一種致密骨基質(zhì)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種致密骨基質(zhì)及其制備方法。本發(fā)明提供的制備骨基質(zhì)（致密脫鈣骨基質(zhì)）的方法，包括如下步驟：（1）取離體的動物骨的骨干，使用表面活性劑溶液浸泡處理；（2）使用堿溶液浸泡處理步驟（1）的產(chǎn)物；（3）使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟（2）的產(chǎn)物；（4）使用酸溶液浸泡處理步驟（3）的產(chǎn)物；（5）使用堿溶液浸泡處理步驟（4）的產(chǎn)物；（6）使用pH6.0-7.5的輻照保護試劑溶液浸泡處理步驟（5）的產(chǎn)物；（7）將步驟（6）的產(chǎn)物依次進行冷凍干燥和輻照滅菌，得到骨基質(zhì)。本發(fā)明提供的骨基質(zhì)無免疫排異反應，生物相容性好，能滿足被修補組織的力學要求。
【專利說明】一種致密骨基質(zhì)及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體涉及一種在外科手術(shù)中對骨組織進行修復的致密骨基質(zhì)及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，骨外科整形手術(shù)涉及的范圍已愈發(fā)廣泛，如粉碎性骨折及骨不連的修復、顱骨重建、頜面外科整形、脊柱修復與重建等。
[0003]在手術(shù)技術(shù)迅速發(fā)展的同時，適宜的修復材料相對難以獲得，成為此類手術(shù)推廣的重大障礙。目前應用較多的金屬修復材料，有重量輕、強度高、方便塑型等優(yōu)勢，但還存在如下問題:熱傳導性能過于良好，給患者造成強烈的異物感；彈性模量遠強于真骨，易對周圍骨組織造成機械損傷；不可降解，作為永久異物存在于體內(nèi)，經(jīng)常發(fā)生非菌炎性反應。后來發(fā)展的以生物陶瓷為代表的無機非金屬材料在生物相容性方面優(yōu)于金屬材料，但其密度過大，在應用時受到一定制約，而且此類材料不易降解，即使能與組織良好相容，也不能達到理想的強度。自體骨是最理想的修復材料，受來源限制不能大量應用，僅在治療骨不連中有優(yōu)秀的表現(xiàn)，但也會造成新的損傷，增加術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，失敗率高達10-30%。異體骨移植在材料篩選、儲存方面相當困難、昂貴，還容易產(chǎn)生免疫排斥反應、感染艾滋病毒等，失敗率更高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種致密骨基質(zhì)及其制備方法。
[0005]本發(fā)明提供的制備骨基質(zhì)(致密骨基質(zhì))的方法，又稱方法甲，包括如下步驟:
[0006]( I)取離體的動物骨的骨干,使用表面活性劑溶液浸泡處理；
[0007](2)使用堿溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物；
[0008](3)使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟(2)的產(chǎn)物；
[0009](4)使用酸溶液浸泡處理步驟(3)的產(chǎn)物；
[0010](5)使用堿溶液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物；
[0011](6)使用 ρΗ6.0-7.5 (如 ρΗ6.0-6.8、ρΗ6.8-7.5、ρΗ6.0、ρΗ6.8 或 ρΗ7.5)的輻照保護試劑溶液浸泡處理步驟(5)的產(chǎn)物；
[0012](7)將步驟(6)的產(chǎn)物依次進行冷凍干燥和輻照滅菌，得到骨基質(zhì)。
[0013]所述步驟(I)中:所述表面活性劑可為TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述步驟(I)中:所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度可為0.5-3g/100ml (如0.5-lg/100ml、lg-3g/100ml、0.5g/100ml、lg/100ml 或 3g/100ml)。所述步驟(I)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如 0-10°C、6-25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C)、1_168 小時(如1-12小時、12-168小時、I小時、12小時或168小時)。所述表面活性劑溶液具體可為表面活性劑水溶液。
[0014]所述步驟(2)中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為NaOH、KOH或Ca (OH)20所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.02-1M (如0.02-0.5Μ、0.5-1Μ、0.02M、0.5M或1M)。所述步驟(2)中:所述浸泡處理的條件可為:0_25°C(如 0-10°C、6-25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C)、30-180 分鐘(如 30-120 分鐘、120-180 分鐘、30分鐘、120分鐘或180分鐘)。所述堿溶液具體可為堿性化合物的水溶液。
