具有抑制呼吸道病毒感染的活性的肽及其應(yīng)用和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有抑制呼吸道病毒感染的活性的肽及其應(yīng)用和制備方法。該肽是通過(guò)化學(xué)途徑或基因工程合成的，其具有能夠與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合的功能性結(jié)構(gòu)域，并且具有抑制呼吸道病毒感染的活性。因此，本發(fā)明的肽能夠用于阻斷呼吸道病毒感染靶細(xì)胞，以及用于預(yù)防或治療呼吸道病毒感染，還可以用于開(kāi)發(fā)新的針對(duì)呼吸道病毒的預(yù)防性和治療性藥物。本發(fā)明還涉及分離的、編碼該肽的DNA，含有與啟動(dòng)子有效連接的該DNA的表達(dá)載體，以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，用于篩選能夠抑制呼吸道病毒感染的肽的試劑盒及篩選方法。本發(fā)明還揭示了該肽抑制呼吸道病毒感染的機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的具有廣譜抗病毒活性的預(yù)防劑和治療劑提供了理論依據(jù)。
【專利說(shuō)明】具有抑制呼吸道病毒感染的活性的肽及其應(yīng)用和制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗病毒預(yù)防和治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及具有抑制呼吸道病毒感染的活性的肽，應(yīng)用該肽來(lái)阻斷呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的方法，應(yīng)用該肽來(lái)制備預(yù)防或治療呼吸道病毒感染用的藥物，以及該肽的制備方法，包含該肽的組合物，分離的編碼該肽的DNA，含有與啟動(dòng)子有效連接的該DNA的表達(dá)載體，以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，用于篩選能夠抑制呼吸道病毒感染的肽的試劑盒及篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽(AMP)是宿主自身固有的防衛(wèi)分子，幾乎所有的多細(xì)胞植物和動(dòng)物都會(huì)產(chǎn)生抗菌妝(參見(jiàn)文獻(xiàn) “Zasloff, M.Antimicrobial peptides of multicellularorganisms.Nature415, 389-395 (2002) ”)。它們構(gòu)成先天免疫系統(tǒng)的第一道防線，能夠在感染早期階段迅速清除侵入的病原體，并且還能夠促進(jìn)全身獲得性免疫應(yīng)答(systemicadaptive immune response)(參見(jiàn)文獻(xiàn) “Rohrl, J.，Huber, Β.，Koehl, G.Ε.，Geissler, Ε.K.&Hehlgans, Τ.Mouse beta-defensinl4(Defbl4)promotes tumor growth by inducingangiogenesis in a CCR6_dependent manner.J Immunol 188,4931-4939(2012)” 和“Yang，D.，et al.Beta-defensins: linking innate and adaptive immunity throughdendritic and T cell CCR6.Science286, 525-528 (1999) ”)。大多數(shù) AMP 為兩親性的陽(yáng)離子分子，這使得其具有能夠與通常帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜相結(jié)合的能力。目前已經(jīng)確認(rèn)了幾百種AMP，并且已經(jīng)根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)特征和/或氨基酸組成進(jìn)行了分類。組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)和防衛(wèi)素(defensin,也稱為防御素)是脊椎動(dòng)物中的兩個(gè)AMP家族，為主要由白細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的小分子(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Lehrer，R.1.Primatedefensins.Nat RevMicrobiol2, 727-738 (2004) ” 和 “Selsted, Μ.Ε.&0uellette, A.J.Mammalian defensins in the antimicrobial immune res ponse.Nat Tmmunol
6,551-557 (2005) ”)。組織蛋白酶抑制素的前體包含保守的氨基末端“catheIin (其名稱源自組織蛋白酶L抑制劑(Cathepsin L inhibitor))”結(jié)構(gòu)域(長(zhǎng)度為約100個(gè)氨基酸殘基)。經(jīng)過(guò)處理的組織蛋白酶抑制素肽的長(zhǎng)度范圍為12至80個(gè)氨基酸殘基，其具有或沒(méi)有a-螺旋、折疊或其它類型的三級(jí)結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Lehrer，R.1.&Ganz，T.Cathelicidins: a family of endogenous antimicrobial peptides.Curr OpinHematol9, 18-22(2002)” 和“Zanetti, M.Cathelicidins, multifunctional peptides ofthe innate immunity.J Leukoc Biol75, 39-48 (2004) ”)。防衛(wèi)素為小的(2_6kD)富含半胱氨酸的AMP，其主要形成β_折疊結(jié)構(gòu)，并通過(guò)三個(gè)(極少數(shù)為四個(gè))保守的分子內(nèi)二硫鍵而得以穩(wěn)定。就脊椎動(dòng)物而言，根據(jù)防衛(wèi)素的二硫鍵的模式(disulfide pattern),將防衛(wèi)素進(jìn)一步分為α-防衛(wèi)素、防衛(wèi)素和Θ-防衛(wèi)素三個(gè)亞家族(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Lehrer，R.1.Primate defensins.Nat Rev Microbiol2, 727-738 (2004) ”)。這些肽通常具有抗微生物(包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、真菌和病毒)感染的廣譜的非特異性活性。AMP抵抗細(xì)菌的各種作用模式包括:破壞細(xì)胞膜完整性(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Shai，Y.Mechanism of thebinding,insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes byalpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides.Biochim Biophys Actal462，55-70 (1999)” 和“Yang，L.，Weiss，T.M.，Lehrer，R.1.&Huang，H.W.Crystallization of antimicrobial pores in membranes:magaininand protegrin.Biophys J79，2002-2009 (2000) ”)、削弱細(xì)胞核和蛋白質(zhì)的合成、抑制蛋白質(zhì)折疊、干擾細(xì)胞壁生物合成途徑及膜的生物靶向作用(參見(jiàn)文獻(xiàn)“BiOgden，K.A.Antimicrobial peptides:pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?NatRev Microbiol3, 238-250 (2005) ”、“Hale，J.D.&Hancock，R.E.Alternative mechanismsof action of cationic antimicrobial peptides on bacteria.Expert RevAnti Infect Ther5, 951-959 (2007)” 和 “Srinivas，N.，et al.Peptidomimeticantibiotics target outer—membrane biogenesis in Pseudomonas aeruginosa.Science327, 1010-1013(2010)”)。然而，到目前為止，AMP的抗病毒機(jī)制仍然在很大程度上尚未被人們所了解。
