特異性識(shí)別egfr突變蛋白的單克隆抗體、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體、制備方法及其應(yīng)用，屬于生物科學(xué)和藥物載體領(lǐng)域。利用本發(fā)明的方法制備出的三種單克隆抗體分別可以特異性識(shí)別十種EGFR?G719A、EGFR?G719C、EGFR?G719S、EGFR?D761Y、EGFR?L858R、EGFR?L861Q、EGFR?A839T、EGFR?N826S、EGFR?G863D以及EGFR?V769L突變蛋白。這十種單克隆抗體可以用于檢測(cè)動(dòng)物或者人體組織中的EGFR蛋白是否含有G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D或者V769L突變，能為臨床上的多種癌癥的診斷和治療提供依據(jù)。
【專利說(shuō)明】特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物科學(xué)和藥物載體領(lǐng)域，特別涉及特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體、制備方法及其作為診斷和治療試劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]EGFR 蛋白(Epidermal Growth Factor Receptor,表皮生長(zhǎng)因子受體，也稱為ErbB-1或者HER1)是細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體家族的跨膜受體成員。EGFR與細(xì)胞外的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)結(jié)合，從而將細(xì)胞外的信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。EGFR蛋白的突變?cè)诙喾N人類癌癥，例如肺癌、肛門(mén)癌、直腸癌、乳腺癌中都存在(Paez JG et al., Science, 304(5676):1497-500 (2004))。這些突變導(dǎo)致EGFR蛋白的持續(xù)激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞生長(zhǎng)。常見(jiàn)的 EGFR 突變蛋白有 G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 和 V769L。
[0003]針對(duì)EGFR突變蛋白的抑制劑藥物已經(jīng)上市，包括易瑞沙? (Iressa?，化學(xué)名Genfitinib)、特羅凱 ? (Tarceva?,化學(xué)名 Erlotinib)等(Mayumi Onoland MichihikoKuwano，Clin.Cancer Res.12:7242(2006))。這些抑制劑藥物特異性針對(duì)突變的EGFR蛋白，因此在使用之前，需要用一種能夠特異性結(jié)合突變的EGFR蛋白但是不結(jié)合野生型EGFR蛋白的抗體來(lái)檢測(cè)該病人是否帶有EGFR突變(Pallis AG et al.,Br.J.Cancer.105(1):1-8.(2011))。這種抗體可以被用來(lái)快速檢測(cè)少量的取自病人的樣品，用于診斷癌癥。能夠特異性結(jié)合EGFR突變蛋白的抗體也是治療癌癥所迫切需要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為解·決上述問(wèn)題而提供了分別特異性地識(shí)別EGFRG719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 和 V769L 突變體蛋白的六種單克隆抗體、制備方法及其應(yīng)用。利用本發(fā)明的方法制備出的單克隆抗體能夠分別特異性地識(shí)別G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 和 V769L 突變體蛋白，而不識(shí)別野生型EGFR蛋白。
[0005]在一些操作實(shí)例中，所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位，其特征在于，由一條重鏈和一條輕鏈組成；重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的氨基酸序列分別是由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號(hào)為CCTCC C201301、CCTCCC2012127、 CCTCC C2012118、 CCTCC C201303、 CCTCC C2012125、 CCTCC C201315、 CCTCCC201302、CCTCCC201320、CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列決定。在進(jìn)一步的操作實(shí)例中，所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位，其特征在于，由分別包含所述雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)域的氨基酸序列的一條重鏈和一條輕鏈組成。在更進(jìn)一步的操作實(shí)例中，抗體或者抗原結(jié)合部位包含上述雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
[0006]本發(fā)明的單克隆抗體可以是一種人源化的或者嵌合型的抗體。在某些操作實(shí)例中，這種單克隆抗體是IgG。
[0007]在一方面，本發(fā)明包括保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號(hào)為CCTCCC201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCCC201315,CCTCC C201302,CCTCC C201320,CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細(xì)胞。
[0008]本發(fā)明包括一種含有所述單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位的藥物或者可用于藥物的載體。本發(fā)明還包括一種含有本發(fā)明中提到的單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部位診斷試劑盒。
[0009]在一些應(yīng)用實(shí)例中，本發(fā)明能夠提供一種癌癥診斷的方法(例如，肺癌，非小細(xì)胞肺癌，直腸癌，結(jié)腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，膠質(zhì)瘤，腦癌)，其主要步驟包括:用本發(fā)明所述的單克隆抗體接觸來(lái)自于檢測(cè)目標(biāo)的生物學(xué)樣本；檢測(cè)抗體或者其部分與樣本是否結(jié)合；如果抗體與樣本存在結(jié)合則表明被檢測(cè)對(duì)象是癌癥，或者存在發(fā)展成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0010]在另外的應(yīng)用實(shí)例中，本發(fā)明提供一種治療腫瘤病人的方法，包括:檢測(cè)G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 或者 V769L 突變形式的 EGFR 蛋白是否存在于來(lái)自于病人的樣本中；如果其中一個(gè)突變存在，則使用一種EGFR抑制劑(例如Genfitinib和Erlotinib)進(jìn)行治療。本發(fā)明還提供一種治療癌癥病人(例如,直腸癌,乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌)的方法。該治療方法包括給予病人一種組成成分中含有本發(fā)明的單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部分的藥物。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種使用本發(fā)明所述單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部`位作為藥劑治療黑色素癌，直腸癌，甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，或者造血組織癌。
[0011]本發(fā)明包括一種純化的核酸分子，其組成為能夠編碼本發(fā)明中的特異性結(jié)合突變EGFR蛋白的的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈或者抗原結(jié)合部分的核酸序列。進(jìn)一步本發(fā)明包括含有該核酸序列的載體；該載體優(yōu)化為含有包括可以聯(lián)系到該核酸分子的表達(dá)調(diào)控序列。在一種應(yīng)用實(shí)例中，本發(fā)明提供一種含有該核酸分子的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)應(yīng)用實(shí)例中，本發(fā)明提供一種能夠產(chǎn)生所述的單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位的細(xì)胞株。本發(fā)明還包括一種生產(chǎn)特異性結(jié)合突變型而不結(jié)合野生型EGFR蛋白的單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位的方法。其步驟包括:在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞或者本發(fā)明中提到的細(xì)胞株；純化所述的抗體。
[0012]本發(fā)明基于單克隆抗體特異性結(jié)合突變型的EGFR蛋白的發(fā)現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)這些抗體能夠非常好地優(yōu)先結(jié)合突變的EGFR蛋白(例如帶有G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D或者V769L突變的EGFR蛋白)。這些抗體能夠有效地診斷或者治療癌癥等疾病。這些抗體特別能夠有效地檢測(cè)生物樣品中微量的EGFR蛋白。