[0015]所述步驟(3)中:所述表面活性劑可為TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述步驟(3)中:所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度可為0.5-3g/100ml (如0.5-lg/100ml、lg-3g/100ml、0.5g/100ml、lg/100ml 或 3g/100ml)。所述步驟(3)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如 0-10°C、6-25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C )、1-168 小時(如1-10小時、10-168小時、I小時、10小時或168小時)。所述表面活性劑溶液具體可為表面活性劑水溶液。
[0016]所述步驟(4)中:所述酸溶液可為酸性化合物溶液。所述酸性化合物具體可為鹽酸。所述酸性化合物溶液中，所述酸性化合物的濃度為l_8g/100ml (如l-5g/100ml、
5-8g/100ml、lg/100ml、5g/100ml或8g/100ml)。所述步驟(4)中:所述浸泡處理的條件為:4-25。。(如 4-14°C、10-25°C、6±2°C、12±2°C或 23±2°C)、18-26 小時(如 18-22 小時、22-26小時、18小時、22小時或26小時)。所述酸性化合物溶液具體可為酸性化合物水溶液。
[0017]所述步驟(4)中:所述酸溶液可為酸性化合物溶液。所述酸性化合物具體可為鹽酸。所述酸性化合物溶液中，所述酸性化合物的濃度為0.3-lg/100ml(如0.3-0.5g/100ml、0.5-lg/100ml、0.3g/100ml、0.5g/100ml 或 lg/100ml)。所述步驟(4)中:所述浸泡處理的條件為:10-200C (如 10-17°C、13-20°C、12±2°C、15±2°C或 18±2°C )、18—26 小時(如 18-22小時、22-26小時、18小時、22小時或26小時)。所述酸性化合物溶液具體可為酸性化合物水溶液。
[0018]所述步驟(5)中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為NaOH、KOH或Ca (OH)20所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.02-1M (如0.02-0.5Μ、0.5-1Μ、0.02M、0.5M或1M)。所述步驟(5)中:所述浸泡處理的條件可為:0_25°C(如 0-10°C、6-25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C)、30-180 分鐘(如 30-120 分鐘、120-180 分鐘、30分鐘、120分鐘或180分鐘)。所述堿溶液為堿性化合物的水溶液。
[0019]所述步驟(6)中:所述輻照保護試劑可為蘆丁。所述步驟(6)中:所述輻照保護試劑溶液中，所述輻照保護試劑的濃度可為0.01-0.5g/100ml (如0.01-0.lg/100ml、0.lg-0.5g/100ml、0.01g/100ml、0.lg/100ml 或 0.5g/100ml)。所述步驟(6)中:所述浸泡處理的條件可為:0-250C (如 0-14°C、10-25°C、2±2°C、12±2°C或 23±2°C)、1_5 小時(如1-3小時、3-5小時、I小時、3小時或5小時)。所述輻照保護試劑溶液具體可為輻照保護試劑水溶液。
[0020]所述輻照滅菌可為鈷-60輻射滅菌。所述鈷-60輻射滅菌的輻照劑量可為15-30KGy (如 15-25KGy、25_30KGy、15KGy、25KGy 或 30KGy)。
[0021]所述動物可為牛或豬。
[0022]所述動物骨的骨干具體可為動物四肢骨的骨干。
[0023]本發(fā)明提供的制備骨基質(zhì)(致密骨基質(zhì))的方法，又稱方法乙，包括如下步驟:
[0024]①取離體的動物骨的骨干,使用表面活性劑溶液浸泡處理；
[0025]②使用堿溶液浸泡處理步驟①的產(chǎn)物；
[0026]③使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟②的產(chǎn)物；
[0027]④使用堿溶液浸泡處理步驟③的產(chǎn)物；
[0028]⑤使用pH6.0-7.5的輻照保護試劑溶液浸泡處理步驟④的產(chǎn)物；
[0029]⑥將步驟⑤的產(chǎn)物依次進行冷凍干燥和輻照滅菌，得到骨基質(zhì)。
