專利名稱：一種與肺癌和淋巴瘤相關(guān)的抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肺癌的檢測(cè)和治療。本發(fā)明還涉及淋巴瘤的檢測(cè)和治療。本發(fā)明包括結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員，尤其是結(jié)合纖連蛋白的ED-A結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生描述從已有的血管生長(zhǎng)新的血管，在成人中很少發(fā)生，但是是多種疾病，包括實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，的典型特征。對(duì)于腫瘤來(lái)說(shuō)，血管發(fā)生必須是直徑生長(zhǎng)超過(guò)幾毫米，腫瘤可以通過(guò)分泌各種生長(zhǎng)因子，例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)來(lái)誘導(dǎo)血管發(fā)生。由血管發(fā)生導(dǎo)致形成的新血管被稱為腫瘤新生血管，旺盛的新生血管是惡性腫瘤的特征。纖連蛋白(FN)是在各種正常組織和體液中廣泛表達(dá)的糖蛋白。它是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的成分，在多種生物進(jìn)程中起作用，包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、瘀血、血栓癥、傷口愈合、組織分化和致癌性轉(zhuǎn)化。通過(guò)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本FN pre-1riRNA的三個(gè)區(qū)(ED_A、ED_B、HICS)的選擇性剪接產(chǎn)生不同的FN同種型,一個(gè)通過(guò)細(xì)胞因子和胞外pH調(diào)節(jié)的過(guò)程(Balzal988 ；CarnemoIlal989 ；Borsil990 ；Borsil99 5)。纖連蛋白包含可進(jìn)行選擇性剪接的兩種類型III球狀額外結(jié)構(gòu)域:ED-A 和 ED-B(ffrench-Constant 1995、Hynes 1990、Kaspar et al.2006)。小鼠纖連蛋白和人纖連蛋白的ED-A是96.7%相同的(在兩個(gè)90個(gè)氨基酸的序列中只有3個(gè)氨基酸不同，見圖2)。已報(bào)道了纖連蛋白ED-A在腫瘤細(xì)胞和實(shí)體腫瘤中的表達(dá)，在乳腺癌(Jacobset al.2002、Matsumoto et al.1999)和肝癌(Oyama et al.1989、Tavian et al.1994)中以mRNA水平，和在纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和黑素瘤中以分離蛋白質(zhì)的水平(Borsi etal.1987)。在免疫組織化學(xué)水平上，已在牙源性腫瘤(Heikinheimo et al.1991)和肝細(xì)胞癌(Koukoulis et al.1995)的細(xì)胞外基質(zhì)中檢測(cè)到了 ED-A的存在。相比之下，在惡性乳腺腫瘤(Koukoulis et al.1993)的基質(zhì)中，在分化良好的腎細(xì)胞癌(Lohi et al.1995)的血管和基底膜中檢測(cè)到了 ED-A。但是，在分化較少的腎細(xì)胞癌(Lohi et al.1995)和甲狀腺乳頭狀癌(Scarpino et al.1999)中，在血管中、基底膜和腫瘤基質(zhì)中檢測(cè)到了 ED-A。也已報(bào)道了 ED-A在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的脈管系統(tǒng)中的存在(Borsi et al.1998)。因此，不同類型腫瘤的ED-A的表達(dá)形式是高度可變的。本文中顯示了 ED-A在肺腫瘤，包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的腫瘤，的新生血管中選擇性表達(dá)。因?yàn)閷?duì)于靜脈給藥的治療劑，腫瘤血管是容易接觸的(Neri andBicknell2005, Rybak et al.2006, Thorpe2004, Trachsel and Neri2006),結(jié)合分子，如結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的抗體分子，代表了新型制劑，其可以被用于治療肺癌，包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的藥物的制備。此外，在本文中顯示了 ED-A在淋巴瘤的新生血管中選擇性表達(dá)。因?yàn)?，?duì)于靜脈給藥的治療劑，血管是容易接觸的(Neri and Bicknell2005, Rybak et al.2006,Thorpe2004, Trachsel and Neri2006),結(jié)合分子,如結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的抗體分子代表了新型制劑，其可以被用于治療淋巴瘤的藥物的制備。腫瘤新生血管(腫瘤血管祀向)治療是用于治療腫瘤的有前途的方法。腫瘤細(xì)胞靶向的目的在于在腫瘤自身內(nèi)部破壞血管，減少血流從而剝奪腫瘤的氧氣和營(yíng)養(yǎng)，造成腫瘤細(xì)胞死亡。

發(fā)明內(nèi)容
本文中提供了抗-ED-A抗體，其選擇性地識(shí)別肺腫瘤(包括小細(xì)胞肺腫瘤和非小細(xì)胞肺腫瘤)的新生血管。本文還提供了抗ED-A抗體，其選擇性地識(shí)別淋巴瘤的新生血管。本發(fā)明提供了結(jié)合纖連蛋白(或稱“纖維連接蛋白”)的額外結(jié)構(gòu)域-A(ED-A)同種型(A-FN)的結(jié)合成員例如抗體分子在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子在用于制備治療肺癌的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明提供了結(jié)合纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域-A(ED-A)同種型(A-FN)的結(jié)合成員例如抗體分子在用于制備治療淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子在用于制備治療淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子的應(yīng)用，用于將結(jié)合到該結(jié)合成員的分子遞呈到肺腫瘤的新生血管。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子的應(yīng)用，用于將結(jié)合到該結(jié)合成員的分子遞呈到肺腫瘤的新生血管。該結(jié)合成員可被用于制造用于遞呈這種分子的藥物。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子的應(yīng)用，用于將結(jié)合到該結(jié)合成員的分子遞呈到淋巴瘤的新生血管。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子的應(yīng)用，用于將結(jié)合到該結(jié)合成員的分子遞呈到淋巴瘤的新生血管。該結(jié)合成員可被用于制造用于遞呈這種分子的藥物。本發(fā)明提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子在用于制造在肺癌診斷中使用的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子在制造用于肺癌診斷的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子在用于制造在淋巴瘤斷中使用的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，在制造用于淋巴瘤診斷的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了檢測(cè)和診斷人和動(dòng)物的肺癌的方法，其包含以下步驟:(a)將結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人和動(dòng)物，和(b)確定該結(jié)合成員在人和動(dòng)物體的肺中是否存在；其中該結(jié)合成員在肺中的定位顯示了肺癌的存在。本發(fā)明還提供了檢測(cè)和 診斷人和動(dòng)物的淋巴瘤的方法，其包含以下步驟:
