基于膠原包覆的組織的膜的制作方法
【專利摘要】一種基于膠原包覆的組織的膜，所述膜兩側(cè)面都光滑以抑制細(xì)胞和組織粘附。還公開了用于制備基于膠原包覆的組織的膜的方法。
【專利說明】基于膠原包覆的組織的膜
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請是于2012年2月29日提交的美國申請?zhí)?3/408，319的國際申請，將其內(nèi)容以其整體通過引用結(jié)合于此。
[0003]背景
[0004]生物相容性膜可以通過多種不同方法制備。在一種方法中，使用提取自富膠原的組織(例如，腱和真皮)的純化的膠原纖維來重構(gòu)膜，如在美國專利6，391，333,6, 599，524和7，807，192中描述的。一種替代方法依賴于使用源自組織的膜(例如，心包膜，腹膜，和小腸粘膜下層(small intestine submucosa)作為起始材料,如在美國專利5，837，278和5，993，844中描述的。
[0005]源自組織的膜(比如心包膜和腹膜)典型地含有兩個(gè)側(cè)面。與內(nèi)部器官和體液相接觸的一側(cè)被稱為臟層或漿液層，而與腹壁或心壁相接觸的一側(cè)被稱為體壁層。臟層(其是光滑的)不粘附至相鄰身體組織。相反，體壁層與其相鄰的組織結(jié)合在一起。體壁層必須機(jī)械地與相鄰體壁組織分離以從身體取下基于組織的膜。從體壁的整合軟組織撕下的基于組織的膜的體壁層覆蓋有纖維材料。體壁層的這些覆蓋有纖維的表面是粘附性的，促成細(xì)胞粘附和組織生長。在分離自動物的膜的體壁側(cè)上的纖維材料可以在顯微鏡，如掃描電子顯微鏡下容易地被鑒定。
[0006]生物相容性膜經(jīng)常用于醫(yī)療和牙科手術(shù)。有時(shí)，需要使用任一側(cè)面都是非粘附性的膜以避免與周圍組織的任何粘附。例如，非粘附性膜可以用于撕裂的硬脊膜的手術(shù)修復(fù)，以及用于需要導(dǎo)向的組織修復(fù)的牙科手術(shù)。
[0007]對于可以在其中與膜的細(xì)胞粘附是不期望的情況中使用的基于組織的生物相容性膜存在需求。
[0008]概述
[0009]本發(fā)明的主要目的在于向手術(shù)團(tuán)體提供在兩側(cè)面上都具有最小粘附性的生物相容的基于組織的膜(tissue-based membrane),其用于組織修復(fù)和再生應(yīng)用。
[0010]因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及基于組織的包覆的膜，其包括具有用膠原的層包覆的纖維表面的衆(zhòng)膜(serous membrane)和未包覆的光滑表面,使得包覆的纖維表面和未包覆的光滑表面對細(xì)胞和組織較差地(很弱地，poorly)粘附。漿膜可以是，例如，心包膜、腹膜、羊膜(amn1n)、小腸粘膜下層、胸膜(pleural)或陰道被囊(陰道膜，vaginal tunics)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，漿膜是心包膜或腹膜。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，漿膜的纖維表面用形成纖維的膠原(fiber-forming collagen)包覆。形成纖維的膠原可以是I型膠原、II型膠原、III型膠原，或這三種類型中的兩種或更多種的組合。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于制備生物相容的膠原包覆的漿膜的方法。所述方法包括其中刮擦漿膜的纖維側(cè)以除去粘附纖維(adhering fiber)的步驟。然后處理刮擦過的漿膜以除去細(xì)胞、脂質(zhì)以及可提取的血液和非膠原分子，之后冷凍干燥處理過的漿膜。將處理過的漿膜的纖維側(cè)壓緊(壓縮，com press)，然后用膠原包覆。