禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備方法
【專利摘要】禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備方法，涉及疫苗的制備方法；根據禽多殺性巴氏桿菌的基因組序列設計用于擴增ptfa基因的兩條引物，PCR擴增出禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因；采用限制性核酸內切酶BamHⅠ和XholⅠ酶切禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因和pcDNA3.1(+)質粒，然后構建禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒；然后依次加入硫酸鈉、無水醋酸鈉、月桂基硫酸鈉、氯化鈣等物質，混合均勻后即為禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗。本發(fā)明方法制備的疫苗不含有活的病原菌，給動物應用后不會由于疫苗本身的原因而引發(fā)禽多殺性巴氏桿菌病，免疫保護率為達到85%，而且該疫苗的本質是含重組質粒的納米顆粒，因此易于保存和運輸。
【專利說明】禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備方 法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種DNA疫苗，具體的說是禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米 DNA疫苗的制備方法。

【背景技術】
[0002] 禽多殺性巴氏桿菌病，是由禽多殺性巴氏桿菌引起的主要侵害雞、火雞、鴨、鵝等 家禽和野禽類的一種接觸性敗血性傳染病，以發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難為特征，最急性病例死 亡迅速。是嚴重影響我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要細菌病之一，也是一種目前尚無很好的預防方 法而又造成重大經濟損失的禽類疾病。
[0003] 目前我國用于預防禽多殺性巴氏桿菌病的商業(yè)化疫苗主要有弱毒活疫苗和滅活 疫苗兩種，其中弱毒活疫苗是我國所有禽類傳染病弱毒活疫苗中研究最多的一類。該類疫 苗雖然能在一定程度上預防該病的發(fā)生，但也存在安全性較差，副作用偏大等問題，應用不 當甚至可能引起禽多殺性巴氏桿菌病的爆發(fā)。而禽多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的免疫效果 尚且不如弱毒活疫苗，所以必需研制更加有效的禽多殺性巴氏桿菌病疫苗以預防該病。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明針對上述問題提供了一種可用于預防禽多殺性巴氏桿菌病的禽多殺性巴 氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備方法，該疫苗制備方法較為簡單，操作方便，以 該方法制備的疫苗能夠有效的防止禽多殺性巴氏桿菌病對雞的傷害。
[0005] 本發(fā)明為解決上述技術問題所采用的技術方案是： 禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備方法，其具體制備方法包括以 下步驟： 步驟一、禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因的獲得 (1) 、根據禽多殺性巴氏桿菌的基因組序列設計用于擴增Ptfa基因的兩條引物PL和 PU，其基因序列如序列表序列1和序列2 : PU ： 5; -TGCggattcATGAAAAAAGCCATTTTC-3; PL：5/ -TGACCTCGAGtTATGCGCAAAATCCT-3;； (2) 、向PCR反應管中依次加入PU和PL引物各1微升、濃度為100-200pmol/ml的禽多 殺性巴氏桿菌基因組水溶液1微升、ddNTPs 2. 5微升、Taq DNA聚合酶1微升、PCR反應緩沖 液2微升和水11. 5微升，混合均勻后進行PCR反應，PCR反應結束后，產物中禽多殺性巴氏 桿菌ptfa基因的基因序列如序列表序列3 ; 所述PCR反應程序為：首先95 °C預變性3分鐘，然后進入循環(huán)程序，循環(huán)程序為94°C變 性1分鐘，53°C復性30秒，72°C延伸30秒，將上述循環(huán)程序重復25次后再以72°C終延伸5 分鐘結束PCR反應。