[0003]防衛(wèi)素已顯示出具有多種特性，包括抗細(xì)菌(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Nizet，V.，etal.1nnate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterialinfection.Nature414, 454-457 (2001)” 和 “Mygind，P.H.，et al.Plectasin is apeptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus.Nature437，975-980 (2005) ”)、抗病毒(參見(jiàn)文獻(xiàn) “Gong，Τ.，et al.Recombinant mousebeta_defensin2inhibits infection by influenza A virus by blocking its entry.Arch Viroll55，491-498(2010) ”和“Leikina，E.，et al.Carbohydrate-binding moleculesinhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins.NatImmunol6, 995-1001 (2005) ”)和抗真菌(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Krishnakumari，V.，Rangarajj N.&Nagaraj, R.Antifungal activities of human beta-defensins HBD-1to HBD_3and theirC-terminal analogs Phdl to Phd3.Antimicrob Agents Chemother53，256-260 (2009)，，和“Jiang，Y.，et al.Antifungal activity of recombinant mouse beta-defensin3.LettAppl Microbiol50, 468-47`3(2010) ”)。
[0004]天然的防衛(wèi)素由先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)在感染應(yīng)答(例如病毒感染應(yīng)答)中產(chǎn)生(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Zasloff，M.Antimicrobial peptides of multicellularorganisms.Nature415, 389-395 (2002) ”)。流感病毒感染會(huì)誘導(dǎo)小鼠上呼吸道中的鼠β-防衛(wèi)素-3和β -防衛(wèi)素-4的基因表達(dá)(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Chong，K.Τ.，Thangavel，R.R.&Tang，X.Enhanced expression of murine beta-defensins(MBD-1，-2，-3，and-4) in upper and lower airway mucosa of influenza virus infected mice.Virology380, 136-143(2008)”)。HIV-1Tat 能夠誘導(dǎo)人 B 細(xì)胞中的人 β -防衛(wèi)素-2 表達(dá)(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Ju，S.M.，et al.Extracellular HIV-1Tat induces humanbeta-defensin_2production via NF-kappaB/AP-1dependent pathways in human Bcells.Mol Cells33，335-341 (2012) ”)。
[0005]在感染早期階段，誘導(dǎo)產(chǎn)生的防衛(wèi)素在保護(hù)機(jī)體免受侵入的微生物危害中發(fā)揮重要的作用(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Zasloff，M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms.Nature415, 389-395 (2002) ,?)o人a -防衛(wèi)素-1能夠抑制流感病毒復(fù)制，這可能是由于該防衛(wèi)素減弱了蛋白激酶C的激活(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Salvatore，M.，et al.alpha-Defensininhibits influenza virus replication by cell-mediated mechanism(s).J InfectDisl96，835-843 (2007)”)。小鼠β -防衛(wèi)素_2通過(guò)阻止病毒進(jìn)入靶細(xì)胞來(lái)抑制病毒感染(參見(jiàn)文獻(xiàn) “Gong，T.，et al.Recombinant mouse beta_defensin2inhibits infectionby influenza A virus by blocking its entry.Arch Virol 155，491-498 (2010)，，)。Θ -防衛(wèi)素I'etrocyliM (RC2)通過(guò)使膜糖蛋白交聯(lián)來(lái)抑制病毒_細(xì)胞膜融合(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Leikina，E.，et al.Carbohydrate-binding molecules inhibit viral fusion and entryby crosslinking membrane glycoproteins.Nat Immunol6，995-1001 (2005)，，)。獲得性免疫系統(tǒng)的效應(yīng)物(例如抗體和T淋巴細(xì)胞)具有高度的病原體特異性。與之形成對(duì)比的是，先天免疫系統(tǒng)的效應(yīng)物(例如防衛(wèi)素)通常對(duì)微生物具有廣譜的活性。防衛(wèi)素這些獨(dú)特的性質(zhì)使得它們成為開(kāi)發(fā)耐藥性機(jī)率低的廣譜抗病毒藥物的有力候選物。對(duì)于抗病毒策略而言，可選擇以下各項(xiàng)作為開(kāi)發(fā)抗病毒藥物的靶標(biāo):抑制病毒進(jìn)入、抑制病毒RNA釋放、抑制病毒復(fù)制和釋放。
[0006]針對(duì)常見(jiàn)的呼吸道病毒家族(例如引起突發(fā)(新發(fā))感染的正粘病毒、副粘病毒和冠狀病毒)的特異性抗病毒劑或者還未能得到，或者由于這些病毒基因的快速變異而易產(chǎn)生抗藥性(參見(jiàn)文獻(xiàn) “Cheng，V.C.，S.K.Lauj P.C.Woo, and K.Y.Yuen.2007.Severe acute respiratory syndrome coronavirus as an agent of emerging andreemerging infection.Clin Microbiol Rev20:660-694.”、“Cheng，V.C.，K.K.To, H.Tsej 1.F.Hung, and Κ.Y.Yuen.2012.Two years after pandemic influenza A/2009/HlNl:what have we learned?Clin Microbiol Rev25:223-263.” 和“Wong，S.S.，andΚ.Y.Yuen.2008.Antiviral therapy for respiratory tract infections.Respirology13:950-971.”)。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種來(lái)自于小鼠或人的防衛(wèi)素在體外和體內(nèi)都具有抗病毒活性(參見(jiàn)文 獻(xiàn) “Jiang，Y.，Y.Wangj Y.Kuangj B.Wang, W.Li, T.Gong, Z.Jiang, D.Yang，and Μ.L1.2009.Expression of mouse beta-defensin_3in MDCK cells and itsant1-1nfluenza-virus activity.Arch Virol154:639-647.”、“Quinones-Mateu，M.E.，M.M.Ledermanj Z.Feng, B.Chakrabortyj J.Weber, H.R.Rangel, M.L.Marottaj M.Mirzaj B.Jiang, P.Kiser, K.Medvikj S.F.Siegj and A.Weinberg.2003.Human epithelialbeta_defensins2and3inhibit HIV-1replication.Aids17:F39_48.” 和 “Sun，L.，C.M.Finnegan,T.Kish—Catalone，R.Blumenthalj P.Garzino—Demo，G.M.La TerraMaggiorej S.Berronej C.Kleinmanj Z.Wuj S.Abdelwahabj W.Lu，and A.Garzino-Dem0.2005.Human beta-defensins suppress human immunodeficiency virus infection!potentialrole in mucosal protection.J Virol79:14318-14329.”)，但這些防衛(wèi)素在進(jìn)行藥物開(kāi)發(fā)時(shí)仍受到了多種因素的阻礙，如效果欠佳、副作用大、以及缺乏適合商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)有效的方法等。
