高良姜地上部分ao-95制備方法及其對癌癥的治療作用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種高良姜地上部分AO-95的制備方法：將干燥的高良姜地上部分粉碎，稱取適量，用95％乙醇浸提過濾分離出固相和液相，液相蒸餾回收乙醇，得到黑色的浸提物AO，AO經(jīng)大孔樹脂純化，得到AO-95，AO-95經(jīng)氣相質(zhì)譜檢測其中主要成分為4-苯基-2-丁酮和3-苯丙醛，兩者的含量之和約為84.25％。本發(fā)明的制備方法簡單易行，容易操作。在細胞、亞細胞水平檢測高良姜地上部分AO-95對癌細胞增殖、癌細胞早期凋亡、癌細胞細胞周期、細胞核及線粒體的影響情況。結(jié)果證明高良姜地上部分AO-95對癌細胞增殖的抑制作用表現(xiàn)出很好的活性，同時通過其對細胞周期、細胞核和線粒體影響實驗，表明高良姜地上部分AO-95對癌細胞增殖的抑制作用是通過線粒體途徑誘導(dǎo)癌細胞凋亡引起的。用高良姜地上部分AO-95制備的抗腫瘤藥物具有很好的療效，且副作用少。
【專利說明】高良姜地上部分A0-95制備方法及其對癌癥的治療作用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高良姜地上部分A0-95的制備方法，以及高良姜地上部分A0-95對癌 癥的防治作用，屬于醫(yī)藥及保健食品【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 自20世紀70年代以來，平均每年惡性腫瘤的發(fā)病人數(shù)為160萬人，死于惡性腫瘤 的人數(shù)為130萬人，占全國平均每年總死亡人數(shù)的18. 63%。腫瘤的發(fā)病率逐年增高，由于 傳染病的減少，腫瘤和心腦血管病上升為第一、二位的疾病，但如果把心血管病和腦血管病 分開的話，腫瘤就穩(wěn)座發(fā)病率和病死率的第一名?；瘜W(xué)治療雖能降低癌癥死亡率，但現(xiàn)有的 抗腫瘤藥具有殺傷腫瘤細胞的同時對正常細胞也有較大的殺傷性，毒副反應(yīng)較大，腫瘤仍 然是嚴重威脅人們生命和生活質(zhì)量的疾病之一。面對如此嚴峻的現(xiàn)實問題，長期以來，各國 的政府部門、研究機構(gòu)、制藥企業(yè)一直對惡性腫瘤的治療方法和抗腫瘤藥物的研究開發(fā)高 度重視，并不惜投入巨額資金。天然藥物在此領(lǐng)域具有重要價值并能夠形成自主知識產(chǎn)權(quán)。
[0003] 高良姜系姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance)，又稱良姜，歷年版的 《中國藥典》均有收載。高良姜主產(chǎn)于廣東、廣西、云南、海南等省，廣東湛江是我國高良姜 道地性最強和最集中的產(chǎn)區(qū)。南藥高良姜作為湛江特產(chǎn)，徐聞縣的高良姜規(guī)模種植可追溯 到16世紀初，作為南藥高良姜開發(fā)基地則始建于1998年，從創(chuàng)建至今，種植面積一直穩(wěn)定 在40000畝左右，主要集中分布在大塘…華林一帶。目前主要利用高良姜地下部分作為藥 食兩用材料，而對高良姜地上部分主要以廢棄物的方式處理。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種高良姜地上部分A0-95的制備方法，以 及高良姜地上部分A0-95對腫瘤的防治作用，該A0-95具有高效、低毒的優(yōu)點，將成為市場 上新的抗腫瘤藥物。
[0005] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0006] 高良姜地上部分A0-95的制備方法如下：以高良姜地上部分為原料通過提取和純 化制備高良姜地上部分A0-95,其特征在于：所述的純化是對高良姜地上部分提取物依次 進行：
[0007] 1、大孔樹脂吸附和解析；
[0008] 2、不同濃度的洗脫溶劑洗脫；
[0009] 3、收集洗脫液。
[0010] 其中：大孔樹脂可以是極性、中等極性、弱極性或非極性打孔樹脂；洗脫溶劑包括 有無水或含水乙醇、無水或含水甲醇、丙酮。
[0011] 所述提取的步驟是： a、 對原料用濃度> 0的醇液進行超聲提取，收集提取液； b、 對提取液進行濃縮，獲取高良姜地上部分提取物。
[0012] 所述純化的步驟是： a、 用醇液對高良姜地上部分提取物進行溶解并將所得溶解液滴加到裝有大孔樹脂的 柱床中進行靜止吸附； b、 用水和不同濃度的醇液對靜止吸附樣品后的大孔樹脂柱進行梯度洗脫分離，收集洗 脫液； c、 對上步收集到的洗脫液進行濃縮，獲得A0-95。
[0013] 本發(fā)明的產(chǎn)品中的主要成分含量為：總苯丙素彡86. 12% ;3-苯丙醛彡33. 09% ; 4-苯基-2-丁醛彡51. 16% ;1-(4_羥基-3-甲氧苯基）-2-丁酮彡1.87%。
[0014] 經(jīng)氣相質(zhì)譜分析：利用本發(fā)明制備的A0-95包括多種苯丙素類成分，其中尤以 3-苯丙醛和4-苯基-2- 丁醛兩種苯丙素類成分為主要成分，兩者之和在A0-95中大于 84%。
[0015] 在細胞、亞細胞水平檢測本發(fā)明的產(chǎn)品對癌細胞增殖、癌細胞早期凋亡、癌細胞細 胞周期、細胞核及線粒體的影響情況。結(jié)果證明本發(fā)明產(chǎn)品對癌細胞增殖的抑制作用表現(xiàn) 出很好的活性，同時通過本發(fā)明產(chǎn)品對細胞周期、細胞核和線粒體影響實驗，表明高良姜地 上部分A0-95對癌細胞增殖的抑制作用是通過線粒體途徑誘導(dǎo)癌細胞凋亡引起的。