[0006] (3)、向上述裝有禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因的PCR反應管中依次加入限制性核 酸內切酶I和通〇1 I各3微升、限制性核酸內切酶緩沖液4微升和水3微升，混合 均勻后將PCR反應管放置于37°C的水浴鍋中反應6小時，取出后再放入65°C的水浴鍋中5 分鐘以結束反應，產物為酶切后禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因，將其保存于-20°C條件下，備 用； 步驟二、pcDNA3. 1(+)質粒的處理 向〇. 5毫升的離心管中依次加入pcDNA3. 1(+)質粒5微升、限制性核酸內切酶BamH I 和Xhol I各2. 5微升、限制性核酸內切酶緩沖液2微升和水8微升，混合均勻后將離心管 放置于37°C的水浴鍋中反應5小時，取出后再放入65°C的水浴鍋中5分鐘，得到處理后的 pcDNA3. 1(+)質粒，備用； 步驟三、禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒的制備 (1) 、依次向〇. 5毫升的離心管中加入處理后的pcDNA3. 1 (+)質粒1微升、酶切后禽多 殺性巴氏桿菌ptfa基因7微升、T4 DNA連接酶1微升和T4 DNA連接酶緩沖液1微升，混合 均勻后將離心管放置于16°C的水浴鍋中反應8小時，取出備用； (2) 、將上述備用的0. 5毫升離心管中的液體移入1. 5毫升的離心管中，再加入100微 升大腸桿菌JM83,混合均勻后依次放置于0°C條件下30分鐘、42°C條件下1分鐘和0°C條件 下2分鐘，然后向離心管中加入0. 8毫升的大腸桿菌液體培養(yǎng)基，混合均勻后放置于37°C的 恒溫搖床中以180轉/分鐘的轉速振蕩培養(yǎng)1小時，培養(yǎng)結束后將離心管以2000轉/分鐘 的轉速離心1分鐘，倒掉上清液，再向其中加入〇. 1毫升無菌水，將懸浮起來的沉淀吸出，并 涂布于含濃度為60微克/毫升氨芐青霉素的固體培養(yǎng)平板上，倒置于37°C的恒溫培養(yǎng)箱內 培養(yǎng)12小時； (3) 、挑取上述培養(yǎng)后的固體培養(yǎng)平板上的1個菌落，將菌落放入5毫升含濃度為60微 克/毫升氨芐青霉素的大腸桿菌液體培養(yǎng)基中，置于轉速為180轉/分鐘，溫度為37°C的恒 溫搖床內振蕩培養(yǎng)12小時，備用； (4) 、取上述培養(yǎng)后的菌液0. 6毫升，向其中加入0. 3毫升苯酚和0. 3毫升氯仿，混合均 勻后以10000轉/分鐘的轉速離心5分鐘，離心結束后吸取上層液體加入到一個2毫升的 離心管中，再向其中加入1. 2毫升的無水乙醇，混合均勻后以13000轉/分鐘的轉速離心10 分鐘，倒掉上清液后將含有沉淀物的2毫升的離心管室溫放置30分鐘，向其中加入30微升 無囷水溶解沉淀后備用； (5) 、取上述2毫升的離心管中的液體2微升加入到0. 5毫升的離心管中，再依次加入 限制性核酸內切酶及I和ZAol I各1微升、限制性核酸內切酶緩沖液1微升和水5微 升，混合均勻后放置于37°C的水浴鍋中反應2小時，反應結束后瓊脂糖凝膠電泳檢測確定 產物中的禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒，采用分光光度計測定其濃度，并以無菌水將其 調整到0.1毫克/毫升，備用； 步驟四、禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備 (1) 、取濃度為〇. 1毫克/毫升的禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒0. 5毫升加入1. 5 毫升的離心管中，向其中加入0. 71毫克硫酸鈉，待硫酸鈉溶解后放置于55°C的水浴鍋中保 溫20分鐘，備用； (2) 、稱取無水醋酸鈉4. 1毫克溶解于含10毫升無菌水中的試管中，以氫氧化鈉調節(jié)pH 值為5. 6,再向試管中加入殼聚糖0. 2克，待殼聚糖溶解后將該試管置于55°C的水浴鍋中保 溫20分鐘，隨后吸取試管中的0. 5毫升液體加入到上述步驟（1)保溫后的1. 5毫升離心管 中，將離心管在漩渦振蕩器上振蕩1分鐘，然后在室溫下放置1小時，備用； (3)、再依次向上述步驟（2)備用的離心管中加入3毫克月桂基硫酸鈉和5毫克氯化鈣， 待月桂基硫酸鈉和氯化鈣溶解后再向其中加入〇. 1毫升的玉米胚芽油，混合均勻后在室溫 下放置20分鐘，此時離心管中的液體即為禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫 苗。