[0007]因此，迫切需要一種安全、有效并且廣譜的抗病毒藥物來(lái)抗擊新發(fā)病毒性呼吸道疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題[0009]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有抑制呼吸道病毒感染的活性的肽。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供合成該肽的方法、包含該肽的組合物、以及分離的編碼該肽的DNA、含有與啟動(dòng)子有效連接的該DNA的表達(dá)載體、以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供阻斷呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的方法、以及用于預(yù)防或治療呼吸道病毒感染的藥物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于篩選能夠抑制呼吸道病毒感染的肽的試劑盒及篩選方法。
[0010]解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案
[0011]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了:
[0012](I) 一種通過(guò)化學(xué)途徑或基因工程合成的肽，其特征在于，所述肽具有能夠與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合的功能性結(jié)構(gòu)域，并且所述肽具有抑制呼吸道病毒感染的活性。
[0013](2)根據(jù)(I)所述的肽，還具有能夠抑制細(xì)胞晚期內(nèi)體酸化的功能。
[0014](3)根據(jù)(I)或(2)所述的肽，其中所述肽具有5個(gè)或更多個(gè)堿性氨基酸；優(yōu)選地，在所述肽的N端或C端具有2個(gè)或更多個(gè)堿性氨基酸；更優(yōu)選地，在所述肽的N端或C端具有3個(gè)或更多個(gè)堿性氨基酸。
[0015](4)根據(jù)(I)至(3)中任意一項(xiàng)所述的肽，其中所述的肽具有4個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸。
[0016](5)根據(jù)(I)至(4)中任意一項(xiàng)所述的肽，其具有以下(a)或(b)所述的氨基酸序列:
[0017](a)具有序列表SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列；或
[0018](b)具有在(a)所述氨基酸序列中替換、刪除、和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。
[0019](6)根據(jù)(5)所述的肽，其中所述的(b)具有與(a)所述氨基酸序列至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%的一致性。
[0020](7)根據(jù)(5)所述的肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 10所示、如序列表SEQID NO: 13所示或者如序列表SEQ ID NO: 17所示。
[0021](8)根據(jù)(3)所述的肽，其中所述N端包括自該肽的N末端氨基酸起10個(gè)氨基酸以內(nèi)的區(qū)段；所述C端包括自該肽的C末端氨基酸起倒數(shù)10個(gè)氨基酸以內(nèi)的區(qū)段。
[0022](9)根據(jù)(8)所述的肽，其中所述C端具有兩個(gè)半胱氨酸并具有所述堿性氨基酸。
[0023](10)根據(jù)(9)所述的肽，其中所述C端具有10個(gè)氨基酸并具有如下氨基酸組成:
[0024]堿性氨基酸-中性氨基酸-堿性氨基酸-中性氨基酸-堿性氨基酸-半胱氨酸-半胱氨酸-堿性氨基酸-中性氨基酸-堿性氨基酸-自由羧基。
[0025](11)根據(jù)(I)- (10)中任意一項(xiàng)所述的肽，其中所述肽源自人或小鼠；更優(yōu)選地，所述肽源自小鼠β-防衛(wèi)素_4。
[0026](12)根據(jù)(I) - (11)中任意一項(xiàng)所述的肽，其中所述呼吸道病毒選自流感病毒和冠狀病毒；所述流感病毒包括流感病毒H1、Η3、Η5和Η7亞型，所述冠狀病毒包括SARS-CoV和 MERS-CoV。
[0027](13) 一種組合物，其包含:
[0028]根據(jù)(I) - (12)中任意一項(xiàng)所述的肽；以及
[0029]可藥用的輔料。[0030](14) 一種阻斷呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的方法，所述方法包括:
[0031]在含有所述靶細(xì)胞和所述呼吸道病毒的體系中，將(I) - (12)中任意一項(xiàng)所述的肽與所述病毒接觸并與所述病毒結(jié)合；
[0032]所述的肽抑制病毒RNA從所述靶細(xì)胞的晚期內(nèi)體中釋放，從而阻斷呼吸道病毒感染該靶細(xì)胞；
[0033]所述呼吸道病毒選自流感病毒和冠狀病毒；所述流感病毒包括流感病毒Hl、H3、H5和H7亞型，所述冠狀病毒包括SARS-CoV和MERS-CoV。
[0034](15)根據(jù)(14)所述的方法，其中所述的肽與所述病毒的結(jié)合包括所述的肽與所述病毒的表面糖蛋白的結(jié)合；并且所述的肽通過(guò)抑制所述晚期內(nèi)體中的PH值的降低來(lái)抑制所述病毒RNA的釋放。
[0035](16)根據(jù)(I) - (12)中任意一項(xiàng)所述的肽在制備用于預(yù)防或治療呼吸道病毒感染的藥物中的用途。
[0036](17) 一種制備根據(jù)(I) - (12)中任意一項(xiàng)所述的肽的方法，包括:通過(guò)化學(xué)途徑或基因工程來(lái)合成所述的肽。
[0037](18) 一種分離的、編碼根據(jù)(I) - (12)中任意一項(xiàng)所述的肽的DNA。
[0038](19) 一種表達(dá)載體，其含有與啟動(dòng)子有效連接的根據(jù)(18)所述的DNA。
[0039](20) 一種宿主細(xì)胞，其含有(19)所述的表達(dá)載體。
[0040](21)—種用于篩選能`夠抑制呼吸道病毒感染的肽的試劑盒，包括:陽(yáng)性對(duì)照，該陽(yáng)性對(duì)照為根據(jù)(I) - (12)中任意一項(xiàng)所述的肽；靶細(xì)胞；以及呼吸道病毒。
[0041](22)根據(jù)(21)所述的試劑盒，還包括細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0042](23)根據(jù)(21)或(22)所述的試劑盒，還包括陰性對(duì)照或空白對(duì)照。
[0043](24)根據(jù)(21)- (23)中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述呼吸道病毒選自流感病毒和冠狀病毒；所述流感病毒包括流感病毒H1、H3、H5和H7亞型，所述冠狀病毒包括SARS-CoV 和 MERS-CoV。
[0044](25 )根據(jù)(21)_(24 )中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述祀細(xì)胞選自Madin-Darby狗腎細(xì)胞(MDCK，ATCC N0.CCL-34)、恒河猴胚腎細(xì)胞(FRhK_4，ATCC N0.CRL-1688)和非洲綠猴腎 E6 細(xì)胞(Vero-E6, ATCC N0.CRL-1586)0
[0045](26) 一種能夠抑制呼吸道病毒感染的肽的篩選方法，包括如下步驟:
[0046]a)提供一種分離的或隨機(jī)合成的候選肽；
[0047]b)提供一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，該陽(yáng)性對(duì)照為根據(jù)(I) - (12)中任意一項(xiàng)所述的肽；
[0048]c)將所述候選肽和陽(yáng)性對(duì)照分別與呼吸道病毒接觸；
[0049]d)用與所述候選肽和陽(yáng)性對(duì)照接觸后的所述呼吸道病毒感染靶細(xì)胞；
[0050]e)評(píng)價(jià)所述候選肽和陽(yáng)性對(duì)照抑制所述呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的能力；
[0051]f)挑選出抑制能力等于或高于所述陽(yáng)性對(duì)照的候選肽。
[0052]本發(fā)明的技術(shù)效果