最后，將膠原包覆的漿膜暴露于交聯(lián)劑以發(fā)生交聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在刮擦步驟之前用脫水劑沖洗漿膜以允許更有效除去粘附至所述膜的纖維側(cè)的纖維。脫水劑可以是小的有機(jī)分子，如丙酮或醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，處理過的漿膜的纖維側(cè)用形成纖維的膠原包覆，所述膠原可以是I型膠原、II型膠原、III型膠原，或其組合。優(yōu)選所述膠原是I型膠原?？梢詫⒛z原通過噴涂(噴霧，spraying)、刷涂(brushing)或浸潰(dipping)而包覆到處理過的衆(zhòng)膜的纖維側(cè)上。優(yōu)選地，將膠原噴涂在漿膜的纖維側(cè)的。
[0012]還提供了通過上述方法制備的生物相容的膠原包覆的漿膜。
[0013]本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)列于以下描述中。根據(jù)該描述和權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)勢將明顯。
[0014]詳細(xì)描述
[0015]本發(fā)明涉及用于制備基于組織的包覆的膜的方法，其產(chǎn)生兩側(cè)都光滑以最小化組織粘附的膜。
[0016]用于生產(chǎn)光滑的基于組織的包覆的膜的方法包括以下六個(gè)關(guān)鍵步驟。第一，刮擦分離的基于組織的膜的纖維(即，體壁)側(cè)以除去粘附纖維。第二，用酶和化學(xué)物質(zhì)處理基于組織的膜以除去細(xì)胞、脂質(zhì)，以及可提取的血液和非膠原分子。第三，將經(jīng)處理的基于組織的膜冷凍干燥。第四，將基于組織的膜的纖維側(cè)壓緊。第五，將經(jīng)壓緊的基于組織的膜的纖維側(cè)用膠原包覆。最后將膠原包覆的基于組織的膜暴露于交聯(lián)劑。
[0017]基于組織的膜，例如，由商業(yè)供應(yīng)商提供的?；蜇i腹膜或心包膜通常含有粘附至膜的體壁側(cè)的纖維，這是由于從相鄰組織機(jī)械分離基于組織的膜所導(dǎo)致的。
[0018]取決于膜在身體中的位置和收獲技術(shù)，粘附纖維的量變化。粘附纖維的除去對于最小化可能的表面不規(guī)則是重要的。 申請人:公開了，用脫水劑(如低分子量有機(jī)化合物或醇)沖洗膜，可以有利于粘附纖維的除去，因?yàn)椴糠置撍估w維堅(jiān)硬并且更易于通過刮擦或其它機(jī)械手段除去。例如，可以用丙酮，甲醇，乙醇或異丙醇沖洗所述膜。處理基于組織的膜中的下一步驟是使用酶和化學(xué)物質(zhì)的組合來盡可能多地除去松散結(jié)合的蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片、DNA物質(zhì)、血液相關(guān)蛋白、水溶性部分和脂質(zhì)。進(jìn)行一系列的相繼化學(xué)處理和用酶的處理以從組織除去非膠原部分、以從組織除去來自細(xì)胞和細(xì)胞核DNA分子，以及從組織使不需要的潛在有害病毒失活。用于實(shí)施此步驟的化學(xué)物質(zhì)和酶包括0.1-3%辛基酚聚氧乙烯BI (octylphenol ethoxylate) (TRITON X-100?, 2-8 小時(shí)處理)、DNA 酶(2-18 小時(shí)處理)、IM Na0H(5-10小時(shí)處理)、0.5M HCl (5-10小時(shí)處理)、IM NaCl (24-48小時(shí)處理)、異丙醇(24-72小時(shí)處理)和水(5-24小時(shí)處理)。
[0019]上述酶和化學(xué)處理從組織除去大多數(shù)的非膠原蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞相關(guān)部分。但是，組織仍保留其天然結(jié)構(gòu)以及相關(guān)的處理和機(jī)械性質(zhì)。