(a)將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人和動(dòng)物，和(b)確定該結(jié)合成員在人和動(dòng)物體的淋巴系統(tǒng)中是否存在；其中該結(jié)合成員在淋巴系統(tǒng)中的定位顯示了淋巴瘤的存在。本發(fā)明提供了治療個(gè)體的肺癌的方法，包括將治療有效量的包含了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子的藥物給藥于個(gè)體。本發(fā)明還提供了治療個(gè)體的肺癌的方法，包含將治療有效量的包含了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，的藥物給藥于個(gè)體。本發(fā)明提供了治療個(gè)體的淋巴瘤的方法，包括將治療有效量的包含了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子的藥物給藥于個(gè)體。本發(fā)明還提供了治療個(gè)體的淋巴瘤的方法，包括將治療有效量的包含了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子的藥物給藥于個(gè)體。本發(fā)明提供了將分子遞呈給人或動(dòng)物的肺腫瘤新生血管的方法，包括將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人或動(dòng)物，其中該結(jié)合成員連接該分子。本發(fā)明還提供了將分子遞呈給人或動(dòng)物的肺腫瘤新生血管的方法，包括將結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人或動(dòng)物，其中該結(jié)合成員連接(conjugate)該分子 。本發(fā)明提供了將分子遞呈給人或動(dòng)物的淋巴瘤新生血管的方法，包括將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人或動(dòng)物，其中該結(jié)合成員連接該分子。本發(fā)明還提供了將分子遞呈給人或動(dòng)物的淋巴瘤新生血管的方法，包括將結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人或動(dòng)物，其中該結(jié)合成員連接該分子。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以是結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的抗體，包含抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9或其變異體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員是結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的抗體，包含B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9或其變異體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。最優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員是結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的抗體，包含抗體F8或其變異體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的一組 H 和 / 或 L CDR,或抗體 H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8 或 G9 的一組 H 和 / 或L⑶R，并且在公開的H和/或L⑶R組中具有10個(gè)或更少，如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸取代。優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員包含抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9的一組H和/或L⑶R，并且在所公開的H和/或L⑶R組中具有10個(gè)或更少，如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸取代。優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員包含抗體F8的一組H和/或L⑶R，并且在所公開的H和/或L CDR組中具有10個(gè)或更少，如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸取代。可能在⑶R組中的任何殘基上潛在地進(jìn)行取代，可能在⑶Rl、OTR2和/或⑶R3中。例如，本發(fā)明中使用的結(jié)合成員可以包含如本文所描述的一個(gè)或多個(gè)CDR，例如⑶R3，并且可選地還有⑶Rl和⑶R2從而形成一組⑶R。用于本發(fā)明的結(jié)合成員還包含抗體分子，例如，人抗體分子。該結(jié)合成員通常包含抗體VH和/或VL域。還提供結(jié)合成員的VH域用于本發(fā)明。在每個(gè)VH和VL域中是互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)和構(gòu)架區(qū)(FR)。VH域包含一組HCDR，V1域包含一組IXDR。抗體分子可以包含含有VH⑶R1、⑶R2和⑶R3和構(gòu)架的抗體VH域。它可替換地或者還包含含有VL⑶R1、CDR2和CDR3和構(gòu)架的抗體VL域。在本文描述了抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的VH和VL域和⑶R。本文中公開的所有VH和VL序列、⑶R序列、⑶R組和HCDR組和LCDR組代表了用于本發(fā)明的結(jié)合成員的實(shí)施例。如本文中所描述的，“CDR組”(或稱“一組CDR” )包含 CDR1、CDR2 和 CDR3。因此，一組 HCDR(或稱 “HCDR 組”)是指 HCDR1、HCDR2 和HCDR3，一組IXDR (或稱“IXDR組”)是指IXDR1、IXDR2和IXDR3。除非另有說(shuō)明，“⑶R組”包括HCDR和LCDR。在本發(fā)明中使用的結(jié)合成員可包括包含了互補(bǔ)決定區(qū)HCDRl、HCDR2和HCDR3和構(gòu)架的抗體 VH 域，其中 HCDRl 是 SEQ ID NO:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103 或 113，其中可選地，HCDR2 是 SEQ ID NO:4 和 / 或 HCDR3 是 SEQ ID NO:5。