[0016] 本發(fā)明不僅工藝簡單、可大規(guī)模生產(chǎn)，而且可以直接利用廢棄物（高良姜地上部 分），從中提取A0-95,變廢為寶。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明所述A0-95的氣相色譜圖；
[0018] 圖2為本發(fā)明產(chǎn)品A0-95,4-苯基-2- 丁酮和3-苯丙醛對人肺癌細胞NCI-H460、 A549和NCI-H23細胞增殖的細胞毒作用圖。A :不同濃度Α0-95(0-50μ g/mL)作用24h、48h 和7211對％1-!1460細胞增殖影響示意圖。8:不同濃度40-95(0-5(^8/1^)作用2411、4811 和72h對A549細胞增殖影響示意圖。C :不同濃度Α0-95(0-50μ g/mL)作用24h、48h和72h 對NCI-H23細胞增殖影響示意圖。
[0019] 圖3為本發(fā)明不同濃度A0-95作用24h后，對A549細胞凋亡的影響。1 :壞死細 胞；2 :晚期凋亡細胞；3 :正常細胞；4 :早期凋亡細胞；
[0020] 圖4為本發(fā)明不同濃度A0-95作用24h后對A549細胞周期影響結(jié)果。通過PI染 色檢測細胞周期的示意；
[0021] 圖5為通過DAPI細胞核染色觀察本發(fā)明所述不同濃度A0-95作用24h后對A549 細胞核的影響情況；
[0022] 圖6為通過JC-1染色檢測本發(fā)明所述不同濃度A0-95處理A549細胞24h后，對 線粒體膜電位的影響情況，B2代表低電位細胞的百分含量；
[0023] 圖7為通過Mito-Tracker Green染色檢測本發(fā)明所述不同濃度A0-95作用A549 細胞48h后，對細胞線粒體質(zhì)量影響情況。

【具體實施方式】
[0024] 以下通過具體實施例來進一步闡述本發(fā)明。
[0025] 1.制備高良姜地上部分A0-95 : 將干燥的高良姜地上部分粉碎，用3倍量的95%乙醇超聲提取，提取5次，每次提取 3h，合并提取液，減壓濃縮得高良姜地上部分浸膏。取浸膏600g用1500mL95%乙醇加熱超 聲溶解，以10mL/min的速度將樣品溶液滴加在D101大孔樹脂上，靜止吸附5h，依次用水、 10%乙醇、30 %乙醇、50 %乙醇、70 %乙醇、95 %乙醇進行梯度洗脫分離，每個比例洗脫5個 保留體積，收集95%乙醇洗脫液濃縮得所述高良姜地上部分AO-9512. 6g。
[0026] 2.采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS)聯(lián)用的方法，從制得的高良姜地上部分A0-95中 共鑒定出了 10個化合物，占總含量的98. 4%。
[0027] 實驗結(jié)果：見圖1和表格1。
[0028] 圖1 :A0-95的氣相色譜圖；表1 :A0-95化學(xué)成分的色譜和光譜組成。
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種高良姜地上部分A0-95的制備方法，其特征在于：所述的純化是對高良姜地上 部分提取物依次進行： 1) 大孔樹脂吸附和解析； 2) 不同濃度的洗脫溶劑洗脫； 3) 收集洗脫液。
2. 如權(quán)利要求1所述的高良姜地上部分揮發(fā)油的制備方法，其特征在于： 1) 所述提取的步驟是： a、 對原料用濃度> 0的醇液進行超聲提取，收集提取液； b、 對提取液進行濃縮，獲取高良姜地上部分提取物。 2) 所述純化的步驟是： a、 用醇液對高良姜地上部分提取物進行溶解并將所得溶解液滴加到裝有大孔樹脂的 柱床中進行靜止吸附； b、 用水和不同濃度的醇液對靜止吸附樣品后的大孔樹脂柱進行梯度洗脫分離，收集洗 脫液； c、 對上步收集到的洗脫液進行濃縮，獲得A0-95。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高良姜地上部分A0-95的制備方法，其特征在于： 1) 所述的提取中： a、 醇液為濃度95 %的乙醇溶液； b、 醇液和原料的重量比值為3-10 ; 2) 所述的純化中： a、 用濃度95 %的乙醇對高良姜地上部分提取物進行加熱超聲溶解； b、 高良姜地上部分提取物溶解液滴加到大孔樹脂柱中后的靜止吸附時間> 3小時； c、 對靜止吸附樣品后的大孔樹脂柱進行梯度洗脫的醇液為乙醇溶液，其組成梯度的濃 度分別為10%、30%、50%、75%、95%，且每一濃度洗脫4個保留體積； d、 收集95%乙醇濃度的洗脫液。
4. 一種利用權(quán)利要求1所述方法制備的AO-95,其特征在于主要成分含量： 1) 總苯丙素彡86. 12% ; 2) 3-苯丙醛彡33. 09% ; 3) 4-苯基-2-丁酮彡 51. 16% ; 4) 1-(4-羥基-3-甲氧苯基）-2-丁酮彡1.87%。
5. 高良姜地上部分AO-95用于防治腫瘤。
6. 防治腫瘤的藥物，其中含有高良姜地上部分AO-95。
【文檔編號】A61K31/12GK104138368SQ201310169242
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】曾小斌, 巫鑫, 汪陽, 崔燎, 吳鐵, 朱宇珍, 蘇艷杰, 鄭雅園 申請人:廣東醫(yī)學(xué)院