用于紅細(xì)胞滅活過程的改進(jìn)的猝滅方法
【專利摘要】提供了在用滅活病原體的化合物處理紅細(xì)胞組合物時(shí)對不需要的副反應(yīng)進(jìn)行改進(jìn)的猝滅的方法，所述的滅活病原體的化合物包含核酸結(jié)合配體和為或能夠形成親電子基團(tuán)的官能團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，這種改進(jìn)的方法使用了適當(dāng)高濃度的猝滅劑，該猝滅劑包含能夠與親電子基團(tuán)共價(jià)反應(yīng)的親核官能團(tuán)，其中所述的處理在所需pH范圍內(nèi)進(jìn)行以便提供充分猝滅。用于這些方法中的某些的優(yōu)選的猝滅劑包括巰基，諸如谷胱甘肽，它們已經(jīng)被適當(dāng)中和，以便加入到紅細(xì)胞組合物中在6.8-8.5的理想pH范圍產(chǎn)生所需的猝滅劑濃度。
【專利說明】用于紅細(xì)胞滅活過程的改進(jìn)的猝滅方法
[0001]本申請是申請?zhí)枮?00580045313.8、申請日為2005年10月31日、發(fā)明名稱為“用于紅細(xì)胞滅活過程的改進(jìn)的猝滅方法”的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]相關(guān)申請的交叉參考
[0003]本申請要求2004年10月29日提交的美國臨時(shí)申請順序號60 / 623，177的優(yōu)先權(quán)利益，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明的領(lǐng)域涉及使用于處理血液制品的反應(yīng)性親電子化合物猝滅以使可能的病原體污染物滅活的方法。特別地，將親核化合物，諸如硫醇類，用于使紅細(xì)胞組合物中的反應(yīng)性親電子化合物猝滅。
[0005]發(fā)明背景
[0006]通過血液制品和其它生物材料傳播疾病仍然是嚴(yán)重的健康問題。盡管在供血者篩選和血液檢測方面已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，但是諸如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人免疫缺陷病毒(HIV)這類病毒在檢測過程中因病毒或病毒抗體低水平而仍然可能逃脫血液制品中的檢測。除病毒的危害外，目前還沒有在指定用于輸血的血液中用于檢測非病毒微生物，諸如細(xì)菌或原生動(dòng)物存在的足夠的經(jīng)許可的試驗(yàn)。迄今未知病原體可能在供血中很普遍并且呈 現(xiàn)疾病傳播的威脅的風(fēng)險(xiǎn)仍然存在，正如在識別HIV通過輸血傳播的風(fēng)險(xiǎn)前實(shí)際發(fā)生的。
[0007]已經(jīng)將化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)入血液或血漿以便使病原體滅活，此后臨床應(yīng)用該血液制品。一般，對幾乎沒有或無紅細(xì)胞內(nèi)含物的血液制品而言，諸如血小板和血漿，使用光化學(xué)活化的化合物諸如補(bǔ)骨脂素。就含有紅細(xì)胞的血液制品而言，已經(jīng)研發(fā)了無需光活化的用于病原體滅活的化合物。這些化合物一般具有與病原體，更具體地說是與病原體核酸反應(yīng)的親電子基團(tuán)。例如，美國專利US5，055，485中描述了使用芳基二醇環(huán)氧化物使細(xì)胞中的病毒和含有蛋白質(zhì)的組合物失活。可以使用原位產(chǎn)生親電子試劑的其它化合物。LoGrippo等評價(jià)了芥子CH3-N(CH2CH2Cl)2在病毒滅活中的應(yīng)用。LoGrippo 等,Proceedings of the SixthCongress of the International Society of Blood Transfusion, Biblio theca Haemato logica(Hollander, ed.)，1958，pp.225-230。更有意義的是，美國專利 US6, 410，219 和US5, 691, 132中描述了具有核酸祀向成分以及與該核酸反應(yīng)的未電子成分的化合物在使病原體滅活中的應(yīng)用，將這些文獻(xiàn)披露的內(nèi)容引入本文作為參考。美國專利US6，514，987中描述了類似的化合物，其中該化合物中核酸靶向成分通過可水解連接基與反應(yīng)性親電子成分連接，將該文獻(xiàn)披露的內(nèi)容引入本文作為參考。美國專利US6，136，586和US6，617，157中描述了使用乙烯亞胺寡聚體和相關(guān)化合物使病原體滅活，將這些文獻(xiàn)披露的內(nèi)容引入本文作為參考。這些乙烯亞胺衍生的化合物一般具有提供反應(yīng)性親電子成分的氮丙啶基團(tuán)和提供化合物的核酸靶向的多胺成分。一般類別的帶有與核酸反應(yīng)的親電子或類似基團(tuán)的靶向核酸的化合物用于使血液、血液制品和各種生物來源樣品中的病原體滅活。
[0008]在一定程度上關(guān)注的是，盡管設(shè)計(jì)這些化合物與核酸特異性地反應(yīng)，但是它們?nèi)匀豢赡芘c血液中的其它成分反應(yīng)，諸如蛋白質(zhì)或細(xì)胞膜。這些副反應(yīng)是不利的，并且可能導(dǎo)致不良作用，諸如可以由免疫系統(tǒng)識別的蛋白質(zhì)修飾和細(xì)胞膜改變。當(dāng)反復(fù)使用這類經(jīng)處理的血液制品時(shí)，它們可能使受血者對經(jīng)處理的血液制品產(chǎn)生免疫反應(yīng)。美國專利US6, 709，810中描述了使這類滅活病原體的化合物猝滅以便降低任何這類不良副反應(yīng)的水平的方法，將該文獻(xiàn)披露的內(nèi)容引入本文作為參考。然而，盡管這類方法顯著地減少了不需要的副反應(yīng)，但是進(jìn)一步減少不需要的免疫反應(yīng)是需要的。使用這類化合物處理紅細(xì)胞的近期臨床試驗(yàn)已經(jīng)顯示出了這類不良事件的可能性。在V.1.Techno logies, Inc.于2003年11月17日發(fā)表的新聞稿中，介紹了他們的用于紅細(xì)胞的I NACTINETM病原體減少系統(tǒng)(Pathogen Reduct ion System)的III期長期試驗(yàn)因涉及對INACTINE?處理的紅細(xì)胞的抗體反應(yīng)而被停止。在Cerus Corporation于2003年9月4日發(fā)表的新聞稿中，指出了在兩位研究患者對用S-303處理的紅細(xì)胞產(chǎn)生抗體后，他們自愿停止其病原體滅活的紅細(xì)胞程序的III期試驗(yàn)，所述S-303是用于其紅細(xì)胞病原體滅活系統(tǒng)的化合物。一般使用間接抗球蛋白試驗(yàn)檢測這類抗體，所述的間接抗球蛋白試驗(yàn)可以在沒有對實(shí)際抗體性質(zhì)或同質(zhì)性的詳細(xì)了解的情況下進(jìn)行。這類測定法本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的且非常靈敏，從而能夠檢測低至每個(gè)RBC中500個(gè)分子。檢測這些抗體的最常用方法是通過將患者血清與為輸注用候選物的RBC制品混合并且檢測凝集反應(yīng)是否發(fā)生來進(jìn)行的。這稱作RBC單位與患者血清的交叉配血。通過包含與抗體交叉反應(yīng)的抗-人免疫球蛋白提供更高的靈敏度。這提高了 RBC表面上IgG或其它抗體之間的反應(yīng)性。最終，可以通過在反應(yīng)介質(zhì)中包含增強(qiáng)抗體彼此之間的on-rate的增效劑而獲得甚至更高的檢測靈敏度(AABB手冊第13版)。例如，這類測定法比例如流式細(xì)胞計(jì)量測定法更為靈敏并且甚至可以在其它方法顯示不存在任何潛在抗體時(shí)觀察到。這類現(xiàn)象發(fā)生在臨床試驗(yàn)中并且常常與可能具有較高的產(chǎn)生這些抗體的趨勢的特殊患者群體相關(guān)。
[0009]因此，對進(jìn)一步減少通過親電子基團(tuán)與病原體反應(yīng)的滅活病原體的化合物的不需要的親電子副反應(yīng)，同時(shí)保持滅活病原體的化合物滅活有害病原體的能力的方法存在需求。具體地，對使紅細(xì)胞 中滅活病原體的化合物猝滅的改進(jìn)方法存在需求。需要這種新方法顯著降低因用滅活病原體的化合物處理而對紅細(xì)胞產(chǎn)生不良免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明提供了在使滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的副反應(yīng)猝滅的改善條件下用滅活病原體的化合物處理紅細(xì)胞組合物的各種方法。在某些實(shí)施方案中，通過調(diào)節(jié)pH和/或增加猝滅劑濃度來改善猝滅。