[0013]EGFR
[0014]本專利所描述的EGFR是指表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal GrowthFactor Receptor, EGFR)的基因或者蛋白(Hunter T and Cooper JA, Annu RevBiochem.54:897-930 (1985))。該基因或者蛋白也被稱為ErbB-1或者HERl。野生型的EGFR蛋白序列包括SEQ ID NO: 7，野生型EGFR蛋白的編碼mRNA序列包括SEQ ID NO:8。
[0015]EGFR是細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體家族的跨膜受體成員，是一種受體酪氨酸激酶。EGFR與細(xì)胞外的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)結(jié)合，發(fā)生二聚化并激活自身的激酶活性，磷酸化細(xì)胞內(nèi)的一系列下游蛋白，從而將細(xì)胞外的信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。
[0016]EGFR蛋白的突變型式包括一個(gè)或者多個(gè)氨基酸的插入、刪除、替換等。本專利所描述的EGFR G719A突變指的是第719位的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)替換的突變；EGFR G719C指的是第719位的甘氨酸(G)被半胱氨酸(C)替換的突變；EGFR G719S指的是第719位的甘氨酸(G)被絲氨酸(S)替換的突變；EGFR D761Y指的是第761位的天冬氨酸(D)被酪氨酸(Y)替換的突變；EGFR L858R指的是第858位的亮氨酸(L)被精氨酸(R)替換的突變；EGFRL861Q指的是第861位的亮氨酸(L)被谷氨酰胺(Q)替換的突變；EGFR A839T指的是第839位的丙氨酸(A)被蘇氨酸(T)替換的突變；EGFR N826S指的是第826位的天冬酰胺(N)被絲氨酸(S)替換的突變；EGFR G863D指的是第863位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)替換的突變；EGFR V769L指的是第769位的纈氨酸(V)被谷亮氨酸(L)替換的突變。
[0017]抗體與抗原結(jié)合部位
[0018]本發(fā)明包括特異性結(jié)合突變型EGFR蛋白但是不結(jié)合野生型EGFR蛋白的單克隆抗體?！翱贵w”或者“免疫球蛋白Ig”指的是由重鏈(H，大約50-70kDa)和輕鏈(L，大約25kDa)通過(guò)二硫鍵鏈接成的四聚體。輕鏈可以是\輕鏈或者K輕鏈。重鏈可以分為U、S、Y、a、e，不同重鏈和輕鏈的組合共同決定抗體的類型分別是IgM、IgD、IgG、IgA或者IgE(Fundamental Immunology Ch.7, Paul, ff., ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y.(1989))。
[0019]每條重鏈(有 時(shí)稱為H鏈，或者HC)都含有一個(gè)重鏈可變區(qū)(也叫Vh)和一個(gè)重鏈恒定區(qū)(也叫CH)。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)與組成，分別SChUCi^pCH3。每條輕鏈(有時(shí)也成為L(zhǎng)鏈，或者LC)也有一個(gè)輕鏈可變區(qū)(也叫 ')和輕鏈恒定區(qū)(CJ。輕鏈恒定區(qū)只含有一個(gè)結(jié)構(gòu)與Q，在輕鏈和重鏈內(nèi)部，可變區(qū)和恒定區(qū)通過(guò)一個(gè)大約12個(gè)氨基酸左右的“J”形狀的結(jié)構(gòu)鏈接起來(lái)。在重鏈內(nèi)部還有一個(gè)3個(gè)氨基酸左右的“D”形區(qū)域。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可以進(jìn)一步被分為超可變區(qū)，也叫互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及穿插中間的略微保守的框架區(qū)域(FR)。這些區(qū)域以此從N端往C端排列為FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列排序是根據(jù) Kabat(Proteins of Immunological Interest, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD (1987andl991))和 Chothia&Lesk (Chothia&Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987) ; Chothia et al., Nature342:878-883 (1989))的研究結(jié)果分類的。
[0020]本發(fā)明的內(nèi)容之一是特異性結(jié)合突變型EGFR蛋白的的單克隆抗體的抗原結(jié)合部位?！翱乖Y(jié)合部位”是指抗體上使其具有特異性識(shí)別并結(jié)合抗原(例如EGFR蛋白上一段含有特定突變的多肽片段)的功能的一段抗體片段。目前認(rèn)為，抗體的抗原結(jié)合功能可以通過(guò)全長(zhǎng)抗體的部分片段來(lái)實(shí)現(xiàn)?？贵w的“抗原結(jié)合部位”的特征在于包含:(I)一個(gè)Fab片段，一個(gè)包含\、VH、CL, ChI結(jié)構(gòu)域的單價(jià)片段；(2) —個(gè)F (ab’) 2片段，一個(gè)含有通過(guò)鉸鏈區(qū)的的二硫鍵連接起來(lái)的Fab片段的二價(jià)片段；(3) —個(gè)包含Vh和ChI結(jié)構(gòu)域的Fd片段；(4)抗體單臂包含一個(gè)'、VH結(jié)構(gòu)域的Fv片段；(5)—個(gè)由Vh結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward etal., (1989) Nature341:544-546) ; (6) —個(gè)獨(dú)立的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。更進(jìn)一步地，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域％和'是由不同的獨(dú)立基因編碼的，但是可以用基因重組的方式通過(guò)合成一個(gè)鏈接區(qū)域?qū)⑺鼈冞B接起來(lái)，形成由單鏈蛋白內(nèi)部的Vh和\配對(duì)成單價(jià)分子，也稱為單鏈 Fv (scFv) (Bird et al.Science242:423-426 (1988) and Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 (1988))。這種單鏈抗體也包括在“抗原結(jié)合部位”的范圍內(nèi)?？贵w的一部分，比如Fab和F(ab’ )2片段，可以從全長(zhǎng)的抗體通過(guò)常規(guī)的技術(shù)，比如木瓜酶(papain)或者胃蛋白酶(P^sin)酶消化的方法獲得。它們也可以通過(guò)下面描述的標(biāo)準(zhǔn)的DNA重組技術(shù)獲得。
[0021 ] 抗EGFR抗體及其抗原結(jié)合部位
[0022]本發(fā)明的抗體可以用來(lái)自于人類EGFR突變蛋白的抗原免疫非人類的動(dòng)物(例如，小鼠、兔子、大鼠或者倉(cāng)鼠)來(lái)制備。這些抗體也可以通過(guò)噬菌體展示技術(shù)或者其它的已知的抗體制備技術(shù)獲得?？乖梢允羌兓亩嗑鄱嚯幕蛘叨嚯?，也可以是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的多聚多肽或者多肽。
[0023]特定疾病相關(guān)的突變的EGFR G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 或者 V769L。
[0024]本發(fā)明中特異性結(jié)合EGFR G719A突變蛋白的抗體可以通過(guò)多肽ETEFKKIKVLASGAFGTV(SEQ ID NO:1)免疫小鼠來(lái)獲得。本發(fā)明中的通過(guò)該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC201301，名稱為雜交瘤細(xì)胞株M116。
[0025]本發(fā)明中特異性結(jié)合EGFR G719C突變蛋白的抗體可以通過(guò)多肽ETEFKKIKVLCSGAFGTV(SEQ ID NO:2)免疫小鼠來(lái)獲得。本發(fā)明中的通過(guò)該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC2012127，名稱為雜交瘤細(xì)胞株M32-8。
[0026]本發(fā)明中特異性結(jié)合EGFR719S突變蛋白的抗體可以通過(guò)多肽ETEFKKIKVLSSGAFGTV(SEQ ID NO:3)免疫小鼠來(lái)獲得。本發(fā)明中的通過(guò)該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC2012118，名稱為雜交瘤細(xì)胞株M20-18。
[0027]本發(fā)明中特異性結(jié)合EGFR D761Y突變蛋白的抗體可以通過(guò)多肽EATSPKANKEILYEAYVM(SEQ ID NO:4)免疫小鼠來(lái)獲得。本發(fā)明中的通過(guò)該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC201303，名稱為雜交瘤 細(xì)胞株M121#l。
[0028]本發(fā)明中特異性結(jié)合EGFR L858R突變蛋白的抗體可以通過(guò)多肽KTPQHVKITDFGRAKLLG(SEQ ID NO:5)免疫小鼠來(lái)獲得。本發(fā)明中的通過(guò)該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC2012125，名稱為雜交瘤細(xì)胞株M85-13。
[0029]本發(fā)明中特異性結(jié)合EGFR L861Q突變蛋白的抗體可以通過(guò)多肽ITDFGLAKQLGAEEKE(SEQ ID NO: 6)免疫小鼠來(lái)獲得。本發(fā)明中的通過(guò)該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC201315，名稱為雜交瘤細(xì)胞株M80-14。
