構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型的方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型的方法，將麻醉大鼠，通過插入島葉皮層與微量注射裝置直接相連的玻璃微電極，將藥物向核團(tuán)內(nèi)注射到腦內(nèi)島葉皮層中。通過本發(fā)明的方法，刺激島葉皮層可以產(chǎn)生類似于阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的呼吸困難癥狀，可以成功構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型?！緦＠f明】構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物和藥物學(xué)【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，具體而言，涉及一種構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructivesleepapneasyndromeOSA)近年來越來越受到人們的關(guān)注，目前OSA已成為高血壓、冠心病、心肌梗死及腦中風(fēng)等發(fā)病的主要危險因素[1_6]，近幾年對其機(jī)制的研究已引起許多學(xué)者的關(guān)注。研究表明:0SA的發(fā)生受多種因素的影響，但根本原因是由于上呼吸道解剖和功能的改變，GG(GenioglossusGG)活動性喪失是引起OSA患者氣道閉塞的主要因素[7]。島葉皮質(zhì)(InsulaCortexIC)是大腦顳葉皮層的一個區(qū)域，與大腦內(nèi)的其他結(jié)構(gòu)有著廣泛的神經(jīng)聯(lián)系。Ic、杏仁核、海馬回有呼吸單位參與醒覺的呼吸調(diào)節(jié)。來自呼吸道和肺內(nèi)感受器的迷走神經(jīng)刺激投射至Ijlc，Ic在健康人呼吸困難傳入過程發(fā)揮重要作用M。已有研究證實OSA患者血漿5-HT(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平明顯異于正常人水平[9,]。而刺激Ic致使中縫核5-HT的釋放減少，可能參與睡眠呼吸調(diào)節(jié)[11]。[0003]OSA是具有潛在生命威脅的疾病，所引起的慢性呼吸衰竭是影響患者生活質(zhì)量的最嚴(yán)重的綜合征。OSA患者的夜間最低血氧飽和度常低于80%。長期低氧血癥導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮，機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，多臟器功能損害，患者后期常并發(fā)高血壓、腦出血、腦梗塞、心肌梗塞、肺源性心臟病、糖尿病、高血脂、心律失常是OSA常見的并發(fā)癥，特別是夜間緩慢性心律失常，是夜間猝死的主要原因。現(xiàn)認(rèn)為OSA是獨(dú)立于年齡、體重、飲食、遺傳等原因的高血壓發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素。目前，睡眠呼吸暫停低通氣綜合征與高血壓、中風(fēng)、心梗及充血性心衰等疾患仍是世界性廣泛關(guān)注的問題，已成為醫(yī)學(xué)界、生物學(xué)界亟待解決的問題。[0004]由于阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的發(fā)病機(jī)制不清，因而目前對該病的治療效果不理想，因此，如何構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型，為研究該病的發(fā)病機(jī)制以及研究該病的治療效果是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。【
發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型的方法，為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案:[0006]本發(fā)明一方面涉及構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型的方法，其特征在于通過插入將麻醉動物島葉皮層與微量注射裝置直接相連的玻璃微電極，將藥物向核團(tuán)內(nèi)注射到腦內(nèi)島葉皮層中。[0007]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的藥物中含有L-谷氨酸。[0008]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，所述的藥物為人工腦脊液配制的L-谷氨酸，優(yōu)選的，所述的L-谷氨酸的濃度為5-20mmol/L。[0009]本發(fā)明另一方面還涉及L-谷氨酸在配制刺激腦內(nèi)島葉皮層的藥物中的應(yīng)用。[0010]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的應(yīng)用是用于構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型。