本發(fā)明涉及一種丹參飲提取物的制備方法，屬藥物領域。

背景技術：

丹參飲源于陳修園《時方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，具有活血化瘀、行氣止痛等功效。由于其配伍精當、療效顯著，被廣泛地應用于高血壓、冠心病心絞痛、慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍、胃神經官能癥等疾病的治療。丹參飲組方簡單，藥味較少且化學成分種類不多，僅含有揮發(fā)油、菲醌類、皂苷等，因此可作為進行中藥復方研究的理想方劑。目前，制備丹參飲提取物的方法較多，其共同點在于：提取丹參的有效成分時均采用了煎煮提取方法，如，蒲清榮，黃銳，等.丹參飲中檀香和砂仁揮發(fā)性成分的提取及鑒別研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2014，35(11)：57-58.公開了一種丹參飲提取物的制備方法：a.按處方比例稱取檀香、砂仁各16g，加入10倍量水浸泡30min，用水蒸汽蒸餾法收集蒸餾液；b.取a步驟的藥渣與丹參96g加8倍量水浸泡1h，煎煮3次，每次1h，合并煎液，過濾，濃縮至800ml，冷藏48h，取上清液；c.將a步驟的蒸餾液與b步驟的上清液混合，加純化水至1000ml，攪勻。該方法在提取丹參有效成分時，采用了煎煮方法，導致丹參中丹參酮類有效成分損失較多，無法發(fā)揮藥材的最佳藥效。因此，尋找一種制備工藝簡便、成本低廉，且能夠提高藥材有效成分含量的制備方法對丹參飲提取物制劑的開發(fā)和應用具有非常重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的技術方案是提供了一種丹參飲提取物的制備方法。

本發(fā)明提供了一種丹參飲提取物的制備方法，其特征在于：包括下述步驟：

a.取檀香和砂仁，加水浸泡后蒸餾提取，收集蒸餾液和藥渣備用；

b.取丹參，加乙醇滲漉提取，收集滲濾液和藥渣，其中，滲漉液經濃縮后加入羥丙基-β-環(huán)糊精，攪勻，備用；

c.取步驟a和步驟b的藥渣混合，加水提取，濾過，濃縮，離心；

d.取步驟c的離心液，加入步驟b羥丙基-β-環(huán)糊精的滲漉液，回收乙醇，再加入步驟a的蒸餾液，攪勻，過濾，即得。

具體地，步驟a中加8-12倍量水，浸泡0.5-2h；

步驟b中加2-8倍量60-95v/v乙醇提??；

步驟c中加5-10倍量水，煎煮1-3次，每次0.5-1h。

優(yōu)選地，步驟a中加10倍量水，浸泡0.5h；

步驟b中加4倍量95％v/v乙醇提??；

步驟c中加8倍量水，煎煮3次，每次1h。

本發(fā)明還提供了所述的制備方法制備得到的丹參飲提取物。

本發(fā)明方法制備工藝簡便、生產成本低，明顯提高了丹參中丹參酮類有效成分的含量。制備得到的丹參飲提取物在預防和/或治療心肌缺血、心肌損傷以及鎮(zhèn)痛、促胃腸消化方面發(fā)揮顯著的藥效，對丹參飲提取物制劑的開發(fā)和應用具有非常重要的意義。

附圖說明

圖1薄層色譜圖；

圖中，從左至右依次為：丹參酮IIA、丹參飲、本發(fā)明丹參飲提取物

圖2注射ISO前10min各組大鼠心電圖

圖3注射ISO后30min空白對照組大鼠心電圖

圖4注射ISO后30min陽性對照組大鼠心電圖

圖5注射ISO后30min低劑量組大鼠心電圖

圖6注射ISO后30min中劑量組大鼠心電圖

圖7注射ISO后30min高劑量組大鼠心電圖

圖8注射異丙腎上腺素2h后空白對照組大鼠心肌HE染色(×200)

圖9注射異丙腎上腺素2h后陽性對照組大鼠心肌HE染色(×200)