[0020]隨后將干凈的、經(jīng)處理的組織在本領(lǐng)域已知的條件(如美國專利6，391，333中公開的那些條件，將其內(nèi)容以其整體通過引用結(jié)合于此)下冷凍干燥。典型地，對于薄的膜，冷凍干燥通過將膜在低于300Torr的真空下在_20°C溫育24-48小時(shí)，接著在20°C干燥8-24小時(shí)實(shí)現(xiàn)。
[0021]在上述處理之后，冷凍干燥的膜在其體壁側(cè)(即纖維側(cè))仍然是粗糙的。為了使纖維側(cè)光滑，將其用膠原包覆。在兩個(gè)步驟中制備用于包覆的膜。第一，通過在加濕的小室中溫育使其軟化。將膜暴露于大于90%的相對濕度達(dá)I至4小時(shí)通常足以使膜軟化用于進(jìn)一步處理。第二，接著通過使輥(滾筒，roller)在該膜的纖維側(cè)上通過而將經(jīng)軟化的膜壓緊。所述輥具有足夠的重量以完全使仍然粘附于該膜的纖維側(cè)的任何表面纖維變平且光滑。例如，輥的重量可以為2至8kg。
[0022]可以通過用pH為2.3-2.5的酸分散膠原纖維(例如，分散在乳酸中)，或pH為11至12的堿分散膠原纖維(例如，分散在NaOH中)噴涂所述表面而實(shí)現(xiàn)膜的包覆。任何商業(yè)的噴霧器(例如，Badger Airbrush Model 150)可以用于將分散的膠原纖維噴涂在膜的纖維側(cè)上?？梢允褂?.1-1.0mm的噴嘴尺寸在10_60psi進(jìn)行噴涂。噴涂溶液中的膠原纖維的濃度范圍為約0.05%至約0.1% (w/v)，以使膠原以均勻包覆膜表面的薄霧形式噴涂，盡管可能存在任何微小不規(guī)則。膠原涂層的單層或多層可以經(jīng)由這種噴涂技術(shù)施加。典型地，膠原涂層的厚度范圍為5-50 μ m。
[0023]備選地，纖維表面可以使用毛刷用酸分散的膠原包覆。用于毛刷涂覆的膠原的濃度可以顯著高于用于噴涂的濃度,范圍為約0.1%至約0.9% (w/v) O使用毛刷施加的膠原涂層比通過噴涂施加的膠原涂層顯著更厚，范圍為約50 μ m至約100 μ m。
[0024]而且，可以將膜浸潰到膠原分散液中以包覆膜的纖維表面。
[0025]與采用的膠原涂覆技術(shù)無關(guān)，將包覆的膜干燥以更牢固地結(jié)合膠原與膜表面。
[0026]包覆的膜可以使用本領(lǐng)域公知的交聯(lián)劑交聯(lián)。交聯(lián)可以在含有交聯(lián)劑(例如，戊二醛，甲醛)的溶液中或通過將包覆的膜暴露于交聯(lián)劑蒸汽(例如，甲醛蒸汽)進(jìn)行。溶液中交聯(lián)的程度是交聯(lián)劑的濃度、溶液的溫度和交聯(lián)時(shí)間的函數(shù)。例如，可以通過在室溫將包覆的膜暴露于0.5%甲醛溶液達(dá)5小時(shí)實(shí)現(xiàn)交聯(lián)。交聯(lián)條件可以顯著影響膜的特性。例如，高濃度的交聯(lián)劑和較長的交聯(lián)時(shí)間將導(dǎo)致產(chǎn)生具有低體內(nèi)再吸收速率的較不合適的膜。相反，為了制備更合適的膜，優(yōu)選低濃度的交聯(lián)劑。該原理同樣適用于蒸汽交聯(lián)，其中較低的交聯(lián)劑蒸汽壓將產(chǎn)生更適合的膜。交聯(lián)的膜可以進(jìn)行沖洗或暴露于空氣以將任何交聯(lián)劑殘余物的量減少至對于人移植是可接受的水平。
[0027]無需進(jìn)一步詳述，認(rèn)為以上描述已足以能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明。因此，以下三個(gè)實(shí)施例被認(rèn)為僅是說明性的，并且無論怎樣不以任何方式限制本公開內(nèi)容的其他方面。
[0028]實(shí)施例1:膠原包覆的牛心包膜