優(yōu)選，HCDRl 是 SEQ ID NO:23、33、43、53、73、83 或 103。最優(yōu)選，HCDRl 是 SEQ ID NO:83。通常，VH域與VL域配對(duì)從而提供抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，盡管如下文中進(jìn)一步討論的可單獨(dú)使用VH或VL域來(lái)結(jié)合抗原。因此，用于本發(fā)明的結(jié)合成員還可以包括包含了互補(bǔ)決定區(qū)LCDRULCDR2和LCDR3和構(gòu)架的抗體VL域，其中LCDRl是SEQ ID NO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106 或 116，其中可選地，LCDR2 是 SEQ ID NO:7 和 / 或 LCDR3 是 SEQ IDN0:8。優(yōu)選，LCDRl 是 SEQ ID NO:26、36、46、56、76、86 或 106。最優(yōu)選，LCDRl 是 SEQ IDNO:86o用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以為纖連蛋白的ED-A的分離的抗體分子，包含VH域和VL域，其中VH域包含構(gòu)架和一組互補(bǔ)決定區(qū)HCDRl、HCDR2和HCDR3，其中VL域包含互補(bǔ)決定區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3和構(gòu)架，其中HCDRl具有氨基酸序列SEQ ID NO:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103 或 113，HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:4,
HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:5，LCDRl 具有氨基酸序列 SEQ ID NO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106 或 116 ；LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:7 ;和LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:8。抗體的一個(gè)或多個(gè)⑶R或一組⑶R可以被移植到一個(gè)構(gòu)架中(例如，人構(gòu)架)從而產(chǎn)生用于本發(fā)明的抗體分子。構(gòu)架區(qū)可以包含人種系基因片段序列。因此，構(gòu)架可以為種系，由此構(gòu)架中的一個(gè)或多個(gè)殘基可以被改變從而匹配最相似的人種系構(gòu)架中的等效位置的殘基。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可為具有包含在人種系構(gòu)架(例如DP47)中的一組HCDR的VH域的分離的抗體分子。通常，該結(jié)合成員還具有包含在人種系構(gòu)架中的一組LCDR的VL域的分離的抗體分子。VL域的人種系構(gòu)架可以為DPK22。用于本發(fā)明的VH域可以具有氨基酸序列SEQ ID NO:1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。優(yōu)選，用于本發(fā)明的VH域具有氨基酸序列SEQ ID NO:21、31、41、51、71、81或101。最優(yōu)選，用于本發(fā)明的VH域具有氨基酸序列SEQ ID N0:81。用于本發(fā)明的VL域可以具有氨基酸序列SEQ ID NO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。優(yōu)選，用于本發(fā)明的VL域具有氨基酸序列SEQ ID N0:22、32、42、52、72、82或102。最優(yōu)選，用于本發(fā)明的VL域具有氨基酸序列SEQ ID NO:82。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以為單鏈Fv(ScFv),包含通過(guò)連接肽(或肽連接子)連接的VH域和Vl域。技術(shù)人員可以選擇合適長(zhǎng)度和序列的連接(子)，例如至少5或10個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，達(dá)到約15、20或25個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。該連接(子)可以具有氨基酸序列GSSGG (SEQ ID NO:28)。scFv可以由氨基酸序列SEQ ID NO:9組成或包含氨基酸序列SEQID NO:9?；蛘撸糜诒景l(fā)明的結(jié)合成員可在非抗體分子中包含抗原結(jié)合位點(diǎn)，通常通過(guò)在非抗體蛋白質(zhì)支架中的一個(gè)或多個(gè)CDR，例如一組CDR來(lái)提供。在本文的其它地方更詳細(xì)的描述了包括非抗體和抗體分子的結(jié)合成員。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以連接具有生物殺滅活性或細(xì)胞毒素活性的分子?；蛘?，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以連接放射性同位素。作為另外一個(gè)選擇，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以用可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的這些和其它方面。


圖1:顯示了用scFv抗ED-A抗體D5的原發(fā)肺腫瘤切片的免疫組織化學(xué)染色。I縱欄顯示了肺癌的分類:A:小細(xì)胞肺癌，B:非小細(xì)胞肺癌，C:鱗狀細(xì)胞癌，D:腺癌，E:細(xì)支氣管肺泡癌和F:大細(xì)胞癌。2和3縱欄:顯示了不同亞類型的肺腫瘤的組織切片中的ED-A的免疫組織化學(xué)檢測(cè)?？v欄2和3中顯示的每一亞類型的組織切片從相同的腫瘤樣品獲得。免疫組織化學(xué)染色(暗線)顯示出在A:小細(xì)胞肺癌和B:非小細(xì)胞肺癌中的原發(fā)腫瘤切片中染色的強(qiáng)烈(strong，濃)的血管圖案(C:鱗狀細(xì)胞癌，D:腺癌，E:細(xì)支氣管肺泡癌和F:大細(xì)胞癌)。圖2:顯示了 A:人ED-A (上部的序列)和B:小鼠ED-A (下部序列)之間的比對(duì)。星號(hào)顯示人ED-A和小鼠 ED-A的氨基酸相同的氨基酸位置。圖3A:顯示了抗ED-A抗體Hl的重鏈(VH)的核苷酸序列(SEQ ID NO:12)。抗ED-A抗體Hl的重鏈⑶Rl的核苷酸序列是有下劃線的。抗ED-A抗體Hl重鏈⑶R2的核苷酸序列以斜體和下劃線表示?？笶D-A抗體Hl重鏈CDR3的核苷酸序列以粗體和下劃線表示。B:顯示了抗ED-A抗體Hl連接(子)序列的核苷酸序列(SEQ ID N0:14)。C:顯示了抗ED-A抗體Hl的輕鏈(VL)的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)?？笶D-A抗體Hl的輕鏈CDRl的核苷酸序列以下劃線表示?？笶D-A抗體Hl的輕鏈CDR2的核苷酸序列以斜體和下劃線表示?？笶D-A抗體Hl的輕鏈CDR3的核苷酸序列以粗體和下劃線表示。圖4A:顯示了抗ED-A抗體Hl重鏈(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。抗ED-A抗體Hl重鏈⑶Rl的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)以下劃線表示?？笶D-A抗體Hl重鏈⑶R2的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)以斜體下劃線表示?？笶D-A抗體Hl重鏈⑶R3的氨基酸序列(SEQ ID N0:5)以粗體下劃線表示。B:顯示了抗ED-A抗體Hl連接(子)序列的氨基酸序列(SEQ ID N0:11)。C:顯示了抗ED-A抗體Hl的輕鏈(VL)的氨基酸序列(SEQ ID NO:
