脫水穿心蓮內(nèi)酯的新用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了脫水穿心蓮內(nèi)酯在制備用于抑制與ANO1離子通道蛋白活性相關(guān)的腫瘤細胞所引發(fā)的疾病的藥物中的用途，所述脫水穿心蓮內(nèi)酯可以選擇性抑制腫瘤細胞上的ANO1離子通道蛋白活性，從而阻斷腫瘤細胞的增殖，遷移和侵襲，將其應(yīng)用于制備腫瘤抑制藥物，必將為腫瘤治療提供新的思路。
【專利說明】脫水穿心蓮內(nèi)酯的新用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種天然小分子化合物的新用途，尤其是脫水穿心蓮內(nèi)酯的新用途。【背景技術(shù)】
[0002]大腸癌(Colorectal cancer)是嚴重威脅人類生存的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。近年來，由于我國人民生活方式、飲食結(jié)構(gòu)、環(huán)境等因素的改變，大腸癌的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，在惡性腫瘤發(fā)病率中排第四位，在發(fā)達國家發(fā)病率居惡性腫瘤第二位。在臨床上，大腸癌侵襲和/或轉(zhuǎn)移的發(fā)生是導(dǎo)致患者死亡的重要原因，根據(jù)WHO的統(tǒng)計，被診斷為大腸癌早期階段的患者其五年生存率為百分之九十，但目前因缺乏有效的早期診斷標(biāo)準及抗腫瘤、抗轉(zhuǎn)移的治療靶點，導(dǎo)致早期檢出率低，確診時60%的病例己屬中晚期，腫瘤已經(jīng)發(fā)生了局部或遠處轉(zhuǎn)移，失去了最佳的治療時機，此時手術(shù)的根治性差，生存率低，術(shù)后五年生存率不足30%，因此確定腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能及其相關(guān)因素對判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療、提高生活質(zhì)量具有十分重要的意義。明確腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及蛋白質(zhì)的作用，篩選和鑒定腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物是腫瘤研究的最前沿領(lǐng)域和熱點。
[0003]隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷深入，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)參與了大腸癌的發(fā)生過程，目前己明確的主要有ρ53、ρ16、β-catenin、TGF-β等。
[0004]鈣激活氯離子通道(ΤΜΕΜ16Α/ΑΝ01)位于人11號染色體長臂I區(qū)3帶(llql3)的CCND1-EMS1基因座內(nèi)，編碼與C12orf3、Cllorf25及FLJ34272基因產(chǎn)物同源的8個跨膜蛋白。參與了諸如嗅覺、味覺與視覺的產(chǎn)生與傳導(dǎo)過程，并對心肌興奮性、平滑肌收縮、腺體和上皮分泌及受精過程具有重要生理作用。隨著氯離子通道研究的深入，發(fā)現(xiàn)ANOl表達與許多疾病相關(guān)，如高血壓，哮喘，腹瀉，肺囊性纖維化疾病等。由于離子通道參與細胞的增殖、遷移和凋亡中的作用得到了公認。研究發(fā)現(xiàn)，氯離子通道不僅在細胞遷移過程中發(fā)揮了重要作用，而且還參與細胞形態(tài) 變化過程，并與細胞的侵襲也密切相關(guān)。由于ANOl位于11號染色體長臂I區(qū)3帶，而該區(qū)聚集有很多腫瘤相關(guān)基因，所以ANOl早就引起腫瘤學(xué)家的關(guān)注。Katoh M等通過基因擴增的方法，發(fā)現(xiàn)ANOl基因在食管癌、膀胱癌、乳腺癌組織中的存在；Robert B.West等通過基因矩陣掃描胃腸間質(zhì)瘤的基因譜，發(fā)現(xiàn)基因ANOl的存在而且具有特異性表達。并因此將其命名為DOGl意為轉(zhuǎn)運陰離子通道1，在頭頸部鱗癌中，ANOl的mRNA表達水平比正常組織高17倍左右。