[0029]純化的腱膠原的制備
[0030]將牛屈肌腱的脂肪和筋膜小心除去并用水清洗腱。將清潔過的腱冷凍并通過用切片機(jī)切為0.5_的薄片分割。首先將切片的腱在凈化水中于室溫提取24小時(shí)。在潷析水后，加入在0.5M Na2SO4中的0.2M HCl溶液并將該腱薄片在室溫提取24小時(shí)。通過加入3MNaOH以將pH升到約7來中和酸溶液。將屈肌腱薄片在該第一中和鹽溶液中提取18小時(shí)，這之后通過潷析除去溶液。然后將酸提取過的腱在室溫用在I M Na2SO4中的0.75M NaOH進(jìn)一步提取24小時(shí)。通過加入3MHC1將此堿溶液中和至pH為約7。將腱薄片在該第二中和鹽溶液中提取18小時(shí)，這之后通過潷析除去該溶液。在兩次剛提到的中和鹽提取之后，將腱薄片用凈化水沖洗4次以除去任何殘留的鹽。隨后將經(jīng)提取、沖洗的腱用99%異丙醇在室溫脫脂8小時(shí)。將異丙醇潷析并加入另一等體積的99%異丙醇以進(jìn)一步在室溫提取腱薄片達(dá)18小時(shí)。
[0031]上述的所有提取步驟在恒定攪拌下進(jìn)行。而且，每克處理的腱使用5ml的提取溶液進(jìn)行所有的提取(除了異丙醇提取之外)。每克處理的腱使用3ml異丙醇進(jìn)行異丙醇提取。
[0032]隨后將脫脂的腱在清潔空氣罩(clean air hood)下干燥。將處理的腱材料(主要由純化的纖維狀膠原組成)干燥儲存在室溫備用。
[0033]酸分散的膠原纖維的制備
[0034]通過在冰箱中于4°C將Ig純化的纖維狀膠原在一升的0.07M乳酸中溶脹過夜而制備0.1% (w/v)的酸性膠原分散液。然后使用Silverson均化器將溶脹后的纖維均化60秒并通過50目不銹鋼濾器過濾。然后將酸性分散液儲存于冰箱中備用。
[0035]牛心包臘的鈍仆,
[0036]將脂肪和無關(guān)組織從未加工的牛心包膜組織機(jī)械地除去并用水清洗。首先將預(yù)先清潔的牛心包膜在凈化水中于室溫清洗2小時(shí)。潷去水，加入0.1 % TRITON X-100TM/DNA酶(DNase)，并在室溫提取該心包膜兩小時(shí)。使用的DNA酶的量為4個(gè)活性單位/cm2膜。將溶液潷析并隨后將牛心包膜用凈化水沖洗2小時(shí)。然后將去污劑/酶-提取的牛心包膜通過用99%的異丙醇室溫溫育三次(6，18和24小時(shí))進(jìn)行脫脂。然后將脫脂的牛心包膜在室溫在0.5M Na2SO4中的0.5M HCl中提取6小時(shí)。通過加入3M NaOH將該酸性溶液中和至pH為約7。隨后將牛心包膜在中和的鹽溶液中提取18小時(shí)并將溶液潷析。然后將酸提取的牛心包膜在室溫在1.2M Na2SO4中的IM NaOH中進(jìn)一步提取6小時(shí)。通過加入3M HCl將該堿溶液中和至PH為約7。隨后將牛心包膜在中和的鹽溶液中提取18小時(shí)并將溶液潷析。在鹽提取之后，將牛心包膜用凈化水洗滌4次以除去與純化的牛心包膜相關(guān)的殘留鹽。所有提取步驟在恒定攪拌下進(jìn)行。
[0037]除了異丙醇提取之外，所有提取使用3ml提取溶液/cm2處理的牛心包膜進(jìn)行。異丙醇提取使用2.7ml異丙醇/cm2處理的牛心包膜進(jìn)行。
[0038]隨后將純化的牛心包膜冷凍干燥并儲存?zhèn)溆谩?br> [0039]用酸分散的膠原包覆純化的牛心包膜
[0040]將冷凍干燥的純化的牛心包膜在濕化罐(humidificat1n tank)中以90-100%的相對濕度加濕處理約30-60分鐘。然后將膜的纖維(體壁)側(cè)使用輥在輕壓力(lightpressure)下在單個(gè)均一方向上壓緊以使纖維沿該方向變平。輥重量為4kg，并且僅以輥重量提供輕壓力。將膜置于清潔空氣罩中以干燥最少15分鐘。然后將膜置于保持架中并使用氣刷槍(air-brush gun) (Badger Airbrush Model 150),將膜用 0.1 % (w/v)酸性膠原分散液噴涂30秒。通過0.3_噴嘴以40psi噴涂膠原分散液。隨后將噴涂過的膜置于玻璃皿中并輕微地與0.001%戊二醛溶液交聯(lián)3小時(shí)。之后將交聯(lián)的膜用凈化水沖洗并再次冷凍干燥。