圖10注射異丙腎上腺素2h后低劑量組大鼠心肌HE染色(×200)

圖11注射異丙腎上腺素2h后中劑量組大鼠心肌HE染色(×200)

圖12注射異丙腎上腺素2h后高劑量組大鼠心肌HE染色(×200)

以下通過具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并不限制本發(fā)明，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明作出的各種改變和替換，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權利要求的范圍。

具體實施方式

實施例1本發(fā)明丹參飲提取物的制備

按下述配比稱取原料：

丹參200g、檀香33.33g和砂仁33.33g

制備方法如下：

a.檀香和砂仁加10倍量水，浸泡0.5h，蒸餾，收集蒸餾液416mL，備用；

b.丹參用4倍量95％乙醇作溶劑進行滲漉，收集滲漉液，回收乙醇濃縮至800mL，加入120g羥丙基-β-環(huán)糊精，攪勻，備用；

c.將步驟a和步驟b的藥渣混合，加8倍量水，煎煮3次，每次1h，合并煎液，濾過，濃縮至584mL，離心；

d.取步驟c的離心液，加入羥丙基-β-環(huán)糊精的滲漉液，回收乙醇至無醇味，加入檀香、砂仁蒸餾液，加入純化水至1000mL，攪勻，過濾，即得。每ml含原生藥0.26666g。

實施例2本發(fā)明丹參飲提取物的制備

按下述配比稱取原料：

丹參200g、檀香33.33g和砂仁33.33g

制備方法如下：

a.檀香和砂仁加12倍量水，浸泡2h，蒸餾，收集蒸餾液416mL，備用；

b.丹參用8倍量75％乙醇作溶劑進行滲漉，收集滲漉液，回收乙醇濃縮至800mL，加入120g羥丙基-β-環(huán)糊精，攪勻，備用；

c.將步驟a和步驟b的藥渣混合，加10倍量水，煎煮2次，每次1h，合并煎液，濾過，濃縮至584mL，離心；

d.取步驟c的離心液，加入羥丙基-β-環(huán)糊精的滲漉液，回收乙醇至無醇味，加入檀香、砂仁蒸餾液，加入純化水至1000mL，攪勻，過濾，即得。每ml含原生藥0.26666g。

實施例3本發(fā)明丹參飲提取物的制備

按下述配比稱取原料：

丹參200g、檀香33.33g和砂仁33.33g

制備方法如下：

a.檀香和砂仁加8倍量水，浸泡1h，蒸餾，收集蒸餾液416mL，備用；

b.丹參用2倍量60％乙醇作溶劑進行滲漉，收集滲漉液，回收乙醇濃縮至800mL，加入120g羥丙基-β-環(huán)糊精，攪勻，備用；

c.將步驟a和步驟b的藥渣混合，加5倍量水，煎煮1次，每次0.5h，合并煎液，濾過，濃縮至584mL，離心；

d.取步驟c的離心液，加入羥丙基-β-環(huán)糊精的滲漉液，回收乙醇至無醇味，加入檀香、砂仁蒸餾液，加入純化水至1000mL，攪勻，過濾，即得。每ml含原生藥0.26666g。

以下通過具體實驗證明本發(fā)明的有益效果。

實驗例1丹參飲提取物藥效學研究

1材料

1.1藥物與試劑

本發(fā)明丹參飲提取物(按照實施例1制備)、欣康(單硝酸異山梨酯緩釋片)：20mg×48片，山東魯南貝特制藥有限公司生產，批號：20150321。

鹽酸異丙腎上腺素注射液(ISO)：lmg*2ml，上海禾豐制藥有限公司生產，批號20140201。

冰醋酸，分析純，購自成都市科龍化工試劑廠，批號：20140104。

阿斯匹林：0.1g×30片，麗珠集團利民制藥廠生產，批號：140923。

西沙比利：5mg×10片，浙江京新藥業(yè)股份有限公司生產，批號：20141208。

1.2動物

SD大鼠，雄雄各半，體重：180g～220g；KM小鼠，雌雄各半，體重：18～22g。以上動物均為SPF級實驗動物，實驗前適應性喂養(yǎng)一周，由四川醫(yī)科大學動物實驗中心提供，生產許可證號：SCXK(川)2013-17，使用許可證號：SCXK(川)2013-065。