[0053]本發(fā)明提供了能夠抑制多種呼吸道病毒感染的肽，并且揭示了所述肽抑制呼吸道病毒感染的機(jī)制。由于所述肽具有能夠與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合的功能性結(jié)構(gòu)域，所以，所述肽能夠與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合，進(jìn)而經(jīng)內(nèi)吞作用而被引入到細(xì)胞內(nèi)體中。由于所述肽富含堿性氨基酸，所以其能夠抑制晚期內(nèi)體中PH值降低，從而阻斷病毒-內(nèi)體膜融合，使病毒不能解體并釋放出RNA。因此，本發(fā)明的肽顯示出有效的防御呼吸道病毒(例如流感病毒和冠狀病毒的各種亞型)感染的活性，并且能夠用于阻斷呼吸道病毒感染靶細(xì)胞，以及用于預(yù)防或治療呼吸道病毒感染。本發(fā)明所揭示的這類肽抑制呼吸道病毒感染的機(jī)制為開(kāi)發(fā)新的具有廣譜抗病毒活性的預(yù)防劑和治療劑提供了理論支持，為研制所述預(yù)防劑和治療劑鋪平了道路。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0054]以下通過(guò)實(shí)例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明。所述附圖包括:
[0055]圖1示出重組小鼠β-防衛(wèi)素-4 (rmBD4)的構(gòu)建、表達(dá)和純化。其中，(A)示出通過(guò)OPTIMIZER將小鼠β-防衛(wèi)素-4 (mBD4)基因的原始密碼子優(yōu)化為大腸桿菌(E.coli)偏好的密碼子。(B)示出根據(jù)優(yōu)化的序列，設(shè)計(jì)了六對(duì)寡核苷酸以用于通過(guò)PCR來(lái)合成rmBD4基因。標(biāo)有下劃線的核苷酸示出了 KpnI和XhoI的識(shí)別位點(diǎn)。(C)示出通過(guò)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析表達(dá)和純化的β-防衛(wèi)素_4融合蛋白Trx-rmBD4 (Trx-0-D_4)。在該分析中，首先利用12%(w/v)的SDS-PAGE使樣品中的蛋白質(zhì)分離，并且利用考馬斯(Coomassie)藍(lán)溶液染色使其視覺(jué)可見(jiàn)；將凝膠上的并列的分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法，利用1:2000兔抗-11^04抗體(得自中國(guó)Max Biotechnology C0.Ltd.)作為第一抗體，利用1:3000辣根過(guò)氧化物酶稱連(HRP-)的山羊抗兔抗體(Dako, Denmark)作為第二抗體進(jìn)行檢測(cè)。(D)示出用16%(w/v)的三(輕甲基)甲基甘氨酸(tricine)凝膠電泳分析純化的Trx-β _D_4、經(jīng)消化的Trx-β -D-4、以及純化的rmBD4 (即圖中所示的回收的β_?_4)。
[0056]圖2示出肽的抗病毒活性和細(xì)胞毒性的體外評(píng)價(jià)。其中，(A)示出利用MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的空斑測(cè)定，對(duì)在30mM磷酸鹽緩沖液(PB)和MEM中的來(lái)源于mBD4的11種短肽的抗病毒活性進(jìn)行篩選。(B)示出用空斑測(cè)定法檢測(cè)在PB中不同濃度的P9的抗病毒效果。(C)示出用四唑鎗的比色分析(MTT)對(duì)P9、smBD4和rmBD4的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)。
[0057]圖3示出在病毒致死攻擊小鼠模型中，P9的預(yù)防和治療效果的評(píng)價(jià)。其中，(A)示出在病毒致死攻擊之前鼻內(nèi)(1.η.)接種P9或rmBD4 (50 μ g/小鼠)的小鼠的存活率。(B)示出在病毒致死攻擊4小時(shí)之后利用鼻內(nèi)接種P9或rmBD4 (50 μ g/小鼠)進(jìn)行治療的小鼠的存活率。(C)示出在病毒致死攻擊4小時(shí)后腹膜內(nèi)(1.p.)注射所示劑量的P9(200或400 μ g/小鼠)的小鼠的存活率。利用GraphPad Prism5分析存活率的統(tǒng)計(jì)顯著性(9只小鼠/組)，并且示出P值。
[0058]圖4示出用P9或rmBD4預(yù)防和治療的小鼠的肺組織中的病毒載量和病理學(xué)改變的檢測(cè)結(jié)果。其中，(A)示出利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)接受預(yù)防性處理(預(yù)防)的小鼠、接受鼻內(nèi)接種治療(1.η.治療)的小鼠以及接受腹膜內(nèi)注射治療(1.p.治療)的小鼠的肺組織中的病毒RNA拷貝；用來(lái)自五只小鼠的結(jié)果的平均值+SD示出數(shù)據(jù)，*表示用雙尾Student’st-檢驗(yàn)進(jìn)行分析 時(shí)P〈0.05。(B)示出還通過(guò)空斑測(cè)定法檢測(cè)了感染性病毒在小鼠肺組織中的效價(jià)；結(jié)果用五只小鼠的平均值+SD示出，*表示用雙尾Student’ s t_檢驗(yàn)進(jìn)行分析時(shí)P〈0.05。(C)示出利用H&E染色檢測(cè)小鼠肺組織的組織病理學(xué)改變。示出了取自經(jīng)P9 (預(yù)防、1.n.治療或1.p.治療)或rmBD4 (預(yù)防、1.n.治療)處理過(guò)的小鼠、未經(jīng)處理的小鼠(未處理)、以及未經(jīng)感染小鼠(正常)的肺組織的代表性組織學(xué)切片(原始放大倍數(shù)為100倍)。[0059]圖5示出P9通過(guò)與病毒反應(yīng)來(lái)抑制病毒感染MDCK細(xì)胞。其中，(A) - (C)示出利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)在所示出的各感染后時(shí)間點(diǎn)所收集的感染細(xì)胞中的病毒RNA拷貝。(D)- (F)示出利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)在所示出的各感染后時(shí)間點(diǎn)所收集的培養(yǎng)上清中的病毒RNA拷貝。(G)- (I)示出通過(guò)空斑測(cè)定法檢測(cè)在所示出的各感染后時(shí)間點(diǎn)所收集的培養(yǎng)上清中的病毒效價(jià)。上述實(shí)驗(yàn)中包括未經(jīng)處理的病毒對(duì)照(即圖中所示的VC)。結(jié)果用三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)平均值+SD示出，*表示用雙尾Student’s t_檢驗(yàn)進(jìn)行分析時(shí)Ρ〈0.05。
[0060]圖6示出Ρ9與病毒顆粒和病毒表面蛋白血凝素(HA)結(jié)合。其中，(A)示出利用共聚焦顯微鏡拍攝的代表性熒光圖像(原始放大倍數(shù)為400倍)，結(jié)果表明Ρ9與病毒結(jié)合而不與細(xì)胞結(jié)合。(B)示出蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果表明Ρ9與病毒表面糖蛋白HA結(jié)合但不與神經(jīng)氨酸酶(NA)結(jié)合。(C)示出還用ELISA檢測(cè)了 Ρ9與HA和NA的結(jié)合親和性。結(jié)果證明Ρ9與HA結(jié)合但不與NA結(jié)合。
[0061]圖7示出Ρ9不抑制病毒-受體的結(jié)合以及內(nèi)吞作用，但阻斷病毒RNA從晚期內(nèi)體中的釋放。其中，(A)和(B)示出用共聚焦顯微鏡拍攝的代表性熒光圖像(原始放大倍數(shù)為400倍)；(A)結(jié)果表明Ρ9不能阻斷病毒與細(xì)胞膜受體的結(jié)合及內(nèi)吞作用；(B)示出感染之后2小時(shí)的時(shí)候病毒(綠色，見(jiàn)(B)左側(cè)圖灰點(diǎn))與Ρ9 (紅色，見(jiàn)(B)中間圖灰點(diǎn))的共定位(橙色，見(jiàn)(B)右側(cè)圖灰點(diǎn))。(C)示出用未經(jīng)處理的病毒感染MDCK細(xì)胞(圖中記為VC)，或者用經(jīng)Ρ9預(yù)處理的病毒感染MDCK細(xì)胞(圖中記為Ρ9 )，在示出的時(shí)間點(diǎn)收集經(jīng)感染的細(xì)胞，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)病毒RNA拷貝。結(jié)果用三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土SD示出。
[0062]圖8示出Ρ9抑制晚期內(nèi)體中pH降低從而阻斷病毒RNA釋放至被感染的細(xì)胞中。其中，(A)示出用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)在示出的時(shí)間點(diǎn)所收集的細(xì)胞樣品中的病毒RNA拷貝的結(jié)果，結(jié)果顯示，P9的抑制效果與晚期內(nèi)體抑制劑(NH4Cl)的效果相似。(B)示出用共聚焦顯微鏡拍攝的內(nèi)體酸化檢測(cè)結(jié)果。白色箭頭指出病毒的位置(綠色，見(jiàn)(B)左下圖灰點(diǎn))和與其相應(yīng)的內(nèi)體酸化(紅色，見(jiàn)(B)左上圖灰點(diǎn))。經(jīng)P9預(yù)處理的病毒感染的細(xì)胞中未見(jiàn)內(nèi)體酸化(右上圖)，而可見(jiàn)內(nèi)體中的病毒(綠色，見(jiàn)(B)右下圖灰點(diǎn))。