[0011]通過本發(fā)明的方法，L-谷氨酸刺激島葉皮層可以產(chǎn)生類似于阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的呼吸困難癥狀，可以成功構(gòu)建阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征動物模型。此外，島葉皮層可能是OSA的皮層中樞，在島葉皮層及其傳導(dǎo)通路上的某個部位采取措施，可以干預(yù)OSA的發(fā)生和發(fā)展，使之成為治療OSA的方法?！揪唧w實施方式】[0012]實施例1[0013]材料:本實驗所用的試劑包括:L-谷氨酸(購自北京鼎國生物制品研究中心)，7.5%EDTA鈉和滂胺天藍(lán)(美國，Sigma公司)，鹽酸利多卡因(無錫市第七制藥有限公司)，生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG(二抗)和鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶(三抗)，(中國，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，SerotoninRIA試劑盒(德國，LaborDiagnostikaNordGmbH&C0.KG);使用的儀器有:VDT_1型腦立體定向儀(日本，TAKAHASHICompany),BL-420E+生物技能實驗系統(tǒng)(中國，四川成都泰盟科技優(yōu)先公司)，HTEC-500熒光光度儀(Japan,EIcomCorporation)等。[0014]分組:健康Wistar成年大鼠60只，隨機(jī)分為3組:藥物刺激島葉組20只(人工腦脊液配制lOmmol/LL-谷氨酸，pH7.4，0.3ul2_3min微量注射)，對照組20只(L-Glu刺激島葉周圍組10只，人工腦脊液刺激島葉組10只)，假手術(shù)組20只(僅行同前麻醉、頭部固定、島葉部位埋置套管)。[0015]麻醉:實驗用各組動物用20%urethane,6ml/kg,腹腔注射麻醉,使動物在整個實驗過程中處于淺麻狀態(tài)(有較靈敏的角膜反射，夾后肢可引起屈腿反射，但動物沒有任何自發(fā)活動)。實驗過程中，根據(jù)需要補(bǔ)充麻醉劑，一般為初劑量的1/5。以熱墊使肛溫保持在36°C。實驗在環(huán)境安靜、光線柔和的條件下進(jìn)行。[0016]刺激島葉皮層:用耳棒將各刺激組動物固定在腦立體定位儀上，切開頭皮暴露顳骨。島葉皮層坐標(biāo)為AP:+1.0，L:5.4-5.5，H:4.2~4.4。在大鼠呼吸平穩(wěn)狀況下，通過插入島葉皮層與微量注射裝置直接相連的玻璃微電極，將藥物向核團(tuán)內(nèi)注射，為了避免因注射過快而發(fā)生短時間內(nèi)顱內(nèi)壓突然升高而影響神經(jīng)元功能，注射時間至少持續(xù)3min，并密切觀察注藥前后大鼠的呼吸變化。[0017]以手術(shù)埋置同心圓電極，刺激組通過埋置在相應(yīng)核團(tuán)的微電極注射。呼吸運(yùn)動和頦舌肌肌電用BL-420E2多導(dǎo)記錄儀記錄。動物出現(xiàn)呼吸暫停后，由內(nèi)眥靜脈抽血，應(yīng)用HTEC-500熒光光度儀(EIcomCorporation,Japan)檢測血漿五羥色胺含量。處死動物后，取橋腦下段和延髓上端之間腦干組織行矢狀位切片，并取頦舌肌組織。然后行腦干和頦舌肌HE染色及五羥色胺的免疫組化染色。[0018]主要觀察指標(biāo):觀察刺激島葉皮層后大鼠呼吸運(yùn)動曲線和頦舌肌肌電變化、五羥色胺在大鼠腦干神經(jīng)細(xì)胞和頦舌肌細(xì)胞胞漿的表達(dá)及血漿五羥色胺含量的變化。[0019]結(jié)果:L_谷氨酸刺激島葉皮層后，動物出現(xiàn)呼吸暫停，頦舌肌肌電振幅由刺激前(100±59.47)μV,降低到刺激后(13.41±1.58)μV(P<0.01);肌電積分減少(93.51±0.99)%(與對照組(使用人工腦脊液注入島葉)比較)(P<0.01);腦干神經(jīng)細(xì)胞和顏舌肌細(xì)胞胞漿內(nèi)五羥色胺棕黃色顆粒顏色變淡，數(shù)量減少，圖像灰度值明顯降低(1698936±725837)與對照組(3203352±194972)比較差異顯著(t=3.073.P<0.05)。顏舌肌細(xì)胞胞漿內(nèi)的棕黃色顆粒顏色變淡，數(shù)量減少，圖像灰度值明顯降低(1698936±725837)與對照組(3203352±194972)比較差異顯著(t=3.073.p<0.05)；外周血五羥色胺濃度顯著低于對照組(P<0.05)。[0020]結(jié)論:谷氨酸剌激島葉皮層可以產(chǎn)生類似于阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的呼吸困難癥狀；阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征主要癥狀一呼吸困難的腦內(nèi)最高級代表區(qū)在島葉皮層。[0021]參考文獻(xiàn)[0022]1.SaboiskyJPjChamberIinNL，MalhotraA.potentialtherapeutictargetsinobstructivesleepapnoea.SaboiskyJPjetal.ShExpertOpinTherTargets.2009Jul；13(7):795-809.