1.3儀器

RM6240生物信號采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠生產；FAl004電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；9mm圓形打孔器：自制；PV－200足趾容積測量儀(成都泰盟科技有限公司)；YLS－6B智能熱板儀(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)。

2實驗方法

2.1劑量設置

丹參飲的臨床人用量為一次20mL(每ml含原生藥0.26666g)，一日3次。藥效學研究時三個劑量組通常設置為臨劑用量的1、2、4倍，成人按60kg計算，由于大鼠與人的等效劑量比值為6.25：1，小鼠與人的等效劑量比值為9.1：1，因此丹參飲大鼠低劑量1.67g生藥/kg、中劑量3.34g生藥/kg、高劑量6.68g生藥/kg，小鼠低劑量2.43g生藥/kg、中劑量組4.86g生藥/kg、高劑量9.72g生藥/kg。臨用時高劑量組將丹參飲濃縮1倍，中劑量組不變，低劑量組將丹參飲稀釋1倍后，大鼠均按1.25ml/100g體重灌胃，小鼠均按0.182ml/10g體重灌胃

2.2對ISO致大鼠心肌缺血的影響

取大鼠50只,隨機分為空白對照組(生理鹽水)、陽性對照組(欣康30mg/kg)、丹參飲低中高劑量組(1.68g生藥/kg、3.36g生藥/kg、6.72g生藥/kg)，均按1.25ml/100g灌胃。各組大鼠灌胃給藥，連續(xù)灌胃14天。于 末次給藥2h后,腹腔注射1％戊巴比妥鈉1ml/100g麻醉。置于操作臺上，按“生物電電纜的正極(紅色)接左下肢，負極(綠色)接右上肢，參考極(黑色)接右下肢”的順序將3個針形電極分別插于大鼠四肢皮下，檢查記錄注射ISO前10min和注射ISO(10mg/Kg)后30min大鼠標準肢體II導聯(lián)心電圖(走紙速度為50ms/div，標準電壓為lmv＝10mm)。各組自身對照比較大鼠注射ISO前后心電圖的變化。末次注射IS02h后經腹主動脈采血,分離血清,4℃保存,待測CPK、LDH。在處死大鼠后2min內迅速切取大鼠心尖同一部位心肌組織，修整成1×1×3mm規(guī)格大小的標本，放入中性甲醛溶液固定，進行石蠟包埋、切片，HE染色后，光學顯微鏡下觀察心肌細胞結構。

2.3對小鼠常壓耐缺氧時間的影響

取KM種小鼠50只，隨機分為為空白對照組(生理鹽水)、陽性對照組(欣康30mg/kg)、丹參飲低、中、高劑量組(2.43g生藥/kg、4.86g生藥/kg、9.72g生藥/kg)，均按0.182ml/10g體重灌胃。各組小鼠灌胃給藥，連續(xù)灌胃14天。于末次給藥2h后,將廣口瓶瓶口涂以凡士林，其中放入鈉石灰5g。給藥30min后，將小鼠放入廣口瓶內，每瓶1只，加蓋密封。觀察并記錄以小鼠呼吸停止作為耐缺氧時間。

2.4對異丙腎上腺素致心肌缺血模型小鼠耐缺氧時間的影響

取KM種小鼠50只，分組給藥同2.3。于末次給藥2h后,皮下注射異丙腎上腺素10mg/kg,誘發(fā)小鼠心肌缺血模型。將廣口瓶瓶口涂以凡士林，其中放入鈉石灰5g。給藥30min后，將小鼠放入廣口瓶內，每瓶1只，加蓋密封。觀察并記錄以小鼠呼吸停止作為耐缺氧時間。

