開口箭在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了開口箭在制備抗腫瘤藥物中的應用，屬于醫(yī)藥【技術領域】。通過MTT法和流式細胞術發(fā)現(xiàn)開口箭能阻滯S-180細胞生長周期，抑制其增殖，誘導腫瘤細胞凋亡。通過EMSA和實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)開口箭能減少NF-κB的表達和抑制NF-κB的活性，對S-180細胞具有抑制作用；開口箭能減少S-180細胞接種的荷瘤小鼠模型瘤體組織內NF-κB的表達，同時還能抑制荷瘤小鼠模型瘤體組織內NF-κB的活性，具有抑制腫瘤生長的作用。通過急性毒性試驗和長期毒性試驗證實開口箭對昆明種小鼠肝腎功能和血糖值無影響，對昆明小鼠的臟器無損傷。表明開口箭具有安全、有效的抗腫瘤作用，可用于制備抗腫瘤藥物。
【專利說明】開口箭在制備抗腫瘤藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術領域】，涉及開口箭在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤、心臟病以及腦血管疾病是21世紀危害人類健康和生命的三大疾病。惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率呈逐年遞增趨勢，關于腫瘤的防治也是近年來國內外研究的重要課題。通過長期大量的臨床實踐得知，傳統(tǒng)的中草藥在抗惡性腫瘤方面具有其獨特療效，通常作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應的特點，能較好的改善腫瘤患者的臨床癥狀、體征，減輕放化療后不良反應，提聞患者免疫力和延長壽命等。在臨床治療中，放化療以及手術治療方式已經是腫瘤治療的基本手段，但存在不良反應大、長期應用易產生耐藥性等問題，中藥治療惡性腫瘤可以減輕患者不良反應，提高患者的免疫力。近年來，國內外的研究機構寄希望于價格低廉、安全性高、不良反應少等的中藥能應用在抗腫瘤方面。
[0003]開口箭錄屬于百合科鈴蘭簇植物，主產三峽庫區(qū)和神農架林區(qū)，長期以來為少數民族民間用藥。取其根莖入藥，味苦，辛，性寒，有毒，具有清熱解毒，祛風除濕，散瘀止痛等功效，主要治療咽喉腫痛、白喉，胃痛，風濕痹痛，跌打損傷，癰腫瘡毒，毒蛇咬傷等。
[0004]NF-κΒ是在成熟B細胞中被發(fā)現(xiàn)的一種核蛋白，因其與B細胞免疫球蛋白上的K B輕鏈基因增強子κ B序列特異結合而得名。NF-κ B在炎癥、腫瘤、哮喘、胃腸道、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病中有廣泛的表達，成為為近20年來研究的重要靶點。NF-κ B蛋白家族包括 Rel (cRel)、p65 (RelA, NF-κ B3)、RelB 和 p50 (NF-κ Bl),p52 (NF-κ B2) 5 個亞單位;其中p65、cRel和RelB分別 含有N端Rel同源區(qū)(RHD)和C端的反式激活結構域(TD)，在RHD的C末端有一個核定位區(qū)域(NLS)，負責與DNA結合、二聚體化和核易位，而TD則與轉錄活化相關。P50和p52只有RHD，缺乏TD，因此二者不能激活基因轉錄，只是作為一種抑制分子而存在，在細胞內二者通常以各自前體P105和plOO存在。兩個亞基形成的二聚體與靶基因上- κ B位點結合調芐基因轉錄，不同的NF-K B 二聚體在選擇結合序列時稍有差異，這是NF-κ B通過不同的二聚體的形式對不同基因的表達進行調節(jié)的一種方式，最常見的NF- κ B 二聚體是p65與p50組成的異二聚體。在靜息狀態(tài)下，NF- κ B與其抑制物(IkB)形成復合體，以無活性形式存在于胞漿中，當細胞受刺激后，NF-κ B 二聚體從細胞質進入細胞核，導致相關基因的轉錄。NF-κ B主要激活途徑因其家族參與主導成員不同分為兩條:經典途徑和旁路路徑。經典途徑主要與RelA-p50有關，在腫瘤壞死因子(TNF-α )、白細胞介素I (IL-1)、病毒、微生物等刺激后激活I κ B激酶復合體(ΙΚΚ)，使其活化將I κ B特定絲氨酸殘基磷酸化，而導致NF- κ B暴露核定位位點，游離的NF- κ B迅速移位至細胞核，與特異性κ B序列結合而誘導一系列相關基因轉錄；旁路途徑主要與RelB-pl05/100有關，在各種因子的刺激下激活IKK，導致plOO磷酸化后被蛋白酶降解，最終引起RelB-p50/p52核轉移并與DNA結合。