[0012]本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括:a)提供:i)包含反應(yīng)性親電子基團(tuán)的滅活病原體的化合物；ii)包含巰基的猝滅劑；和iii)包含紅細(xì)胞的組合物，其中存在紅細(xì)胞組合物被病原體污染的可能性；和b)混合滅活病原體的化合物和猝滅劑與包含紅細(xì)胞的組合物，其中所得混合物在適合于使滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞結(jié)合充分猝滅的PH范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括步驟c)調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH。在某些實(shí)施方案中，該處理導(dǎo)致至少llog,也可以至少21og或至少31og的病原體污染物滅活。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞組合物含有白細(xì)胞，并且所述的處理導(dǎo)致至少llog，也可以至少21og或至少31og的白細(xì)胞滅活。在某些實(shí)施方案中，將猝滅劑與包含紅細(xì)胞的組合物混合，此后添加滅活病原體的化合物。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH，此后與滅活病原體的化合物和猝滅劑混合。在某些實(shí)施方案中，在添加滅活病原體的化合物后調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH。在某些實(shí)施方案中，通過添加猝滅劑調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH。在某些實(shí)施方案中，一旦混合了所有三種成分，猝滅劑、滅活病原體的化合物和包含紅細(xì)胞的組合物的混合物在室溫下就具有約6.8-8.5的pH，也可具有約7.0-8.5，也可具有約7.2-8.5或約7.2-8.0的pH。在某些實(shí)施方案中，將猝滅劑、滅活病原體的化合物和包含紅細(xì)胞的組合物的混合物孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔，諸如約30分鐘-48小時(shí)，也可以約2-24小時(shí)，也可以約8-24小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的孵育在約1°C -30°C，也可以在約18°C -25°C的溫度范圍內(nèi)或在約室溫下。在某些實(shí)施方案中，一旦混合了所有三種成分，則猝滅劑的濃度在約2mM-約40mM，也可以在約4mM_約40mM，也可以在約4mM-約30mM，也可以在約5mM_約30mM，也可以約IOmM-約30mM的范圍內(nèi)，也可以為約20禮。在某些實(shí)施方案中，一旦混合了所有三種成分，則一旦混合了三種成分，則猝滅劑在所得混合物中的濃度大于約2mM,至少約4mM,至少約5mM,至少約IOmM或至少約15mM。在某些實(shí)施方案中，一旦混合了三種成分，則猝滅劑與滅活病原體的化合物的摩爾比為約10: 1-約400: 1，也可以為約10: 1-約200: 1，也可以為約20: 1-約200: 1，也可以為約50: 1-約200: 1，也可以為約100: I。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑為包含至少一種半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，猝滅劑為谷胱甘肽。在某些實(shí)施方案中，中和猝滅劑并且添加中和的猝滅劑以調(diào)節(jié)紅細(xì)胞組合物的pH。在某些實(shí)施方案中，中和的猝滅劑包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在某些實(shí)施方案中，中和的猝滅劑為包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的肽。在某些實(shí)施方案中，滅活病原體的化合物包含核酸結(jié)合基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合基團(tuán)為嵌入劑，諸如吖啶基。在某些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合基團(tuán)為多胺。在某些實(shí)施方案中，滅活病原體的化合物包含通過可水解鍵與反應(yīng)性親電子基團(tuán)連接的核酸結(jié)合基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合基團(tuán)為嵌入劑且反應(yīng)性親電子基團(tuán)選自芥子、芥子中間體和芥子等效物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，猝滅劑為中和的谷胱甘肽，其中用約2當(dāng)量的合適的堿中和質(zhì) 子化的谷胱甘肽，并且滅活病原體的化合物為β -丙氨酸、Ν-(吖唳_9_基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯。
[0013]本發(fā)明在一個(gè)另外的方面中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括:a)提供:i)包含核酸結(jié)合基團(tuán)和反應(yīng)性親電子基團(tuán)的滅活病原體的化合物；ii)包含半胱氨酸或合適的半胱氨酸衍生物的猝滅劑；和iii)包含紅細(xì)胞的組合物，其中存在紅細(xì)胞組合物被病原體污染的可能性山)混合猝滅劑與包含紅細(xì)胞的組合物，其中添加猝滅劑將該混合物的pH調(diào)節(jié)至合適的pH ;和c)混合滅活病原體的化合物與包含紅細(xì)胞的組合物,其中病原體如果存在于包含紅細(xì)胞的組合物中，那么它被滅活至少llog，也可以至少21og，也可以至少31og。在某些實(shí)施方案中，所述的紅細(xì)胞組合物含有白細(xì)胞，并且所述的處理導(dǎo)致至少llog，也可以至少21og或至少31og的白細(xì)胞被滅活。在某些實(shí)施方案中，將猝滅劑在與滅活病原體的化合物混合前與包含紅細(xì)胞的組合物混合。在某些實(shí)施方案中，將猝滅劑在與滅活病原體的化合物混合后與包含紅細(xì)胞的組合物混合。在某些實(shí)施方案中，將猝滅劑和滅活病原體的化合物與包含紅細(xì)胞的組合物同時(shí)或基本上同時(shí)，諸如彼此在約I分鐘內(nèi)混合。在某些實(shí)施方案中，將猝滅劑和包含紅細(xì)胞的組合物的混合物孵育約1-30分鐘，此后與滅活病原體的化合物混合。在某些實(shí)施方案中，所述的孵育在約1°C -30°C，也可以在約18°C _25°C溫度范圍內(nèi)或在約室溫下。在某些實(shí)施方案中，將猝滅劑、滅活病原體的化合物和包含紅細(xì)胞的組合物的混合物孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔，諸如約30分鐘-48小時(shí)，也可以約2-24小時(shí)，也可以約8-24小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的孵育在約1°C _30°C，也可以在約18°C _25°C的溫度范圍內(nèi)或在約室溫下。在某些實(shí)施方案中，在將猝滅劑與包含紅細(xì)胞的組合物混合時(shí)適當(dāng)?shù)腜H在約6.8-8.5，也可以在約7.0-8.5，也可以在約7.2-8.5或約7.2-8.0的范圍內(nèi)，如在室溫下測定的。在某些實(shí)施方案中，一旦混合了所有三種成分，那么該混合物的pH在約6.8-8.5，也可以在約7.0-8.5，也可以在約7.2-8.5或約7.2-8.0的范圍內(nèi)，如在室溫下測定的。在某些實(shí)施方案中，一旦混合了所有三種成分，那么猝滅劑的濃度在約2mM-約40mM，也可以在約4mM_約40mM，也可以在約4mM_約30mM，也可以在約5mM-約30mM，也可以在約IOmM-約30mM的范圍內(nèi)，也可以為約20mM。在某些實(shí)施方案中，一旦混合了所有三種成分，那么猝滅劑與滅活病原體的化合物的摩爾比為約10: 1-約400: 1，也可以為約10: 1-約200: 1，也可以為約20: 1-約200: 1，也可以為約50: 1-約200: 1，也可以為約100: I。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑為包含至少一種半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，猝滅劑為谷胱甘肽。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑被中和或呈對組合物的PH進(jìn)行所需調(diào)節(jié)的形式。在某些實(shí)施方案中，通過向猝滅劑中添加I當(dāng)量，也可以約為2當(dāng)量的堿中和猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑呈中和的形式，諸如合適的鹽。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑被中和。在某些實(shí)施方案中，中和的猝滅劑為包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的中和的肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，