[0030]所述步驟①中:所述表面活性劑可為TritonX-100、Tween_80或Tween-40。所述步驟①中:所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度可為0.5-3g/100ml (如0.5_lg/100ml、lg-3g/100ml、0.5g/100ml、lg/100ml或3g/100ml)。所述步驟①中:所述浸泡處理的條件可為:0-250C (如 0-10°C、6-25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C)、1_168 小時(如 1-12 小時、12-168小時、I小時、12小時或168小時)。所述表面活性劑溶液具體可為表面活性劑水溶液。
[0031]所述步驟②中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為Na0H、K0H或Ca (OH)20所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.02-1M (如0.02-0.5M、0.5-1Μ、0.02M、0.5M或1M)。所述步驟②中:所述浸泡處理的條件可為:0_25°C(如0_10°C、
6-25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C )、30_180 分鐘(如 30-120 分鐘、120-180 分鐘、30 分鐘、120分鐘或180分鐘)。所述堿溶液具體可為堿性化合物的水溶液。
[0032]所述步驟③中:所述表面活性劑可為TritonX-100、Tween_80或Tween-40。所述步驟③中:所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度可為0.5-3g/100ml (如0.5_lg/100ml、lg-3g/100ml、0.5g/100ml、lg/100ml或3g/100ml)。所述步驟③中:所述浸泡處理的條件可為:0-250C (如 0-10°C、6-25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C)、1_168 小時(如 1-10 小時、10-168小時、I小時、10小時或168小時)。所述表面活性劑溶液具體可為表面活性劑水溶液。
[0033]所述步驟④中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為Na0H、K0H或Ca (OH)20所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.02-1M (如0.02-0.5M、
0.5-1Μ、0.02M、0.5M或1M)。所述步驟④中:所述浸泡處理的條件可為:0_25°C(如0_10°C、
6-25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C )、30_180 分鐘(如 30-120 分鐘、120-180 分鐘、30 分鐘、120分鐘或180分鐘)。所述堿溶液為堿性化合物的水溶液。
[0034]所述步驟⑤中:所述輻照保護試劑可為蘆丁。所述步驟⑤中:所述輻照保護試劑溶液中，所述輻照保護試劑的濃度可為0.01-0.5g/100ml (如0.01-0.lg/100ml、
0.lg-0.5g/100ml、0.01g/100ml、0.lg/100ml 或 0.5g/100ml)。所述步驟⑤中:所述浸泡處理的條件可為:0-250C (如 0-14°C、10-25°C、2±2°C、12±2°C或 23±2°C)、1_5 小時(如 1-3小時、3-5小時、I小時、3小時或5小時)。所述輻照保護試劑溶液具體可為輻照保護試劑水溶液。
[0035]所述輻照滅菌可為鈷-60輻射滅菌。所述鈷-60輻射滅菌的輻照劑量可為15-30KGy (如 15-25KGy、25_30KGy、15KGy、25KGy 或 30KGy)。
[0036]所述動物可為牛或豬。
[0037]所述動物骨的骨干具體可為動物四肢骨的骨干。
[0038]以上任一所述方法制備得到的骨基質(zhì)也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0039]本發(fā)明的優(yōu)點:原料是動物骨組織，主要成分是膠原蛋白和無機骨鹽，保留了與機體相似的空間結(jié)構(gòu)，可被動降解，降解速度與再生組織的生長速度同步，降解產(chǎn)物是二十種氨基酸或多肽，非完全脫鈣材料還可以提供無機骨鹽，可被機體吸收利用，有利于缺損組織的再生性修復。本發(fā)明提供的骨基質(zhì)無免疫排異反應，生物相容性好，能滿足被修補組織的力學要求；表面較柔軟并具有一定彈性，適宜與自體骨組織貼合，且避免了因植入材料與自體骨組織硬度不同造成的自體骨組織二次傷害。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1和圖2為實施例1制備的致密型脫鈣骨基質(zhì)的切片的HE染色圖。
[0041]圖3為實施例1制備的致密型脫鈣骨基質(zhì)的照片。

【具體實施方式】
[0042]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。
[0043]蘆丁:國藥集團化學試劑有限公司，產(chǎn)品編號為U1606503，CAS編號為250249-75-3。該商購的蘆丁的分子式為C27H3tlO16.3H20,實施例中制備的蘆丁溶液的濃度均以 C27H30O16 計。
