一種抗耐藥性的多功能納米粒制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗耐藥性的多功能納米粒制劑及其制備方法，包括以下步驟：將多烯紫杉醇和哌立福新以及共聚物溶于有機溶劑，作為油相，PVA溶液作為水相，在超聲冰浴條件下，將油相滴加到水相中，得到混合乳液，減壓蒸餾除去有機溶劑，離心處理，收集到的納米粒子水洗后復(fù)溶，真空冷凍干燥后得到納米粒制劑。本發(fā)明制備的多功能納米粒制劑具有良好的粒徑、包封率、載藥量；能有效提高細(xì)胞毒性，細(xì)胞攝取量。
【專利說明】一種抗耐藥性的多功能納米粒制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抗耐藥性的多功能納米粒制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]靶向納米給藥系統(tǒng)通?？煞譃橹鲃影邢蚝捅粍影邢蚣{米給藥系統(tǒng)。主動靶向給藥系統(tǒng)研究的重要方向是利用受體與配基的專一性結(jié)合的原理。葉酸(Folate)是主動靶向配基中常用的一種，許多腫瘤細(xì)胞膜表面都有葉酸受體過度表達(dá)。基于這種特殊的作用，可將與葉酸結(jié)合的藥物載體導(dǎo)入這些腫瘤細(xì)胞中。細(xì)胞穿透肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一類短肽，少于30個氨基酸，具有強的穿膜能力，可以將抗腫瘤藥物、多肽、核酸或是納米粒等運送至細(xì)胞內(nèi)。將納米給藥系統(tǒng)與細(xì)胞穿透肽結(jié)合，可以增加細(xì)胞對納米藥物的滲透攝取。
[0003]多烯紫杉醇易溶于有機溶劑，但幾乎不溶于水，為FDA批準(zhǔn)的紫杉烷類抗癌藥物，對乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等均有明顯療效。但是腫瘤細(xì)胞容易對其產(chǎn)生耐藥性，使其應(yīng)用受到了限制。
[0004]PI3K-Akt信號通路在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)血管生成等方面起到重要作用。Akt受抑制后將會抑制大部分下游分子，控制腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移。哌立福新為脂類Akt抑制劑，對前列腺癌、肺癌、胰腺癌的治療效果的臨床試驗正在進(jìn)行中。
[0005]事實上，靶向納米給藥系統(tǒng)進(jìn)入血液后容易被吞噬細(xì)胞吞噬，吞噬作用則是通過血液中親脂性的調(diào)理蛋白介導(dǎo)的，將納米粒直徑控制在300nm以下，并用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行表面修飾，可減少吞噬細(xì)胞對納米粒的捕獲，起到“長循環(huán)”的功能。另外，聚乳酸乙醇酸(PLGA)是納米粒制備的常用載體之一，具有良好的生物相容性，且無毒可生物降解，通過美國FDA認(rèn)證并被收錄美國藥典，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種抗耐藥性的多功能納米粒制劑及其制備方法。本發(fā)明通過乳化蒸發(fā)法制備得到多功能納米粒制劑，其制備方法簡單，得到的多功能納米粒制劑中包載有多烯紫杉醇和哌立福新，具有良好的包封率、載藥量和穩(wěn)定性。
[0007]本發(fā)明涉及一種抗耐藥性的多功能納米粒的制備方法，具體步驟如下:
[0008](I)將多烯紫杉醇、哌立福新以及多功能納米粒載體溶解于有機溶劑中，得到油相；
[0009](2)配制PVA溶液，作為水相；
[0010](3)在超聲冰浴條件下，將油相滴加到水相中，得到混合液；
[0011](4)上述混合液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，離心除去游離藥物，得到溶液，將溶液低溫凍干，即得到抗耐藥性的多功能納米粒制劑。
[0012]本發(fā)明中，步驟(1)中所述的多功能納米粒載體選自所述多功能納米粒載體選自mPEG-PLGA、mPEG-PLGA-R7和mPEG-PLGA-Fol中的一種或幾種；優(yōu)選的，多功能納米粒載體為PEG-PLGA-Fol和PEG-PLGA-R7混合物。所述PLGA是分子量為8000~15000的長鏈高分子聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，其結(jié)構(gòu)中乳酸與羥基乙酸的摩爾比為50:50。
[0013]本發(fā)明中，步驟(1)中所述的多烯紫杉醇、哌立福新與所述多功能納米粒載體的重量比為(1.0-1.5):(1.0-1.5):10o
[0014]本發(fā)明中，步驟(1)中所述的有機溶劑為二氯甲烷。
[0015]本發(fā)明中，步驟(2)中所述的PVA溶液的重量體積百分比濃度為0.6~2%。