[0014]中和的肽為中和的谷胱甘肽。在某些實(shí)施方案中，滅活病原體的化合物的核酸結(jié)合基團(tuán)為嵌入劑，諸如吖啶基。在某些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合基團(tuán)為多胺。在某些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合基團(tuán)通過可水解的鍵與反應(yīng)性親電子基團(tuán)連接。在某些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合基團(tuán)為嵌入劑并且反應(yīng)性親電子基團(tuán)選自芥子、芥子中間體和芥子等效物。在某些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合基團(tuán)為 多胺并且親電子基團(tuán)為吖啶基或吖丙啶?基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，猝滅劑為中和的谷胱甘肽并且滅活病原體的化合物為β -丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯。
[0015]本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括下列順序的步驟:
a)提供:i) β -丙氨酸、Ν-( Π丫卩定-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯；ii)中和的谷胱甘肽；和iii)包含紅細(xì)胞的組合物，其中存在紅細(xì)胞組合物被病原體污染的可能性；b)將中和的谷胱甘肽與包含紅細(xì)胞的組合物混合；c)將該混合物孵育合適的時(shí)間間隔；和d)將丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯與中和的谷胱甘肽和包含紅細(xì)胞的組合物的混合物混合，其中如果病原體存在于包含紅細(xì)胞的組合物中，那么它被滅活至少llog,也可以至少21og,也可以至少31og。在某些實(shí)施方案中，所述的紅細(xì)胞組合物包含白細(xì)胞,并且所述的處理導(dǎo)致至少llog，也可以至少21og或至少31og的白細(xì)胞被滅活。在某些實(shí)施方案中，將中和的谷胱甘肽作為合適的鹽提供。在某些實(shí)施方案中，通過用約I當(dāng)量的堿，也可以約2當(dāng)量的堿中和質(zhì)子化的谷胱甘肽提供中和的谷胱甘肽。在某些實(shí)施方案中，中和的谷胱甘肽在溶解狀態(tài)中。在某些實(shí)施方案中，中和的谷胱甘肽為固體，諸如凍干粉和合適的鹽。在某些實(shí)施方案中，用于孵育與谷胱甘肽混合的紅細(xì)胞的時(shí)間間隔為約1-30分鐘，也可以為約5-20分鐘，其中孵育在約I °C -30°C，也可以在約18°C_25°C范圍內(nèi)的溫度下或在約室溫下進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，在與β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯混合后，將該混合物孵育合適的時(shí)間間隔，諸如約30分鐘-48小時(shí)，也可以約2-24小時(shí)，也可以約8-24小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，孵育在約1°C -30°C，也可以在約18°C -25°C的溫度范圍內(nèi)或在約室溫下進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，在混合丙氨酸、Ν-(吖啶-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯時(shí)，谷胱甘肽在混合物中的濃度在約5mM-約30mM的范圍內(nèi)，并且β-丙氨酸、N_(吖啶_9_基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯的濃度在約0.05mM-約0.5mM的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，在混合β -丙氨酸、Ν-(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯時(shí)，谷胱甘肽在混合物中的濃度在約IOmM-約30mM的范圍內(nèi)，并且β -丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯的濃度在約0.05mM-約0.3mM的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，在混合β -丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯時(shí)，谷胱甘肽在混合物中的濃度為約20mM，并且3-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯的濃度為約0.2mM。
[0016]本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括:(a)提供:i)包含為或形成反應(yīng)性親電子基團(tuán)的官能團(tuán)的滅活病原體的化合物；ii)包含巰基的猝滅劑，其中巰基能夠與滅活病原體的化合物的反應(yīng)性親電子基團(tuán)反應(yīng)；和iii)包含紅細(xì)胞的組網(wǎng)，其中存在紅細(xì)胞組合物被病原體污染的可能性；和(b)將滅活病原體的化合物和猝滅劑與包含紅細(xì)胞的組合物混合，其中猝滅劑在所得混合物中的濃度大于2mM，其中所得混合物在室溫下的pH在約6.7或6.7以上的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所得混合物在室溫下的pH在約7.0-8.5的范圍內(nèi)。
[0017]本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括:將下列成分與紅細(xì)胞組合物混合:(a)滅活病原體的化合物，其中滅活病原體的化合物包含核酸結(jié)合配體和為或形成能夠與核酸反應(yīng)的親電子基團(tuán)的官能團(tuán)；(b)包含巰基的猝滅劑，其中巰基能夠與親電子基團(tuán)反應(yīng) ；和(C)與不含堿的混合物相比，降低包含紅細(xì)胞組合物、滅活病原體的化合物、猝滅劑和堿的混合物中滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的反應(yīng)水平的足量的合適的堿。在某些實(shí)施方案中，滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的反應(yīng)是滅活病原體的化合物對紅細(xì)胞表面的修飾。
[0018]本發(fā)明在另一個(gè)實(shí)施方案中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括將下列成分與紅細(xì)胞組合物混合:(a)滅活病原體的化合物，其中滅活病原體的化合物包含核酸結(jié)合配體和為或形成能夠與核酸反應(yīng)的親電子基團(tuán)的官能團(tuán)；(b)包含巰基的猝滅劑，其中巰基能夠與親電子基團(tuán)反應(yīng)；和(C)與不含堿的混合物相比，增加包含紅細(xì)胞組合物、滅活病原體的化合物、猝滅劑和堿的混合物的pH的足量的合適的堿。在某些實(shí)施方案中(例如在某些實(shí)施方案中，其中猝滅劑為酸性化合物)，加入足量的合適的堿以便將混合物的PH增加到至少約為不含堿或猝滅劑的混合物的PH。
[0019]本發(fā)明在一個(gè)另外的方面中提供了在有猝滅劑存在下在用滅活病原體的化合物處理包含紅細(xì)胞的組合物的過程中改善滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞不需要的副反應(yīng)的猝滅的方法，其中猝滅劑包含巰基，并且其中滅活病原體的化合物包含為或形成與猝滅劑的巰基反應(yīng)的親電子試劑的官能團(tuán)，其中該方法包括增加包含紅細(xì)胞組合物、滅活病原體的化合物和猝滅劑的反應(yīng)混合物的pH。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括增加猝滅劑在反應(yīng)混合物中的濃度的步驟。在某些實(shí)施方案中，滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的反應(yīng)為滅活病原體的化合物對紅細(xì)胞表面的修飾。
[0020]在上述方法各自的某些實(shí)施方案以及本文所述的其它方法中，該方法進(jìn)一步包括降低滅活病原體的化合物在混合物中的濃度的步驟。
[0021]在上述方法各自的某些實(shí)施方案以及本文所述的其它方法中，在離體條件下處理所述的紅細(xì)胞組合物。在上述方法各自的某些實(shí)施方案以及本文所述的其它方法中，在體外處理所述的紅細(xì)胞組合物。
[0022]還提供了通過上述各方法以及本文所述的其它方法生產(chǎn)的紅細(xì)胞組合物。