[0044]蘆丁的結(jié)構(gòu)式如下:
[0045]



OH
HO' 八兒

9H ^1O-CH5

OH OH 0H I

OH
[0046]實施例1、致密骨基質(zhì)的制備(完全脫鈣)
[0047]1、從規(guī)范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的成年豬的四肢骨，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲存。
[0048]2、將步驟I得到的四肢骨解凍并充分清洗，取骨干部分，去除骨膜和骨髓，加工成適宜處理的條狀或塊狀。
[0049]3、脫細胞處理
[0050]使用表面活性劑溶液浸泡處理骨干。
[0051]本步驟的目的為:破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，使細胞破碎溶出。
[0052]具體步驟:使用0.5g/100ml TritonX-100水溶液8±2°C浸泡處理12小時，然后用清水洗滌。
[0053]4、第一次堿處理
[0054]使用堿溶液浸泡處理步驟3的產(chǎn)物。
[0055]本步驟的目的為:破壞并溶出非膠原類蛋白，脫脂。
[0056]具體步驟:使用IM NaOH水溶液，8±2°C浸泡處理120min，然后用清水洗滌。
[0057]5、脫脂處理
[0058]用表面活性劑溶液浸泡處理步驟4的產(chǎn)物。
[0059]本步驟的目的為:抽提骨材料中的脂肪及脂溶性雜質(zhì)。
[0060]具體步驟:使用lg/100ml TritonX-100水溶液8±2°C浸泡處理10小時，然后用清水洗滌。
[0061]6、酸處理
[0062]用酸溶液浸泡處理步驟5的產(chǎn)物。
[0063]本步驟的目的為:完全脫除骨組織中的無機骨鹽。
[0064]具體步驟:使用5g/100ml鹽酸水溶液12±2°C浸泡處理22小時,然后用清水洗滌。
[0065]7、第二次堿處理
[0066]使用堿溶液浸泡處理步驟6的產(chǎn)物。
[0067]本步驟的目的為:去除可能存在的內(nèi)毒素及滅活可能存在的病毒。
[0068]具體步驟:使用IM NaOH水溶液，8±2°C浸泡處理120min，然后用清水洗滌。
[0069]8、輻照保護處理
[0070]用pH6.0-7.5的輻照保護試劑溶液浸泡處理步驟7的產(chǎn)物。
[0071]具體步驟:使用pH6.8,0.lg/100ml的蘆丁水溶液，12±2°C浸泡處理3小時，然后用清水洗滌。
[0072]也可以用輻照保護試劑溶液對步驟7的產(chǎn)物進行表面涂抹，來代替浸泡處理。
[0073]9、取步驟8的產(chǎn)物，使用凍干機進行冷凍干燥后，然后封裝并用鈷-60輻射滅菌(輻照劑量為25KGy)。照片見圖3。
[0074]實施例2、致密骨基質(zhì)的制備(完全脫鈣)
[0075]1、從規(guī)范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的成年牛的四肢骨，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲存。
[0076]2、將步驟I得到的四肢骨解凍并充分清洗，取骨干部分，去除骨膜和骨髓，加工成適宜處理的條狀或塊狀。
[0077]3、脫細胞處理
[0078]使用表面活性劑溶液浸泡處理骨干。
[0079]具體步驟:使用lg/100ml Tween-80水溶液23±2°C浸泡處理I小時，然后用清水洗漆。
[0080]4、第一次堿處理
[0081]使用堿溶液浸泡處理步驟3的產(chǎn)物。
[0082]具體步驟:使用0.02M Ca(OH)JK溶液，2±2°C浸泡處理180min，然后用清水洗滌。
[0083]5、脫脂處理
[0084]用表面活性劑溶液浸泡處理步驟4的產(chǎn)物。
[0085]具體步驟:使用0.5g/100ml Tween-80水溶液23±2°C浸泡處理I小時，然后用清水洗漆。
[0086]6、酸處理
[0087]用酸溶液浸泡處理步驟5的產(chǎn)物。
[0088]具體步驟:使用lg/100ml鹽酸水溶液6±2°C浸泡處理26小時,然后用清水洗漆。
[0089]7、第二次堿處理
[0090]使用堿溶液浸泡處理步驟6的產(chǎn)物。
[0091]具體步驟:使用0.02M Ca(OH)JK溶液，2±2°C浸泡處理180min，然后用清水洗滌。
[0092]8、輻照保護處理
[0093]用pH6.0-7.5的輻照保護試劑溶液浸泡處理步驟7的產(chǎn)物。
[0094]具體步驟:使用pH6.0,0.01g/100ml的蘆丁水溶液，23±2°C浸泡處理I小時，然后用清水洗滌。
[0095]也可以用輻照保護試劑溶液對步驟7的產(chǎn)物進行表面涂抹，來代替浸泡處理。
[0096]9、取步驟8的產(chǎn)物，使用凍干機進行冷凍干燥后，然后封裝并用鈷-60輻射滅菌(輻照劑量為15KGy)。
[0097]實施例3、致密脫鈣骨基質(zhì)的制備(完全脫鈣)
[0098]1、從規(guī)范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的成年豬的四肢骨，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲存。