[0005]活化的NF-κ B進入到細胞核后，與其靶基因中的啟動子或增強子共有的κ B序列“GGGRNNYYCC”結合從而誘導下游基因的轉錄。NF- κ B調控的下游基因包括TNF、IL-1、C0X2、ΜΜΡ9等促進腫瘤發(fā)生的基因，VEGF, TNF等與腫瘤血管生成有關的基因，ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1等與腫瘤轉移有關的基因，bcl_2、cIAP、TRAF等與腫瘤抗調亡有關的基因。許多證據表明，NF-κ B與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系。NF-κ B的激活不僅存在于造血系統(tǒng)來源的腫瘤細胞中，也存在于實體瘤來源的細胞中，然而在正常的細胞中卻很少發(fā)現(xiàn)有NF- κ B的激活。NF- κ B的激活既存在于腫瘤細胞中，也存在于一些腫瘤組織中如多發(fā)性骨髓瘤、急性髓性白血病、急性淋巴細胞白血病、前列腺癌和乳腺癌。更重要的是，在這些腫瘤標本中抑制NF-κ B的活化會抑制腫瘤細胞的增殖，引起細胞周期的停滯并誘導凋亡，表明NF-kB在腫瘤細胞的增殖存活中起著重要的作用。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于開發(fā)傳統(tǒng)民間用藥開口箭新的用途，提供開口箭在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0007]本發(fā)明的目的還在于提供一種安全、有效的含開口箭抗腫瘤藥物。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):
[0009]MTT法檢測開口箭對S-180細胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)開口箭能夠抑制S-180細胞增殖。流式細胞術檢測S-180細胞DNA含量及其周期發(fā)現(xiàn)開口箭阻滯S-180細胞生長周期，導致細胞形態(tài)的變化，誘導腫瘤細胞凋亡。通過EMSA和實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)開口箭能減少NF- κ B的表達和抑制NF- κ B的活性，對S-180細胞具有抑制作用，且在一定濃度和時間范圍內具有量效；建立荷瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)開口箭能減少S-180細胞接種的荷瘤小鼠模型瘤體組織內NF- κ B的表達，同時還能抑制荷瘤小鼠模型瘤體組織內NF- κ B的活性，具有抑制腫瘤生長的作用。通過EMSA和實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)開口箭能減少NF- κ B的表達和抑制NF- κ B的活性，對S-180細胞具有抑制作用，且在一定濃度和時間范圍內具有量效。開口箭短時間大劑量服用對昆明小鼠肝腎功能和血糖值無影響，對昆明小鼠的臟器組織無病理性損傷。開口箭長期服用對昆明小 鼠的肝腎功能和空腹血糖值亦無影響，對昆明小鼠的臟器組織無病理性損傷。通過急性毒性試驗和長期毒性試驗證實開口箭對昆明種小鼠肝腎功能和血糖值無影響，對昆明小鼠的臟器無損傷。
[0010]上述結果表明開口箭通過抑制NF- K B的活性，降低NF- κ B在瘤體組織的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，具有安全、有效的抗腫瘤作用，可用于制備抗腫瘤藥物。
[0011]一種抗腫瘤藥物，包含開口箭或開口箭提取物。
[0012]所述的開口箭提取物的制備優(yōu)選包括如下步驟:將開口箭或開口箭飲片用水清洗后浸泡，再用蒸餾水進行熬制，將熬制的溶液煎熬濃縮，待濃縮液冷卻后過濾即得到開口箭提取物。
[0013]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下優(yōu)點和效果:本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)開口箭具有抑制腫瘤細胞的功能，并揭示了其抑制腫瘤細胞增殖的靶向機制(開口箭通過抑制NF-κ B的活性，降低NF- κ B在瘤體組織的表達，抑制腫瘤細胞的增殖)。由于開口箭對實驗動物無毒副作用，可開發(fā)成一種安全、有效的抗腫瘤藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】[0014]圖1是開口箭對S-180細胞抑制增殖的時效圖。
[0015]圖2是電鏡下各組實體瘤超微結構圖；其中，A:生理鹽水組(X5000) ;B:CTX組(X4000 ；C:高劑量組(2g/mg，X3000) ；D:中劑量組(lg/mg，X4000) ；E:低劑量組(0.5g/mg, X 4000)ο
[0016]圖3是EMSA檢測S-180細胞NF-κ B活性結果圖；其中，A:突變探針反應組，B:探針反應組，C:空白對照組，D:高劑量組，E:中劑量組，F(xiàn):低劑量組，G:陰性對照組，H:環(huán)磷酰胺組。