[0030]本發(fā)明中特異性結(jié)合EGFR A839T突變蛋白的抗體可以通過(guò)多肽DRRLVHRDLTARNVLVKTP(SEQ ID NO:7)免疫小鼠來(lái)獲得。本發(fā)明中的通過(guò)該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC201302，名稱為雜交瘤細(xì)胞株M118#7。
[0031]本發(fā)明中特異性結(jié)合EGFR N826S突變蛋白的抗體可以通過(guò)多肽IAKGMSYLEDRRLVHR(SEQ ID NO: 8)免疫小鼠來(lái)獲得。本發(fā)明中的通過(guò)該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC201320，名稱為雜交瘤細(xì)胞株M117-10。
[0032]本發(fā)明中特異性結(jié)合EGFR G863D突變蛋白的抗體可以通過(guò)多肽ITDFGLAKLLDAEEKE(SEQ ID NO: 9)免疫小鼠來(lái)獲得。本發(fā)明中的通過(guò)該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC201304，名稱為雜交瘤細(xì)胞株M120。
[0033]本發(fā)明中特異性結(jié)合EGFR V769L突變蛋白的抗體可以通過(guò)多肽EAYVMASLDNPHV(SEQ ID NO: 10)免疫小鼠來(lái)獲得。本發(fā)明中的通過(guò)該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC201316，名稱為雜交瘤細(xì)胞株M122#l。 [0034]本發(fā)明進(jìn)一步包含一種單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部位，它們包括由保藏號(hào)為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315、CCTCC C201302、CCTCC C201320、CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明中的單克隆抗體或許只包含由保藏號(hào)為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118,CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315,CCTCC C201302,CCTCCC201320,CCTCC C201304以及CCTCC C201316的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈氨基酸序列或者輕鏈氨基酸序列。
[0035]在某些操作實(shí)例中，本發(fā)明的抗EGFR抗體或者抗原結(jié)合部位包含一條或者多條由保藏號(hào)為 CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCCC2012125、CCTCC C201315、CCTCC C201302、CCTCC C201320、CCTCC C201304 以及 CCTCCC201316的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈或者CDR的氨基酸序列。在某些操作實(shí)例中，抗體或者抗原結(jié)合部位包括由保藏號(hào)為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118,CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315,CCTCC C201302,CCTCCC201320,CCTCC C201304以及CCTCC C201316的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的所有⑶R1、⑶R2以及⑶R3的氨基酸序列。
[0036]在某些操作實(shí)例中，本發(fā)明的抗EGFR抗體或者抗原結(jié)合部位包含由保藏號(hào)為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315、CCTCC C201302、CCTCC C201320、CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。在特定的操作實(shí)例中，抗體或者抗原結(jié)合部位同時(shí)包含由保藏號(hào)為C CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118,CCTCC C201303,CCTCC C2012125、CCTCC C201315,CCTCC C201302、CCTCCC201320,CCTCC C201304以及CCTCC C201316的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
[0037]EGFR的結(jié)合特異性[0038]本發(fā)明的抗體或者抗原結(jié)合部位能夠分別特異性地結(jié)合突變型的EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q.EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L蛋白，但是不結(jié)合野生型的EGFR蛋白(完全不結(jié)合或者在某種程度上不結(jié)合)。換言之，該抗體或者抗原結(jié)合部位能夠區(qū)分突變型和野生型的人類EGFR蛋白。該結(jié)合的特異性可以用已知的常用檢測(cè)手段進(jìn)行確認(rèn)，例如免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Westernblot),酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，流式細(xì)胞分選，免疫共沉淀，免疫熒光，免疫組織化學(xué)染色，表面離子共振(例如BIAC0RE?)或者放射免疫實(shí)驗(yàn)等方法。
[0039]在一些操作實(shí)例中，該抗體能夠特異性地優(yōu)先結(jié)合突變型的EGFR蛋白，對(duì)于突變型EGFR蛋白的結(jié)合能力至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)野生型EGFR蛋白的結(jié)合能力。在某些操作實(shí)例中，本發(fā)明中的抗體或者抗原結(jié)合部位特異性結(jié)合突變型EGFR蛋白的解離平衡常數(shù)Kd至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，至少500倍，或者至少1000倍強(qiáng)于對(duì)野生型EGFR蛋白的結(jié)合的解離平衡常數(shù)(Kd)。解離平衡常數(shù)(Kd)可以通過(guò)表面離子共振或者流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)得。
[0040]本發(fā)明的抗體或者抗原結(jié)合部位或許只能結(jié)合一種EGFR突變蛋白而不能結(jié)合其他的 EGFR 突變蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q, EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L 的一種)。舉例來(lái)說(shuō)，該抗體特異性地結(jié)合EGFR G719A蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變EGFR蛋白的結(jié)合能力。
[0041]在一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合EGFR G719A蛋白而不結(jié)合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFRA839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來(lái)說(shuō)，該抗體特異性地結(jié)合EGFRG719A蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R, EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結(jié)合能力。
[0042]在一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合EGFR G719C蛋白而不結(jié)合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFRA839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來(lái)說(shuō)，該抗體特異性地結(jié)合EGFRG719C蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R, EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結(jié)合能力。
[0043]在一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合EGFR G719S蛋白而不結(jié)合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFRA839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來(lái)說(shuō)，該抗體特異性地結(jié)合EGFRG719S蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFRN826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結(jié)合能力。
