399)溶解于乙醇中以達(dá)到1.5mg/ml的儲備物濃度。每次在使用之前制備新鮮儲備物。對于測量蠕蟲溶解產(chǎn)物中的ROS，在室溫下用0.1M NaOH水解30ng/ml工作濃度的H₂DCF-DA 30分鐘以產(chǎn)生2’,7’-二氯二氫熒光素(DCFH)，隨后與整個蠕蟲溶解產(chǎn)物在黑色96孔板(Greiner Bio-One)中混合。DCFH被ROS氧化產(chǎn)生高度熒光性2',7'-二氯熒光素(DCF)。使用SpectraMax MS(Molecular Devices)在485/530nm的激發(fā)/發(fā)射下讀取DCF熒光。H₂O₂用作陽性對照(未顯示)。為制備蠕蟲溶解產(chǎn)物，在含有媒介物或8mMα-KG以及OP50或HT115大腸桿菌的板上培養(yǎng)同步幼小成體動物1天，接著收集并如本文所述溶解。繪制平均值±s.d.。圖版b顯示在α-KG處理或atp-2(RNAi)后，蛋白質(zhì)氧化不存在顯著變化。通過OxyBlot來測定氧化蛋白質(zhì)水平。將同步幼小成體N2動物放置于含有媒介物或8mMα-KG的板上，并且用OP50或表達(dá)對照或atp-2dsRNA的HT115細(xì)菌接種。收集成體第2天和第3天蠕蟲，并且用M9緩沖液洗滌4次，接著在-80℃下儲存至少24小時。添加Laemmli緩沖液(Biorad,161-0737)至每個樣品中，并且通過交替煮沸/冷凍循環(huán)來溶解動物。在4℃下在14,000rpm下離心溶解的動物10分鐘以集結(jié)蠕蟲碎片，并且收集上清液供oxyblot分析。通過660nm蛋白質(zhì)測定(Thermo Scientific,1861426)來測定樣品的蛋白質(zhì)濃度，并且對于所有樣品都加以標(biāo)準(zhǔn)化。使用OxyBlot蛋白質(zhì)氧化檢測試劑盒(Millipore,S7150)檢測各樣品中蛋白質(zhì)的羰基化。

圖9顯示在不存在aak-2、daf-16、hif-1、vhl-1或egl-9下，α-KG達(dá)成的壽命。圖版a顯示N2蠕蟲，m_veh＝17.5(n＝119)，m_α-KG＝25.4(n＝97)，P<0.0001；或aak-2(ok524)突變體，m_veh＝13.7(n＝85)，m_α-KG＝17.1(n＝83)，P<0.0001。圖版b顯示喂以gfp RNAi對照的N2蠕蟲，m_veh＝18.5(n＝101)，m_α-KG＝23.1A(n＝98)，P<0.0001；或daf-16RNAi，m_veh＝14.3(n＝99)，m_α-KG＝17.6(n＝99)，P<0.0001。圖版c顯示N2蠕蟲，m_veh＝21.5(n＝101)，m_α-KG＝24.6(n＝102)，P<0.0001；hif-1(ia7)突變體，m_veh＝19.6(n＝102)，m_α-KG＝23.6(n＝101)，P<0.0001；vhl-1(ok161)突變體，m_veh＝20.0(n＝98)，m_α-KG＝24.9(n＝100)，P<0.0001；或egl-9(sa307)突變體，m_veh＝16.2(n＝97)，m_α-KG＝25.6(n＝96)，P<0.0001。m，平均壽命(成體期的天數(shù))；n，測試動物的數(shù)目。通過對數(shù)秩檢驗來確定P值。獨立實驗數(shù)目：N2(8)、hif-1(5)、vhl-1(1)、和egl-9(2)；對于細(xì)節(jié)，參見圖13。已使用兩個不同hif-1突變等位基因(Zhang等PLoSOne 4,e6348(2009))：ia4(顯示于圖3，圖版g中)是歷經(jīng)若干內(nèi)含子和外顯子的缺失；ia7(以上顯示)是導(dǎo)致截短蛋白質(zhì)的早期終止密碼子。兩個等位基因?qū)勖哂邢嗤绊?。關(guān)于α-KG長壽來測試兩個等位基因，并且獲得相同結(jié)果。