[0007] 所述的大腸桿菌液體培養(yǎng)基的組成成分：按重量百分比配置，其中蛋白胨1%，酵 母浸膏0. 5%，氯化鈉1%，余量為水；所述的固體培養(yǎng)平板的組成成分：按重量百分比配置， 其中蛋白胨1%，酵母浸膏〇. 5%，氯化鈉1%，瓊脂粉1. 8%，余量為水。
[0008] 所述大腸桿菌JM83和禽多殺性巴氏桿菌也可通過市場購買得到。
[0009] 有益效果是： 1、本發(fā)明所用的基因是禽多殺性巴氏桿菌的Ptfa基因，該基因是禽多殺性巴氏桿菌 的主要保護性抗原基因之一，該基因編碼的抗原可誘導動物機體產生較強的免疫應答水平 和保護效果。本發(fā)明所選用的殼聚糖是迄今為止人們發(fā)現的自然界中唯一帶正電荷的堿性 多糖，該堿性多糖可包裹帶負電荷的禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒形成緊密結合的納 米顆粒復合物即禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗，進入動物機體后可通過 表面多余的陽離子電荷與動物細胞表面的陰離子粘蛋白結合，被吞噬入細胞，轉入細胞核 內表達，同時，禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒被殼聚糖分子包裹后可抵抗動物體內源性 DNA酶的降解，增強緩釋控釋作用，提高免疫效果。
[0010] 2、本發(fā)明制備的禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗除含有殼聚糖 夕卜，還添加有月桂基硫酸鈉、氯化鈣和玉米胚芽油。其中的月桂基硫酸鈉進入動物機體后 可激活動物機體的特異性和非特異性免疫應答反應，增強抗原提呈細胞對疫苗的加工和提 呈；氯化鈣可增加動物細胞膜的通透性，有利于疫苗中的DNA分子進入細胞內；玉米胚芽油 可與殼聚糖納米DNA疫苗相融合，有利于疫苗的緩慢釋放，從而不斷地刺激動物機體的免 疫系統(tǒng)，延長疫苗的免疫持續(xù)期，因此，本發(fā)明將月桂基硫酸鈉、氯化鈣、玉米胚芽油與殼聚 糖聯(lián)合應用有利于增強動物機體對疫苗的免疫應答反應，提高疫苗的免疫保護效果。
[0011] 3、利用本發(fā)明方法制備的禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗不含 有活的病原菌，給動物應用后不會由于疫苗本身的原因而引發(fā)禽多殺性巴氏桿菌病，免疫 保護率為達到85%，而且該疫苗的本質是含重組質粒的納米顆粒，因此易于保存和運輸。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明所獲得的禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖2是本發(fā)明禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒的雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖中標記是：M、DL5000Marker，1、禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因，2、雙酶切后的 pcDNA3. 1 (+)質粒。

【具體實施方式】
[0013] 禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備方法，其具體制備方法包 括以下步驟： 步驟一、禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因的獲得 (1) 、根據禽多殺性巴氏桿菌的基因組序列設計用于擴增Ptfa基因的兩條引物PL和 PU，其基因序列如序列表序列1和序列2 : PU ： 5; -TGCggattcATGAAAAAAGCCATTTTC-3; PL：5/ -TGACCTCGAGtTATGCGCAAAATCCT-3;； (2) 、向PCR反應管中依次加入PU和PL引物各1微升、濃度為100-200pmol/ml的禽多 殺性巴氏桿菌基因組水溶液1微升、ddNTPs 2. 5微升、Taq DNA聚合酶1微升、PCR反應緩沖 液2微升和水11. 5微升，混合均勻后進行PCR反應，PCR反應結束后，產物中禽多殺性巴氏 桿菌ptfa基因的基因序列如序列表序列3 ; 所述PCR反應程序為：首先95 °C預變性3分鐘，然后進入循環(huán)程序，循環(huán)程序為94°C變 性1分鐘，53 °C復性30秒，72 °C延伸30秒，將上述循環(huán)程序重復25次后再以72 °C終延伸5 分鐘結束PCR反應。