[0044]在一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合EGFR D761Y蛋白而不結(jié)合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFRA839T、EGFR N826S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來(lái)說(shuō)，該抗體特異性地結(jié)合EGFRD761Y蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR L858R, EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結(jié)合能力。
[0045]在一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合EGFR L861Q蛋白而不結(jié)合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR A839T、EGFRN826S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來(lái)說(shuō)，該抗體特異性地結(jié)合EGFR L861Q蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR A839T、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結(jié)合能力。
[0046]在一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合EGFR A839T蛋白而不結(jié)合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFRL861Q、EGFR N826 S、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來(lái)說(shuō)，該抗體特異性地結(jié)合EGFRA839T蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR N826S、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結(jié)合能力。
[0047]在一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合EGFR N826S蛋白而不結(jié)合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFRL861Q、EGFR A839T、EGFR G863D以及EGFR V769L)。舉例來(lái)說(shuō)，該抗體特異性地結(jié)合EGFRN826S蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR G863D 以及 EGFR V769L)的結(jié)合能力。
[0048]在一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合EGFR G863D蛋白而不結(jié)合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFRL861Q、EGFR A839T、EGFR N826S以及EGFR V769L)。舉例來(lái)說(shuō)，該抗體特異性地結(jié)合EGFRG863D蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S 以及 EGFR V769L)的結(jié)合能力。
[0049]在一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合EGFR V769L蛋白而不結(jié)合其他突變型的 EGFR 蛋白(例如 EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFRL861Q、EGFR A839T、EGFR N826S以及EGFR G863D)。舉例來(lái)說(shuō)，該抗體特異性地結(jié)合EGFRV769L蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變EGFR蛋白(例如EGFR G719A、EGFR G719C、EGFR G719S、EGFR D761Y、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR A839T、EGFR N826S 以及 EGFR G863D)的結(jié)合能力。
[0050]在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明中的抗體或者抗原結(jié)合部位能夠特異性結(jié)合含有SEQID N0:l，2，3，4，5，6，7，8，9或者10的EGFR多肽。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明的抗體或者抗原結(jié)合部位特異性結(jié)合保藏號(hào)為 CCTCC C20130KCCTCC C2012127、CCTCC C2012118,CCTCCC20I303,CCTCC C2012125、CCTCC C2013I5,CCTCC C201302,CCTCC C201320,CCTCC C201304或者CCTCC C201316的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的抗原表位或者與其重合的抗原表位。
[0051]生產(chǎn)抗體的重組方法
[0052]本發(fā)明包括編碼能夠特異性結(jié)合人類突變型的EGFR蛋白但是不能結(jié)合野生型EGFR蛋白的單克隆抗體及其抗原結(jié)合部位的核酸序列。人類突變的EGFR蛋白包括:G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 以及 V769L。在一些操作實(shí)例當(dāng)中，該核酸分子只編碼單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位的重鏈或者輕鏈。在另外一些操作實(shí)例當(dāng)中，該核酸分子同時(shí)編碼單克隆抗體及其抗原結(jié)合部位的重鏈和輕鏈。在一些操作實(shí)例中，該核酸分子編碼保藏號(hào)為 CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCCC20I303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315、CCTCC C20I302、CCTCC C20I320、CCTCC C201304以及CCTCC C201316的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈、輕鏈、重鏈可變區(qū)或者輕鏈可變區(qū)。核算可以是純化的核酸分子。
[0053]編碼本發(fā)明抗體的核酸分子可以從任何能夠產(chǎn)生該抗體的來(lái)源中獲得。例如，核酸可以從保藏號(hào)為 CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCC C2012125、CCTCC C201315、CCTCC C201302、CCTCC C201320、CCTCC C201304 以及CCTCC C201316的雜交瘤細(xì)胞中獲得。分離純化編碼抗體的核酸的方法是一種已知的常見(jiàn)的技術(shù)。具體方法可以參見(jiàn)書(shū)籍:[美]J.莎姆布魯克D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，第三版，2002年。
[0054]在一些操作實(shí)例中，編碼本發(fā)明中的單克隆抗體的重鏈的核酸序列可以是由編碼本發(fā)明抗體的Vh結(jié)構(gòu)域的核酸序列與一條編碼任意其它來(lái)源抗體的重鏈恒定區(qū)的組成的同框編碼序列。類似地，一條編碼本發(fā)明的抗EGFR蛋白的輕鏈的核酸分子也可以是由編碼本發(fā)明抗體的'結(jié)構(gòu)域的核酸序列與一條編碼任意其它來(lái)源的抗體的輕鏈恒定區(qū)的組成的同框編碼序列。
[0055]在進(jìn)一步的操作實(shí)例中，編碼重鏈可變區(qū)(Vh)和/或者輕鏈可變區(qū)(')的核酸分子被轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)的抗體編碼基因。在一些操作實(shí)例中，編碼Vh或者\(yùn)結(jié)構(gòu)域的核酸序列被分別通過(guò)插入到已經(jīng)含有重鏈恒定區(qū)(Ch)或者輕鏈恒定區(qū)(CJ的表達(dá)載體中去的方法構(gòu)建為一個(gè)全長(zhǎng)抗體基因。這樣構(gòu)建的全長(zhǎng)抗體基因的Ch的片段與Q的片段在載體內(nèi)部相連接，并且/或者編碼Vh的片段與編碼\的片段在載體內(nèi)部相連接。在另外的操作實(shí)例中，編碼Vh以及/或者\(yùn)結(jié)構(gòu)域的核酸序列分別通過(guò)核酸重組技術(shù)被連接到一個(gè)編碼Ch的片段和/或者編碼Q的片段上面。編碼人類免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的基因是已知的。具體參見(jiàn)著作 Kabat et al., Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5th ed., NIH Publ.N0.91-3242，1991。編碼全長(zhǎng)重鏈和/或者輕鏈的核酸分子可以在被引入和純化EGFR抗體的細(xì)胞株中表達(dá)。
[0056]可以使用核酸分子實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)大量的EGFR抗體。也可以用核酸分子來(lái)生產(chǎn)嵌合抗體，雙特異性結(jié)合抗體，單鏈抗體，免疫粘附劑，雙頭抗體，突變抗體以及抗體衍生物。如果該核酸分子來(lái)自于非人類、非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該核酸分子也可能被用來(lái)實(shí)現(xiàn)抗體的人源化。
[0057]本發(fā)明還包括插入有編碼抗體重鏈、輕鏈或者同時(shí)編碼本發(fā)明的EGFR抗體或者其抗原結(jié)合部位的核酸分子。該載體可能適合于在原核宿主細(xì)胞,例如酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明中的抗體或者其抗原結(jié)合部位。