[0023]本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了試劑盒，諸如用于處理紅細(xì)胞組合物的一次性試劑盒。這些試劑盒可以用于人工操作、自動(dòng)化操作或人工和自動(dòng)化操作。在某些實(shí)施方案中，該試劑盒包括:包含反應(yīng)性親電子基團(tuán)的滅活病原體的化合物，包括其任何鹽；包含巰基的猝滅劑，包括其任何鹽；和I或2當(dāng)量的合適的堿，其中當(dāng)量意指與試劑盒中猝滅劑的摩爾量相當(dāng)?shù)哪柫?。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該試劑盒包含:丙氨酸、Ν-(吖啶-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯，包括其任何鹽；谷胱甘肽，包括其任何鹽；和I或2當(dāng)量的合適的堿，其中當(dāng)量意指與試劑盒中谷胱甘肽的摩爾量相當(dāng)?shù)哪柫?。在某些?shí)施方案中，丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯或其任何鹽為固體形式。在某些實(shí)施方案中，β _丙氨酸、N-( B丫卩定-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯或其任何鹽為溶液形式。在某些實(shí)施方案中，谷胱甘肽或任何鹽為固體形式。在某些實(shí)施方案中，谷胱甘肽或任何鹽為溶液形式。在某些實(shí)施方案中，I或2當(dāng)量的堿為固體形式。在某些實(shí)施方案中，I或2當(dāng)量的堿為溶液形式。在某些實(shí)施方案中，谷胱甘肽或其任何鹽和I或2當(dāng)量的堿作為混合物存在。在某些實(shí)施方案中，谷胱甘肽或其任何鹽與I或2當(dāng)量的堿的混合物為均勻性混合物。在某些實(shí)施方案中，該均勻性混合物為固體形式。在某些實(shí)施方案中，該均 勻性混合物為溶液形式。在某些實(shí)施方案中，所述的試劑盒包含用于溶解為固體形式的@-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯或其任何鹽的溶液。在某些實(shí)施方案中，所述的試劑盒包含用于溶解為固體形式的谷胱甘肽或其任何鹽的溶液。在某些實(shí)施方案中，所述的試劑盒包含用于溶解為固體形式的I或2當(dāng)量的堿的溶液。在某些實(shí)施方案中，所述的試劑盒包含用于溶解為固體形式的猝滅劑或其任何鹽和I或2當(dāng)量的堿的溶液。在某些實(shí)施方案中，所述的試劑盒包含用于溶解猝滅劑和I或2當(dāng)量的堿的混合物的溶液。在某些實(shí)施方案中，試劑盒中的固體或溶液進(jìn)一步包括可接受的賦形劑、輔助劑、稀釋劑或穩(wěn)定劑。
[0024]本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了例如用于處理紅細(xì)胞組合物以滅活病原體的試劑盒，包含:包含核酸結(jié)合配體和為或形成親電子基團(tuán)的官能團(tuán)的滅活病原體的化合物(包括其任何鹽)；包含巰基的猝滅劑(包括其任何鹽)；和至少約I當(dāng)量的堿，其中當(dāng)量意指與試劑盒中猝滅劑的摩爾量相等的摩爾量。在某些實(shí)施方案中，該試劑盒包含約I或約2當(dāng)量的合適的堿。
[0025]本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了用于處理紅細(xì)胞組合物以滅活病原體的試劑盒，包含:核酸結(jié)合配體和為或形成親電子基團(tuán)(例如(PIC-1)的官能團(tuán)，包括其任何鹽；和包含巰基的中和的猝滅劑(例如中和的谷胱甘肽)，包括其任何鹽。
[0026]本發(fā)明在另一個(gè)方面中包括一種組合物，其包含:紅細(xì)胞；包含反應(yīng)性親電子基團(tuán)的滅活病原體的化合物；和包含能夠與親電子基團(tuán)反應(yīng)的親核基團(tuán)的猝滅劑，其中猝滅劑的濃度在約2mM-40mM，也可以在約4mM-40mM，也可以在約5mM-30mM，或在約10mM-30mM的范圍內(nèi)，并且該組合物的pH在約6.8-8.5，也可以在約7.0-8.5，也可以在約7.2-8.5或約
7.2-8.0的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，滅活病原體的化合物包含核酸結(jié)合配體和包含巰基的猝滅劑。優(yōu)選的實(shí)施方案包括一種組合物，其包含紅細(xì)胞。0-丙氨酸4-(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯和濃度范圍在約2mM-40mM的谷胱甘肽，其中該組合物的pH在約6.8-8.5，也可以在約7.0-8.5，也可以在約7.2-8.5，或約7.2-8.0的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，該組合物的紅細(xì)胞比容在約1-100%，也可以在約10-90%，也可以在約35-80%，或在約40-70%的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，3-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯的濃度在約0.05mM-4mM，也可以在約0.05mM-2mM，也可以在約0.05mM-0.5mM,或在約0.1mM-0.3mM的范圍內(nèi)，并且谷胱甘肽的濃度在約5mM-40mM，也可以在約5mM-30mM，或在約10mM-30mM的范圍內(nèi)。
[0027]本發(fā)明在一個(gè)另外的方面中提供了一種組合物，其包含:紅細(xì)胞；包含核酸結(jié)合配體和反應(yīng)性親電子基團(tuán)的滅活病原體的化合物；和包含能夠與親電子基團(tuán)反應(yīng)的巰基的猝滅劑，其中猝滅劑的濃度大于2mM，并且該組合物的pH為約6.7或6.7以上。在某些實(shí)施方案中，該組合物具有的PH在約6.8-8.5，約7.0-8.5，約7.2-8.5和約7.2-8.0的范圍內(nèi)。例如，在某些實(shí)施方案中，該組合物的PH在約7.0-8.5的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，該組合物包含至少約4mM的猝滅劑或至少約IOmM的猝滅劑。例如，在某些實(shí)施方案中，猝滅劑的濃度在約4-40mM或約10-30mM的范圍內(nèi)。例如，在某些實(shí)施方案中，猝滅劑的濃度在約4mM-40mM的范圍內(nèi)，并且該組合物的pH在約6.8-8.5的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑的濃度為至少約4mM，并且該組合物的pH在約6.8-8.5的范圍內(nèi)。
[0028]本發(fā)明還提供了另外的方面。
[0029]附圖簡述
[0030]附圖1表示在實(shí)施例121期反復(fù)輸血過程中血清抗體滴度。為清楚起見，僅對KLH-吖啶免疫接種顯示了誤差棒。RBC輸注組的誤差棒約為±1。
[0031]附圖2表示實(shí)施例122期的4A、4B和6組中原始S-220RBC的壽命。通過將早期時(shí)間點(diǎn)外推至在第O天時(shí)的100%確定壽命。I組動(dòng)物接受生物素化對照RBC。為清楚起見，僅對4A、4B和6組顯示了誤差棒。
[0032]附圖3表示實(shí)施例122期的2A、2B和5組中原始S-303 (PIC-1) RBC的壽命。通過將早期時(shí)間點(diǎn)外推至在第O天時(shí)的100%確定壽命。I組動(dòng)物接受生物素化對照RBC。為清楚起見，僅對2B和5組顯示了誤差棒。
[0033]附圖4表示實(shí)施例122期的4A、4B和6組中修飾的S-220RBC的壽命。通過將早期時(shí)間點(diǎn)外推至在第O天時(shí)的100%確定壽命。I組動(dòng)物接受生物素化對照RBC。為清楚起見，僅對1、4B和6組顯不了誤差棒。
[0034]附圖5表示實(shí)施例122期的2A、2B和5組中修飾的S-303RBC的壽命。通過將早期時(shí)間點(diǎn)外推至在第O天時(shí)的100%確定壽命。I組動(dòng)物接受生物素化對照RBC。為清楚起見，僅對2B和5組顯不了誤差棒。
[0035]附圖6表示S-303處理的RBC的FACScan分析結(jié)果。
[0036]發(fā)明詳述