[0014] (3)、向上述裝有禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因的PCR反應管中依次加入限制性核 酸內切酶I和通〇1 I各3微升、限制性核酸內切酶緩沖液4微升和水3微升，混合 均勻后將PCR反應管放置于37°C的水浴鍋中反應6小時，取出后再放入65°C的水浴鍋中5 分鐘以結束反應，產物為酶切后禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因，將其保存于-20°C條件下，備 用； 步驟二、pcDNA3. 1(+)質粒的處理 向〇. 5毫升的離心管中依次加入pcDNA3. 1 (+)質粒5微升、限制性核酸內切酶BamH I 和Xhol I各2. 5微升、限制性核酸內切酶緩沖液2微升和水8微升，混合均勻后將離心管 放置于37°C的水浴鍋中反應5小時，取出后再放入65°C的水浴鍋中5分鐘，得到處理后的 pcDNA3. 1(+)質粒，備用； 步驟三、禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒的制備 (1) 、依次向〇. 5毫升的離心管中加入處理后的pcDNA3. 1 (+)質粒1微升、酶切后禽多 殺性巴氏桿菌ptfa基因 7微升、T4 DNA連接酶1微升和T4 DNA連接酶緩沖液1微升，混合 均勻后將離心管放置于16°C的水浴鍋中反應8小時，取出備用； (2) 、將上述備用的0. 5毫升離心管中的液體移入1. 5毫升的離心管中，再加入100微 升大腸桿菌JM83,混合均勻后依次放置于0°C條件下30分鐘、42°C條件下1分鐘和0°C條件 下2分鐘，然后向離心管中加入0. 8毫升的大腸桿菌液體培養(yǎng)基，混合均勻后放置于37°C的 恒溫搖床中以180轉/分鐘的轉速振蕩培養(yǎng)1小時，培養(yǎng)結束后將離心管以2000轉/分鐘 的轉速離心1分鐘，倒掉上清液，再向其中加入〇. 1毫升無菌水，將懸浮起來的沉淀吸出，并 涂布于含濃度為60微克/毫升氨芐青霉素的固體培養(yǎng)平板上，倒置于37°C的恒溫培養(yǎng)箱內 培養(yǎng)12小時； (3) 、挑取上述培養(yǎng)后的固體培養(yǎng)平板上的1個菌落，將菌落放入5毫升含濃度為60微 克/毫升氨芐青霉素的大腸桿菌液體培養(yǎng)基中，置于轉速為180轉/分鐘，溫度為37°C的恒 溫搖床內振蕩培養(yǎng)12小時，備用； (4) 、取上述培養(yǎng)后的菌液0. 6毫升，向其中加入0. 3毫升苯酚和0. 3毫升氯仿，混合均 勻后以10000轉/分鐘的轉速離心5分鐘，離心結束后吸取上層液體加入到一個2毫升的 離心管中，再向其中加入1. 2毫升的無水乙醇，混合均勻后以13000轉/分鐘的轉速離心10 分鐘，倒掉上清液后將含有沉淀物的2毫升的離心管室溫放置30分鐘，向其中加入30微升 無囷水溶解沉淀后備用； (5)、取上述2毫升的離心管中的液體2微升加入到0. 5毫升的離心管中，再依次加入 限制性核酸內切酶及I和ZAol I各1微升、限制性核酸內切酶緩沖液1微升和水5微 升，混合均勻后放置于37°C的水浴鍋中反應2小時，反應結束后瓊脂糖凝膠電泳檢測確定 產物中的禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒，采用分光光度計測定其濃度，并以無菌水將其 調整到0.1毫克/毫升，備用； 步驟四、禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備 (1) 、取濃度為〇. 1毫克/毫升的禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒0. 5毫升加入1. 5 毫升的離心管中，向其中加入0. 71毫克硫酸鈉，待硫酸鈉溶解后放置于55°C的水浴鍋中保 溫20分鐘，備用； (2) 、稱取無水醋酸鈉4. 1毫克溶解于含10毫升無菌水中的試管中，以氫氧化鈉調節(jié)pH 值為5. 6,再向試管中加入殼聚糖0. 2克，待殼聚糖溶解后將該試管置于55°C的水浴鍋中保 溫20分鐘，隨后吸取試管中的0. 5毫升液體加入到上述步驟（1)保溫后的1. 5毫升離心管 中，將離心管在漩渦振蕩器上振蕩1分鐘，然后在室溫下放置1小時，備用； (3) 、再依次向上述步驟（2)備用的離心管中加入3毫克月桂基硫酸鈉和5毫克氯化鈣， 待月桂基硫酸鈉和氯化鈣溶解后再向其中加入〇. 1毫升的玉米胚芽油，混合均勻后在室溫 下放置20分鐘，此時離心管中的液體即為禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫 苗。