[0099]2、將步驟I得到的四肢骨解凍并充分清洗，取骨干部分，去除骨膜和骨髓，加工成適宜處理的條狀或塊狀。
[0100]3、脫細胞處理
[0101]使用表面活性劑溶液浸泡處理骨干。
[0102]具體步驟:使用3g/100ml Tween-40水溶液2±2°C浸泡處理168小時，然后用清水洗漆。
[0103]4、第一次堿處理
[0104]使用堿溶液浸泡處理步驟3的產(chǎn)物。
[0105]具體步驟:使用0.5M KOH水溶液，23 ±2 °C浸泡處理30min，然后用清水洗滌。
[0106]5、脫脂處理
[0107]用表面活性劑溶液浸泡處理步驟4的產(chǎn)物。
[0108]具體步驟:使用3g/100ml Tween-40水溶液2±2°C浸泡處理168小時，然后用清水洗漆。
[0109]6、酸處理
[0110]用酸溶液浸泡處理步驟5的產(chǎn)物。
[0111]具體步驟:使用8g/100ml鹽酸水溶液23±2°C浸泡處理18小時,然后用清水洗滌。
[0112]7、第二次堿處理
[0113]使用堿溶液浸泡處理步驟6的產(chǎn)物。
[0114]具體步驟:使用0.5M KOH水溶液，23 ±2 °C浸泡處理30min，然后用清水洗滌。
[0115]8、輻照保護處理
[0116]用pH6.0-7.5的輻照保護試劑溶液浸泡處理步驟7的產(chǎn)物。
[0117]具體步驟:使用pH7.5,0.5g/100ml的蘆丁水溶液，2±2°C浸泡處理5小時，然后用清水洗滌。
[0118]也可以用輻照保護試劑溶液對步驟7的產(chǎn)物進行表面涂抹，來代替浸泡處理。
[0119]9、取步驟8的產(chǎn)物，使用凍干機進行冷凍干燥后，然后封裝并用鈷-60輻射滅菌(輻照劑量為30KGy)。
[0120]實施例4、致密骨基質(zhì)的制備(部分脫鈣)
[0121]1、同實施例1的步驟I。
[0122]2、同實施例1的步驟2。
[0123]3、脫細胞處理
[0124]同實施例1的步驟3。
[0125]4、第一次堿處理
[0126]同實施例1的步驟4。
[0127]5、脫脂處理
[0128]同實施例1的步驟5。
[0129]6、酸處理
[0130]用酸溶液浸泡處理步驟5的產(chǎn)物。
[0131]本步驟的目的為:部分脫除骨組織中的無機骨鹽。
[0132]具體步驟:使用0.5g/100ml鹽酸水溶液15±2°C浸泡處理22小時,然后用清水洗滌。
[0133]7、第二次堿處理
[0134]同實施例1的步驟7。
[0135]8、輻照保護處理
[0136]同實施例1的步驟8。
[0137]9、同實施例1的步驟9。
[0138]實施例5、致密骨基質(zhì)的制備(部分脫鈣)
[0139]1、同實施例2的步驟I。
[0140]2、同實施例2的步驟2。
[0141]3、脫細胞處理
[0142]同實施例2的步驟3。
[0143]4、第一次堿處理
[0144]同實施例2的步驟4。
[0145]5、脫脂處理
[0146]同實施例2的步驟5。
[0147]6、酸處理
[0148]用酸溶液浸泡處理步驟5的產(chǎn)物。
[0149]本步驟的目的為:部分脫除骨組織中的無機骨鹽。
[0150]具體步驟:使用lg/100ml鹽酸水溶液12±2°C浸泡處理18小時,然后用清水洗滌。
[0151]7、第二次堿處理
[0152]同實施例2的步驟7。
[0153]8、輻照保護處理
[0154]同實施例2的步驟8。
[0155]9、同實施例2的步驟9。
[0156]實施例6、致密骨基質(zhì)的制備(部分脫鈣)
[0157]1、同實施例3的步驟I。
[0158]2、同實施例3的步驟2。
[0159]3、脫細胞處理
[0160]同實施例3的步驟3。
[0161]4、第一次堿處理
[0162]同實施例3的步驟4。
[0163]5、脫脂處理
[0164]同實施例3的步驟5。
[0165]6、酸處理
[0166]用酸溶液浸泡處理步驟5的產(chǎn)物。
[0167]本步驟的目的為:部分脫除骨組織中的無機骨鹽。
[0168]具體步驟:使用0.3g/100ml鹽酸水溶液18±2°C浸泡處理26小時,然后用清水洗滌。
[0169]7、第二次堿處理
[0170]同實施例3的步驟7。
[0171]8、輻照保護處理
[0172]同實施例3的步驟8。
[0173]9、同實施例3的步驟9。
[0174]實施例7、致密骨基質(zhì)的制備(不脫鈣)
[0175]1、同實施例1的步驟I。
[0176]2、同實施例1的步驟2。
[0177]3、脫細胞處理
[0178]同實施例1的步驟3。
[0179]4、第一次堿處理
[0180]同實施例1的步驟4。
[0181]5、脫脂處理
[0182]同實施例1的步驟5。
[0183]6、第二次堿處理
[0184]同實施例1的步驟7。
[0185]7、輻照保護處理
[0186]同實施例1的步驟8。
[0187]8、同實施例1的步驟9。
[0188]實施例8、致密骨基質(zhì)的性能
[0189]實施例1制備的致密骨基質(zhì)的切片的HE染色圖見圖1和圖2。實施例1得到的致密骨基質(zhì)染色后顯示為粉紅色，沒有藍色顯示，表明該致密骨基質(zhì)已完全脫鈣。實施例1得到的致密骨基質(zhì)可見內(nèi)環(huán)骨板、外環(huán)骨板、哈佛氏系統(tǒng)等結(jié)構(gòu)留下的膠原基質(zhì)；可見骨陷窩中無遺傳物質(zhì)殘留。實施例2和實施例3得到的致密骨基質(zhì)的HE染色結(jié)果與實施例1的結(jié)果一致。