2)?？笶D-A抗體Hl的輕鏈CDRl的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)是有下劃線的?？笶D-A抗體Hl的輕鏈CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)是以斜體和下劃線表示的?？笶D-A抗體Hl的輕鏈CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)是以粗體和下劃線表示的。
具體實(shí)施例方式專用術(shù)語(yǔ)纖連蛋白纖連蛋白是進(jìn)行選擇性剪接的抗原，已知數(shù)種可選的纖連蛋白同種型，如在本文其它部分所描述的。額外結(jié)構(gòu)域_A(EDA*ED-A)還被稱為ED，額外類型III重復(fù)A (EliIA)或EDI。Kornblihtt等(1984)，Nucleic Acids Res.12，5853-5868和Paolella等(1988)，Nucleic Acids Res.16, 3545-3557 已經(jīng)公布了人 ED-A 的序列。還可以從 SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)以登陸號(hào)為P02751存儲(chǔ)的氨基酸序列的氨基酸1631-1720(纖連蛋白類型-1II12 ;額外結(jié)構(gòu)域2)獲得人ED-A序列。可以從SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)以登陸號(hào)為P11276存儲(chǔ)的氨基酸序列的氨基酸1721-1810(纖連蛋白III型13 ;額外結(jié)構(gòu)域2)獲得小鼠ED-A序列。纖連蛋白的ED-A同種型(A-FN)包含額外結(jié)構(gòu)域_A (ED-A)。人A-FN的序列可以從相應(yīng)的人纖連蛋白前體序列(其可以登陸號(hào)P092751從SwissPiOt數(shù)據(jù)庫(kù)獲得)推導(dǎo)出。小鼠A-FN的序列可以從相應(yīng)的小鼠纖連蛋白前體序列(其可以登陸號(hào)P11276從SwissPiOt數(shù)據(jù)庫(kù)獲得)推導(dǎo)出。A-FN可為人纖連蛋白的ED-A同種型。ED-A可以為人纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域-A。ED-A是90個(gè)氨基酸序列，其通過(guò)選擇性剪接插入纖連蛋白(FN)并且位于FN的結(jié)構(gòu)域 11 和 12 之間(Borsi et al.1987，J.Cell Biol.，104, 595-600)。在多數(shù)情況下，ED-A不存在于血漿形式的FN，但是在胚胎發(fā)生、組織重塑、纖維化、心臟移植和實(shí)體瘤生長(zhǎng)過(guò)程中大量存在。選擇性剪接選擇性剪接是指DNA的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本發(fā)生不同剪接形式從而產(chǎn)生不同的mRNA。在切除內(nèi)含子之后， 可以確定選擇哪一個(gè)外顯子被剪接在一起從而形成mRNA。選擇性剪接導(dǎo)致包含不同外顯子和/或不同數(shù)量外顯子的不同的同種型的產(chǎn)生。例如，一種同種型可以包含對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)外顯子的額外的氨基酸序列，其可包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域。淋巴瘤這描述了一種涉及被稱為淋巴細(xì)胞的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的癌癥類型，并且其特征在于這些細(xì)胞的異常增殖。有多種淋巴瘤亞型，它們可以被分為兩種主要類別:霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤?；羝娼鹆馨土鍪怯商禺愋援惓淋巴細(xì)胞系發(fā)展形成，而非霍奇金淋巴瘤可能來(lái)源于異常的B、T或NK細(xì)胞，并且可通過(guò)獨(dú)特的基因標(biāo)記進(jìn)行區(qū)別。Burkitt淋巴瘤是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的實(shí)例。本文中提到的淋巴瘤可以為原發(fā)性淋巴瘤。本文中提到的淋巴瘤可以為霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。優(yōu)選，本文中提到的淋巴瘤為原發(fā)性霍奇金淋巴瘤或原發(fā)性非霍奇金淋巴瘤。肺癌這描述了肺組織的惡性變形和增大。肺癌可以被分為兩種主要類別:小細(xì)胞肺癌(小細(xì)胞癌)和非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌的亞類型為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌。細(xì)支氣管肺泡癌是腺癌的亞類型。本文中提到的肺癌可以為原發(fā)性肺癌。肺腫瘤是動(dòng)物(例如，人)的肺中的腫瘤，其是肺癌的結(jié)果。本文中提到的肺腫瘤可以為原發(fā)性肺腫瘤。原發(fā)性腫瘤
這描述了位于腫瘤最初形成的位點(diǎn)上(原發(fā)位點(diǎn))的腫瘤。原發(fā)性腫瘤有時(shí)候從它們的初始位點(diǎn)(原發(fā)位點(diǎn))散布從而在動(dòng)物體的其它位點(diǎn)形成繼發(fā)腫瘤(轉(zhuǎn)移)，該散布被稱為轉(zhuǎn)移。結(jié)合成員這描述了互相結(jié)合的一對(duì)分子中的一個(gè)成員。結(jié)合對(duì)的成員可以源于自然，或部分或全部合成產(chǎn)生。分子對(duì)的一個(gè)成員在其表面上具有結(jié)合于并且因此互補(bǔ)于分子對(duì)的另外一個(gè)成員的特殊空間或極性組織的表面區(qū)域或空穴。結(jié)合對(duì)類型的實(shí)例為抗原-抗體、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本發(fā)明關(guān)注的是抗原-抗體類型的反應(yīng)。結(jié)合成員通常包含具有抗原-結(jié)合位點(diǎn)的分子。例如，結(jié)合成員可以為包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子或非抗體蛋白。可以通過(guò)在非抗體蛋白質(zhì)支架，如纖連蛋白或細(xì)胞色素B等上安排互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)來(lái)產(chǎn)生抗原結(jié)合位點(diǎn)(Haan&Maggos，2004 ；Koidel998 ;Nygrenl997)，或通過(guò)隨機(jī)排列或突變蛋白質(zhì)支架內(nèi)的環(huán)的氨基酸殘基來(lái)產(chǎn)生抗原結(jié)合位點(diǎn)以提供對(duì)需要的目標(biāo)的結(jié)合特異性。