[0015] 所述的大腸桿菌液體培養(yǎng)基的組成成分：按重量百分比配置，其中蛋白胨1%，酵 母浸膏0. 5%，氯化鈉1%，余量為水；所述的固體培養(yǎng)平板的組成成分：按重量百分比配置， 其中蛋白胨1%，酵母浸膏〇. 5%，氯化鈉1%，瓊脂粉1. 8%，余量為水。
[0016] 所述大腸桿菌JM83和禽多殺性巴氏桿菌也可通過市場購買得到。本發(fā)明所使用 的大腸桿菌JM83購買于華美生物工程有限公司；禽多殺性巴氏桿菌購買于中國獸醫(yī)藥品 監(jiān)察所。
[0017] 動物實驗： 1、動物免疫：取1日齡的未經任何處理且生長狀況相同的雛雞40只，正常飼養(yǎng)28天 后，隨機分為對照組和免疫組，每組各20只，免疫組的每只雞均以禽多殺性巴氏桿菌ptfa 基因殼聚糖納米DNA疫苗進行免疫，免疫的劑量為0. 2毫升/只雞，免疫方式為肌肉注射， 共免疫三次，分別在飼養(yǎng)至第28天、第49天和第70天時進行免疫，對照組的雞不進行任何 免疫； 2、攻毒試驗：在免疫組和對照組的雞91日齡時，對兩組的每只雞均肌肉注射禽多殺性 巴氏桿菌進行攻毒，每只雞的攻毒劑量為1. 〇X 101°個禽多殺性巴氏桿菌，隨后將對照組和 免疫組的雞繼續(xù)飼養(yǎng)2周，記錄兩組雞在攻毒2周后的存活量，并計算出對照組和免疫組的 保護率，存活率越高說明免疫預防效果越好，說明利用本發(fā)明的方法制備的禽多殺性巴氏 桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗具有免疫預防效果； 對照組的保護率的計算方法如下： (對照組的雞在攻毒2周后仍然存活的數量/20) X 100% ; 免疫組的保護率的計算方法如下： (免疫組的雞在攻毒2周后仍然存活的數量/20) X 100%。
[0018] 結果顯示，對照組的雞在攻毒2周后全部死亡，對照組的保護率為0%，免疫組的雞 在攻毒2周后存活17只，免疫組的保護率為85%，說明利用本發(fā)明的方法制備出的禽多殺性 巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗能有效地預防禽多殺性巴氏桿菌病。
【權利要求】
1.禽多殺性巴氏桿菌Ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備方法，其特征在于：具體制 備方法為： 步驟一、禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因的獲得 (1) 、根據禽多殺性巴氏桿菌的基因組序列設計用于擴增Ptfa基因的兩條引物PL和 PU，其基因序列如序列表序列1和序列2 : PU ： 5; -TGCggattcATGAAAAAAGCCATTTTC-3; PL：5/ -TGACCTCGAGtTATGCGCAAAATCCT-3;； (2) 、向PCR反應管中依次加入PU和PL引物各1微升、濃度為100-200pmol/ml的禽多 殺性巴氏桿菌基因組水溶液1微升、ddNTPs 2. 5微升、Taq DNA聚合酶1微升、PCR反應緩沖 液2微升和水11. 5微升，混合均勻后進行PCR反應，PCR反應結束后，產物中禽多殺性巴氏 桿菌ptfa基因的基因序列如序列表序列3 ; (3) 、向上述裝有禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因的PCR反應管中依次加入限制性核酸內 切酶及I和通〇1 I各3微升、限制性核酸內切酶緩沖液4微升和水3微升，混合均勻后 將PCR反應管放置于37°C的水浴鍋中反應6小時，取出后再放入65°C的水浴鍋中5分鐘以 結束反應，產物為酶切后禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因，將其保存于-20°C條件下，備用； 步驟二、pcDNA3. 1(+)質粒的處理 向〇. 5毫升的離心管中依次加入pcDNA3. 1 (+)質粒5微升、限制性核酸內切酶BamH I 和Xhol I各2. 5微升、限制性核酸內切酶緩沖液2微升和水8微升，混合均勻后將離心管 放置于37°C的水浴鍋中反應5小時，取出后再放入65°C的水浴鍋中5分鐘，得到處理后的 pcDNA3. 1(+)質粒，備用； 步驟三、禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒的制備 (1) 、依次向〇. 5毫升的離心管中加入處理后的pcDNA3. 1 (+)質粒1微升、酶切后禽多 殺性巴氏桿菌ptfa基因 7微升、T4 DNA連接酶1微升和T4 DNA連接酶緩沖液1微升，混合 均勻后將離心管放置于16°C的水浴鍋中反應8小時，取出備用； (2) 、將上述備用的0. 