[0063]圖9示出P9中的堿性氨基酸在抑制病毒感染中起到關(guān)鍵作用。(A)示出用ELISA檢測(cè)標(biāo)明的肽在所示濃度Ug)下與病毒蛋白HA結(jié)合的親和性，所述肽包括P9的C端的I至3個(gè)堿性氨基酸被中性或酸性氨基酸替換的P9類似肽(P9-S1、P9-S2和P9-S3)、在P9的N端添加了 3個(gè)酸性氨基酸的P9類似肽(P9-ac1-l)、以及在P9的N端添加了 3個(gè)堿性氨基酸的P9類似肽(P9-KHR)(見(jiàn)下文表3)。用牛血清白蛋白作為陰性對(duì)照(NC)。(B)示出利用血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HAI)檢測(cè)所述肽對(duì)病毒HA蛋白的血細(xì)胞凝集作用的抑制活性。(C)示出用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)在MDCK細(xì)胞中P9類似肽的抗病毒效果的結(jié)果。
[0064]圖10示出在體外檢測(cè)P9對(duì)多種呼吸道病毒感染的抗病毒效果。用虛線示出50%抑制濃度(IC5tl),結(jié)果用三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均土SD示出。其中，(A)示出利用空斑測(cè)定法檢測(cè)P9對(duì)不同亞型的甲型流感病毒感染的抗病毒效果。(B)示出利用空斑測(cè)定法檢測(cè)P9對(duì)SARS-CoV和MERS-CoV感染的抗病毒效果。
【具體實(shí)施方式】
[0065]本發(fā)明提供了一種通過(guò)化學(xué)途徑或基因工程合成的肽，所述肽具有能夠與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合的功能性結(jié)構(gòu)域，并且所述肽具有抑制呼吸道病毒感染的活性。
[0066]例如，當(dāng)所述呼吸道病毒為流感病毒(如H1、H3、H5和H7亞型)時(shí)，本發(fā)明的肽與所述病毒的表面糖蛋白HA結(jié)合；當(dāng)所述呼吸道病毒為冠狀病毒(如SARS-CoV和MERS-CoV)時(shí)，本發(fā)明的肽與所述病毒的表面糖蛋白S蛋白(spike protein)結(jié)合。
[0067]由于所述肽具有能夠與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合的功能性結(jié)構(gòu)域，所以，所述肽能夠與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合，進(jìn)而經(jīng)內(nèi)吞作用被引入到細(xì)胞內(nèi)體中，從而發(fā)揮其抑制呼吸道病毒感染的活性。
[0068]優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的肽還具有能夠抑制細(xì)胞晚期內(nèi)體酸化的功能。具體而言，所述肽能夠抑制晚期內(nèi)體中的PH值降低，從而阻斷病毒-內(nèi)體膜融合，使病毒不能解體和釋放出RNA。
[0069]優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的肽具有5個(gè)或更多個(gè)(例如小于或等于18個(gè)、17個(gè)、16個(gè)、15個(gè)、14個(gè)、13個(gè)、12個(gè)、11個(gè)、10個(gè)、9個(gè)、8個(gè)、7個(gè)、6個(gè))堿性氨基酸；優(yōu)選地，在所述肽的N端或C端具有2個(gè)或更多個(gè)(例如小于或等于12個(gè)、11個(gè)、10個(gè)、9個(gè)、8個(gè)、7個(gè)、6個(gè)、5個(gè)、4個(gè)、3個(gè))堿性氨基酸；更優(yōu)選地，在所述肽的N端或C端具有3個(gè)或更多個(gè)(例如小于或等于12個(gè)、11個(gè)、10個(gè)、9個(gè)、8個(gè)、7個(gè)、6個(gè)、5個(gè)、4個(gè))堿性氨基酸。
[0070]還優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的肽具有4個(gè)或更多個(gè)(例如小于或等于10個(gè)、9個(gè)、8個(gè)、7個(gè)、6個(gè)、5個(gè))半胱氨酸，優(yōu)選具有4-6個(gè)半胱氨酸。
[0071]優(yōu)選的是，在本發(fā)明中，所述肽的所述N端包括自該肽的N末端氨基酸起10個(gè)氨基酸以內(nèi)的區(qū)段；所述C端包括自該肽的C末端氨基酸起倒數(shù)10個(gè)氨基酸以內(nèi)的區(qū)段。
[0072]優(yōu)選的是，所述C端具有兩個(gè)半胱氨酸并富含堿性氨基酸。其中，“富含堿性氨基酸”是指在所述肽的C端具有2個(gè)或更多個(gè)(例如小于或等于12個(gè)、11個(gè)、10個(gè)、9個(gè)、8個(gè)、7個(gè)、6個(gè)、5個(gè)、4個(gè)、3個(gè))堿性氨基酸，優(yōu)選具有3-6個(gè)堿性氨基酸。
[0073]更優(yōu)選的是，所述C端具有10個(gè)氨基酸并具有如下氨基酸組成:堿性氨基酸-中性氨基酸-堿性氨基酸-中性氨基酸-堿性氨基酸-半胱氨酸-半胱氨酸-堿性氨基酸-中性氨基酸-堿性氨基酸-自由羧基。其中，位于C末端的所述“自由羧基”是該末端堿性氨基酸的竣基。
[0074]優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的肽具有以下(a)或(b)所述的氨基酸序列:
[0075]Ca)具有序列表SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列；或
[0076](b)具有在(a)所述氨基酸序列中替換、刪除、和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。
[0077]序列表SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列包含所述的與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合的功能性結(jié)構(gòu)域，并且在C端具有兩個(gè)半胱氨酸并富含堿性氨基酸。具有序列表SEQID NO: 10所示的氨基酸序列的肽能夠與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合，具有能夠抑制細(xì)胞晚期內(nèi)體酸化的功能，能夠抑制呼吸道病毒的感染。
[0078](b)所述的肽可以是在(a)所述氨基酸序列中替換、刪除、和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的，只要不顯著影響所述肽抑制呼吸道病毒感染的活性即可。優(yōu)選的是，在通過(guò)所述替換、刪除、和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的氨基酸序列中，堿性氨基酸的數(shù)目不變或增加。優(yōu)選的是，所述的(b)具有與(a)所述氨基酸序列至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、還優(yōu)選至少97%的一致性。[0079]還優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 10所示、如序列表SEQ ID NO: 13所示或者如序列表SEQ ID NO: 17所示。如上文所述，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 10所示的肽能夠與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合，具有能夠抑制細(xì)胞晚期內(nèi)體酸化的功能，能夠抑制呼吸道病毒的感染。如序列表SEQ ID NO: 13所示的肽是將序列表SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的C端的I個(gè)堿性氨基酸K替換為N而得到的。研究發(fā)現(xiàn)，這樣的替換并不影響所述肽與呼吸道病毒表面糖蛋白結(jié)合的親和性，并且不會(huì)顯著影響所述肽的抗呼吸道病毒感染的效果。如序列表SEQ ID NO: 17所示的肽是在序列表SEQID NO: 10所示的氨基酸序列的N端添加3個(gè)堿性氨基酸K、H和R而得到的。研究發(fā)現(xiàn)，這樣的添加不會(huì)影響所述肽與呼吸道病毒表面糖蛋白結(jié)合的親和性，并且也不會(huì)影響所述肽的抗呼吸道病毒感染的效果。
[0080]優(yōu)選的是，本發(fā)明的肽是通過(guò)基因工程獲得的(如重組肽)或者是通過(guò)化學(xué)合成方法獲得的。優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的肽來(lái)源于小鼠或人；更優(yōu)選的是，所述肽來(lái)源于小鼠β-防衛(wèi)素-4 (mBD4)。
[0081]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明所述的肽中的任意一種或多種、以及可藥用的輔料。
[0082]本發(fā)明所述的肽在所述組合物中的含量視具體應(yīng)用而定，可以在5-500 μ g/ml的范圍內(nèi)，優(yōu)選在20-300 μ g/ml的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在50-200 μ g/ml的范圍內(nèi)。