[0041]月交原包覆的牛心包膜的表征
[0042]使用掃描電子顯微鏡(JE0L Ltd.Model JSM6100SEM)，在膠原包覆的和未包覆的樣品上以50x放大倍數(shù)進(jìn)行掃描子顯微鏡(SEM)。使用粘性碳膠帶將樣品安裝在鋁圓片上。將約500埃的純金濺射到樣品上以改善電子束傳導(dǎo)和阻止樣品放電。
[0043]由于膜的表面上的隨機(jī)取向的纖維所致，牛心包膜的纖維(體壁)側(cè)具有粗糙的外觀，如在SEM下可視化的。按照上述程序，在用膠原包覆牛心包膜的體壁表面之后，在SEM下觀察到光滑表面。牛心包膜的光滑(內(nèi)臟)非包覆側(cè)在外觀上類似于包覆的纖維側(cè)。
[0044]實(shí)施例2:膠原包覆的豬腹膜
[0045]將脂肪和無關(guān)組織從豬腹膜機(jī)械地除去并用水清洗。首先將預(yù)先清潔的豬腹膜在凈化水中于室溫清洗2小時(shí)。將水潷析并將3% TRITONX-100?加入至腹膜并在室溫孵育7小時(shí)。將TRITON X-100?溶液潷析并隨后將腹膜在DNA酶溶液中溫育18小時(shí)。使用的DNA酶的量為8個(gè)活性單位/cm2膜。通過用99%異丙醇在室溫溫育三次(3，3，18和24小時(shí))而將去污劑和酶提取的豬腹膜脫脂。將脫脂的豬腹膜在室溫在0.5MNa2S04中的0.5MHCl中提取6小時(shí)。使用3M NaOH將該酸溶液中和至pH為約7。將豬腹膜在中和的鹽溶液中進(jìn)一步提取18小時(shí)并將溶液潷析。隨后將酸提取的豬腹膜在室溫在1.2M Na2SO4中的IMNaOH中提取6小時(shí)。使用3M HCl將該堿性溶液中和至pH為約7。將豬腹膜在中和的鹽溶液中進(jìn)一步提取18小時(shí)并將溶液潷析。在鹽提取之后，將豬腹膜用凈化水清洗4次以除去與純化的豬腹膜相關(guān)的殘留鹽。
[0046]除異丙醇提取之外，所有提取使用3ml提取溶液/cm2處理的豬腹膜進(jìn)行。異丙醇提取使用2.7ml異丙醇/cm2處理的豬腹膜進(jìn)行。
[0047]將純化的豬腹膜冷凍干燥并儲存?zhèn)溆谩?br> [0048]如上文對牛心包膜描述的，將純化的豬腹膜用酸分散的膠原包覆。
[0049]實(shí)施例3:用堿分散的膠原纖維包覆牛心包膜
[0050]通過在冰箱中將Ig如上所述純化的纖維狀膠原在一升的0.0lMNaOH中于4°C溶脹過夜來制備0.1% (w/v)堿膠原分散液。然后使用Silverson均化器將溶脹后的纖維均化90秒，這之后將它們通過50目不銹鋼濾器過濾。隨后將堿分散液儲存于冰箱中備用。
[0051]牛心包膜如上所述進(jìn)行純化。如上文對酸分散的膠原纖維的描述，將堿分散膠原纖維包覆在純化的膜上。
[0052]實(shí)施例4:用堿分散的膠原纖維包覆豬腹膜
[0053]通過在冰箱中將Ig如上所述純化的纖維狀膠原在一升的0.0lMNaOH中于4°C溶脹過夜來制備0.1% (w/v)堿膠原分散液。隨后使用Silverson均化器將溶脹后的纖維均化90秒，這之后將它們通過50目不銹鋼濾器過濾。隨后將堿分散液儲存于冰箱中備用。
[0054]豬腹膜如上文所述進(jìn)行純化。如上文對酸分散的膠原纖維描述的，將堿分散的膠原纖維包覆在純化的膜上。
[0055]其它實(shí)施方案