[0058]常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括很多永生細(xì)胞系都可以用來(lái)作為表達(dá)宿主。這些細(xì)胞系包括但不限于:中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，NSO細(xì)胞，SP2細(xì)胞，HEK293T細(xì)胞，293Freestyle(Invitrogen公司)，NIH3T3細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)，非洲綠猴腎細(xì)胞，人類肝癌細(xì)胞(如HepG2)，以及A549細(xì)胞。其它可以用于表達(dá)的細(xì)胞有昆蟲(chóng)細(xì)胞，包括sf9和sf21細(xì)胞。植物宿主細(xì)胞包括:煙草，擬南芥，浮萍，玉米，小麥，番茄，水稻來(lái)源的細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞包括大腸桿菌和放線菌。酵母宿主包括裂殖酵母，釀酒酵母，畢赤酵母。
[0059]利用不同的細(xì)胞系在不同的培養(yǎng)條件下，或者利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的抗體能夠有不同的糖基化模式。但是不論其糖基化模式是怎樣的，所有由所述的核酸或者含有所述核酸的序列編碼的抗體都是本發(fā)明的內(nèi)容。
[0060]嵌合與人源化抗體
[0061]這里所說(shuō)的嵌合抗體，其特征在于有來(lái)自于兩種或者更多種不同的抗體的結(jié)構(gòu)域組成的抗體。例如，嵌合抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域可能是來(lái)自于保藏號(hào)為CCTCC C201301、CCTCC C2012127,CCTCC C2012118,CCTCC C20I303,CCTCC C2012125,CCTCC C201315,CCTCCC201302,CCTCC C2013 20,CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體，但是其恒定區(qū)可能是來(lái)自于人類抗體。這種嵌合抗體在作為人類的治療藥物時(shí)具有較少的免疫原性。
[0062]在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明抗體的人源化抗體是一種將本發(fā)明中的來(lái)源于老鼠的抗體的CDR結(jié)構(gòu)域插入到人類受體抗體中去。因此，嵌合抗體的FR和恒定區(qū)域來(lái)自于人類。這種含有人類FR區(qū)域的人源化EGFR抗體在人類身上比只是恒定區(qū)來(lái)自于人類的嵌合抗體具有更小的免疫原性。在一些操作實(shí)例中，人源化抗體的CDR序列可以是來(lái)自于保藏號(hào)為 CCTCC C20130KCCTCC C2012127,CCTCC C2012118,CCTCC C201303,CCTCC C2012125、CCTCC C201315,CCTCC C201302,CCTCC C201320,CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體?？贵w人源化的方法是一種已知的成熟技術(shù)。
[0063]修飾與標(biāo)簽抗體
[0064]本發(fā)明還包括以上所描述的抗EGFR單克隆抗體或其抗原結(jié)合部位被至少一種額外分子或集團(tuán)修飾而成的抗體。該修飾可以是用于純化或者檢測(cè)該抗體的，以及/或者增強(qiáng)其治療效果。例如，抗體或者抗原結(jié)合部位可以連接到一種檢測(cè)試劑、標(biāo)簽、細(xì)胞毒性試劑、藥物分子以及/或者蛋白或多肽，以便接到該抗體或者其抗原結(jié)合部位與其它一種分子(例如親和素核心區(qū)域，或者多聚組氨酸標(biāo)簽)的結(jié)合。常見(jiàn)的檢測(cè)標(biāo)簽包括但不限于:放射性同位素(例如125I，131I，35S or3H)，熒光復(fù)合物(例如熒光素，二氯三嗪氨熒光素，異硫氰酸熒光素，羅丹明，5- 二甲氨基-1-萘磺酰氯苯，熒光素PE，稀土發(fā)光物，傘形酮，丹磺酰氯)，以及酶(例如辣根過(guò)氧化物酶，O-半乳糖苷酶，β -半乳糖苷酶，熒光素酶，堿性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，乙酰膽堿酯酶)。在進(jìn)一步的操作實(shí)例中，本發(fā)明所述抗體或者其部分可以被標(biāo)記生物素，或者已經(jīng)證明可以被另一個(gè)報(bào)告分子(例如亮氨酸拉鏈配對(duì)區(qū)域，二抗結(jié)合位點(diǎn)，金屬集合結(jié)構(gòu)域，表位標(biāo)簽)識(shí)別的多肽表位。在更進(jìn)一步的操作實(shí)例中，任意一種抗體或者其部分可以利用聚乙烯醇(PEG)，甲基或乙基或者糖基經(jīng)行修飾。
[0065]抗EGFR抗體或者其抗原結(jié)合部位的診斷用途
[0066]本發(fā)明的一個(gè)方面是使用所述的抗EGFR抗體或者其抗原結(jié)合部位作為一種癌癥診斷試劑。癌癥指的是任意一種惡性腫瘤，包括任何階段和級(jí)別的癌癥。可能用本發(fā)明的單克隆抗體診斷的癌癥具體例子包括但是不限于:肺癌，非小細(xì)胞肺癌，直腸癌，結(jié)腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，膠質(zhì)瘤，腦癌。
[0067]診斷包括檢測(cè)癌癥的發(fā)展程度，確認(rèn)癌癥的存在，或者癌癥的分型或分類。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明可以提供一種診斷目標(biāo)中癌癥的方法，其步驟包括:用本發(fā)明所述的抗EGFR單克隆抗體接觸來(lái)自于檢測(cè)目標(biāo)的生物學(xué)樣本；檢測(cè)抗體或者其部分與樣本是否結(jié)合；如果抗體與樣本存在結(jié)合則表明被檢測(cè)主體是癌癥，或者存在發(fā)展成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)的樣本可以是血液，血清，淋巴，組織(例如穿刺或者甲醛和石蠟固定的包被切片)。
[0068]抗體結(jié)合到樣本上與否可以用常見(jiàn)的的已知技術(shù)檢測(cè)，包括但是不限于:ELISA，RIA,流式細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)，免疫組織化學(xué)，免疫熒光，免疫印跡，或者免疫共沉淀?？笶GFR抗體或者其部分也可以用一種可以檢測(cè)的標(biāo)記物直接標(biāo)記。如果抗體沒(méi)有被標(biāo)記，則可以使用一種能夠結(jié)合EGFR抗體并能夠被檢測(cè)到的二抗或者其它分子。根據(jù)已有的常識(shí)，特定的二抗能夠特異性地結(jié)合特定的種類和亞型的一抗。例如，如果抗EGFR抗體是一種小鼠IgG，則二抗必須是一種標(biāo)記的抗小鼠IgG的抗體。其它能夠結(jié)合抗體的分子包括但是不限于Protein A和Protein G。他們都有多種商業(yè)化的形式。例如來(lái)自Pierce公司的Protein A和Protein G。適合用來(lái)標(biāo)記抗體或者二抗的分子包括但是不限于:酶,輔基,突光材料，發(fā)光材料，磁性材料以·及放射性材料(見(jiàn)上文描述)。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明的抗體或者其部分可以提供在一種包含檢測(cè)抗體結(jié)合試劑的試劑盒中。
[0069]抗EGFR抗體或者其部分還可以用來(lái)檢查癌癥病人的發(fā)展進(jìn)程，然后決定采取哪一種治療治療方案。例如在治療方案的伴隨檢測(cè)中。醫(yī)務(wù)人員可能根據(jù)EGFR突變的檢測(cè)結(jié)果來(lái)決定對(duì)特定病人最優(yōu)的治療方案。治療方案可以是手術(shù),放射性治療,藥物治療(包括化學(xué)治療與靶向治療)，或者以上多種治療方式的結(jié)合。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明包括一種治療癌癥病人的方法，其特征在于包括:檢查來(lái)自病人的生物樣本是否帶有EGFR G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 或者 V769L 突變；如果存在某種突變則對(duì)病人給予EGFR抑制劑治療。EGFR抑制劑可能是一種反義RNA (antisense RNA),小干涉RNA (siRNA)，微小RNA (miRNA)藥物，抗EGFR單克隆抗體藥物。在給予病人抗EGFR物的靶向治療之前檢測(cè)是否存在EGFR突變對(duì)于治療十分有意義。
[0070]抗EGFR抗體及其抗原結(jié)合部位的治療應(yīng)用
[0071]本發(fā)明同樣提供一種抗體及其抗原結(jié)合部位作為治療性藥物的應(yīng)用包括用本發(fā)明的抗體或者其部分作為治療人類的應(yīng)用，以及使用抗體或者其部分作為制造用于治療人類癌癥藥物的應(yīng)用。這些人類癌癥包括直腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。詳細(xì)的癌癥種類亦可參閱上文的描述。[0072]在一些操作實(shí)例中，醫(yī)務(wù)人員給予能夠?qū)μ囟膊∵_(dá)到有效劑量的本發(fā)明的抗體或者部分，一般是一種嵌合的或者人源化的抗體或者部分，從而實(shí)現(xiàn)減緩或者治療該疾病，防止癌癥轉(zhuǎn)移或者進(jìn)一步發(fā)展。抗體的給藥方式可以是例如:注射或者浸注。抗體或者部分的劑量可以由醫(yī)務(wù)人員決定，大致范圍為0.1到100毫克/公斤體重，更優(yōu)地為0.5到50毫克/公斤體重，更優(yōu)地為I到20毫克/公斤體重，更優(yōu)地為I到10毫克/公斤體重。治療的效果可以通過(guò)監(jiān)測(cè)例如腫瘤體積縮小的程度來(lái)說(shuō)明。