[0037] 例如，美國專利US6，709，810中提供了使紅細(xì)胞組合物中反應(yīng)性親電子種類猝滅的現(xiàn)存方法。作為這些方法的非限制性實(shí)例，將谷胱甘肽與0-丙氨酸、化(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯組合使用(下文也可以稱作"滅活病原體的化合物I"、" PIC-1 "或"S-303")。一般將谷胱甘肽以酸性形式分離(即質(zhì)子化)，并且這種形式被用于這些已知的方法。因而，當(dāng)提及已知的猝滅方法時(shí)，谷胱甘肽被稱作酸性或質(zhì)子化的谷胱甘肽。本文所用的用于滅活紅細(xì)胞中的病原體的標(biāo)準(zhǔn)條件包括用2mM質(zhì)子化的谷胱甘肽和0.2mM PIC-1處理紅細(xì)胞組合物?？梢栽黾淤|(zhì)子化谷胱甘肽的濃度，在對不需要的副反應(yīng)提供較好猝滅的嘗試中，使猝滅劑與滅活病原體的化合物之比較高。然而，在質(zhì)子化谷胱甘肽濃度增加時(shí)，紅細(xì)胞組合物的總體PH因谷胱甘肽的酸性而下降。已經(jīng)確定這種較低的pH導(dǎo)致不足以粹滅滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞,特別是紅細(xì)胞表面的反應(yīng)。還已確定所述的標(biāo)準(zhǔn)條件無法對紅細(xì)胞表面的修飾提供足夠的猝滅。因而，本發(fā)明提供了改進(jìn)的猝滅方法，其中將包含滅活病原體的化合物和猝滅劑的紅細(xì)胞組合物的PH調(diào)節(jié)至適當(dāng)范圍以便提供改善的猝滅，其中所用猝滅劑的濃度為大于2mM，諸如為約5-40mM，也可以為約10-30mM，或?yàn)榧s20mM。例如，提供了這樣的方法，使得在將包含紅細(xì)胞的組合物與滅活病原體的化合物和猝滅劑混合時(shí)，pH在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，諸如pH在約6.8-8.5，也可以在約
7.0-8.5，也可以在約7.2-8.5，或在約7.2-8.0的范圍內(nèi)，其中猝滅劑的濃度在約5_40mM的范圍內(nèi)。
[0038]在本文所述方法各自的某些實(shí)施方案中，減少滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不理想的(本文也稱作"不需要的")副反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，減少的不理想的副反應(yīng)為滅活病原體的化合物對紅細(xì)胞表面的修飾。在某些實(shí)施方案中，將副反應(yīng)的水平降低至少約5%，至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%或至少約90%。例如，可以通過下列步驟驗(yàn)證副反應(yīng)的減少(與第二種方法相比):測定對滅活病原體的化合物具有特異性的抗體與處理的紅細(xì)胞結(jié)合的量和/或測定處理的紅細(xì)胞在體內(nèi)的壽命，并且將這些測定值與通過第二種不同方法處理的紅細(xì)胞進(jìn)行比較。例如，在改進(jìn)方法的某些實(shí)施方案中，與未改進(jìn)的方法 相比，將抗-滅活病原體的化合物的抗體與處理的紅細(xì)胞結(jié)合的水平降低至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%或至少約90%。
[0039]在本文所述本發(fā)明各方面各自的某些實(shí)施方案中，適合于對滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞結(jié)合提供足夠猝滅的PH范圍為與用2mM質(zhì)子化谷胱甘肽和0.2mM PIC-1對紅細(xì)胞組合物進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)處理相比對滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞結(jié)合提供改善的粹滅的pH范圍。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)處理的紅細(xì)胞與通過標(biāo)準(zhǔn)方法處理的那些紅細(xì)胞相比的免疫原性降低驗(yàn)證猝滅的改善。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)對滅活病原體的化合物具有特異性的抗體與與處理的紅細(xì)胞在體外結(jié)合的量的減少和/或根據(jù)處理的紅細(xì)胞在體內(nèi)的壽命增加驗(yàn)證指定方法與標(biāo)準(zhǔn)方法相比提供的猝滅的改善。
[0040]本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括:a)提供:i)包含反應(yīng)性親電子基團(tuán)的滅活病原體的化合物；ii)包含巰基的猝滅劑；和iii)包含紅細(xì)胞的組合物，其中存在紅細(xì)胞組合物被病原體污染的可能性；和b)將滅活病原體的化合物和猝滅劑與包含紅細(xì)胞的組合物混合，其中所得混合物在適合于使滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞結(jié)合充分猝滅的PH范圍。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的PH的步驟。在某些實(shí)施方案中，在與滅活病原體的化合物和猝滅劑混合前調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH。在某些實(shí)施方案中，通過添加猝滅劑調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH。在某些實(shí)施方案中，在向紅細(xì)胞組合物中添加猝滅劑前用至少約I當(dāng)量的合適的堿中和猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，在添加滅活病原體的化合物前將猝滅劑與包含紅細(xì)胞的組合物混合。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在室溫下合適的pH范圍為約6.8-8.5，約7.0-8.5，約7.2-8.5，或約7.2-8.0。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度在約2mM_約40mM的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度在約4mM-約40mM，約10-約30mM的范圍內(nèi)。在所述方法的某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度為至少約4mM或至少約10mM。在某些實(shí)施方案中，用于所述方法的猝滅劑包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。例如，在某些實(shí)施方案中，猝滅劑為谷胱甘肽。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)性親電子基團(tuán)選自芥子、芥子中間體和芥子等效物。在某些實(shí)施方案中，滅活病原體的化合物為運(yùn)-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些實(shí)施方案中，所述的處理導(dǎo)致紅細(xì)胞組合物中至少Ilog的病原體污染物的滅活。
[0041]本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括:(a)提供:i)包含為或形成反應(yīng)性親電子基團(tuán)的官能團(tuán)的滅活病原體的化合物；ii)包含巰基的猝滅劑，其中巰基能夠與滅活病原體的化合物的反應(yīng)性親電子基團(tuán)反應(yīng)；和iii)包含紅細(xì)胞的組合物，其中存在紅細(xì)胞組合物被病原體污染的可能性；和(b)將滅活病原體的化合物和猝滅劑與包含紅細(xì)胞的組合物混合，其中猝滅劑在所得混合物中的濃度大于2mM，其中所得混合物在室溫下的pH在約6.7或6.7以上的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所得混合物在室溫下具有的pH為約7.0或7.0以上，或?yàn)?.2或7.2以上。在某些實(shí)施方案中，所得混合物的pH在約6.8-8.5，約7.0-8.5，約7.2-8.5或約7.2-8.0的范圍內(nèi)。例如，在某些實(shí)施方案中，所得混合物在室溫下的pH在約7.0-8.5的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括下列步驟:(c)調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH，使得所得混合物在室溫下的pH在指定的范圍內(nèi)(例如在約7.0-8.5的范圍內(nèi))。在某些實(shí)施方案中，通過將至少約0.5當(dāng)量，至少約I當(dāng)量或至少約2當(dāng)量的堿添加到紅細(xì)胞組合物中調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH,其中當(dāng)量意指與混合物 中猝滅劑的摩爾量相等的摩爾量。在某些實(shí)施方案中，在向紅細(xì)胞組合物中添加猝滅劑前用至少約I當(dāng)量的合適的堿中和猝滅劑并且通過添加中和的猝滅劑調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度為至少約4mM或至少約10mM。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度為約4_40mM或約10-30mM。