[0005]ANOl在被發(fā)現(xiàn)是鈣激活氯離子通道前有很多個名稱，胃腸道腫瘤間質(zhì)蛋白I(DOGl) ; 口腔腫瘤過表達2 (0RA0V2);腫瘤擴增和過表達序列2 (TA0S2)。從名稱上看，ANOl過表達于某些特定的腫瘤細胞上并與腫瘤相關(guān)聯(lián)。目前ANOl已經(jīng)是診斷胃腸間質(zhì)瘤(ICC)和胰腺癌的最敏感指標(biāo)-生物標(biāo)記。其家族的另兩個成員TMEM16G和TMEM16G被認為與前列腺癌和乳腺癌相關(guān)。在某些特定腫瘤的高表達，提示鈣激活氯離子通道與腫瘤的發(fā)生、凋亡、細胞增殖和遷移相關(guān)。因此ANOl成為治療腫瘤的潛在藥物靶點。
[0006]一些證據(jù)證明ANOl具有非常重要的生理意義，但是目前人們對其確切的病理和生理意義的認識還很有限。其中最主要的原因是目前還缺乏高親和力、選擇性的ANOl抑制劑作為研究工具。尼氟滅酸(NFA)，9-羧酸蒽(9-AC)，茚基氧乙酸，依他尼酸和他莫西芬等雖能夠抑制ANOl通道活性，但需要很高濃度才可以完全抑制劑通道，并且有不理想的副作用。因其缺乏特異性而無法用于ANOl的研究。表明特異性的ANOl離子通道抑制劑對于研究其生理功能以及與其相關(guān)的疾病并揭示其分子藥理學(xué)特性是不可或缺的。
[0007]我國的傳統(tǒng)中醫(yī)藥是中華民族幾千年燦爛文化的瑰寶，它以“標(biāo)本兼治”的獨特理念和神奇的功效而得到人們廣泛的接受。中藥中有效成分含量極其豐富，尤其是小分子化合物更加豐富，多種小分子化合物已經(jīng)被分離、提取、純化和鑒定，并證明對多種靶點有效。最有說服力的是目前廣泛應(yīng)用于臨床的抗瘧疾藥物青蒿素和抗癌中藥小分子紫杉醇。
[0008]現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，爵床科植物穿心蓮葉中分離提取出小分子脫水穿心蓮內(nèi)酯具有抗炎解熱作用，能抑制炎癥時毛細血管通透性的增高和炎性水腫的發(fā)展，并能減少炎性滲出量，臨床用于呼吸道及腸道感染性疾病的治療有較好療效。但對于腫瘤細胞的抑制作用并沒有任何相關(guān)文獻記載。通過對于該脫水穿心蓮內(nèi)酯的深入研究，發(fā)現(xiàn)脫水穿心蓮內(nèi)酯對于其他疾病的治療作用，將具有極大的臨床應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供脫水穿心蓮內(nèi)酯的新用途。
[0010]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0011]脫水穿心蓮內(nèi)酯在制備用于抑制與ANOl離子通道蛋白活性相關(guān)的腫瘤細胞所引發(fā)的疾病的藥物中的用途。
[0012]優(yōu)選的，上述脫水穿心蓮內(nèi)酯在制備大腸癌`制藥物中的用途。
[0013]優(yōu)選的，上述脫水穿心蓮內(nèi)酯在制備結(jié)腸癌抑制藥物中的用途。
[0014]實現(xiàn)上述用途的藥物組合物，包含治療有效量的脫水穿心蓮內(nèi)酯和任選的藥學(xué)可接受的賦形劑。
[0015]上述藥學(xué)可接受的賦形劑可以是藥物制劑領(lǐng)域中任何常規(guī)的賦形劑，特定賦形劑的選擇將取決于用于治療特定患者的給藥方式或疾病類型和狀態(tài)，用于特定給藥模式的合適藥物組合物的制備方法完全在藥物領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。例如，可以作為藥學(xué)可接受的賦形劑包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、載體、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑等。
[0016]上述組合物可以制成滴劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、注射乳劑、注射用無菌粉針等多種形式，上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
[0018]本發(fā)明所述天然小分子化合物脫水穿心蓮內(nèi)酯，以人大腸癌細胞株SW620為研究對象，以分子生物學(xué)、電生理學(xué)及細胞生物學(xué)相關(guān)技術(shù)為手段，經(jīng)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn):(I)天然小分子化合物脫水穿心蓮內(nèi)酯對人大腸癌SW620細胞生長具有抑制作用；(2)人大腸癌細胞株SW620細胞膜上表達鈣激活氯離子通道蛋白(AN01/TMEM16A) ；(3)天然小分子化合物脫水穿心蓮內(nèi)酯特異性抑制ANOl離子通道蛋白的活性；(4)AN01離子通道蛋白參與大腸癌SW620細胞的增殖過程；(5)脫水穿心蓮內(nèi)酯抑制ANOl離子通道蛋白誘導(dǎo)的SW620細胞的增殖、遷移和侵襲；(6)脫水穿心蓮內(nèi)酯通過抑制ANOl誘導(dǎo)的MAPK/ERK信號通路的激活而抑制的細胞增殖與遷移。