Nygren等已詳細(xì)綜述了用于在蛋白質(zhì)中設(shè)計(jì)新型結(jié)合位點(diǎn)的支架(1997)。在專利W0/0034784中公開了用于抗體模擬的蛋白質(zhì)支架，其全文通過(guò)引用結(jié)合到本文中作為參考，其中發(fā)明者描述了包括具有至少一個(gè)隨機(jī)環(huán)的纖連蛋白類型III域的蛋白質(zhì)(抗體模擬)。可以通過(guò)免疫球蛋白超基因族中的任意域成員來(lái)提供適合于移植入一個(gè)或多個(gè)CDR，例如一組HCDR的支架。支 架可以為人或非人蛋白質(zhì)。非抗體蛋白質(zhì)支架的優(yōu)勢(shì)在于其可以在與至少一些抗體分子相比更小和/或更易制造的支架分子中提供抗原結(jié)合位點(diǎn)。小尺寸的結(jié)合成員可以提供有用的生理特性，如進(jìn)入細(xì)胞的能力，深入組織或接觸其它結(jié)構(gòu)中的靶，或結(jié)合靶抗原的蛋白質(zhì)空穴的能力。在Wess，2004中綜述了抗原結(jié)合位點(diǎn)在非抗體蛋白質(zhì)支架中的應(yīng)用。一般為具有穩(wěn)定骨架和一個(gè)或多個(gè)可變的環(huán)的蛋白質(zhì)，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)的氨基酸序列被特異性或隨機(jī)地突變從而產(chǎn)生結(jié)合靶抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這樣的蛋白質(zhì)包括金黃色釀膿葡萄球菌S.aureus的蛋白質(zhì)A、鐵傳遞蛋白、四聯(lián)蛋白、纖連蛋白(例如，第10纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域)和脂籠蛋白的IgG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其它的方法包括合成“微體(細(xì)胞)(Selecore GmbH),其是基于具有分子內(nèi)二硫鍵的小蛋白質(zhì)-環(huán)蛋白。除了抗體序列和/或抗原結(jié)合位點(diǎn)，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含其它氨基酸，例如形成肽或多肽，如折疊結(jié)構(gòu)域，或者從而提供分子除了結(jié)合抗原能力的其它功能特性。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以具有可檢測(cè)標(biāo)記，或可以連接毒素或靶定部分targetingmoiety或酶(例如，通過(guò)肽鍵或連接子)。例如，結(jié)合成員可以包含催化部位(例如，在酶結(jié)構(gòu)域中)以及抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合抗原并且因此將催化部位靶定于抗原。催化部位可以抑制抗原的生物功能，例如通過(guò)裂解。盡管已知⑶R可以被非抗體支架所附載，附載⑶R或一組⑶R的結(jié)構(gòu)通常為抗體重鏈或輕鏈或其主要部分substantial portion,其中⑶R或⑶R組位于對(duì)應(yīng)于由重組免疫球蛋白基因編碼的自然產(chǎn)生的VH和VL抗體可變域的CDR或CDR組的位置。通過(guò)參考Kabatl987和其現(xiàn)在互聯(lián)網(wǎng)上可獲得的更新(immun0.bme.nwu.edu或通過(guò)任何搜索引擎查找"Kabat"),可以確定免疫球蛋白可變域的結(jié)構(gòu)和位置。通過(guò)⑶R或⑶R區(qū)，希望顯示如Kabat等所定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)(1987)，(Kabatl991a，和較新的版本)。抗體一般包含3個(gè)重鏈⑶R和3個(gè)輕鏈⑶R。這里使用的術(shù)語(yǔ)⑶R是為了表示，根據(jù)該情況，包含大部分的負(fù)責(zé)通過(guò)抗體對(duì)其識(shí)別的抗原或抗原決定基的親和力進(jìn)行結(jié)合的氨基酸殘基的這些區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)，甚至整個(gè)。在六個(gè)短⑶R序列中，重鏈的第三個(gè)⑶R (HCDR3)具有更大的尺寸可變性(主要是由于生成基因的基因排列機(jī)制的更大的多樣性)。它可以短到2個(gè)氨基酸，雖然最長(zhǎng)的尺寸已知是26。功能上，HCDR3在確定抗體的特異性上起到部分作用(Segall974 ;Amitl986 ；Chothial987 ；Chothial989 ；Catonl990 ；Sharonl990a ；Sharonl990b ；Kabat et al.，1991b)o抗體分子這里描述了自然產(chǎn)生或部分或完全合成的免疫球蛋白。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋了包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽或蛋白質(zhì)。在這里必須理解本發(fā)明不涉及天然形式的抗體，即它們不是在它們天然的環(huán)境中，而是已經(jīng)能夠通過(guò)從天然來(lái)源純化來(lái)分離或獲得，或通過(guò)基因重組，或通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得，因此它們能夠包含非天然的氨基酸殘基，如此后描述的。包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段包括，但是不限定于如Fab、Fab' >Fab/ _SH、scFv、Fv、dAb、Fd的抗體分子和雙體抗體。 采用單克隆或其它抗體，使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生結(jié)合靶抗原的其它抗體或嵌合分子是可能的。這樣的技術(shù)可包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)或抗體CDR的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)及構(gòu)架區(qū)。例如，見EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400,以及大量的后續(xù)資料。產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞或其它細(xì)胞可以進(jìn)行基因突變或其它改變，其可能會(huì)或不會(huì)改變抗體產(chǎn)生的結(jié)合特異性?？贵w可以以多種方法改進(jìn)，術(shù)語(yǔ)“抗體分子”應(yīng)該被理解為涵蓋具有需要的特異性和/或結(jié)合抗原的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的任何結(jié)合成員或物質(zhì)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括抗體片段和衍生物，包括包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽，無(wú)論是天然或完全或部分合成。因此包括與其它的多肽(例如，來(lái)源于其它物種或?qū)儆谄渌贵w類或亞類)融合的包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的嵌合分子，或等效物。