[0016]本發(fā)明中，步驟(3)中進(jìn)行超聲時，將所述溶有包合物凍干粉的內(nèi)水相置于超聲波破碎儀的超聲探頭下，超聲波破碎儀的工作功率為200~400W。
[0017]本發(fā)明中，步驟(4)中進(jìn)行離心時，離心轉(zhuǎn)速為12000~50000rpm，離心時間為30分鐘。
[0018]本發(fā)明涉及一種抗耐藥性的多功能納米粒制劑，其為包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒子，呈圓球形，粒徑分布集中，大小分布均勻；粒徑為(141.6±7.02) nm,包封率為(92.35±6.31)%，載藥量為(1.57±0.19)%。
[0019]本發(fā)明提供的上述納米粒的應(yīng)用方法為:通過將所述納米粒的溶液放置于透析袋后置于釋放介質(zhì)中，經(jīng)恒溫?fù)u床震蕩實現(xiàn)藥物釋放。所述透析袋截留分子量為3000-10000Da ;所述恒溫為37±0.5°C ;所述釋放介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液(PBS)。
[0020]本發(fā)明的有益效果在于:其制備方法簡單，得到的多功能納米粒制劑中包載有多烯紫杉醇和哌立福新，具有良好的抗耐藥性、包封率、載藥量，是一種理想的藥物載體。與多烯紫杉醇溶液以及非修飾的mPEG-PLGA納米粒相比，包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒具有良好的細(xì)胞毒性，在體內(nèi)外表現(xiàn)出良好的性能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ] 圖1為實施例1得到的包載多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA納米粒的粒徑分布圖。
[0022]圖2是實施例1得到的包載多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA納米粒的透射電鏡圖。
[0023]圖3是各種包載多烯紫杉醇和哌立福新的納米粒在磷酸鹽緩沖液中的釋放行為結(jié)果圖；
[0024]圖4是各種包載多烯紫杉醇和哌立福新的納米粒對MCF-7 (A)和MCF-7/ADR⑶細(xì)胞的毒性。
[0025]圖5是MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞對各種包載多烯紫杉醇和哌立福新的納米粒的攝取圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0027]原料來源
[0028]多烯紫杉醇購自上海北卡醫(yī)藥技術(shù)有限公司(純度>99%)；
[0029]哌立福新購自上海瀚香生物科技有限公司(純度>98%)；
[0030]mPEG-PLGA共聚物購自濟南岱罡生物科技有限公司(化學(xué)純)；
[0031]mPEG-PLGA-Fol 共聚物和 mPEG_PLGA-R7 共聚物參考文獻(xiàn)(Zhang Y, WangRR, WuJ, Shen Q.Characterization and evaluation of self-microemulsifyingsustained-release pellet formulation of puerarin for oral delivery[J].Int.)制備;
[0032]其它原料為普通市售商品。
[0033]實施例1
[0034]本實施例涉及一種包載多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA納米粒制劑的制備方法。
[0035]包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒制劑的制備，包括以下步驟:
[0036](I)多烯紫杉醇2mg，哌立福新2mg，mPEG_PLGA共聚物20mg溶于二氯甲烷中，作為油相；`
[0037](2)將PVA配成重量體積濃度為1%的溶液，作為水相；
[0038](3)在超聲冰浴條件下，將油相滴加到水相中，得到混合液；
[0039](4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去步驟(3)得到的混合液中的有機溶劑；
[0040](5)將步驟(4)得到的溶液高速離心(12000~50000rpm) 30min,除去游離藥物，得到帶有淡藍(lán)色乳光的納米粒溶液；
[0041](6)將納米粒溶液低溫凍干，即得到包載多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA納米粒制劑NP I。
[0042]實施例2
[0043]本實施例涉及一種包載多烯紫杉醇和哌立福新的PEG-PLGA-Fol納米粒制劑的制備方法；
[0044]包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒制劑的制備，包括以下步驟:
[0045](I)多烯紫杉醇2mg,哌立福新2mg,mPEG-PLGA-FoI共聚物20mg溶于二氯甲燒中，作為油相；