[0019]可見，脫水穿心蓮內(nèi)酯可以選擇性抑制腫瘤細胞上的ANOl離子通道蛋白活性，從而阻斷腫瘤細胞的增殖，遷移和侵襲，將其應(yīng)用于制備腫瘤抑制藥物，必將為腫瘤治療提供新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1AN01鈣激活氯離子通道蛋白在SW620細胞上的表達與定位；
[0021]圖2脫水穿心蓮內(nèi)酯(DHDG)特異性抑制SW620細胞的生長；
[0022]圖3脫水穿心蓮內(nèi)酯抑制了 ANOl鈣激活氯離子通道蛋白的功能；
[0023]圖4脫水穿心蓮內(nèi)酯抑制了 SW620細胞增殖并阻斷細胞周期的Gl期；
[0024]圖5干擾ANOl鈣激活氯離子通道蛋白表達后，抑制了 SW620細胞的增殖；
[0025]圖6細胞劃痕實驗中脫水穿心蓮內(nèi)酯抑制了 SW620細胞的遷移；
[0026]圖7Transwell實驗中脫水穿心蓮內(nèi)酯抑制了 SW620細胞的的遷移；
[0027]圖8Matrigel實驗中脫水穿心蓮內(nèi)酯抑制了 SW620細胞的侵襲；
[0028]圖9脫水穿心蓮內(nèi)酯通過抑制ANOl誘導(dǎo)的MAPK/ERK信號通路的激活而抑制的細胞增殖與遷移。
【具體實施方式】
[0029]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進一步的詳細說明。
`[0030]其中，待研究化合物脫水穿心蓮內(nèi)酯購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號:13050531，純度:> 98%，該脫水穿心蓮內(nèi)酯的化學(xué)分子式為C2tlH28O4，分子量332.42，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2A中所示。
[0031]實施例1
[0032]材料與方法
[0033]一、材料
[0034]1.主要試劑
[0035]EDTA (超純級)、NaOH、NaHC03、Na2HP04、KH2HP04、NaCl、KCl、D_Glucose、丙酮酸鈉(BBI)、乙醇、異丙醇、氯仿(北京化工廠)、水飽和酚、DMSO (北京鼎國)、β -巰基乙醇、3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、臺盼藍(Sigma公司)
[0036]谷氨酸胺、膜酶(AMRESC0)、Dulbecco’s Modified Eagle，s Medium-highglucose (DMEM)和F_12Coon’ s (Sigma)、青霉素和鏈霉素(華北制藥)、胎牛血清FBS (GIBCO)、兔抗人ANOl多克隆抗體(Abeam)、Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗、DIPA、β-Tubulin、β-actin、瓊脂糖、Triton X-100、BSA、尼氟滅酸 NFA (Sigma)、核酸分子量標(biāo)準品(XHindIII fragments 和 Φ xl74DNA, NaeIII fragments)購于 Promega 公司
[0037]SuperScript II1、Reverse Transcription System 試劑盒、PCR 反應(yīng)試劑盒、Lipofectamine?2000 (Invitrogen)、PCR 引物合成(上海生工)、DNA marker (北京天根)
[0038]PVDF膜(北京鼎國)、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、SDS、過硫酸銨、TEMED>Protein Molecular Weight Marker、PMSF、_春紅、脫脂奶粉、考馬斯亮蘭 R_250、多聚甲醒、PepstatinA、Leupeptin、Aprotinin (Sigma)、PV-9003Polink_2plus Polymer HRPDetection System For Goat Primary Antibody (北京中衫金橋)[0039]ATP、1noymycin、Calcimycin 和 Carbachol (Sigma)、脫水穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準品(上海同田生物技術(shù)股份有限公司)