如圖10中所示，α-KG降低TOR路徑活性，但不直接與TOR相互作用。圖版a顯示在用α-KG辛酯處理的U87細(xì)胞中，而非在用辛醇對照處理的細(xì)胞中，S6K(T389)磷酸化降低。使用HEK-293和MEF細(xì)胞獲得相同結(jié)果。圖版b顯示在WI-38細(xì)胞中，在由α-KG抑制復(fù)合物V后，AMPK(T172)磷酸化被上調(diào)，這與α-KG處理的細(xì)胞和動物中的ATP含量降低一致。然而，這個AMPK活化似乎涉及比mTOR失活更重度的復(fù)合物V抑制，因為寡霉素或較高濃度的α-KG辛酯使P-AMPK增加，而與降低細(xì)胞ATP含量(圖2，圖版d)或氧消耗(圖2，圖版f)的濃度類似的α-KG辛酯濃度也足以降低P-S6K。使用U87細(xì)胞獲得相同結(jié)果。用針對P-AMPK T172(CellSignaling Technology,2535S)和AMPK(Cell Signaling Technology,2603S)的特異性抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。圖版c顯示α-KG仍然誘導(dǎo)aak-2(RNAi)蠕蟲中的自體吞噬；**P<0.01(t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。使用Image J定量含有GFP::LGG-1的斑點的數(shù)目。棒條指示平均值。圖版d-e顯示α-KG不直接結(jié)合到TOR，如通過DARTS所確定。在M-PER緩沖液(Thermo Scientific,78501)中，在添加蛋白酶抑制劑(Roche,11836153001)和磷酸酶抑制劑(50mM NaF、10mMβ-甘油磷酸酯、5mM焦磷酸鈉、2mM Na₃VO₄)下溶解HEK-293(圖版d)或HeLa(圖版e)細(xì)胞。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce,23227)來測量溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度。添加冷卻TNC緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8.0、50mM NaCl、10mM CaCl₂)至蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)物中，并且接著使蛋白質(zhì)溶解產(chǎn)物與媒介物對照(DMSO)或不同濃度的α-KG一起在室溫下孵育1小時(對于圖版d)或3小時(對于圖版e)。在室溫下進(jìn)行20分鐘鏈霉蛋白酶(Roche,10165921001)消化，并且通過添加SDS裝載緩沖液以及立刻在95℃下加熱5分鐘(對于圖版d)或在70℃下加熱10分鐘(對于圖版e)來終止。使樣品在4-12％Bis-Tris梯度凝膠(Invitrogen,NP0322BOX)上經(jīng)受SDS-PAGE，并且用針對ATP5B(Santa Cruz,sc58618)、mTOR(Cell Signaling Technology,2972)或GAPDH(Ambion,AM4300)的特異性抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。ImageJ用于定量mTOR/GAPDH和ATP5B/GAPDH比率。在α-KG存在下，mTOR蛋白對鏈霉蛋白酶消化的易感性不變，而如所預(yù)期，在α-KG存在下，ATP5B對鏈霉蛋白酶的抗性增加。圖版f顯示通過對MAP1LC3(Novus,NB 100-2220)的蛋白質(zhì)印跡分析來確認(rèn)用α-KG辛酯處理的HEK-293細(xì)胞中的自體吞噬增加，這與自體吞噬引發(fā)激酶ULK1的磷酸化降低一致(圖4，圖版a)。

如圖11中所示，在用ogdh-1RNAi處理的秀麗隱桿線蟲中，自體吞噬被增強。圖版a顯示用媒介物或α-KG(8mM)處理的中間L3期對照或ogdh-1敲低秀麗隱桿線蟲的表皮中的GFP::LGG-1斑點的共焦圖像。圖版b顯示使用ImageJ定量的GFP::LGG-1斑點的數(shù)目。棒條指示平均值，ogdh-1(RNAi)蠕蟲具有顯著較高自體吞噬水平，并且在ogdh-1(RNAi)蠕蟲中，α-KG不顯著加強自體吞噬(t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。

如圖14中所示，2-HG使成體秀麗隱桿線蟲的壽命延長。圖版A顯示2-羥基戊二酸和α-酮戊二酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖版B顯示補充(R)-2-HG的蠕蟲的壽命與補充以α-KG的蠕蟲類似。在以下情況下的平均壽命(成體期的天數(shù))：媒介物處理，m_veh＝14.0(n＝112個測試動物)；m_α-KG＝20.7(n＝114)，P<0.0001(對數(shù)秩檢驗)；m_(R)-2-HG＝20.0(n＝110)，P<0.0001(對數(shù)秩檢驗)；m_Met＝14.7(n＝116)，P＝0.4305(對數(shù)秩檢驗)；m_Leu＝13.2(n＝110)，P＝0.3307(對數(shù)秩檢驗)。圖版C顯示(S)-2-HG補充的蠕蟲的壽命與補充以α-KG的蠕蟲類似。m_veh＝15.7(n＝85)；m_Na2α-KG＝21.5(n＝99)，P<0.0001(對數(shù)秩檢驗)；m_(S)-2-HG＝20.7(n＝87)，P<0.0001(對數(shù)秩檢驗)。所有代謝物都在8mM的濃度下給與。