[0046](2)將PVA配成重量體積濃度為1%的溶液，作為水相；
[0047](3)在超聲冰浴條件下，將油相滴加到水相中，得到混合液；
[0048](4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去步驟(3)得到的混合液中的有機溶劑；
[0049](5)將步驟(4)得到的溶液高速離心(12000~50000rpm) 30min,除去游離藥物，得到帶有淡藍(lán)色乳光的納米粒溶液；
[0050](6)將納米粒溶液低溫凍干，即得到圓形的包載多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA-Fol 納米粒制劑 NP2。
[0051]實施例3
[0052]本實施例涉及一種包載多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA-R7納米粒制劑的制備方法；
[0053]包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒制劑的制備,包括以下步驟:
[0054](I)多烯紫杉醇2mg,哌立福新2mg, mPEG-PLGA-R7共聚物20mg溶于二氯甲燒中，作為油相；
[0055](2)將PVA配成重量體積濃度為1%的溶液，作為水相；
[0056](3)在超聲冰浴條件下，將油相滴加到水相中，得到混合液；
[0057](4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去步驟(3)得到的混合液中的有機溶劑；
[0058](5)將步驟(4)得到的溶液高速離心(12000~50000rpm) 30min,除去游離藥物，得到帶有淡藍(lán)色乳光的納米粒溶液；
[0059](6)將納米粒溶液低溫凍干，即得到圓形的包載多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA-R7 納米粒制劑 NP3。
[0060]實施例4
[0061]本實施例涉及一種包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒制劑的制備方法;
[0062]包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒制劑的制備，包括以下步驟:
[0063](1)多烯紫杉醇 2mg,哌立福新 2mg,mPEG-PLGA-FoI 共聚物 IOmg,mPEG-PLGA-R7 共聚物IOmg溶于二氯甲烷中，作為油相；
[0064](2)將PVA配成重量體積濃度為1%的溶液，作為水相；
[0065](3)在超聲冰浴條件下，將油相滴加到水相中，得到混合液；
[0066](4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去步驟(3)得到的混合液中的有機溶劑；
[0067](5)將步驟(4)得到的溶液高速離心(12000~50000rpm) 30min,除去游離藥物，得到帶有淡藍(lán)色乳光的納米粒溶液；
[0068](6)將納米粒溶液低溫凍干，即得到圓形的包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒制劑NP4。
[0069]實施例(I~4)得到的納米粒制劑，用透射電鏡檢測，其透射電鏡結(jié)果如圖2所示，呈圓形。經(jīng)激光粒徑儀測定，其粒徑為(141.6±7.02)nm，用高效液相色譜(HPLC)測定，其載藥量為(1.57±0.19)%，包封率為(92.35±6.31)%。
[0070]實施例5
[0071 ] 包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒的釋放試驗
[0072]稱取取多烯紫杉醇Img和哌立福新lmg(DTX+perifosine_Sol)、按照本發(fā)明制備方法獲得的理論含藥量為Img的包載多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA納米粒(DTX+perifosine-mPEG-PLGA-NPs)、理論含藥量為Img的包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒(DTX+perifosine-mPEG-PLGA-Fol/R7-NPs)，加2毫升PBS緩沖液配成溶液，置于透析袋(3000-5000Da)，于體積為50ml釋放介質(zhì)(PBS緩沖液)中，37°C恒溫?fù)u床震蕩，定時取樣用高效液相色譜測定釋放介質(zhì)中的DTX，計算釋放百分率，釋放曲線如圖3所示。從圖3的釋放曲線中可以看出，呈平穩(wěn)釋放特征，不存在明顯的突釋。
[0073]實施例6
[0074]包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒的細(xì)胞毒性實驗