[0040]2.主要儀器及數(shù)據(jù)分析和圖像處理軟件[0041 ]I) PTC100PCR 儀(加拿大 MJ Reseach 公司)
[0042]2)光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)
[0043]3)倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)
[0044]4) Hera cel 1150 細胞培養(yǎng)箱(德國 Heraeus 公司)
[0045]5)Heal Force超凈工作臺(上海力申儀器公司)
[0046]6)Microfuge22R 高速冷凍離心機(美國 Beckman Coulter 公司)
[0047]7)熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)
[0048]8) DYY-1I型多用電泳儀(北京六一儀器廠)
[0049]9)Quantity one凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)
[0050]10)TM-250電泳系統(tǒng)(大連捷邁科貿(mào)有限公司)
[0051]11)電熱干燥鼓風(fēng)箱(天津泰斯特公司)
[0052]12) Adobe photoshop 圖形編輯軟件、0rigin7.5、Graphpad prism5> imageJ 作圖統(tǒng)計分析軟件
[0053]13) Fluostar opt ima 酶標(biāo)儀(德國 BMG 公司)
[0054]14)-80°C超低溫冰箱(美國Thermo Forma公司)
[0055]15)恒溫水浴箱(德國Edmund Buhler公司)
[0056]16) ND-1000紫外/可見光分光光度計(美國NanoDrop公司)
[0057]17)DYC_Z22A型電泳槽(北京六一儀器廠)
[0058]18)醫(yī)用微波爐(上海中達醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究所)
[0059]19)膜片鉗(德國HEKA公司EPC9)
[0060]20) AG135 電子天平(瑞士 Mettler Toled 公司)
[0061]21)微電極玻璃管電極(產(chǎn)品號B15024F武漢微探科學(xué)儀器有限公司)
[0062]22)電極拉制儀(MF_900Narishige)
[0063]23)蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司BQ50-1J)
[0064]24)Epics-XL II FACScan (美國 Beckman Coulte)
[0065]3.主要耗材
[0066]I)細胞培養(yǎng)板(皿)(美國Costar公司)
[0067]2) 24 孔 Transwell (pore-8 μ m)(美國 Costar 公司)
[0068]3) 24 孔 Transwell-coated matrigel (pore-8 μ m)(美國 BD 公司)
[0069]二、實驗方法
[0070]1.細胞培養(yǎng)及測試化合物溶液配制
[0071]人大腸癌高轉(zhuǎn)移潛能細胞株SW620和人大腸癌低轉(zhuǎn)移潛能細胞株SW480來自同一親本、遺傳背景一致，購于中國科學(xué)院上海細胞庫。大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞株FRT由美國加州大學(xué)舊金山醫(yī)學(xué)院Verkman.S.Alan教授惠贈。新鮮的小鼠脾臟細胞來源于純系C57/BL6小鼠(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部SPF級實驗動物中心)
[0072]1.1.主要液體和化合物配制:[0073](I)PBS (磷酸鹽緩沖液)液:精確稱取 NaC18.0g, KC10.2g，Na2HPO4.12Η203.49g，KH2PO40.24g，溶于三蒸水中，定容至1000ml，高壓，除菌，分裝，4°C保存。
[0074](2)細胞消化液(0.25%胰蛋白酶):精確稱取胰酶粉末0.25g，加PBS液充分溶解后定容至100ml，0.22 μ m濾器過濾，除菌，分裝，_20°C保存。
[0075]( 3 )化合物溶液配制
[0076]貯液配制:脫水穿心蓮內(nèi)酯和NFA分子量分別為332.42和282.22。不同工作濃度的脫水穿心蓮內(nèi)酯和NFA，使用細胞培養(yǎng)液分別將其貯液進行稀釋即可。細胞培養(yǎng)液中的DMSO濃度〈0.1%即可避免引起細胞毒性。