在EP-A-0120694和EP-A-0125023和大量后續(xù)的文獻(xiàn)中描述了嵌合抗體的克隆和表達(dá)?？贵w工程技術(shù)領(lǐng)域中的其它可用技術(shù)已使分離人或人源化抗體成為可能。例如，可根據(jù)Kontermann&Dubel (2001)所描述的制造人雜種瘤。在許多公開文獻(xiàn)如W092/01047(后面進(jìn)一步討論)和美國(guó)專利 US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404 和 Kontermann&Dubel (2001)中已經(jīng)詳細(xì)描述了噬菌體展示，一種其它的已建立的產(chǎn)生結(jié)合成員的技術(shù)。其中小鼠抗體基因被失活并且被功能性地以人抗體基因取代，但是小鼠免疫系統(tǒng)的其他組成保持完整的基因改造小鼠可以被用于分離人抗體(Mendezl997)?？赏ㄟ^(guò)以合成寡核苷酸并且與合適的表達(dá)載體組裝的方法產(chǎn)生的基因的表達(dá)來(lái)產(chǎn)生合成抗體分子，例如Knappik等(2000)或Krebs等(2001)所描述的。已顯示完整抗體的片段可以執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的實(shí)例為(i)由VL、VH、CL和CHl域組成的Fab片段；(ii)由VH和CHl域組成的Fd片段；(iii)由單一抗體的VL和VH域組成的Fv片段；(iv)由VH和VL域組成的dAb片段(Wardl989 ；McCaffertyl990 ；Holt2003) ；(v)分離的CDR區(qū)；(vi) F (ab' ) 2片段，包含兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv),其中VH域與VL域通過(guò)肽連接子連接,其可使兩個(gè)域相聯(lián)合從而形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(Birdl988 ；Hustonl988) ； (viii)雙特異單鏈Fv 二聚物(PCT/US92/09965)和(ix) “雙體抗體(diabody) ”，通過(guò)基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異片段(W094/13804 ;Holliger 1993a)?？赏ㄟ^(guò)整合連接VH和VL域的二硫鍵來(lái)穩(wěn)定Fv、scFv或雙體抗體分子(Reiter 1996)。還可以制造包含結(jié)合到CH3域的scFv的微抗體(minibody)(Hul996)。結(jié)合片段的其它實(shí)例為Fab'，其由于在重鏈CHl域的羧基末端加入幾個(gè)殘基而與Fab片段不同，包括一個(gè)或多個(gè)抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸，和Fab' _SH，其為其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基具有自由硫醇基團(tuán)的Fab'片段。用于 本發(fā)明的抗體片段可從本文描述的任意抗體分子，例如，包含本文描述的任意抗體的VH和/或VL域或CDR出發(fā)，通過(guò)如酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通過(guò)化學(xué)還原來(lái)裂解二硫鍵的方法來(lái)獲得。以另外一種方式，本發(fā)明的抗體片段可以通過(guò)所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的基因重組技術(shù)等，或通過(guò)借助于例如肽自動(dòng)合成儀(如Applied Biosystems公司等提供的肽自動(dòng)合成儀)的肽合成,或通過(guò)核酸合成和表達(dá)來(lái)獲得。本發(fā)明的功能抗體片段包括任何通過(guò)化學(xué)修飾，尤其是通過(guò)聚乙二醇修飾，或通過(guò)整合入脂質(zhì)體來(lái)提高其半衰期的功能片段。dAb(域抗體)是抗體的小的單體抗原結(jié)合片段，即抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)(Holt2003) ο VH dAb在駱駝(例如，駱駝、美洲駝)中天然產(chǎn)生，可以通過(guò)以靶抗原來(lái)免疫駱駝，分離抗原特異性B細(xì)胞，直接從單個(gè)B細(xì)胞中克隆dAb基因來(lái)獲得。在細(xì)胞培養(yǎng)物中也可產(chǎn)生dAb。它們較小的尺寸，良好的可溶性和溫度穩(wěn)定性使它們尤其在生理上適合用于篩選和親和力成熟。本發(fā)明的結(jié)合成員可以為包含VH或VL域(基本如本文所列出的)或包含一組⑶R (基本如本文所列出的)的VH或VL域的dAb。如本文中所使用的，短語(yǔ)“基本如列出(set out，示出)的”是指本文所描述的結(jié)合成員的VH或VL域的相關(guān)的CDR與本文所顯示的序列的特定區(qū)域相同或高度相似的特性。如本文中所描述的，短語(yǔ)相對(duì)于一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的特定區(qū)域的“高度相似”，被認(rèn)為是可在⑶R和/或VH或VL域進(jìn)行I至約5，例如，I至4，包括I至3，或I或2，或3或4個(gè)的氨基酸取代。雙特異或雙功能抗體形成了單克隆抗體的第二代，其中兩個(gè)不同的可變區(qū)結(jié)合到同一分子中(Holligerl999)。由它們募集新效應(yīng)物功能或祀定腫瘤細(xì)胞表面上幾個(gè)分子的能力，在診斷和治療領(lǐng)域都證明了它們的用途。在要使用雙特異抗體的情況下，它們可以為傳統(tǒng)的雙特異抗體，其可以以多種方法制造(Holligerl993b),例如化學(xué)制備或從雜交雜種瘤，或可以為以上所提到的任意的雙特異抗體片段。可以通過(guò)化學(xué)方法(Glenniel987 ;Reppl995)或動(dòng)物體方法(Staerzl986 ；Sureshl986)獲得這些抗體，但是也可以通過(guò)基因工程技術(shù)，其可強(qiáng)制進(jìn)行異二聚作用(heterodimerization),因此有利于所需要的抗體的純化過(guò)程(Merchandl998)。雙特異抗體的實(shí)例包括BiTE 技術(shù)的那些，其中可以使用具有不同特異性的兩個(gè)抗體的結(jié)合域，并且通過(guò)短的柔性肽連接。這將兩個(gè)抗體結(jié)合在一個(gè)短的多肽鏈上。可以只使用可變區(qū)域構(gòu)建沒(méi)有Fe區(qū)的雙體抗體和scFv，可能會(huì)減少抗獨(dú)特型反應(yīng)的影響。雙特異抗體可被構(gòu)建為完整IgG、雙特異Fab' 2、Fab' PEG、雙體抗體或也可為雙特異scFc。此外，可以使用所屬領(lǐng)域已知的常規(guī)方法將兩個(gè)雙特異抗體連接從而形成四價(jià)抗體。與雙特異整體抗體相反，雙特異雙抗體(bispecific diabodies)還是尤其有用的，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀妆粯?gòu)建及在E.coli中被表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)使用噬菌體展示(W094/13804)從文庫(kù)方便地篩選合適的結(jié)合特異性的雙體抗體(和許多其它的多肽，如抗體片段)。如果雙體抗體的一個(gè)臂保持，例如針對(duì)靶抗原的特異性的恒定，則可制造一個(gè)文庫(kù)，其中其它臂是可變的，選擇合適特異性的抗體。