[0083]可用于本發(fā)明中的可藥用的輔料為本領(lǐng)域通常所用的那些?？梢愿鶕?jù)實(shí)際應(yīng)用的需要或所采用的具體劑型來(lái)選擇合適的輔料，例如可以為參考文獻(xiàn)“厲保秋主編，《多肽藥物研究與開(kāi)發(fā)》，第四章‘多肽藥物制劑研究’，第82-100頁(yè)，人民衛(wèi)生出版社，2011年7月”中披露的那些。可藥用的 輔料以其常規(guī)用量用于本發(fā)明的組合物中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用的需要來(lái)確定合適的用量。
[0084]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種用于阻斷呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的方法，所述方法包括:
[0085]在含有所述靶細(xì)胞和所述呼吸道病毒的體系中，將根據(jù)本發(fā)明所述的肽中的任意一種與所述病毒接觸并與所述病毒結(jié)合；以及
[0086]所述的肽抑制病毒RNA從所述靶細(xì)胞的晚期內(nèi)體中釋放，從而阻斷呼吸道病毒感染該靶細(xì)胞。
[0087]其中，所述呼吸道病毒選自流感病毒和冠狀病毒；所述流感病毒包括流感病毒H1、H3、H5和H7亞型，所述冠狀病毒包括SARS-CoV和MERS-CoV。
[0088]優(yōu)選的是，所述的肽與所述病毒的結(jié)合包括所述的肽與所述病毒的表面糖蛋白的結(jié)合；并且所述的肽通過(guò)抑制所述晚期內(nèi)體中的PH值的降低來(lái)抑制所述病毒RNA的釋放，由此發(fā)揮阻斷呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的作用。
[0089]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述用于阻斷呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的方法是在體內(nèi)或體外實(shí)施的。
[0090]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了根據(jù)本發(fā)明所述的肽在制備用于預(yù)防或治療呼吸道病毒感染的藥物中的用途。所述藥物的劑型可以為噴霧劑、注射劑(如注射液、凍干粉針劑)、口服劑等。
[0091]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種用于對(duì)感染了呼吸道病毒的對(duì)象或者對(duì)具有呼吸道病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象進(jìn)行處理(即治療或預(yù)防)的方法，其包括對(duì)所述對(duì)象施用有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的肽中的任意一種或多種。
[0092]在用于對(duì)感染了呼吸道病毒的對(duì)象進(jìn)行治療時(shí)，本發(fā)明所述肽的施用劑量為治療有效量。例如，治療時(shí)所述施用劑量(以所用的本發(fā)明的肽的總重量計(jì))可以在l_40mg/kg體重/天的范圍內(nèi)，優(yōu)選在2-20mg/kg體重/天的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在2.5-10mg/kg體重/天的范圍內(nèi)。
[0093]在用于對(duì)具有呼吸道病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象進(jìn)行預(yù)防處理時(shí)，本發(fā)明所述肽的施用劑量為預(yù)防有效量。例如，預(yù)防時(shí)所述施用劑量(以所用的本發(fā)明的肽的總重量計(jì))可以在0.l-40mg/kg體重/天的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.5-20mg/kg體重/天的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在1-1Omg/kg體重/天的范圍內(nèi)。
[0094]可以采取鼻內(nèi)接種(例如噴霧)或靜脈(例如腹膜內(nèi))注射的方式施用本發(fā)明所述的肽。
[0095]本申請(qǐng)中所述的呼吸道病毒優(yōu)選包括流感病毒和冠狀病毒。更優(yōu)選的是，所述流感病毒包括流感病毒H1、H3、H5和H7亞型，例如HlNl、H3N2、H5N1、H7N7和H7N9。所述冠狀病毒優(yōu)選包括SARS-CoV、MERS-CoV。
[0096]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種用于制備本發(fā)明所述肽的方法，包括通過(guò)化學(xué)方法合成、或者采用生物學(xué)方法(即基因工程)合成。
[0097]可采用本領(lǐng)域的一般過(guò)程，通過(guò)化學(xué)方法、或者采用生物學(xué)方法合成所需的肽。例如，通過(guò)化學(xué)方法合成所需的肽可以通過(guò)使組成目標(biāo)肽的各個(gè)氨基酸依次通過(guò)化學(xué)反應(yīng)連接，從而得到所需的肽。采用生物學(xué)方法合成所需的肽例如可以包括以下步驟:利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增編碼所需的肽的DNA ;將該DNA亞克隆至表達(dá)載體中；將含有該DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化至真核或原核宿主細(xì)胞中，從而表達(dá)合成所需的肽。
`[0098]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種分離的、編碼任意一種根據(jù)本發(fā)明所述肽的DNA。
[0099]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種表達(dá)載體，其含有與啟動(dòng)子有效連接的根據(jù)本發(fā)明所述的DNA。
[0100]在本發(fā)明中，“表達(dá)載體”是指能夠指導(dǎo)其有效連接的基因的表達(dá)的載體。通過(guò)將啟動(dòng)子序列有效連接至根據(jù)本發(fā)明所述的DNA，該啟動(dòng)子序列可指導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明所述的相應(yīng)的肽的表達(dá)。通常，基因工程技術(shù)中所用的表達(dá)載體可以為質(zhì)粒的形式，但本發(fā)明也可以包括表達(dá)載體的其它已知形式。
[0101]當(dāng)啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)編碼本發(fā)明所述肽的DNA表達(dá)為RNA時(shí)，該啟動(dòng)子和所述DNA即被“有效連接”。所述啟動(dòng)子可以為基因工程領(lǐng)域中常用的啟動(dòng)子。
[0102]本發(fā)明的表達(dá)載體還可包含其它的序列，如還可以包含終止序列，其能夠用于提高信息水平并使從構(gòu)建體到其它序列的通讀最小化。另外，表達(dá)載體還可以具有選擇性標(biāo)記，例如抗生素抗性基因的形式，從而能夠使攜帶這些載體的細(xì)胞被篩選出來(lái)。
[0103]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)本發(fā)明所述的表達(dá)載體。
[0104]本文所用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指已經(jīng)引入了根據(jù)本發(fā)明所述的表達(dá)載體的細(xì)胞。該細(xì)胞例如可以為原核細(xì)胞，其可用于例如快速產(chǎn)生大量的本發(fā)明的表達(dá)載體。
[0105]可以用本發(fā)明所述的表達(dá)載體瞬時(shí)或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意技術(shù)實(shí)現(xiàn)，所述技術(shù)包括但不限于:標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、磷酸鈣共沉淀或電穿孔。
[0106]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種用于篩選能夠抑制呼吸道病毒感染的肽的試劑盒，包括:陽(yáng)性對(duì)照，該陽(yáng)性對(duì)照為本發(fā)明所述的肽中的任意一種；靶細(xì)胞；以及呼吸道病毒。
[0107]優(yōu)選的是，所述試劑盒還包括細(xì)胞培養(yǎng)基。更優(yōu)選的是，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照或空白對(duì)照。所述陰性對(duì)照或空白對(duì)照為不能抑制所述呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的肽。