[0190]分別檢測實施例1至實施例7制備的各個致密骨基質(zhì)的無機物含量，方法為:稱取100-105°C恒重的待測樣品lg，置已熾灼至恒重的坩堝中(恒重的坩堝的重量為Wl)，精密稱定，置電爐上緩緩熾灼至完全炭化，放冷至室溫，然后800°C熾灼6-8小時使完全灰化，移置干燥器內(nèi)，放冷至室溫精密稱定(灰化物和坩堝的總重為W2)。
[0191]



VV ^ - W I
無機物含量(％) = - X 100%

恒重樣品重(即Ig)
[0192]實施例1至實施例7制備的各個致密骨基質(zhì)的無機物含量見表I。
[0193]表I實施例1至實施例7制備的各個致密骨基質(zhì)的無機物含量
[0194]

無機物含量(％)
__樣品I樣品2樣品3樣品4樣品5平均
實施例1 0.96~ 0.88—1.20 ~1.140.92~ 1.02
實施例 2 1.02 0.791.031.170.850.97
實施例 3 0.89~ 1.02 ~1.11 ■1.070.94一1.PO
實施例 4 51.2753.9152.1256.3853.7453.28
實施例 5 41.3T~ 44.60一40.98 ~46.0245.39~ 43.67
實施例 6 60.θΓ~ 59.63一59.92 ~61.2561.77~ 60.52
實施例 7 69.3367.5367.9870.0868.7768.74
[0195]實施例7制備的為不脫鈣型致密骨基質(zhì)，根據(jù)其無機物含量計算實施例4、實施例5和實施例6制備的各個致密骨基質(zhì)的脫鈣率。為了便于計算，將實施例7得到的致密骨基質(zhì)的無機物含量計算為70%。
[0196]

70-100*無機物含量脫鈣率(％) = - X 100%

70* (1-無機物含量)
[0197]實施例4制備得到的致密骨基質(zhì)的平均脫鈣率為51.13%。實施例4制備得到的致密骨基質(zhì)的平均脫鈣率55.16%。實施例6制備得到的致密骨基質(zhì)的平均無機物含量為60.52%，平均脫鈣率為34.30%ο
[0198]實施例9、致密骨基質(zhì)的抗壓強度試驗
[0199]參照中華人民共和國國家標準GB/T1448-2005《纖維增強塑料壓縮性能實驗方法》分別檢測實施例4的產(chǎn)物、實施例5的產(chǎn)物、實施例6的產(chǎn)物和實施例7的產(chǎn)物的抗壓強度，具體步驟如下:
[0200]1、將試樣制成抗壓橫截面積40-80mm2,高約為10_15mm的立方體或圓柱體,兩抗壓面切平，試樣邊緣平滑無缺口，舍去邊緣有缺陷的試樣。
[0201]2、用游標卡尺測量試樣長度、寬度、高或直徑、高，準確至0.01mm，每個項目測量三次并計算出其平均值。
[0202]3、將試樣置于試驗機(微機控制電子萬能試驗機，深圳市新三思計量技術(shù)有限公司，型號CMT8502)的兩壓板之間，使試樣縱軸與上下夾具中心連線相重合，設(shè)置試樣定變形5mm,按照10mm/min的規(guī)定速度，開動試驗機進行試驗。當試驗機返車時，記錄試樣屈服負荷力值和屈服強度。
[0203]實施例4得到的致密骨基質(zhì)的抗壓強度為50MPa。
[0204]實施例5得到的致密骨基質(zhì)的抗壓強度為35MPa。
[0205]實施例6得到的致密骨基質(zhì)的抗壓強度為60MPa。
[0206]實施例7得到的致密骨基質(zhì)的抗壓強度為190MPa。
[0207]實施例10、致密骨基質(zhì)修復長骨骨折動物實驗
[0208]實驗動物:新西蘭白兔、清潔級、6個月齡,體重3_4kg。
[0209]1、將實驗動物麻醉，從左后肢股骨前外側(cè)縱切口，長約10cm，切開皮膚、皮下組織和深筋膜，沿股直肌與股外側(cè)肌間隙銳性分開進入，不切開骨膜，于股骨前外側(cè)放置已塑形好的4孔普通鋼板(鋼板預彎一定的弧度，約5° -8°，以使鋼板和股骨向前外凸的弧度相吻合)，電鉆鉆孔后依次旋入4枚螺釘固定。于鋼板第2孔、第3孔之間，以線鋸鋸斷股骨一偵牝用直尺測量股骨1.5cm長，并標記好另一端截骨線，線鋸截斷，并切除該段對應的骨膜，造成標準的1.5cm段缺性骨與骨膜缺損。
[0210]2、將完成步驟I的動物分組處理:
[0211]實驗組-1:將實施例1得到的致密骨基質(zhì)修剪為合適的形態(tài)后修補1.5cm段的骨缺損，然后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4X 15U預防感染(每天兩次，共3天)；
[0212]實驗組-2:將實施例2得到的致密骨基質(zhì)修剪為合適的形態(tài)后修補1.5cm段的骨缺損，然后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4X 15U預防感染(每天兩次，共3天)；
[0213]實驗組-3:將實施例3得到的致密骨基質(zhì)修剪為合適的形態(tài)后修補1.5cm段的骨缺損，然后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4X 15U預防感染(每天兩次，共3天)；