可通過(guò)Ridgeway 1996描述的可選擇的工程方法來(lái)制造雙特異整體抗體。所屬領(lǐng)域中具有多種方法來(lái)獲得抗靶抗原的抗體。該抗體可為單克隆抗體，尤其是人的、鼠科的、嵌合的或人源化的，其可以根據(jù)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)獲得。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于單克隆抗體或其功能片段(尤其是鼠源的)的制備，可能是指尤其是手冊(cè) “Antibodies" (Harlow and Lanel988)中描述的技術(shù)或是指 Kohler 和 Milstein描述的從雜交瘤制備的技術(shù)(1975)。單克隆抗體可從例如針對(duì)A-FN或它的包含所述的單克隆抗體識(shí)別的抗原決定基的片段之一(例如包含ED-A或由ED-A構(gòu)成的片段、或ED-A的肽片段)免疫了的動(dòng)物細(xì)胞來(lái)獲得。特別是可以根據(jù)常規(guī)的工作方法來(lái)產(chǎn)生A-FN或其片段之一，通過(guò)從包含在編碼A-FN或其片段的cDNA序列中的核酸序列出發(fā)的基因重組，通過(guò)從包含在A-FN和/或其片段的肽序列中的氨基酸序列出發(fā)的肽合成?？梢岳缭谟H和柱上純化單克隆抗體，在親和柱上A-FN或它的包含被所述的單克隆抗體識(shí)別的抗原決定基的片段之一(例如包含ED-A或由ED-A組成的片段或ED-A肽片段)先被固定。通過(guò)在蛋白A和/或G上的色譜層析可以純化單克隆抗體，隨后進(jìn)行或不進(jìn)行旨在去除其自身的殘余的蛋白質(zhì)污染物以及DNA和LPS的離子交換層析，隨后進(jìn)行或不進(jìn)行用于去除由于二聚物或其它的多聚體的存在產(chǎn)生的可能的聚合體的在瓊脂糖凝膠上的排阻層析。所有這些技術(shù)可以同時(shí)使用或者依次使用?？乖Y(jié)合位點(diǎn)這描述了結(jié)合并且與整個(gè)或部分祀抗原互補(bǔ)的分子部分。在抗體分子中，它被稱為抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，包含結(jié)合并且與整個(gè)或部分靶抗原互補(bǔ)的抗體部分。當(dāng)抗原為大抗原時(shí)，抗體可能只結(jié)合到抗原的特定部分，該部分被稱為抗原決定基。可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)抗體可變區(qū)來(lái)提供抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)可以包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。分離的 這表示用于本發(fā)明的結(jié)合成員或編碼這樣的結(jié)合成員的核酸的狀態(tài)，會(huì)基本與本發(fā)明一致。因此，本發(fā)明的結(jié)合成員、VH和/或VL域可以以被分離的和/或被純化來(lái)被提供，例如從它們的天然環(huán)境，以基本純化或均質(zhì)的形式，或在核酸的情況下，除了編碼具有所需功能的多肽的序列，沒(méi)有或基本沒(méi)有源核酸或基因。分離的成員或分離的核酸沒(méi)有或基本沒(méi)有它們天然相聯(lián)的物質(zhì)，如在其天然環(huán)境中或在其被制備的環(huán)境(例如，細(xì)胞培養(yǎng)物)(當(dāng)這樣的制備是通過(guò)體外或體內(nèi)操作的重組DNA技術(shù))中發(fā)現(xiàn)與其在一起的其它的多肽和核酸。成員和核酸可以與稀釋劑或佐劑配制，仍然是基于被分離的操作目的-例如如果用于涂覆免疫測(cè)定用的微量滴定板，成員通常會(huì)與凝膠或其它載體混合，或當(dāng)用于診斷或治療時(shí)，會(huì)與藥物可接受載體或稀釋劑混合。結(jié)合成員可以為糖基化的，天然的或通過(guò)異源真核細(xì)胞系統(tǒng)(例如，CHO或NS0(ECACC85110503)細(xì)胞)，或它們可以為非糖基化的(例如，如果通過(guò)在原核細(xì)胞中表達(dá)來(lái)產(chǎn)生)。包含抗體分子的非均質(zhì)制備也可以被用于本發(fā)明中。例如，這樣的制備可以為具有完整長(zhǎng)度的重鏈和缺少C-末端賴氨酸的重鏈，具有各種程度的糖基化和/或具有衍生化氨基酸，如N-末端谷氨酸的環(huán)化從而形成焦谷氨酸殘基的抗體的混合物。抗原(例如A-FN或纖連蛋白的ED-A)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合成員可以通過(guò)將本發(fā)明的結(jié)合成員的庫(kù)與抗原或其片段(例如包含ED-A或由ED-A組成的片段或ED-A的肽片段)進(jìn)行接觸，并且選擇一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合該抗原的庫(kù)的結(jié)合成員來(lái)獲得?？梢酝ㄟ^(guò)重復(fù)菌落過(guò)濾篩選(IterativeColony Filter Screening) (ICFS)來(lái)篩選抗體庫(kù)。在ICFS中，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)包含編碼幾種結(jié)合特異性的DNA的細(xì)菌，一旦達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，數(shù)十億的細(xì)菌被分布到由適當(dāng)預(yù)處理的膜過(guò)濾器(其被孵育直到完全融合的細(xì)菌菌落出現(xiàn))構(gòu)成的生長(zhǎng)支持物上。由另外一個(gè)膜過(guò)濾器構(gòu)成第二捕獲培養(yǎng)基，預(yù)先濕潤(rùn)并且被所需的抗原覆蓋。

然后，該捕獲膜過(guò)濾器被放置在含有合適的培養(yǎng)基并且被具有覆蓋了指向向上的細(xì)菌菌落的表面的生長(zhǎng)過(guò)濾器覆蓋的板上。將這樣獲得的夾層結(jié)構(gòu)在室溫中孵育約16小時(shí)。由此可能獲得表達(dá)編碼具有散布作用的抗體片段scFv的基因，因此那些在捕獲膜上存在的特異性結(jié)合抗原的片段被捕獲。然后處理該捕獲膜從而以通?；诖四渴褂玫谋壬椒▉?lái)找出被結(jié)合的抗體片段scFv。捕獲膜上的有色點(diǎn)的位置使得能夠返回于對(duì)應(yīng)的細(xì)菌菌落，該細(xì)菌菌落存在于生長(zhǎng)膜上并且產(chǎn)生被捕獲的抗體片段。收集并培養(yǎng)這樣的菌落，將數(shù)百萬(wàn)該細(xì)菌分布到新的培養(yǎng)膜上重復(fù)以上所描述的程序。進(jìn)行相似的循環(huán)，直到捕獲膜上的陽(yáng)性信號(hào)對(duì)應(yīng)于單一陽(yáng)性菌落，單一陽(yáng)性菌落中的每一個(gè)代表了針對(duì)篩選中使用的抗原的單克隆抗體片段的潛在源。在例如W00246455中描述了 ICFS，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中作為參考。也可以在微粒上或分子配合物上顯示庫(kù)，例如可重復(fù)遺傳包裝，如噬菌體(例如，T7)粒子，或其它的體外展示系統(tǒng)，在其上展示包含編碼抗體VH可變區(qū)的核酸的每一種微?；蚍肿优浜衔铮蚩蛇x的還展示VL域(如果存在的話)。在W092/01047和例如，美國(guó)專利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160 和 US6521404 描述了噬菌體展示，其每一個(gè)的全部?jī)?nèi)容都結(jié)合于此作為參考。在選擇了能夠結(jié)合抗原的結(jié)合成員并且在噬菌體或其它的庫(kù)粒子或分子配合物上展示之后，可從展示了所選的結(jié)合成員的噬菌體或其它的庫(kù)粒子或分子配合物獲得核酸。通過(guò)具有從展示了所選的結(jié)合成員的噬菌體或其它的庫(kù)粒子或分子配合物獲得的核酸序列的核酸的表達(dá)，這樣的核酸可被用于隨后生產(chǎn)結(jié)合成員或抗體VH或VL可變區(qū)。可以以被分離的形式提供具有所選的結(jié)合成員的抗體VH可變區(qū)的氨基酸序列的抗體VH可變區(qū)，因?yàn)榻Y(jié)合成員包含這樣的VH域。