2.5對醋酸所致小鼠扭體反應的影響

KM小鼠50只，雌雄各半，隨機分為空白對照組(生理鹽水)、陽性對照組(阿斯匹林，200mg/Kg))、丹參飲低中高劑量組(2.43g生藥/kg、4.86g生藥/kg、9.72g生藥/kg)，均按0.182ml/10g灌胃，連續(xù)灌胃14天。于末次給藥0.5小時后，腹腔注射0.5％冰醋酸0.2ml/只，觀察并記錄每只小鼠自注射醋酸致痛后至出現(xiàn)第一次扭體反應的時間(扭體潛伏期)和15分鐘內出現(xiàn)扭體反應的次數(shù)，計算各組藥物扭體抑制率(對應組扭體次數(shù)/陰性組扭體次數(shù))。

2.6對小鼠熱板性疼痛的影響

KM小鼠70只，雌性，用YLS-6B智能熱板儀測定痛閾值(調節(jié)熱板溫度使恒定于55±0.5℃，以小鼠自置于儀器上至出現(xiàn)舔后足所需時間作為該鼠的痛閾值)，凡舔后足時間小于5s或大于30s或跳躍者棄之不用，篩選出合格的KM小鼠50只，隨機分為空白對照組(生理鹽水)、陽性對照組(阿斯匹林，200mg/Kg))、丹參飲低中高劑量組(2.43g生藥/kg、4.86g生藥/kg、 9.72g生藥/kg)，均按0.182ml/10g灌胃，連續(xù)灌胃14天。于末次給藥后30min后分別測小鼠痛閾值，如60s仍無反應，則其痛閾值以60s計算。

2.7對胃腸功能的影響(胃排空和腸推進實驗)

取健康KM小鼠50只，雌雄各半，實驗前進食不進水20小時，隨機分為空白對照組(生理鹽水)、陽性對照組(西沙必利，4mg/kg)、丹參飲低中高劑量組(2.43g生藥/kg、4.86g生藥/kg、9.72g生藥/kg)，均按0.182ml/10g灌胃，連續(xù)灌胃14天。于末次給藥后40min后，每只小鼠用營養(yǎng)性半固體糊(取5g羧甲基纖維素溶于25ml蒸餾水中，然后分別加入8g奶粉、4g糖、4g淀粉、3g活性炭，攪拌均勻，配成150ml約150g的半固體糊，置冰箱中冷藏12h，使用前2h取出恢復常溫)0.8ml灌胃，20min后脫頸椎處死小鼠。結扎小鼠胃噴門和幽門，取胃，沿胃大彎剪開胃體，洗出胃內容物后稱凈重，計算胃殘留率。同時自胃幽門剪至回盲部，用鑷子不加牽引的取出整個小腸段，鋪直于表面濕潤的板子上，測量幽門至炭糊最前端的距離和小腸全長，計算小腸推進率。

胃殘留率＝(全胃重量-胃凈重量)/灌胃營養(yǎng)性半固體糊重量×100％

小腸推進率＝幽門至炭糊最前端的距離/小腸全長×100％

3結果

3.1對心肌缺血模型大鼠心電圖的影響，見表1、圖2-圖7。

表1.注射ISO后30min各組大鼠心電圖陽性反應情況(n＝10)

注：與空白對照組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

結果顯示，各組大鼠注射ISO前10min心電圖全部正常(圖2)，未出現(xiàn)陽性反應?？瞻讓φ战M10只大鼠給ISO后30min均出現(xiàn)陽性反應，表現(xiàn)為出現(xiàn)大Q波或ST段明顯抬高(圖3)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明ISO造模成功。丹參飲三個劑量組和陽性對照組大鼠在給ISO后30min陽性反應率明顯下降(圖4，圖5，圖6，圖7)，與空白對照組比較，差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)。