5毫升離心管中的液體移入1. 5毫升的離心管中，再加入100微 升大腸桿菌JM83,混合均勻后依次放置于0°C條件下30分鐘、42°C條件下1分鐘和0°C條件 下2分鐘，然后向離心管中加入0. 8毫升的大腸桿菌液體培養(yǎng)基，混合均勻后放置于37°C的 恒溫搖床中以180轉/分鐘的轉速振蕩培養(yǎng)1小時，培養(yǎng)結束后將離心管以2000轉/分鐘 的轉速離心1分鐘，倒掉上清液，再向其中加入〇. 1毫升無菌水，將懸浮起來的沉淀吸出，并 涂布于含濃度為60微克/毫升氨芐青霉素的固體培養(yǎng)平板上，倒置于37°C的恒溫培養(yǎng)箱內 培養(yǎng)12小時； (3) 、挑取上述培養(yǎng)后的固體培養(yǎng)平板上的1個菌落，將菌落放入5毫升含濃度為60微 克/毫升氨芐青霉素的大腸桿菌液體培養(yǎng)基中，置于轉速為180轉/分鐘，溫度為37°C的恒 溫搖床內振蕩培養(yǎng)12小時，備用； (4) 、取上述培養(yǎng)后的菌液0. 6毫升，向其中加入0. 3毫升苯酚和0. 3毫升氯仿，混合均 勻后以10000轉/分鐘的轉速離心5分鐘，離心結束后吸取上層液體加入到一個2毫升的 離心管中，再向其中加入1. 2毫升的無水乙醇，混合均勻后以13000轉/分鐘的轉速離心10 分鐘，倒掉上清液后將含有沉淀物的2毫升的離心管室溫放置30分鐘，向其中加入30微升 無囷水溶解沉淀后備用； (5)、取上述2毫升的離心管中的液體2微升加入到0. 5毫升的離心管中，再依次加入 限制性核酸內切酶及I和ZAol I各1微升、限制性核酸內切酶緩沖液1微升和水5微 升，混合均勻后放置于37°C的水浴鍋中反應2小時，反應結束后瓊脂糖凝膠電泳檢測確定 產物中的禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒，測得其濃度，并以無菌水將其調整到0. 1毫克 /暈升，備用； 步驟四、禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備 (1) 、取濃度為〇. 1毫克/毫升的禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒0. 5毫升加入1. 5 毫升的離心管中，向其中加入0. 71毫克硫酸鈉，待硫酸鈉溶解后放置于55°C的水浴鍋中保 溫20分鐘，備用； (2) 、稱取無水醋酸鈉4. 1毫克溶解于含10毫升無菌水中的試管中，以氫氧化鈉調節(jié)pH 值為5. 6,再向試管中加入殼聚糖0. 2克，待殼聚糖溶解后將該試管置于55°C的水浴鍋中保 溫20分鐘，隨后吸取試管中的0. 5毫升液體加入到上述步驟（1)保溫后的1. 5毫升離心管 中，將離心管在漩渦振蕩器上振蕩1分鐘，然后在室溫下放置1小時，備用； (3) 、再依次向上述步驟（2)備用的離心管中加入3毫克月桂基硫酸鈉和5毫克氯化鈣， 待月桂基硫酸鈉和氯化鈣溶解后再向其中加入〇. 1毫升的玉米胚芽油，混合均勻后在室溫 下放置20分鐘，此時離心管中的液體即為禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫 苗。
2. 如權利要求1所述的禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備方法， 其特征在于：所述PCR反應程序為：首先95°C預變性3分鐘，然后進入循環(huán)程序，循環(huán)程序 為94 °C變性1分鐘，53 °C復性30秒，72 °C延伸30秒，將上述循環(huán)程序重復25次后再以72 °C 終延伸5分鐘結束PCR反應。
3. 如權利要求1所述的禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備方法， 其特征在于：采用分光光度計測定禽多殺性巴氏桿菌ptfa重組質粒的濃度。
4. 如權利要求1所述的禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備方法， 其特征在于：所述的大腸桿菌液體培養(yǎng)基的組成成分：按重量百分比配置，其中蛋白胨1%， 酵母浸膏〇. 5%，氯化鈉1%，余量為水；所述的固體培養(yǎng)平板的組成成分：按重量百分比配 置，其中蛋白胨1%，酵母浸膏〇. 5%，氯化鈉1%，瓊脂粉1. 8%，余量為水。
【文檔編號】A61K47/20GK104056280SQ201410262864
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權日:2014年6月13日
【發(fā)明者】宮強, 孔梁宇, 侯穎, 牛明福, 孫軍杰 申請人:河南科技大學