[0056]可以以任意組合將本說明書中公開的所有特征進(jìn)行組合。本說明書中公開的每個(gè)特征可以被用于相同、相當(dāng)或類似目的的備選特征替代。因此，除非另有明確陳述，公開的每個(gè)特征僅是通用系列的相當(dāng)或類似特征的實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從以上描述容易地確定本發(fā)明的本質(zhì)特性，同時(shí)不偏離其精神和范圍，可以進(jìn)行本發(fā)明的各種改變和改進(jìn)以使其適于不同用途和條件。因此，其它實(shí)施方案也在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于組織的包覆的膜，其包括漿膜和膠原涂層，其中所述漿膜具有纖維表面和光滑表面，所述膠原涂層存在于所述纖維表面上，并且所述膠原包覆的纖維表面和所述光滑表面都對細(xì)胞和組織較差地粘附。
2.權(quán)利要求1所述的基于組織的膜，其中所述漿膜是心包膜、腹膜、羊膜、小腸粘膜下層、胸膜或陰道被囊。
3.權(quán)利要求1所述的基于組織的膜，其中所述膠原是形成纖維的膠原。
4.權(quán)利要求3所述的基于組織的膜，其中所述形成纖維的膠原為I型膠原、II型膠原、III型膠原，或其組合。
5.權(quán)利要求4所述的基于組織的膜，其中所述形成纖維的膠原是I型膠原。
6.權(quán)利要求5所述的基于組織的膜，其中所述漿膜是心包膜或腹膜。
7.一種用于制備生物相容的膠原包覆的漿膜的方法，所述方法包括: 刮擦漿膜的纖維側(cè)以除去粘附纖維； 處理所述漿膜以除去細(xì)胞、脂質(zhì)以及可提取的血液和非膠原分子； 冷凍干燥經(jīng)處理的漿膜； 壓緊所述漿膜的所述纖維側(cè)； 用膠原包覆所述漿膜的所述纖維側(cè)；和 將膠原包覆的漿膜暴露于交聯(lián)劑以發(fā)生交聯(lián)。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中在所述刮擦步驟之前，將所述漿膜用脫水劑沖洗。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述脫水劑是醇。
10.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述漿膜是心包膜、腹膜、羊膜、小腸粘膜下層、胸膜或陰道被囊。
11.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述膠原是形成纖維的膠原。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述形成纖維的膠原是I型膠原、II型膠原、III型膠原，或其組合。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述形成纖維的膠原是I型膠原。
14.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述包覆通過將所述膠原噴涂到所述漿膜的所述纖維側(cè)上實(shí)現(xiàn)。
15.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述包覆通過將所述膠原刷涂在所述漿膜的所述纖維側(cè)上實(shí)現(xiàn)。
16.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述包覆通過將所述漿膜的所述纖維側(cè)浸潰在所述膠原中實(shí)現(xiàn)。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述漿膜是心包膜或腹膜。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述膠原是I型膠原。
19.一種通過權(quán)利要求7所述的方法制備的生物相容的膠原包覆的漿膜。
20.一種通過權(quán)利要求18所述的方法制備的生物相容的膠原包覆的漿膜。
【文檔編號】A61F2/02GK104168925SQ201380011027
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月29日
【發(fā)明者】李樹東 申請人:膠原基質(zhì)公司