如圖15中所示，2-HG結(jié)合并抑制ATP合成酶。圖版A是顯示ATP5B是如通過DARTS和蛋白質(zhì)印跡鑒定的2-HG結(jié)合蛋白的凝膠。圖版B顯示ATP合成酶受2-HG抑制。從2-HG辛酯(600μΜ)釋放的2-HG使從小鼠肝分離的線粒體中狀態(tài)3(由2mM ADP引發(fā))而非狀態(tài)4o(寡霉素不敏感性，也就是說復(fù)合物V非依賴性)或3u(FCCP解偶聯(lián)的最大呼吸量)呼吸降低。辛醇用作媒介物。Oligo，寡霉素；FCCP，羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙；AA，抗霉素A。圖版C顯示在用2-HG辛酯或α-KG辛酯處理的U87細(xì)胞中，ATP含量降低(*P<0.05，***P<0.001；未配對t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。辛醇對ATP含量不具有影響。圖版D顯示在葡萄糖培養(yǎng)基中，在2-HG辛酯處理的U87細(xì)胞中，如由OCR指示的呼吸降低(**P<0.01，未配對t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。相較于DMSO，辛醇顯示對OCR無影響。繪制平均值±s.d.。

圖16顯示對IDH1(R132H)細(xì)胞中ATP合成酶的抑制。圖版A顯示在U87IDH1(R132H)細(xì)胞中，ATP水平降低(**P＝0.0071)。利用雙尾、雙樣本不等方差未配對t檢驗。在所有情況下都繪制平均值±s.d.。圖版B)在U87IDH1(R132H)細(xì)胞中，呼吸降低(**P＝0.0037)。圖版C顯示在U87/IDH1(R132H)細(xì)胞中，2-HG積累(***P＝0.0003)。圖版D顯示(R)-2-HG辛酯處理的U87細(xì)胞的代謝概況(***P<0.001，*P＝0.0435)。圖版E是由α-KG和2-HG通過抑制ATP合成酶達(dá)成的代謝物信號傳導(dǎo)的圖解模型。

圖17A-I顯示ATP5B敲低、2-HG積累或IDH突變的細(xì)胞中的代謝易感性。圖17A顯示U87/IDH1(R132H)細(xì)胞對葡萄糖饑餓具有增加的敏感性(***P<0.001)。圖17B-D顯示α-KG辛酯或2-HG辛酯處理的U87細(xì)胞在葡萄糖饑餓后展現(xiàn)活力降低(****P<0.0001，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05)。辛醇對活力不具有影響。圖17E)ATP5B敲低抑制U87細(xì)胞生長(***P＝0.0004)。圖17F顯示HCT 116IDH1(R132H/+)細(xì)胞展現(xiàn)對補充以(R)-3-羥基丁酸的無葡萄糖培養(yǎng)基的易感性增加(***P<0.001)。利用雙尾、雙樣本不等方差未配對t檢驗。在所有情況下都繪制平均值±s.d.。圖17G-I顯示ATP5B敲低、α-KG或2-HG的膜可滲透性酯酶可水解類似物處理或穩(wěn)定表達(dá)IDH1(R132H)的U87細(xì)胞在無葡萄糖含半乳糖培養(yǎng)基中展現(xiàn)mTOR復(fù)合物1活性降低。S6K(T389)和4E-BP1(S65)是mTOR復(fù)合物1的底物。辛醇展現(xiàn)對TOR活性無影響。