[0108]所述靶細(xì)胞是要被所述呼吸道病毒感染的細(xì)胞，其可選自Madin-Darby狗腎細(xì)胞(MDCK, ATCC N0.CCL-34)、恒河猴胚腎細(xì)胞(FRhK-4，ATCC N0.CRL-1688)和非洲綠猴腎 E6細(xì)胞(Vero-E6，ATCC N0.CRL-1586)。所述的呼吸道病毒可選自流感病毒和冠狀病毒。所述流感病毒優(yōu)選包括流感病毒H1、H3、H5和H7亞型。所述冠狀病毒優(yōu)選包括SARS-CoV和MERS-CoV。
[0109]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種能夠抑制呼吸道病毒感染的肽的篩選方法，包括如下步驟:
[0110]a)提供一種分離的或隨機(jī)合成的候選肽；
[0111]b)提供一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，該陽(yáng)性對(duì)照為本發(fā)明所述的肽中的任意一種；
[0112]c)將所述候選肽和陽(yáng)性對(duì)照分別與呼吸道病毒接觸；
[0113]d)用與所述候選 肽和陽(yáng)性對(duì)照接觸后的所述呼吸道病毒感染靶細(xì)胞；
[0114]e)評(píng)價(jià)所述候選肽和陽(yáng)性對(duì)照抑制所述呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的能力；
[0115]f)挑選出抑制能力等于或高于所述陽(yáng)性對(duì)照的候選肽。
[0116]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述能夠抑制呼吸道病毒感染的肽的篩選方法是在體內(nèi)或體外實(shí)施的。在下文中通過(guò)實(shí)例并參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。以下描述公開(kāi)了本發(fā)明的目的、特征和各個(gè)方面，或者使它們更為清楚。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下文只是對(duì)示例性實(shí)施方案的描述，其并非旨在限制本發(fā)明的更廣泛的方面，這些更廣泛的方面體現(xiàn)在示例性結(jié)構(gòu)中。
[0117]材料和方法
[0118]病毒和細(xì)胞培養(yǎng)
[0119]在Madin-Darby狗腎(MDCK，ATCC N0.CCL-34)細(xì)胞中培養(yǎng)甲型流感病毒株高致病性小鼠適應(yīng)性突變株A/Hong Kong/415742Md/2009 (HlNl)(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Zheng, B.，etal.D225G mutation in hemagglutinin of pandemic influenza HlNl(2009)virusenhances virulence in mice.Exp Biol Med (Maywood) 235，981-988 (2010)，，)、A/Hong Kong/8/68 (H3N2) (ATCC N0.VR-544)、A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)(參見(jiàn)文獻(xiàn) Chan MC, et al.Proinflammatory cytokine responses induced by influenzaA(H5N1)viruses in primary human alveolar and bronchial epithelial cells.Respir Res.2005Novll; 6:135.)、A/Netherlands/219/2003 (H7N7)(參見(jiàn)文獻(xiàn) FouchierRA, et al.Avian influenza A virus(H7N7)associated with human conjunctivitisand a fatal case of acute respiratory distress syndrome.Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOl:1356-1361.2004.)和 A/Anhui/1/2013 (H7N9)(參見(jiàn)文獻(xiàn) Gao R, etal.Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9)virus.N Engl JMed.368 (20): 1888-97.May2013.)，并且通過(guò)空斑測(cè)定法和TCID5tl檢驗(yàn)來(lái)確定效價(jià)(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Zheng, B.J.，et al.Delayed antiviral plus immunomodulator treatment stillreduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5Nlvirus.Proc Natl Acad Sci U S A105, 8091-8096 (2008) ”)。在恒河猴胚腎細(xì)胞(FRhK-4，ATCCN0.CRL-1688)中培養(yǎng)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SRAS-CoV)株HKU39849 (參見(jiàn)文獻(xiàn)“Peiris JS, et al.Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratorysyndrome.Lancet.361 (9366): 1319-25.Apr2003.”)，以及在非洲綠猴腎 E6 (Vero-E6, ATCCN0.CRL-1586)細(xì)胞中培養(yǎng)中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)株hCoV_EMC/2012(由鹿特丹伊拉斯姆斯大學(xué)的Ron Fouchier博士提供)，并且通過(guò)空斑測(cè)定法和TCID5tl檢驗(yàn)來(lái)確定它們的效價(jià)(參見(jiàn)文獻(xiàn) “Zhong, N.S.，et al.Epidemiology and cause of severeacute respiratory syndrome (SARS) in Guangdong, People’s Republic of China, inFebruary, 2003.Lancet362, 1353-1358 (2003)，，)。
[0120]重組小鼠防衛(wèi)素-4的克隆、表達(dá)和純化[0121]基于OPTIMIZER，將小鼠β -防衛(wèi)素_4(mBD4)的密碼子優(yōu)化為大腸桿菌(E.coli)偏好的密碼子(圖 1A)(參見(jiàn)文獻(xiàn) “Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A.&Garcia_Vallve, S.0PTIMIZER:a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences.NucleicAcids Res35，W126-131 (2007)”)。利用6對(duì)寡核苷酸(圖1B)，通過(guò)PCR合成產(chǎn)生mBD4的基因片段。將經(jīng)密碼子優(yōu)化的基因克隆至PCR2.1載體(InVitr0gen，USA)中，之后通過(guò)KpnI和XhoI位點(diǎn)亞克隆至PET32a(+) (Novagen，USA)中。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)中以表達(dá)硫氧還蛋白-防衛(wèi)素-4融合蛋白(Trx-β -D-4)。通過(guò)簡(jiǎn)單的滲透壓休克處理(參見(jiàn)文獻(xiàn)“McCoy, J.&Lavallie, Ε.Expression and purification of thioredoxin fusionproteins.Curr Protoc Mol Biol Chapterl6, Unitl618 (2001) ”)使 Trx-β _D_4 從大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中釋放出來(lái)，并且通過(guò)AKTA-FPLC (英國(guó)GE Healthcare公司)，按照制造商的說(shuō)明，利用His Trap FF柱子進(jìn)行進(jìn)一步純化(圖1C)。利用IU腸激酶(Merck，USA)消化80 μ g Trx- β -D-4以釋放出重組小鼠β _防衛(wèi)素_4(rmBD4,或者簡(jiǎn)稱為β-?_4)。利用快流速SP-瓊脂糖凝膠(Sp sepharose Fast Flow, GE Healthcare),按照制造商的說(shuō)明，通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜回收β-?-4。利用ro-10柱子(GE Healthcare)，將純化的β _D_4脫鹽至25mM HEPES 緩沖液(ρΗ7.4)中(圖 1D)。
[0122]肽設(shè)計(jì)以及抗病毒效果評(píng)價(jià)