例如，在某些實(shí)施方案中，猝滅劑的濃度為至少約4mM，其中所述混合物在室溫下具有的PH在約6.8-8.5的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑的濃度在約4-40mM內(nèi)并且在室溫下的pH在約7.2-8.5的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，在向紅細(xì)胞組合物中添加猝滅劑前用至少約I當(dāng)量的合適的堿中和猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，在添加滅活病原體的化合物前將猝滅劑與包含紅細(xì)胞的組合物混合。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑化合物為酸性。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。例如，在某些實(shí)施方案中，猝滅劑為谷胱甘肽。在某些實(shí)施方案中，官能團(tuán)選自芥子、芥子中間體和芥子等效物。在某些實(shí)施方案中，滅活病原體的化合物為0-丙氨酸4-(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些實(shí)施方案中，所述的處理導(dǎo)致紅細(xì)胞組合物中至少Ilog的病原體污染物的滅活。在某些實(shí)施方案中，所述的處理導(dǎo)致紅細(xì)胞組合物中至少llog，至少約21og或至少約31og的病原體污染物的滅活。
[0042]本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括將下列成分與紅細(xì)胞組合物混合:(a)滅活病原體的化合物，其中滅活病原體的化合物包含核酸結(jié)合配體和為或形成能夠與核酸反應(yīng)的親電子基團(tuán)的官能團(tuán)；(b)包含巰基的猝滅劑，其中巰基能夠與親電子基團(tuán)反應(yīng)；和(C)與不含堿的混合物(即除未加入(C)的堿外包含與第一種混合物相同成分的第二種混合物)相比，降低包含紅細(xì)胞組合物、滅活病原體的化合物、猝滅劑和堿的混合物中滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的副反應(yīng)水平的足量合適的堿。在某些實(shí)施方案中，滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的反應(yīng)為滅活病原體的化合物對紅細(xì)胞表面的修飾。在某些實(shí)施方案中，在將滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞組合物合并之前，同時(shí)或之后不超過約I小時(shí)，約30分鐘，約20分鐘，約10分鐘，約5分鐘，約2分鐘或約I分鐘將堿和猝滅劑與紅細(xì)胞組合物合并。在某些實(shí)施方案中，在將滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞組合物混合前將堿和猝滅劑與紅細(xì)胞組合物混合。在某些實(shí)施方案中，在將堿或猝滅劑與紅細(xì)胞組合物混合前將堿和猝滅劑彼此混合。在某些實(shí)施方案中，包含猝滅劑的堿式鹽不但提供猝滅劑而且提供堿。在某些實(shí)施方案中，堿為NaOH。在某些實(shí)施方案中，堿為堿性緩沖劑。在某些實(shí)施方案中，加入至少約0.5當(dāng)量，至少約1.0或至少約2當(dāng)量的堿，其中當(dāng)量意指與混合物中猝滅劑的摩爾量相等的摩爾量。在某些實(shí)施方案中，堿包含至少約I當(dāng)量的堿。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在室溫下合適的PH范圍為約6.8-8.5，約7.0-8.5，約7.2-8.5或約7.2-8.0。在某些實(shí)施方案中，所得混合物在室溫下具有的pH為約7.0-8.5。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度為大于2mM，大于約4mM或大于約10mM。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度在約2mM-約40mM的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度在約4mM-約40mM，約10-約30mM的范圍內(nèi)。例如，在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度在約10mM-30mM的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑為酸性的。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，諸如谷胱甘肽。在某些實(shí)施方案中，官能團(tuán)選自芥子、芥子中間體和芥子等效物。例如，在某些實(shí)施方案中，權(quán)利要求14所述的方法中滅活病原體的化合物為β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些實(shí)施方案中，所述的處理導(dǎo)致紅細(xì)胞組合物中至少Ilog的病原體污染物的滅活。 [0043]本發(fā)明在另一個(gè)實(shí)施方案中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括將下列成分與紅細(xì)胞組合物混合:(a)滅活病原體的化合物，其中滅活病原體的化合物包含核酸結(jié)合配體和為或形成能夠與核酸反應(yīng)的親電子基團(tuán)的官能團(tuán)；(b)包含巰基的猝滅劑，其中巰基能夠與親電子基團(tuán)反應(yīng)；和(C)與不含堿的混合物(即除未向混合物中加入(C)的堿外包含與第一種混合物相同成分的第二種混合物)相比，增加包含紅細(xì)胞組合物、滅活病原體的化合物、猝滅劑和堿的混合物的PH的足量合適的堿。在某些實(shí)施方案(例如在某些實(shí)施方案中，其中猝滅劑為酸性化合物)中，加入足量的合適的堿以便將混合物的pH增加到至少約為不含堿或猝滅劑的混合物的pH。在某些實(shí)施方案中，在將滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞組合物合并之前，同時(shí)或之后不超過約I小時(shí)，約30分鐘，約20分鐘，約10分鐘，約5分鐘，約2分鐘或約I分鐘將堿和猝滅劑與紅細(xì)胞組合物合并。在某些實(shí)施方案中，在將滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞組合物混合前將堿和猝滅劑與紅細(xì)胞組合物混合。在某些實(shí)施方案中，在將堿或猝滅劑與紅細(xì)胞組合物混合前將堿和猝滅劑彼此混合。在某些實(shí)施方案中，包含猝滅劑的堿式鹽不但提供猝滅劑而且提供堿。在某些實(shí)施方案中，堿為NaOH。在某些實(shí)施方案中，堿為堿性緩沖劑。在某些實(shí)施方案中，加入至少約0.5當(dāng)量，至少約1.0或至少約2當(dāng)量的堿，其中當(dāng)量意指與混合物中猝滅劑的摩爾量相等的摩爾量。在某些實(shí)施方案中，堿包含至少約I當(dāng)量的堿。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在室溫下合適的PH范圍為約6.8-8.5，約7.0-8.5，約7.2-8.5或約7.2-8.0。在某些實(shí)施方案中，所得混合物在室溫下具有的pH為約7.0-8.5。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度為大于2mM，大于約4mM或大于約10mM。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度在約2mM-約40mM的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度在約4mM_約40mM,約10-約30mM的范圍內(nèi)。例如，在某些實(shí)施方案中，猝滅劑在所得混合物中的濃度在約10mM-30mM的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑為酸性的。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，諸如谷胱甘肽。在某些實(shí)施方案中，官能團(tuán)選自芥子、芥子中間體和芥子等效物。例如，在某些實(shí)施方案中，權(quán)利要求14所述的方法中滅活病原體的化合物為@-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些實(shí)施方案中，所述的處理導(dǎo)致紅細(xì)胞組合物中至少Ilog的病原體污染物的滅活。