[0073]本發(fā)明的治療性藥物的成分除了所述的單克隆抗體或者其部分以外，可能包括一種可接受的藥劑載體。可接受的藥劑載體其特征在于，可以是一種溶劑，分散劑，包被劑，抗菌劑和抗真菌劑，滲透平衡劑和吸附延緩劑，其特征是具有生理兼容性。在很多情況下，優(yōu)先的載體包括滲透平衡劑，例如糖類，多聚醇如甘露醇，山梨醇，氯化鈉組分。其它可以接受的藥劑材料包括濕潤(rùn)劑或者少量的輔劑，例如濕潤(rùn)劑，乳化劑，保護(hù)劑或緩沖液，它們能夠增加抗體的保質(zhì)期或者效果。
[0074]在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明的抗EGFR抗體或者其部分被與其它一種和/或者多種治療藥物，診斷藥物，或者預(yù)防劑混合在一起。治療藥物包括但不限于具有不同細(xì)微特異性差異的結(jié)合不同靶標(biāo)的抗EGFR抗體，以及EGFR抑制劑，例如抑制劑可以是西妥昔單抗(cetuxmab)，中白尼單抗(panitumumab)，Necitumumab, Nimotuzumab,吉非替尼(gefitinib),厄洛替尼(erlotinib)，拉帕替尼(Iapatinib),凡德他尼(Vandetanib),PF299804, R05083945, ABT-806，AP-26113，Afatinib(BIBW2992), Canertinib (C1-1033),Neratinib (HK1-272)，CP-724714，TAK-285，AST-1306，ARRY334543, Lapatinib, Arry-380,Dacomitinib (PF-299804)，WH1-P154，Desmethyl Erlotinib (CP-473420), DesmethylErlotinib (0S1-420)，AZD8931, AEE788 (NVP-AEE788)，Pelitinib (EKB-569)，CUDC-101,WZ804, WZ4002, WZ3146, XL647, PD-153035， PD-174265， PD158780, BMS-599626(AC480)，Lavendustin A, Lavendustin C, BIBU-1361, Hypericin, BIBX-1382, DAPH, ErbstatinAnalog, JNJ28871063, R0106-9920, GW2974, GW583340,PD-153035,PD-158780,PD-168393，Tyrphostin AG-183, Tyrphostin AG-99, Tyrphostin AG-825, Tyrphostin B42 (AG-490),Tyrphostin AG-494, Tyrphostin AG-555, Tyrphostin AG-527, Tyrphostin AG-528,Tyrphostin AG-835, TyrphostinAG-1478, Tyrphostin RG-14620, Daphnetin, BPIQ,BPIQ-1，BPIQ-1I，CL-387, 785，`EGFR Inhibitor (K00598a), LFM-Al2,Pelitinib,PKC-412，PP3 (5334-30-5)，SU5402, HDS029, WH1-P154, TAK165, Vatalanib。
[0075]本發(fā)明的藥劑組成可能含有一種“治療有效劑量”或者“預(yù)防有效量”的本發(fā)明的抗體或者抗原結(jié)合部位?！爸委熡行┝俊笔侵冈谝欢ǖ寞煶毯蛣┝肯?，要達(dá)到有治療效果的有效藥物量?？贵w及其抗原結(jié)合部分的治療有效劑量可能根據(jù)多種因素，例如疾病進(jìn)程，年齡，性別，體重，以及抗體或者抗體部分能夠在個(gè)體內(nèi)所引起的反應(yīng)能力而有所不同。治療有效劑量也包含了該抗體或者抗原結(jié)合部位的有利作用強(qiáng)于任何毒性或者不利作用的意思?！邦A(yù)防有效量”是指在一定的療程和劑量下，要達(dá)到有預(yù)防效果的有效藥物量。通常由于預(yù)防藥物都是在疾病發(fā)生之前或者疾病早期使用，因此預(yù)防有效量可能會(huì)小于治療有效量。
[0076]除非特別聲明，這里所用的所有的技術(shù)或者科學(xué)屬于都與一般熟知本發(fā)明領(lǐng)域的人員的常識(shí)相一致?？尚Х碌姆椒ê筒牧显谙旅鎸⑦M(jìn)行詳細(xì)描述，盡管與這里描述的相似或者同樣的方法和材料也可以用來(lái)檢驗(yàn)本發(fā)明。所有的參考文獻(xiàn)都詳細(xì)列出。盡管引用了大量的文獻(xiàn)，但是這些引用并不表明承認(rèn)任何文獻(xiàn)是該領(lǐng)域的常識(shí)。本專利描述過(guò)程中使用的“包含” “包括”應(yīng)當(dāng)被理解為表明包含所述的完整對(duì)象或者群體對(duì)象，而不是排除任何其他的對(duì)象或者群體對(duì)象。材料、方法和實(shí)例僅是為了說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非限制。
[0077]以下實(shí)例是為了描述本發(fā)明的方法與材料。對(duì)描述的條件或參數(shù)適當(dāng)?shù)男薷幕蛘咄忍鎿Q通常符合本領(lǐng)域技術(shù)人員的明顯常識(shí)，因此依然屬于本發(fā)明的精神和范圍。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0078]圖1顯示保藏號(hào)為CCTCC C201301的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR G719A蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型EGFR G719A蛋白；
[0079]圖2顯示保藏號(hào)為CCTCC C2012127的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR G719C蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型EGFR G719C蛋白；[0080]圖3顯示保藏號(hào)為CCTCC C2012118的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR G719S蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型EGFR G719S蛋白；
[0081]圖4顯示保藏號(hào)為CCTCC C201303的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR D761Y蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型EGFR D761Y蛋白；
[0082]圖5顯示保藏號(hào)為CCTCC C2012125的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR L858R蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型EGFR L858R蛋白；
[0083]圖6顯示保藏號(hào)為CCTCC C201315的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR L861Q蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型EGFR L861Q蛋白；
[0084]圖7顯示保藏號(hào)為CCTCC C201302的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR A839T蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型EGFR A839T蛋白；
[0085]圖8顯示保藏號(hào)為CCTCC C201320的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR N826S蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型EGFR N826S蛋白；
[0086]圖9顯示保藏號(hào)為CCTCC C201304的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR G863D蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型EGFR G863D蛋白；
[0087]圖10顯示保藏號(hào)為CCTCC C201316的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR V769L蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型EGFR蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型EGFR V769L蛋白；
[0088]圖11顯示保藏號(hào)為CCTCC C201301的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR G719A蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR G719A蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)EGFR G719A蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)；
[0089]圖12顯示保藏號(hào)為CCTCC C2012127的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR G719C蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR G719C蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)EGFR G719C蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)；
[0090]圖13顯示保藏號(hào)為CCTCC C2012118的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR G719S蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR G719S蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)EGFR G719S蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)；