[0075]將不同濃度的NPl、NP2、NP3、NP4、DTX+perifosine溶液與人乳腺癌細(xì)胞共同孵化24h，然后用MTT法檢測細(xì)胞存活率。存活率結(jié)果如圖4所示。[0076]從圖4可以看出，在相同濃度下，四種納米粒制劑的細(xì)胞毒性均強于原藥溶液，且包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒制劑NP4具有最低的細(xì)胞存活率，表現(xiàn)出最強的細(xì)胞毒作用?？芍?，包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒制劑具有良好的細(xì)胞毒性。
[0077]實施例7
[0078]包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒的細(xì)胞攝取實驗
[0079]取納米粒制劑NP1、NP2、NP3、NP4及原藥用培養(yǎng)基溶解，配成相同濃度的納米粒溶液。孵育MCF-7細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞Ih后，用胰酶消化，流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞攝取的結(jié)果如圖5所示。
[0080]從圖5可以看出，MCF-7/ADR細(xì)胞因為其耐藥性，對納米粒的攝取明顯低于MCF-7細(xì)胞。兩種細(xì)胞對多功能納米粒制劑的攝取量高于其他納米粒制劑。
[0081]實驗結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞對原藥溶液的攝取遠(yuǎn)低于對各種納米粒制劑的攝取，其中對NP1、NP2、NP3、NP4的攝取量依次增加。另外，MCF-7/ADR細(xì)胞因為其耐藥性，對原藥溶液的攝取明顯低于MCF-7細(xì)胞，但是對NP1、NP2、NP3、NP4的攝取僅比MCF-7細(xì)胞略低?？芍?，納米粒制劑能夠增加細(xì)胞對藥物的攝取，包載多烯紫杉醇和哌立福新的納米粒具有一定的抗耐藥性。
[0082]以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種抗耐藥性的多功能納米粒制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將多烯紫杉醇、哌立福新以及多功能納米粒載體溶解于有機溶劑中，得到油相； (2)配制PVA溶液，作為水相； (3)在超聲冰浴條件下，將油相滴加到水相中，得到混合液； (4)上述混合液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，離心除去游離藥物，得到溶液，將溶液低溫凍干，即得到抗耐藥性的多功能納米粒制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，所述多烯紫杉醇、哌立福新與多功能納米粒載體的重量比為(1.0~1.5): (1.0~1.5) IlO0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，所述多功能納米粒載體選自mPEG-PLGA、mPEG-PLGA-R7和mPEG-PLGA_Fol中的一種或幾種；所述PLGA是分子量為8000~15000的長鏈高分子聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，其結(jié)構(gòu)中乳酸與羥基乙酸的摩爾比為 50:50。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所 述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，所述多功能納米粒載體為 mPEG-PLGA-Fol 和 mPEG_PLGA-R7 的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述有機溶劑為二氯甲燒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述PVA溶液的重量體積百分比濃度為0.6~2%ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)中進(jìn)行超聲時，將所述水相置于超聲波破碎儀的超聲探頭下，超聲波破碎儀的工作功率為200~400W。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)中，所述離心時轉(zhuǎn)速為12000~50000rpm，離心時間為30分鐘。
9.一種抗耐藥性的多功能納米粒制劑，其特征在于:其為包載多烯紫杉醇和哌立福新的多功能納米粒子，呈圓球形，粒徑分布集中，大小分布均勻；粒徑為(141.6±7.02) nm,包封率為(92.35±6.31)%，載藥量為(1.57±0.19)%。
【文檔編號】A61K31/337GK103494829SQ201310455018
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】沈琦, 卜祥媛, 陳晶晶 申請人:上海交通大學(xué)