[0044]本發(fā)明在一個(gè)另外的方面中提供了在有猝滅劑存在下在用滅活病原體的化合物處理包含紅細(xì)胞的組合物過程中改善滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的副反應(yīng)的猝滅的方法，其中猝滅劑包含巰基，并且其中滅活病原體的化合物包含為或形成與猝滅劑的巰基反應(yīng)的親電子試劑的官能團(tuán)，其中該方法包括增加包含紅細(xì)胞組合物、滅活病原體的化合物和猝滅劑的反應(yīng)混合物的pH。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括增加猝滅劑在反應(yīng)混合物中的濃度的步驟。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑為酸性的。在某些實(shí)施方案中，滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的反應(yīng)為滅活病原體的化合物對紅細(xì)胞表面的修飾。
[0045]本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括按照下列次序的步驟:a)提供:i) β -丙氨酸、Ν_(卩丫卩定-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯；ii)中和的谷胱甘肽；和iii)包含紅細(xì)胞的組合物，其中存在紅細(xì)胞組合物被病原體污染的可能性；
b)將中和的谷胱甘肽與包含紅細(xì)胞的組合物混合；c)將該混合物孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔；和d)將@-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯與中和的谷胱甘肽和包含紅細(xì)胞的組合物的混合物混合，其中病原體如果存在于包含紅細(xì)胞的組合物中，那么被滅活至少llog。在某些實(shí)施方案中，中和的谷胱甘肽包含加入了至少約I當(dāng)量的堿的谷胱甘肽，其中當(dāng)量意指與猝滅劑的摩爾量相等的摩爾量。在某些實(shí)施方案中，中和的谷胱甘肽包含加入了約2當(dāng)量的堿的谷胱甘肽(例如谷胱甘肽的游離酸)。
[0046]還提供了通過本文所述方法各自生產(chǎn)的紅細(xì)胞組合物。在某些實(shí)施方案中，與通過包括用滅活病原體的化合物處理的其它方法生產(chǎn)的紅細(xì)胞相比，紅細(xì)胞組合物包含滅活病原體的化合物對紅細(xì)胞表面的降低水平的修飾。在某些實(shí)施方案中，通過所述方法的處理生產(chǎn)的紅細(xì)胞組合物包含滅活病原體的化合物的降解產(chǎn)物(例如猝滅劑與滅活病原體的化合物的反應(yīng)產(chǎn)物)。在某些實(shí)施方案中，與通過包括用滅活病原體的化合物處理的另一種方法生產(chǎn)的紅細(xì)胞組合物 相比,通過本文所述方法的處理生產(chǎn)的紅細(xì)胞組合物包含處理完成后減少量的包含反應(yīng)性親電子基團(tuán)的滅活病原體的化合物。在某些實(shí)施方案中，包含反應(yīng)性親電子基團(tuán)的滅活病原體的化合物在組合物中的量與通過包括滅活病原體的化合物的另一種方法(例如不向反應(yīng)混合物中加入猝滅劑和/或堿的方法或在較低pH下處理)處理的組合物相比已經(jīng)減少了約10 %，約25 %，約50 %，約75 %，約90 %，約95 %或約99%。
[0047]本發(fā)明在一個(gè)另外的方面中提供了包含紅細(xì)胞的組合物、包含核酸結(jié)合配體和反應(yīng)性親電子基團(tuán)的滅活病原體的化合物和包含能夠與親電子基團(tuán)反應(yīng)的巰基的猝滅劑，其中猝滅劑的濃度為大于2mM，并且組合物的pH在約6.7或6.7以上。在某些實(shí)施方案中，組合物具有的PH范圍在約6.8-8.5，約7.0-8.5和約7.2-8.0的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，組合物包含至少約4mM的猝滅劑或至少約IOmM的猝滅劑。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑的濃度在約4-40mM或約10-30mM的范圍內(nèi)。例如，在某些實(shí)施方案中，猝滅劑的濃度在約4mM-40mM的范圍內(nèi)，并且組合物的pH在約6.8-8.5的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，猝滅劑的濃度為至少約4mM，并且組合物的pH在約6.8-8.5的范圍內(nèi)。
[0048]就包含氨基酸取代基的本文的序列而言，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，每個(gè)氨基酸取代基都可以獨(dú)立地選擇。本發(fā)明還提供了包含氨基酸取代基的序列，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代基被消除。
[0049]本發(fā)明方法中待滅活的病原體污染物包括能夠使人、其它哺乳動(dòng)物或脊椎動(dòng)物產(chǎn)生疾病的任何含核酸的病原體。病原體可以為單細(xì)胞的或多細(xì)胞的。病原體的實(shí)例為使人、其它哺乳動(dòng)物或脊椎動(dòng)物產(chǎn)生疾病的細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌、酵母、霉菌和支原體。病原體的遺傳物質(zhì)可以為DNA或RNA并且該遺傳物質(zhì)可以為單鏈或雙鏈核酸形式。表1中列舉了病毒的實(shí)例，但它們并不以任何方式來限定本發(fā)明。
[0050]表1.病毒的非限制性實(shí)例
[0051]
【權(quán)利要求】
1.處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括將下列物質(zhì)與紅細(xì)胞組合物混合: (a)滅活病原體的化合物，其中該滅活病原體的化合物包含核酸結(jié)合配體和為或形成能夠與核酸反應(yīng)的親電子基團(tuán)的官能團(tuán)； (b)包含疏基的粹滅劑，其中疏基能夠與未電子基團(tuán)反應(yīng)；和 (C)足量的合適的堿以便降低滅活病原體的化合物與混合物中紅細(xì)胞的不需要的反應(yīng)的水平，所述的混合物與不含堿的混合物相比包含紅細(xì)胞組合物、滅活病原體的化合物、猝滅劑和堿。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的反應(yīng)為滅活病原體的化合物對紅細(xì)胞表面的修飾。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中在將滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞組合物混合前，混合同時(shí)或混合后不超過約30分鐘將堿和猝滅劑與紅細(xì)胞組合物混合。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中在將堿或猝滅劑與紅細(xì)胞組合物混合前將所述的堿和所述的猝滅劑彼此混合。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中猝滅劑和堿均由包含猝滅劑的堿式鹽提供。
6.權(quán)利要求1所述的方 法，其中所述的堿為NaOH。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的堿為堿性緩沖劑。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的堿包含至少約I當(dāng)量堿，其中當(dāng)量意指與混合物中猝滅劑的摩爾量相等的摩爾量。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中猝滅劑在所得混合物中的濃度大于2mM。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中猝滅劑在所得混合物中的濃度在約10mM-30mM的范圍。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所得混合物在室溫下具有約7.0-8.5的pH。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的猝滅劑包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的猝滅劑為谷胱甘肽。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的官能團(tuán)選自芥子、芥子中間體和芥子等效物。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的滅活病原體的化合物為β-丙氨酸、Ν-(吖唳_9_基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的處理導(dǎo)致紅細(xì)胞組合物中至少為Ilog的病原體污染物滅活。
17.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括降低混合物中滅活病原體的化合物的濃度的最終步驟。
18.組合物，包含用權(quán)利要求17所述方法生產(chǎn)的紅細(xì)胞。