3.2對心肌缺血模型大鼠血清心肌酶的影響，見表2。

表2.注射異丙上腺素2h后各組大鼠的血清心肌酶(n＝10)

注：與空白對照組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

結果顯示，腹腔注射異丙上腺素2h后,丹參飲高劑量組大鼠LDH、CPK活性明顯降低，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3.3對心肌缺血模型大鼠心肌組織結構的影響，見圖8-圖12。

結果顯示，腹腔注射異丙上腺素2h后,光鏡下顯示空白對照組大鼠心肌纖維排列紊亂，細胞核模糊或消失(圖7)；陽性對照組及丹參飲低、中劑量組心肌纖維排列輕度紊亂，部分細胞核變得較為模糊(圖9、圖10、圖11)；丹參飲高劑量組心肌纖維排列基本正常，病變輕微(圖12)。

3.4對小鼠耐缺氧時間的影響，見表3。

表3.丹參飲對小鼠常壓耐缺氧時間的影響

注：與生理鹽水組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

結果顯示，丹參飲低、中劑量組對小鼠耐缺氧時間無明顯影響，但丹參飲高劑量組能延長小鼠耐缺氧時間，與空白對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)。

3.5對ISO致心肌缺血模型小鼠耐缺氧時間的影響，見表4。

表4.丹參飲對ISO致心肌缺血模型小鼠耐缺氧時間的影響

注：與生理鹽水組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

結果顯示，腹腔注射ISO 30min后，丹參飲低劑量組對小鼠耐缺氧時間無明顯影響，但丹參飲中、高劑量組和陽性對照組能延長小鼠耐缺氧時間，與空白對照組比較，差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)，

3.6對醋酸所致小鼠扭體反應的影響，見表5。

表5.丹參飲對醋酸所致小鼠扭體反應的影響

注：與空白對照組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

結果顯示，小鼠注射0.5％冰醋酸后，丹參飲低劑量組對小鼠扭體反應無明顯影響，但丹參飲中、高劑量組能延長出現(xiàn)扭體反應的平均時間(潛伏期)，減少扭體反應的平均次數(shù)，與空白對照組比較，差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)。

3.7對小鼠熱板性疼痛的影響，見表6。

表6.丹參飲對小鼠熱板性疼痛的影響

注：與空白對照組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

結果顯示，丹參飲各劑量組在給藥后30min后對小鼠的痛閾值無明顯影響，與生理鹽水組比較，差異有顯著性(P>0.05)。

3.8對小鼠胃腸運動功能的影響，見表7。

表7.丹參飲對小鼠胃腸運動功能的影響

注：與空白對照組比較，^*P＜0.05，^**P＜0.01

結果顯示，小鼠灌胃營養(yǎng)性半固體糊后，丹參飲低劑量組對小鼠胃殘留率和小腸推進率無明顯影響，但丹參飲中、高劑量組能促進胃排空和小腸推進運動，其胃殘留率和小腸推進率與空白對照組比較，差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)。

綜上，本發(fā)明丹參飲提取物能有效緩解ISO致心肌缺血模型大鼠的心電圖表現(xiàn)，降低心肌酶LDH、CPK的活性，改善缺血心肌的組織結構，對心肌缺血具有明顯的防治作用；能提高小鼠常壓耐缺氧時間，并明顯延長ISO致心肌缺血模型小鼠的耐缺氧時間，對缺血性心肌損傷具有保護作用；能延長出現(xiàn)扭體反應的平均時間，減少扭體反應的平均次數(shù)，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用；本發(fā)明丹參飲提取物還能減少胃殘留率，提高小腸推進率，具有顯著地促進胃腸消化功能的作用。

本發(fā)明方法制備工藝簡便、生產成本低，明顯提高了丹參中丹參酮類有 效成分的含量。制備得到的丹參飲提取物在預防和/或治療心肌缺血、心肌損傷以及鎮(zhèn)痛、促胃腸消化方面發(fā)揮顯著的藥效，對丹參飲提取物制劑的開發(fā)和應用具有非常重要的意義。