[0091]圖14顯示保藏號(hào)為CCTCC C201303的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR D761Y蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR D761Y蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)EGFR D761Y蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)；
[0092]圖15顯示保藏號(hào)為CCTCC C2012125的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR L858R蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR L858R蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與EGFR 蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)EGFR L858R蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)；
[0093]圖16顯示保藏號(hào)為CCTCC C201315的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR L861Q蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR L861Q蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)EGFR L861Q蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)；
[0094]圖17顯示保藏號(hào)為CCTCC C201302的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR A839T蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR A839T蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)EGFR A839T蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)；
[0095]圖18顯示保藏號(hào)為CCTCC C201320的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR N826S蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR N826S蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)EGFR N826S蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)；
[0096]圖19顯示保藏號(hào)為CCTCC C201304的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR G863D蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR G863D蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)EGFR G863D蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)；
[0097]圖20顯示保藏號(hào)為CCTCC C201316的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合EGFR V769L蛋白，卻不能結(jié)合野生型的EGFR蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型EGFR (上面)和突變型EGFR V769L蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與EGFR蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)EGFR V769L蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0098]實(shí)施例1
[0099]特異性結(jié)合EGFR突變蛋白的單克隆抗體的生產(chǎn)
[0100]含有EGFR突變蛋白氨基酸序列的多肽通過(guò)合成獲得。詳細(xì)的多肽序列在下表中列出，相對(duì)野生型蛋白的突變氨基酸加下劃線標(biāo)示:
[0101]表1突變的EGFR多肽
[0102]
EGFR突變~j多肽序列(突變氨基酸加下劃線)

G719AETEFKKIKVLASGAFGTV(SEQ ID NO:1)

G719CETEFKKIKVLCSGAFGTV(SEQ ID NO:2)

G719SETEFKKIKVLSSGAFGTV(SEQ ID NO:3)

D761YEATSPKANKEILYEAYVM(SEQ ID NO:4)

L858RKTPQHVKITDFGRAKLLG(SEQ ID NO:5)

L861QITDFGLAKQLGAEEKE(SEQ ID NO:6)

A839TDRRLVHRDLTARNVLVKTP(SEQ ID NO:7)

N826SIAKGMSYLEDRRLVHR(SEQ ID NO:8)

G863DITDFGLAKLLDAEEKE(SEQ ID NO:9)

V769LEAYVMASLDNPHV(SEQ ID NO:10)
[0103]每條合成的多肽都被偶聯(lián)到琥拍酰化鑰孔慽血蘭蛋白(keyhole Iimpethemocyanin,KLH)上，用來(lái)免疫小鼠，并利用弗氏佐劑混合增強(qiáng)免疫效果。將用以上多肽免疫的抗EGFR G719A、G719C、G719S、D761Y、L858R和L861Q小鼠的脾臟細(xì)胞分別與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞通過(guò)聚乙烯醇(PEG)介導(dǎo)融合。用ELISA實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆細(xì)胞注射到相同品系的小鼠腹腔，產(chǎn)生腹水。從腹水中純化抗體。
[0104]通過(guò)用含有突變的EGFR蛋白的多肽免疫小鼠產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，湖北省武漢市武漢大學(xué)，430072).雜交瘤細(xì)胞的名稱和保藏編號(hào)在下表中列出。
[0105]表2抗EGFR雜交瘤細(xì)胞株 以及保藏編號(hào)
[0106]
抗體及其特異性j保藏編號(hào)
Ant1-EGFR G719A~CCTCC C201301
【權(quán)利要求】
1.特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體，其特征在于，不能識(shí)別EGFR野生型蛋白的單克隆抗體，或者抗原結(jié)合蛋白，該單克隆抗體特異性識(shí)別的EGFR突變蛋白包括:第719位的甘氨酸(Glycine，G)突變?yōu)楸彼?Alanine，A)的突變蛋白(EGFR G719A);第719位的甘氨酸(G)突變?yōu)榘腚装彼?C)的突變蛋白(EGFR G719C);第719位的甘氨酸(Glycine, G)突變?yōu)榻z氨酸(Serine，S)的突變蛋白(EGFR G719S);第761位的天冬氨酸(Asparatic Acid, D)突變?yōu)槔野彼?Tyrosine, Y)的突變蛋白(EGFR D761Y);第 858 位的亮氨酸(Leucine，L)突變?yōu)榫彼?Arginine，R)的突變蛋白(EGFR L858R);第861位的亮氨酸(Leucine, L)突變?yōu)楣劝滨０?Glutamine, Q)的突變蛋白(EGFR L861Q);第839位的丙氨酸(Alanine，A)突變?yōu)樘K氨酸(Threonine, T)的突變蛋白(EGFR A839T);第826位的天冬酰胺(Asparagine, N)突變?yōu)榻z氨酸(Serine, S)的突變蛋白(EGFR N826S);第863位的甘氨酸(Glycine,G)突變?yōu)樘於彼?Asparatic Acid,D)的突變蛋白(EGFR G863D);第769位的纈氨酸(Valine, V)突變?yōu)楣攘涟彼?Leucine，L)的突變蛋白(EGFR V769L)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID NO:1的EGFR蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID N0:2的EGFR蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID N0:3的EGFR蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID N0:4的EGFR蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID N0:5的EGFR蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID N0:6的EGFR蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID N0:7的EGFR蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID N0:8的EGFR蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID N0:9的EGFR蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID NO: 10的EGFR蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括抗原結(jié)合部位，由一條重鏈和一條輕鏈組成；重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的氨基酸序列分別是由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號(hào)為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118,CCTCC C20I303,CCTCC C2012125、CCTCC C201315,CCTCCC201302,CCTCC C201320,CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的氨基酸序列決定。