[0123]如表1所示，設(shè)計(jì)了全長(zhǎng)mBD4 (smBD4)和來(lái)源于mBD4的短肽，并且由上海默悉生物科技有限公司(Mocell Biotech Limited)進(jìn)行了化學(xué)合成和確認(rèn)。在低鹽緩沖液(即，含有24.6mM Na2HPO4和5.6mM KH2PO4的30mM磷酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱PB)，pH7.4 (參見(jiàn)文獻(xiàn)uGong, T., et al.Recombinant mouse beta_defensin2inhibits infection by influenzaA virus by blocking its entry.Arch Viroll55, 491-498 (2010) ”)中和高鹽細(xì)胞培養(yǎng)液MEM(Invitrogen, USA)中初步評(píng)價(jià)所述短肽、smBD4和rmBD4的抗病毒效果。在PB或MEM中，分別將所述肽(25 μ g/ml)與HlNl病毒(50PFU/孔)預(yù)混合，并且在室溫下孵育I小時(shí)。利用經(jīng)肽預(yù)處理的病毒感染MDCK細(xì)胞，利用空斑測(cè)定法來(lái)測(cè)定所述肽的抗病毒活性(參見(jiàn)文獻(xiàn)“Sui, H.Y.，et al.Small interfering RNA targeting m2 gene induces effective andlong term inhibition of influenza A virus replication.PLoS 0ne4, e5671 (2009)，，)。
[0124]表1.smBD4和來(lái)源于mBD4的短肽
【權(quán)利要求】
1.一種通過(guò)化學(xué)途徑或基因工程合成的肽，其特征在于，所述肽具有能夠與呼吸道病毒的表面糖蛋白結(jié)合的功能性結(jié)構(gòu)域，并且所述肽具有抑制呼吸道病毒感染的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的肽，還具有能夠抑制細(xì)胞晚期內(nèi)體酸化的功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽具有5個(gè)或更多個(gè)堿性氨基酸；優(yōu)選地，在所述肽的N端或C端具有2個(gè)或更多個(gè)堿性氨基酸；更優(yōu)選地，在所述肽的N端或C端具有3個(gè)或更多個(gè)堿性氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中所述的肽具有4個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其具有以下(a)或(b)所述的氨基酸序列: (a)具有序列表SEQID NO: 10所示的氨基酸序列；或 (b)具有在(a)所述氨基酸序列中替換、刪除、和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肽，其中所述的(b)具有與(a)所述氨基酸序列至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%的一致性。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肽，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO: 10所示、如序列表SEQID NO: 13所示或者如序列表SEQ ID NO: 17所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中所述N端包括自該肽的N末端氨基酸起10個(gè)氨基酸以內(nèi)的區(qū)段；所述C端包括自該肽的C末端氨基酸起倒數(shù)10個(gè)氨基酸以內(nèi)的區(qū)段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肽，其中所述C端具有兩個(gè)半胱氨酸并具有所述堿性氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的肽，其中所述C端具有10個(gè)氨基酸并具有如下氨基酸組成: 堿性氨基酸-中性氨基酸-堿性氨基酸-中性氨基酸-堿性氨基酸-半胱氨酸-半胱氨酸-堿性氨基酸-中性氨基酸-堿性氨基酸-自由羧基。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽源自人或小鼠；更優(yōu)選地，所述肽源自小鼠β-防衛(wèi)素-4。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述呼吸道病毒選自流感病毒和冠狀病毒；所述流感病毒包括流感病毒H1、Η3、Η5和Η7亞型，所述冠狀病毒包括SARS-CoV和MERS-CoV。
13.一種組合物，其包含: 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的肽；以及可藥用的輔料。
14.一種阻斷呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的方法，所述方法包括: 在含有所述靶細(xì)胞和所述呼吸道病毒的體系中，將根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的肽與所述病毒接觸并與所述病毒結(jié)合； 所述的肽抑制病毒RNA從所述靶細(xì)胞的晚期內(nèi)體中釋放，從而阻斷呼吸道病毒感染該靶細(xì)胞； 所述呼吸道病毒選自流感病毒和冠狀病毒；所述流感病毒包括流感病毒H1、Η3、Η5和Η7亞型，所述冠狀病毒包括SARS-CoV和MERS-CoV。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的肽與所述病毒的結(jié)合包括所述的肽與所述病毒的表面糖蛋白的結(jié)合；并且所述的肽通過(guò)抑制所述晚期內(nèi)體中的PH值的降低來(lái)抑制所述病毒RNA的釋放。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的肽在制備用于預(yù)防或治療呼吸道病毒感染的藥物中的用途。
17.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的肽的方法，包括:通過(guò)化學(xué)途徑或基因工程來(lái)合成所述的肽。
18.一種分離的、編碼根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的肽的DNA。
19.一種表達(dá)載體，其含有與啟動(dòng)子有效連接的根據(jù)權(quán)利要求18所述的DNA。
20.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求19所述的表達(dá)載體。
21.一種用于篩選能夠抑制呼吸道病毒感染的肽的試劑盒，包括:陽(yáng)性對(duì)照，該陽(yáng)性對(duì)照為根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的肽；靶細(xì)胞；以及呼吸道病毒。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，還包括細(xì)胞培養(yǎng)基。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，還包括陰性對(duì)照或空白對(duì)照。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述呼吸道病毒選自流感病毒和冠狀病毒；所述流感病毒包括流感病毒H1、H3、H5和H7亞型，所述冠狀病毒包括SARS-CoV和MERS-CoV。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中所述祀細(xì)胞選自Madin-Darby狗腎細(xì)胞(MDCK, ATCC N0.CCL-34)、恒河猴胚腎細(xì)胞(FRhK-4，ATCC N0.CRL-1688)和非洲綠猴腎 E6細(xì)胞(Vero-E6, ATCC N0.CRL-1586)。
26.一種能夠抑制呼吸道病毒感染的肽的篩選方法，包括如下步驟: a)提供一種分離的或隨機(jī)合成的候選肽； b)提供一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，該陽(yáng)性對(duì)照為根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的肽； c)將所述候選肽和陽(yáng)性對(duì)照分別與呼吸道病毒接觸； d)用與所述候選肽和陽(yáng)性對(duì)照接觸后的所述呼吸道病毒感染靶細(xì)胞； e)評(píng)價(jià)所述候選肽和陽(yáng)性對(duì)照抑制所述呼吸道病毒感染靶細(xì)胞的能力； f)挑選出抑制能力等于或高于所述陽(yáng)性對(duì)照的候選肽。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK103554244SQ201310451941
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月9日
【發(fā)明者】鄭伯建, 趙旵軍 申請(qǐng)人:香雪集團(tuán)(香港)有限公司