[0214]實驗組-4:將實施例4得到的致密骨基質(zhì)修剪為合適的形態(tài)后修補1.5cm段的骨缺損，然后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4X 15U預防感染(每天兩次，共3天)；
[0215]實驗組-5:將實施例5得到的致密骨基質(zhì)修剪為合適的形態(tài)后修補1.5cm段的骨缺損，然后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4X 15U預防感染(每天兩次，共3天)；
[0216]實驗組-6:將實施例6得到的致密骨基質(zhì)修剪為合適的形態(tài)后修補1.5cm段的骨缺損，然后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4X 15U預防感染(每天兩次，共3天)；
[0217]對照組:用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4 X 15U預防感染(每天兩次，共3天)。
[0218]術(shù)后18周時，解剖動物并觀察股骨形態(tài)。對照組動物可見骨缺損區(qū)生成骨痂，但骨缺損區(qū)仍無骨性連接，其內(nèi)大部分仍然是由肉芽疤痕填充，骨缺損未愈合。實驗組-1、實驗組_2、實驗組_3、實驗組-4、實驗組-5、實驗組-6中，動物的骨缺損基本愈合。
[0219]實施例11、采用實施例7制備的致密骨基質(zhì)修復關(guān)節(jié)骨折的動物實驗
[0220]實驗動物:健康成年新西蘭白兔24只，體重3_4kg。
[0221]1、股骨內(nèi)髁骨折模型的制備:新西蘭白兔腹腔注射戊巴比妥鈉(35mg/kg)全麻，于左側(cè)股骨遠端前側(cè)沿髕韌帶內(nèi)側(cè)做5cm縱形切口，暴露股骨遠端，在距股骨遠端5mm處由外下方向內(nèi)上方，用骨刀鑿開股骨內(nèi)髁，制備股骨內(nèi)髁骨折模型。
[0222]2、試驗方法:隨機抽簽法分為實驗組和對照組，實驗組用實施例7制備的致密骨基質(zhì)進行外形加工得到的骨釘固定，對照組用日本剛子牌可吸收螺釘固定。術(shù)后12、24周取骨釘及周圍組織行組織學檢測。
[0223]3、結(jié)果:術(shù)后兩組動物均在2周完全愈合。病理切片顯不:術(shù)后12周，炎性細胞數(shù)逐漸減少，纖維化較前明顯，纖維邊緣出現(xiàn)少許破骨細胞；術(shù)后24周，纖維層厚度減低，破骨細胞數(shù)明顯增加，與宿主骨間發(fā)生骨橋連接。表明實施例7制備的骨基質(zhì)加工形成的骨釘具有一定的誘導成骨作用，并無明顯的免疫排斥反應。
[0224]實施例12、致密骨基質(zhì)治療股骨頭壞死的動物實驗
[0225]實驗動物:健康成年新西蘭白兔20只，體重3_4kg。
[0226]1、股骨頭壞死動物模型的制備:新西蘭白兔腹腔注射戊巴比妥鈉(35mg/kg)全麻，無菌手術(shù)暴露左側(cè)髖關(guān)節(jié)，切開關(guān)節(jié)囊顯露股骨頸前上方，剪斷圓韌帶，脫出股骨頭，于股骨頸前上方近關(guān)節(jié)緣處的骨皮，用直徑300mm的鉆頭鉆孔開窗，用刮匙向內(nèi)側(cè)刮除約50%的松質(zhì)骨，用紗布團蘸取液氮，即刻填塞于骨腔冷凍，持續(xù)30秒鐘，生理鹽水復溫，即制得股骨頭壞死模型。
[0227]2、試驗方法:隨機抽簽法分為實驗組、對照組-1、對照組-2和對照組-3，三個實驗組分別用實施例1制備的致密骨基質(zhì)、實施例2制備的致密骨基質(zhì)或?qū)嵤├?制備的致密骨基質(zhì)填充股骨頭壞死處孔洞，對照組填充生理鹽水。逐層縫合關(guān)節(jié)囊及各層，放回籠中分籠飼養(yǎng)，自然活動。術(shù)前肌注I次青霉素鈉，術(shù)后肌注2次預防感染。術(shù)后4、8周兩個時間組，取股骨頭標本進行組織學檢查。
[0228]3、結(jié)果:對照組股骨頭缺損處骨組織愈合力差，缺損處基本由纖維組織填充；三個實驗組術(shù)后4周時股骨頭內(nèi)纖維組織增生，有大量的軟骨形成和成骨細胞增生明顯，新骨形成多于對照組，8周時股骨頭內(nèi)填充區(qū)骨組織修復大部分已完成，充填區(qū)廣泛分布相對較成熟的骨小梁。
【權(quán)利要求】
1.制備骨基質(zhì)的方法，為方法甲或方法乙； 所述方法甲包括如下步驟: (1)取離體的動物骨的骨干，使用表面活性劑溶液浸泡處理； (2)使用堿溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物； (3)使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟(2)的產(chǎn)物； (4)使用酸溶液浸泡處理步驟(3)的產(chǎn)物； (5)使用堿溶液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物； (6)使用pH6.0-7.5的輻照保護試劑溶液浸泡處理步驟(5)的產(chǎn)物； (7)將步驟(6)的產(chǎn)物依次進行冷凍干燥和輻照滅菌，得到骨基質(zhì)； 所述方法乙包括如下步驟: ①取離體的動物骨的骨干，使用表面活性劑溶液浸泡處理； ②使用堿溶液浸泡處理步驟①的產(chǎn)物； ③使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟②的產(chǎn)物； ④使用堿溶液浸泡處理步驟③的產(chǎn)物； ⑤使用PH6.0-7.5的輻照保護試劑溶液浸泡處理步驟④的產(chǎn)物； ⑥將步驟⑤的產(chǎn)物依次進行冷凍干燥和輻照滅菌，得到骨基質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步驟(I)中:所述表面活性劑為TritonX-100、Tween_80或Tween-40 ;所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度為0.5-3g/100ml ;所述浸泡處理的條件為:0_25°C、1-168小時； 所述步驟①中:所述表面活性劑為TritonX-100、Tween_80或Tween-40 ;所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度為0.5-3g/100ml ;所述浸泡處理的條件為:0_25°C、1-168小時。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述步驟(2)中:所述堿溶液為堿性化合物溶液；所述堿性化合物為NaOH、KOH或Ca(OH)2 ;所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度為0.02-1M ;所述浸泡處理的條件為:0-25°C>30-180 分鐘； 所述步驟②中:所述堿溶液為堿性化合物溶液；所述堿性化合物為NaOH、KOH或Ca(OH)2 ;所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度為0.02-1M ;所述浸泡處理的條件為:0-25°C>30-180 分鐘。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于: 所述步驟(3)中:所述表面活性劑為TritonX-100、Tween_80或Tween-40 ;所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度為0.5-3g/100ml ;所述浸泡處理的條件為:0_25°C、1-168小時； 所述步驟③中:所述表面活性劑為TritonX-100、Tween_80或Tween-40 ;所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度為0.5-3g/100ml ;所述浸泡處理的條件為:0_25°C、1-168小時。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于: 所述步驟(4)中:所述酸溶液為酸性化合物溶液；所述酸性化合物溶液中，所述酸性化合物的濃度為l_8g/100ml ;所述浸泡處理的條件為:4-25°C、18-26小時； 或 所述步驟(4)中:所述酸溶液為酸性化合物溶液；所述酸性化合物溶液中，所述酸性化合物的濃度為0.3-lg/100ml ;所述浸泡處理的條件為:10-20°C、18-26小時。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于: 所述步驟(5)中:所述堿溶液為堿性化合物溶液；所述堿性化合物為NaOH、KOH或Ca(OH)2 ;所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度為0.02-1M ;所述浸泡處理的條件為:0-25°C>30-180 分鐘； 所述步驟④中:所述堿溶液為堿性化合物溶液；所述堿性化合物為NaOH、KOH或Ca(OH)2 ;所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度為0.02-1M ;所述浸泡處理的條件為:0-25°C>30-180 分鐘。
7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于: 所述步驟(6)中:所述輻照保護試劑為蘆丁 ；所述輻照保護試劑溶液中，所述輻照保護試劑的濃度為0.01-0.5g/100ml ;所述浸泡處理的條件為:0_25°C、1_5小時； 所述步驟⑤中:所述輻照保護試劑為蘆丁 ；所述輻照保護試劑溶液中，所述輻照保護試劑的濃度為0.01-0.5g/100ml ;所述浸泡處理的條件為:0_25°C、1_5小時。
8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于:所述滅菌為鈷-60輻射滅菌。
9.如權(quán)利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于:所述所述動物為?；蜇i。
10.權(quán)利要求1至9中任一所述方法制備得到的骨基質(zhì)。
【文檔編號】A61L27/36GK104174069SQ201310192715
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月22日
【發(fā)明者】董佳桓, 孫先昌, 馬百聚, 王麗, 林萍 申請人:煙臺正海生物技術(shù)有限公司