[0023]2.SaboiskyJPjStashukDWjHamiIton-WrightAjCarusonaAL,CampanaLMjTrinderJjEckertDJjJordanAS,McSharryDGjWhiteDPjNandedkarSjDavidWSjMalhotraA.Neurogenicchangesintheupperairwayofpatientswithobstructivesleepapnea.SaboiskyJPjetal.ShowAmJRespirCritCareMed.2012Febl；185(3):322-9.Epub20110ct20[0024]3.MckayLCjEvansKCjFrackowiakRSjCorfieldDR.Neuralcorrelatesofvoluntarybreathinginhumans.JApplPhysiol.2003；95:1170-8.[0025]4.HendersonLA,WooMA，MaceyPM，MaceyKEjFrysingerRCjAlgerJRjYan-GoFjHarperRM.NeuralresponsesduringValsalvamaneuversinobstructivesleepapneasyndrome.JApplPhysio12003:94(3):1063-1074.[0026]5.CuiLjWangJHjWangM，HuangMjWangCY，XiaH，XuJGjLiMX,WangS.1njectionofL—glutamateintotheinsularcortexproducessleepapneaandserotoninreductioninrats.SleepBreath2011.2011；Sep27..[0027]6.KouZYjLiMSjZhangCXjWangS.[Habenulaparticipatesthevasopressorresponsebystimulationoftheinsularcortex,central—，lateralamygdaloidnucleusrespectively].ZhongguoYingYongShengLiXueZaZh1.2003Nov；19(4):334-6.[0028]7.LiMjWangJ，HuangM，LinWjWangM，YuLjWangS.Blockageofthehabenularnucleuscaneliminatedyspneainducedbyelectrostimulationoftheinsularcortex.NeuralRegenerationResearch2010:5(13):1025-1029。[0029]8.TheMinistryofScienceandTechnologyofthePeople’sRepublicofChina(2006).GuidanceSuggestionsfortheCareandUseofLaboratoryAnimals.2006-09-30.[0030]9.FieldsHLjBryJ，HentallI,ZormanG(1983).Theactivityofneuronsintherostralmedullaoftheratduringwithdrawalfromnoxiousheat.JNeurosc1.1983；3(12):2545-2552.[0031]10.WangS，F(xiàn)uQ，F(xiàn)uJ.Modulationofpreopticareaondischargesofparafascicularpainneurons.KexueTongba0.1983；28(3):401-405.[0032]11.CaoY，F(xiàn)ujitoYjMatsuyamaK，AokiM(2006).Effectsofelectricalstimulationofthemedullaryraphenucleionrespiratorymovementinrats.JCompPhysiolANeuroetholSensNeuralBehavPhysiol.2006;192(5):497-505.[0033]12.CarleyDWjTrbovicSjRadulovackiM.SleepapneainnormalandREMsleep-deprivednormotensiveWistar-Kyotoandspontaneouslyhypertensive(SHR)rats.[J]PhysiolBehavj1996，59:827-831.[0034]13.LingL.SerotoninandNMDAreceptorsinrespiratorylong-termfacilitation.RespirPhysiolNeurobiol.2008Decl0;164(1-2):233-41.[0035]14.GraceKP，LiuH，HornerRL.5-HTlAreceptor-responsivepedunculopontinetegmentalneuronssuppressREMsleepandrespiratorymotoractivity.JNeurosc1.2012Febl；32(5):1622-33.[0036]15.SheltonL，BecerraL，BorsookD.Unmaskingthemysteriesofthehabenulainpainandanalgesia.ProgNeurobiol.2012Feb；96(2):208-19.[0037]16.WangS.Habenula—ane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