如圖18中所示，2-HG不影響通過電子傳遞鏈的電子流動，并且不影響ADP輸入。圖版A顯示來自分離的小鼠肝線粒體的在基礎(chǔ)條件下(在FCCP存在下，丙酮酸鹽和蘋果酸鹽分別作為復(fù)合物I底物和復(fù)合物II抑制劑)以及響應(yīng)于依序注射魚藤酮(Rote；復(fù)合物I抑制劑)、丁二酸鹽(復(fù)合物II底物)、抗霉素A(AA；復(fù)合物III抑制劑)、四甲基苯二胺(TMPD；細(xì)胞色素c(復(fù)合物IV)底物)的OCR。在用600μΜ2-HG辛酯處理30分鐘之后，未觀察到復(fù)合物I(C I)、復(fù)合物II(C II)或復(fù)合物IV(C IV)呼吸差異，而復(fù)合物V受相同處理抑制(圖15，圖版B)(2個獨立實驗)。辛醇用作媒介物。圖版B顯示在辛醇(媒介物對照)或2-HG辛酯(600μΜ)存在下測量ADP輸入。(R)-2-HG辛酯，P＝0.4237；(S)-2-HG辛酯，P＝0.1623)。ADP輸入的已知抑制劑CATR(羧基蒼術(shù)苷)作為陽性對照用于測定(***P＝0.0003)。利用雙尾、雙樣本不等方差未配對t檢驗。在所有情況下都繪制平均值±s.d.。

如圖19中所示，2-HG抑制細(xì)胞呼吸，并且降低ATP水平。圖版A顯示ATP合成酶的已知抑制劑寡霉素用作陽性對照。(*P<0.05；未配對t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。圖版B-C顯示用2-HG辛酯處理的U87細(xì)胞具有降低的ATP合成酶依賴性(寡霉素敏感性)氧消耗速率(OCR)(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；未配對t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差)。在所有情況下都繪制平均值±s.d.。

圖20顯示2-HG積累的細(xì)胞的細(xì)胞能量學(xué)和代謝概況。圖版A顯示HCT 116IDH1(R132H/+)細(xì)胞展現(xiàn)呼吸降低(**P＝0.0015)。圖版B顯示2-HG水平在HCT 116/IDH1(R132H/+)細(xì)胞中比在親本對照細(xì)胞中高約100倍(****P<0.0001)。圖版C顯示在(S)-2-HG辛酯處理的U87細(xì)胞中，TCA循環(huán)中間體和相關(guān)氨基酸的代謝概況(*P<0.05)。圖版D顯示在α-KG辛酯處理的U87細(xì)胞中，TCA循環(huán)中間體和相關(guān)氨基酸的代謝概況(***P<0.001，**P<0.01)。未配對t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差。在所有情況下都繪制平均值±s.d.。

如圖21中所示，HCT 116IDH1(R132H/+)細(xì)胞展現(xiàn)代謝易感性和生長抑制。圖版A顯示HCT 116IDH1(R132H/+)細(xì)胞對葡萄糖饑餓具有增加的敏感性。圖版B顯示HCT 116IDH1(R132H/+)細(xì)胞呈現(xiàn)生長速率降低。**P<0.01；未配對t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差。在所有情況下都繪制平均值±s.d.。

圖22顯示在ATP5B敲低、用2-HG辛酯或α-KG辛酯處理或IDH1(R132H)突變后的細(xì)胞生長抑制。圖版A顯示甚至在葡萄糖培養(yǎng)基中，ATP5B敲低也降低U87細(xì)胞的生長速率。圖版B-D顯示在無葡萄糖培養(yǎng)基中，在α-KG辛酯或2-HG辛酯處理后，U87細(xì)胞展現(xiàn)生長速率降低。雖然程度較小，但在葡萄糖培養(yǎng)基中，生長速率也降低(未顯示)。圖版E顯示表達(dá)IDH1(R132H)的U87細(xì)胞甚至在葡萄糖培養(yǎng)基中也展現(xiàn)增殖速率降低。****P<0.0001，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；未配對t檢驗，雙尾，雙樣本不等方差。在所有情況下都繪制平均值±s.d.。

在與對α-KG和2-HG化合物進(jìn)行的實驗類似的實驗中，施用D-谷氨酸與施用L-谷氨酸兩者均使受試者的壽命增加(數(shù)據(jù)未顯示)。

就為理解或完善本發(fā)明的公開內(nèi)容所必需來說，本文提及的所有出版物、專利和專利申請都以引用的方式明確并入本文，所述引用的程度就好像各自被個別地如此并入一樣。

由此已描述本發(fā)明的示例性實施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)注意在公開內(nèi)容內(nèi)的僅具有示例性，并且可在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行各種其它替代方案、改適和修改。因此，本發(fā)明不限于如本文說明的特定實施方案，而是僅受以下權(quán)利要求限制。