[0017]圖4是EMSA檢測S-180細胞接種的荷瘤小鼠腫瘤組織中NF-κ B活性結果圖；其中，A:突變探針反應組，B:探針反應組，C:空白對照組，D:高劑量組，E:中劑量組，F(xiàn):低劑量組，G:陰性對照組，H:環(huán)磷酰胺組。
[0018]圖5是S-180細胞NF-κ B擴增倍數結果圖；其中，A:5_氟尿嘧啶組，B:高劑量組，C:中劑量組，D:低劑量組。
[0019]圖6是S-180細胞接種的荷瘤小鼠腫瘤組織中NF-κ B擴增倍數結果圖；其中，A:環(huán)磷酰胺組，B:高劑量組，C:中劑量組，D:低劑量組。
【具體實施方式】
[0020]下面結合實施例和附圖進一步闡述本發(fā)明，但不應理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0021 ] 實施例1開口箭藥物制備
[0022]稱取開口箭飲片(神農架產區(qū)，渦陽縣源和堂中藥飲片有限責任公司)0.5kg，首先用自來水將開口箭飲片清洗兩遍，再用自來水將其浸泡30min，更換蒸餾水1.5L熬制40~50分鐘，將得到的溶液倒入事先準備的干凈燒杯中，逐漸放置至冷卻，再次往開口箭飲片中加入750mL蒸餾水熬制40~50分鐘，然后將溶液倒入同一個燒杯中冷卻，倒掉藥渣，將兩次所收集的開口箭藥物的溶液放入藥罐中煎熬濃縮至250mL，分煎兩次得濃度為2.0g/mL溶液，冷卻后用無菌紗布過濾兩次，分瓶置4°C保存，使用時可用蒸餾水將其稀釋到0.04g/mL和1.0g/mL,在要進行體內灌胃時提前30min移至室溫。
[0023]實施例2MTT法檢測開口箭對S-180細胞增殖的影響
[0024]取對數生長期的S-180細胞用臺盼藍染色法測定細胞活力:將細胞懸液作適當稀釋，與0.4%的臺盼藍溶液以9:1 (體積比)混勻，取少許溶液滴入清潔計數板，分別計數活細胞和死細胞數，根據活細胞拒染呈無色透明狀，死細胞被染成明顯藍色計算細胞活力:活細胞率(％)=活細胞數/ (活細胞數+死細胞數)X 100%。
[0025]選取活細胞率> 96%的S-180細胞用細胞計數板進行計數,根據細胞數/mL=四大格細胞總數/4X 10000計數細胞數，根據該細胞生長特性將細胞稀釋成4X IOVmL以100 μ L/孔細胞懸 液轉板至96孔板中，周圍36孔用蒸餾水填充以防止蒸發(fā)現(xiàn)象影響測定結果。再將開口箭分別稀釋至0、20、40、80、160、320yg/mL的濃度梯度以100 μ L/孔加入到每孔中混勻，每組設5個復孔,將培養(yǎng)板置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h取出一塊培養(yǎng)板進行測定。測定時試驗孔以20 μ L/孔加入5mg/mLMTT溶液，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育4h，再以150 μ L/孔加入DMSO溶結晶，并置搖床80rpm、IOmin加速結晶的溶解，最后用酶標儀設定波長為570nm測量各孔的吸光值，按照抑瘤率=(對照組值一治療組值)/對照組值X 100% (對照組即5-氟尿嘧啶組，治療組即開口箭組)，計算各組的抑瘤率和IC50值，并進行統(tǒng)計學分析，結果如圖1和表1所示。
[0026]活細胞內線粒體琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的MTT還原為藍紫色的結晶甲臜，該結晶的量與活細胞數成正相關。圖1顯示:從干預時間上看，24h、48h、72h均有不同程度的抑制S-180細胞增殖作用，48h各個濃度的OD值均低于24h，72h的OD值高于48h，與24h比較無明顯規(guī)律性，說明開口箭抑制S-180細胞增殖的最佳時間是給藥后48h。
[0027]根據檢測OD值統(tǒng)計分析顯示，當藥物濃度在0-320 μ g/mL之間，隨著藥物濃度的增加OD值越小，抑瘤率越大，說明開口箭在0-320 μ g/mL之間存在量效關系；各濃度OD值有顯著性差異(P=0.000, P〈0.01)，給藥時間與濃度梯度無明顯統(tǒng)計學意義(P=l.000，P>0.05)，如表1所示。
[0028]表1開口箭對S-180細胞抑制增殖表
【權利要求】
1. 開口箭在制備抗腫瘤藥物中的應用。
2.開口箭提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述的開口箭提取物的制備包括如下步驟:將開口箭或開口箭飲片用水清洗后浸泡，再用蒸餾水進行熬制，將熬制的溶液煎熬濃縮，待濃縮液冷卻后過濾即得到開口箭提取物。
4.一種抗腫瘤藥物，其特征在于包含開口箭。
5.一種抗腫瘤藥物，其特征在于包含開口箭提取物。
【文檔編號】A61K36/896GK103520445SQ201310514604
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權日:2013年10月28日
【發(fā)明者】張瑩雯 申請人:武漢大學