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括抗原結(jié)合部位，所述雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體重鏈和輕鏈的組成分別包含重鏈和輕鏈的可變區(qū)域。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括抗原結(jié)合部位，包含有所述的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體，其特征在于，包括抗原結(jié)合部位，是一種人源化或者嵌合型抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求2至13及15任一項(xiàng)所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述單克隆抗體是一種IgG。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體，其特征在于，保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)的保藏號(hào)為CCTCC C201301、CCTCC C2012127、CCTCC C2012118、CCTCC C201303、CCTCCC2012125、CCTCC C201315、CCTCC C201302、CCTCCC201320、CCTCC C201304 以及 CCTCC C201316 的十株雜交瘤細(xì)胞。
18.特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，該單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位的藥物，以及可以藥用的載體。
19.特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種診斷EGFR突變的診斷試劑盒，其組成含有權(quán)利要求1至14所述的任意一種單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位。
20.特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種診斷腫瘤的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)用權(quán)利要求1至14所述的任意一種單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位接觸需要檢測(cè)的生物樣本； (2)檢測(cè)單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位是否與樣本發(fā)生結(jié)合，而結(jié)合指示樣本存在癌癥或者發(fā)展成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷方法中，常見(jiàn)的癌癥類型包括:肺癌，非小細(xì)胞肺癌，直腸癌，結(jié)腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，膠質(zhì)瘤，腦癌。
22.特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種治療癌癥病人的方法，其特征在于: (1)檢測(cè)來(lái)自于病人的生物學(xué)樣品中是否含有EGFRG719A、G719C、G719S、D761Y、L858R、L861Q、A839T、N826S、G863D 或者 V769L 突變； (2)如果存在上述突變，對(duì)該病人給予EGFR蛋白抑制劑的治療。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述治療方法中，EGFR蛋白抑制劑包括:反義RNA (antisense RNA)，小干涉RNA (siRNA)，微小RNA (miRNA)藥物，抗EGFR單克隆抗體藥物。EGFR抑制劑可以是西妥昔單抗(cetuxmab)，中白尼單抗(panitumumab)，Necitumumab, Nimotuzumab,吉非替尼(gefitinib),厄洛替尼(erlotinib)，拉帕替尼(Iapatinib),凡德他尼(Vandetanib),PF299804, R05083945, ABT-806，AP-26113，Afatinib (BIBW2992), Canertinib (C1-1033),Neratinib (HK1-272)，CP-724714，TAK-285，AST-1306，ARRY334543, Lapatinib, Arry-380,Dacomitinib(PF-299804)， WH1-P154, Desmethyl Erlotinib(CP-473420), DesmethylErlotinib (0S1-420)，AZD8931, AEE788(NVP-AEE788)，Pelitinib(EKB-569)，CUDC-1Ol,WZ804, WZ4002, WZ3146, XL647, PD-153035, PD-174265， PD158780, BMS-599626(AC480)，Lavendustin A, Lavendustin C, BIBU-1361, Hypericin, BIBX-1382, DAPH, ErbstatinAnalog, JNJ28871063,RO 106-9920,GW2974,GW583340,PD-153035,PD-158780，PD-168393，Tyrphostin AG-183, Tyrphostin AG-99, Tyrphostin AG-825, Tyrphostin B42 (AG-490),Tyrphostin AG-494, Tyrphostin AG-555, Tyrphostin AG-527, Tyrphostin AG-528,Tyrphostin AG-835, Tyrphostin AG-1478, Tyrphostin RG-14620, Daphnetin, BPIQ,BPIQ-1，BPIQ-1I，CL-387, 785，EGFR Inhibitor (K00598a),LFM-Al2,Pelitinib,PKC-412，PP3 (5334-30-5)，SU5402, HDS029, WH1-P154, TAK165, Vatalanib0
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述治療癌癥病人的方法，給予病人含有權(quán)利要求11的組成成分的藥物。
25.根據(jù)權(quán)利要求22或24所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述治療癌癥病人的方法中，常見(jiàn)的癌癥類型包括:直腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。
26.特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求1至15的單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位用于癌癥治療藥物的生產(chǎn)過(guò)程，常見(jiàn)的癌癥種類包括:黑色素癌，直腸癌，甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，或者造血組織癌。
27.特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種純化的核酸分子，包含能夠編碼權(quán)利要求1至15所述單克隆抗體的重鏈或者其一個(gè)抗原結(jié)合部位，或者能夠編碼輕鏈或者其一個(gè)抗原結(jié)合部位，或者能夠同時(shí)編碼二者的核酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種載體分子，含有可以聯(lián)系到該核酸分子的表達(dá)調(diào)控序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種宿主細(xì)胞，含有該核酸分子。
30.特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，包含權(quán)利要求1至14的一種細(xì)胞株，其含有所述的單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部位。
31.特異性識(shí)別EGFR突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種生產(chǎn)單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部位的方法，所生產(chǎn)的抗體或者抗原結(jié)合部位特異性結(jié)合人類突變的EGFR蛋白，而不結(jié)合人類野生型的EGFR蛋白，其步驟包括: (1)根據(jù)權(quán)利要求29，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，或者根據(jù)權(quán)利要求30，在釋放的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞株； (2)提純所述的抗體部分。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK103626871SQ201310137856
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月19日
【發(fā)明者】黃文俊 申請(qǐng)人:武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司