19.處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括將下列物質(zhì)與紅細(xì)胞組合物混合: (a)滅活病原體的化合物，其中該滅活病原體的化合物包含核酸結(jié)合配體和為或形成能夠與核酸反應(yīng)的親電子基團(tuán)的官能團(tuán)； (b)包含疏基的粹滅劑，其中疏基能夠與未電子基團(tuán)反應(yīng)；和 (C)足量的合適的堿以便增加混合物的pH，所述的混合物與不含堿的混合物相比包含紅細(xì)胞組合物、滅活病原體的化合物、猝滅劑和堿。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中在將滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞組合物混合前，混合同時(shí)或混合后不超過約30分鐘將堿和猝滅劑與紅細(xì)胞組合物混合。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中在將堿或猝滅劑與紅細(xì)胞組合物混合前將所述的堿和所述的猝滅劑彼此混合。
22.權(quán)利要求19所述的方法，其中猝滅劑和堿均由包含猝滅劑的堿式鹽提供。
23.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的堿為NaOH。
24.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的堿為堿性緩沖劑。
25.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的堿包含至少約I當(dāng)量堿，其中當(dāng)量意指與混合物中猝滅劑的摩爾量相等的摩爾量。
26.權(quán)利要求19所述的方法，其中猝滅劑在所得混合物中的濃度大于2mM。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中猝滅劑在所得混合物中的濃度在約10mM-30mM的范圍。
28.權(quán)利要求19所述的方法，其中所得混合物在室溫下具有約7.0-8.5的pH。
29.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的猝滅劑包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的猝滅劑為谷胱甘肽。
31.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的官能團(tuán)選自芥子、芥子中間體和芥子等效物。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的滅活病原體的化合物為β-丙氨酸、Ν-(吖唳_9_基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯。
33.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的處理導(dǎo)致紅細(xì)胞組合物中至少為Ilog的病原體污染物滅活。
34.權(quán)利要求19所述的方法，進(jìn)一步包括降低滅活病原體的化合物在混合物中的濃度的最終步驟。
35.組合物，包含用權(quán)利要求34所述方法生產(chǎn)的紅細(xì)胞。
36.處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括: (a)提供:i)包含為或形成反應(yīng)性親電子基團(tuán)的官能團(tuán)的滅活病原體的化合物；ii)包含巰基的猝滅劑，其中巰基能夠與滅活病原體的化合物的反應(yīng)性親電子基團(tuán)反應(yīng)；和iii)包含紅細(xì)胞的組合物，其中存在紅細(xì)胞組合物被病原體污染的可能性；和 (b)將滅活病原體的化合物和猝滅劑與包含紅細(xì)胞的組合物混合，其中猝滅劑在所得混合物中的濃度大于2mM， 其中所得混合物在室溫下的PH在約7.0-8.5的范圍。
37.權(quán)利要求36所述的方法，進(jìn)一步包括下列步驟: (c)調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH，使得所得混合物在室溫下的pH在約7.0-8.5的范圍。
38.權(quán)利要求36所述的方法，其中通過向紅細(xì)胞組合物中添加至少約I當(dāng)量的堿調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH，其中當(dāng)量意指與猝滅劑在混合物中的摩爾量相等的摩爾量。
39.權(quán)利要求36所述的方法，其中在向紅細(xì)胞組合物中添加猝滅劑前用至少約I當(dāng)量的合適的堿中和猝滅劑，并且通過添加中和的猝滅劑調(diào)節(jié)包含紅細(xì)胞的組合物的pH。
40.權(quán)利要求36所述的方法，其中所得混合物在室溫下具有約7.2-8.5的pH。
41.權(quán)利要求36所述的方法，其中猝滅劑在所得混合物中的濃度在約10mM-30mM的范圍。
42.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的猝滅劑包含半胱氨酸或合適的半胱氨酸衍生物。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的猝滅劑為谷甘胱肽。
44.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的反應(yīng)性親電子基團(tuán)選自芥子、芥子中間體和芥子等效物。
45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的滅活病原體的化合物為β-丙氨酸、Ν-(吖唳_9_基)、2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯。
46.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的處理導(dǎo)致紅細(xì)胞組合物中至少為Ilog的病原體污染物滅活。
47.權(quán)利要求36所述的方法，進(jìn)一步包括降低滅活病原體的化合物在混合物中的濃度的最終步驟。
48.用權(quán)利要求47所述方法生產(chǎn)的紅細(xì)胞組合物。
49.處理紅細(xì)胞組合物的方法，包括下列順序的步驟: (a)提供:i)β -丙氨酸、Ν-(卩丫卩定-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯；ii)中和的谷胱甘肽；和iii)包含紅細(xì)胞的組合物，其中存在紅細(xì)胞組合物被病原體污染的可能性； (b)將中和的谷胱甘肽與包含紅細(xì)胞的組合物混合； (c)將該混合物孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔；和 (d)將β-丙氨酸、Ν_(卩丫卩定-9-基)、2_[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯與中和的谷胱甘肽和包含紅細(xì)胞的組合物的混合物混合，其中如果病原體存在于包含紅細(xì)胞的組合物中，那么它被滅活至少llog。
50.在有猝滅劑存在下用滅活病原體的化合物處理包含紅細(xì)胞的組合物的過程中改進(jìn)滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的副反應(yīng)猝滅的方法，其中猝滅劑包含巰基，并且其中滅活病原體的化合物包含為或形成親電子試劑的官能團(tuán)，所述的親電子試劑與猝滅劑的巰基反應(yīng)，該方法包括:增加包含紅細(xì)胞組合物、滅活病原體的化合物和粹滅劑的反應(yīng)混合物的pH。
51.權(quán)利要求50所述的方法，進(jìn)一步包括下列步驟:增加反應(yīng)混合物中猝滅劑的濃度。
52.權(quán)利要求50所述的方法，其中滅活病原體的化合物與紅細(xì)胞的不需要的反應(yīng)為滅活病原體的化合物對紅細(xì)胞表面的修飾。
53.組合物，包含: (a)紅細(xì)胞； (b)包含核酸結(jié)合配體和反應(yīng)性親電子基團(tuán)的滅活病原體的化合物；和 (C)包含能夠與親電子基團(tuán)反應(yīng)的巰基的猝滅劑， 其中猝滅劑的濃度大于2mM，并且組合物的pH在約7.0-8.5的范圍。
54.試劑盒，包含:滅活病原體的化合物，該化合物包含核酸結(jié)合配體和為或形成親電子基團(tuán)的官能團(tuán)；包含巰基的猝滅劑；和至少約I當(dāng)量的堿，其中當(dāng)量意指與試劑盒中猝滅劑的摩爾量相等的摩爾量。
55.用權(quán)利要求1所述方法生產(chǎn)的紅細(xì)胞組合物。
56.用權(quán)利要求19所述方法生產(chǎn)的紅細(xì)胞組合物。
57 .用權(quán)利要求36所述方法生產(chǎn)的紅細(xì)胞組合物。
58.用權(quán)利要求49所述方法生產(chǎn)的紅細(xì)胞組合物。
【文檔編號】A61K31/198GK103961731SQ201410112134
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2005年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2004年10月29日
【發(fā)明者】A·斯塔西諾普洛斯 申請人:塞魯斯公司