[0077]脫水穿心蓮內(nèi)酯20mM:稱取脫水穿心蓮內(nèi)酯粉末0.0Olg，溶于150 μ I DMSO中，搖
勻，放4°C保存即可。
[0078]尼氟滅酸(即4)20禮:稱取即4粉末0.0018，溶于20(^1 DMSO中，搖勻，放4°C保
存即可。
[0079]1.2.細胞的培養(yǎng):
[0080]1.2.1細胞復(fù)蘇
[0081]I)實驗前提前將水浴鍋加熱到37°C，無菌操作臺紫外照射20min。
[0082]2)無菌操作臺關(guān)閉紫外，吹風(fēng)5min。取一個`無菌的15ml管，向其中9ml加入不含抗生素的DMEM或者F-12Coon’ s基本培養(yǎng)液。
[0083]3)液氮罐中取出細胞，速速放入37°C在水浴鍋中快速融化后轉(zhuǎn)入已含有基本培養(yǎng)液離心管中，蓋緊封口，1000rpm/min離心5min。
[0084]4)在無菌操作臺中用無菌槍頭棄去上清液，加入Iml完全培養(yǎng)液(10% FBS, 100U青/鏈霉素2mM谷氨酰胺)重懸細胞沉淀，將懸液加入已經(jīng)還有8ml完全培養(yǎng)液的IOcm細胞培養(yǎng)板，37 0C，5%C02孵箱中培養(yǎng)。
[0085]5)培養(yǎng)12到24h后，棄去培養(yǎng)液，加入新鮮的9ml完全培養(yǎng)液(10% FBS, 100U青/鏈霉素2mM谷氨酰胺)繼續(xù)培養(yǎng)。
[0086]1.2.2細胞傳代
[0087]I)在操作臺中吸掉IOcm培養(yǎng)板的培養(yǎng)液，加入無菌8mlPBS，潤洗后吸去PBS。
[0088]2)再用PBS洗一次后，加入500 μ I配置好的0.25%胰酶消化，放入細胞培養(yǎng)箱作用 3min 或 lOmin。
[0089]3)加入Iml的完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)，并用槍頭吹打數(shù)次，使成團的細胞成單個細胞。
[0090]4)取500 μ I細胞懸液轉(zhuǎn)入新IOcm板，加入9ml完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0091]1.2.3細胞凍存
[0092]I)選用對數(shù)生長期細胞，在操作臺中吸掉IOcm培養(yǎng)板的培養(yǎng)液，加入無菌8mlPBS，潤洗后吸去PBS。
[0093]2)再用PBS洗一次后，加入500 μ I配置好的0.25%胰酶消化，放入細胞培養(yǎng)箱作用 3min 或 lOmin。
[0094]3)細胞從培養(yǎng)板上消化下來后，加入Iml的完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)，用槍頭吹打數(shù)次，使成細胞吹成單個細胞。
[0095]4)取500 μ I細胞懸液轉(zhuǎn)入提前加入有500 μ I細胞凍存液(60%基本培養(yǎng)液，20%DMS0, 20%FBS)的無菌凍存管中，充分混合均勻后，先放入4°C 30min，后放入凍存盒中置于-80°C冰箱或液氮中保存。
[0096]2.總RNA的提取及RT-PCR分析
[0097]2.1.1 待 SW620、SW480 及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 FRT-pcDNA3.1-hANOl-EGFP 細胞長滿 IOcm 細胞培養(yǎng)板后棄培養(yǎng)液并加入3ml變性液(表1)中，10分鐘后，分裝到1.5ml離心管中，600 μ I/管。
[0098]表1變性液成分
[0099]
【權(quán)利要求】
1.脫水穿心蓮內(nèi)酯在制備用于抑制與ANOl離子通道蛋白活性相關(guān)的腫瘤細胞所引發(fā)的疾病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫水穿心蓮內(nèi)酯在制備大腸癌抑制藥物中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫水穿心蓮內(nèi)酯在制備結(jié)腸癌抑制藥物中的用途。
4.實現(xiàn)權(quán)利要求1-3之一所述用途的藥物組合物，其特征在于:包含治療有效量的脫水穿心蓮內(nèi)酯和任選的藥學(xué)可接受的賦形劑。
【文檔編號】A61K31/365GK103494803SQ201310497255
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】李麗華, 翁志勇, 胡杰華 申請人:李麗華