可進(jìn)一步試驗(yàn)結(jié)合A-FN或纖連蛋白的ED-A或其它的靶抗原或同種型的能力，例如，與例如抗ED-A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9中的任意一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合A-FN或A-FN片段(例如，纖連蛋白的ED-A)的能力。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以特異性地結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。本發(fā)明的結(jié)合成員可以以與抗ED-A抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9相同的親和力，例如以scFv形式，或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以以3x10_8M的Kd或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白蛋白的ED-A。優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以以2χ1(Γ8Μ的Kd或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A0更優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以以1.7χ10_8的Kd或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。仍然更優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以以1.4χ10_8Μ的Kd或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。最優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以以3χ10_9Μ的Kd或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。本發(fā)明的結(jié)合成員可以結(jié)合到與抗ED-A抗體H1、Β2、C5、D5、Ε5、C8、F8、F1、Β7、
Ε8或G9相同的A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的抗原決定基。用于本發(fā)明的結(jié)合成員 可以不顯示對(duì)A-FN和/或纖連蛋白的ED-A以外的分子的顯著結(jié)合。尤其是，該結(jié)合成員可以不結(jié)合纖連蛋白的其它同種型，例如纖連蛋白的ED-B同種型和/或IIICS同種型。本文所公開的抗體分子的變體可以由本發(fā)明產(chǎn)生并且用于本發(fā)明中。在CDR、抗體Vh或VL域和結(jié)合成員的氨基酸序列中進(jìn)行取代所需的技術(shù)在所屬領(lǐng)域中一般是可獲得的。可通過(guò)取代來(lái)制造變體序列，預(yù)測(cè)該取代對(duì)活性可具有或不具有最小或有利的影響，并且試驗(yàn)變體序列結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力和/或任何其它需要的特性。根據(jù)本發(fā)明可以使用任意VH和VL域的可變區(qū)氨基酸序列變體(其序列在本文進(jìn)行了特別的公開)，如討論。特殊變體可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的改變(氨基酸殘基的增加、缺失、取代和/或插入)，可少于約20個(gè)的改變，少于約15個(gè)的改變，少于約10個(gè)的改變，少于約5個(gè)的改變，可以為5、4、3、2或I (個(gè)的改變)。可以在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)和/或一個(gè)或多個(gè)⑶R中進(jìn)行改變。該改變通常不會(huì)導(dǎo)致功能喪失，因此包含這樣改變了的氨基酸序列的結(jié)合成員會(huì)保持結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力。例如，其可能保持了與其中不進(jìn)行改變的結(jié)合成員相同數(shù)量的結(jié)合，例如，如在本文所描述的試驗(yàn)中測(cè)量的。包含這樣改變了的氨基酸序列的結(jié)合成員可能提高了結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力?？梢允褂秒S機(jī)誘變一個(gè)或多個(gè)選擇的VH和/或VL基因在整個(gè)可變區(qū)內(nèi)產(chǎn)生突變，從而產(chǎn)生用于本發(fā)明的新型的具有CDR源序列的VH或VL區(qū)。在某些實(shí)施例中，在整個(gè)可變區(qū)或CDR組中進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)氨基酸取代。另外可用的方法是定向誘變VH或VL基因的CDR區(qū)。如上所知，基本上根據(jù)本文顯示的CDR氨基酸序列可以作為CDR被攜帶在人抗體可變區(qū)或其主要部分(substantial portion,實(shí)質(zhì)部分)?；救绫疚牧谐龅腍CDR3序列代表本發(fā)明的實(shí)施例，例如其每一個(gè)可以作為HCDR3被攜帶在人(抗體)重鏈可變區(qū)或其主要部分。本發(fā)明中使用的可變區(qū)可以獲自或來(lái)源自任何種系或重新設(shè)計(jì)的人可變區(qū)，或者可以為基于已知的人可變區(qū)的共有序列或?qū)嵲谛蛄械暮铣煽勺儏^(qū)。可變區(qū)可來(lái)源于非人抗體。用于本發(fā)明的⑶R序列(例如，⑶R3)可使用重組DNA技術(shù)被引入到缺乏⑶R(例如，⑶R3)的全套可變區(qū)中。例如，Marks等(1992)描述了產(chǎn)生全套抗體可變區(qū)的方法，其中位于或接近可變區(qū)區(qū)域的5’末端的共有引物與人VH基因的第三構(gòu)架區(qū)的共有引物聯(lián)合使用從而產(chǎn)生缺乏CDR3的全套VH可變區(qū)。Marks等還表述了這樣的全套可變區(qū)怎樣與特殊抗體的⑶R3結(jié)合。使用相似的技術(shù)，本發(fā)明的⑶R3源序列可以與缺乏⑶R3的全套VH或VL區(qū)改組，改組后的完整的VH或VL區(qū)與同源VL或VH區(qū)結(jié)合從而提供用于本發(fā)明的結(jié)合成員。然后該全套可變區(qū)可在合適的宿主體系進(jìn)行展示，如W092/01047的噬菌體展示系統(tǒng)，其全文通過(guò)引用結(jié)合到本文中作為參考，或任何此后大量的資料，包括Kay，Winter&McCafferty(1996),因此可以選擇合適的結(jié)合成員。全套可變區(qū)可由IO4以上的任何值的單獨(dú)成員組成，例如至少105，至少106，至少107，至少108，至少IO9或至少IOltl成員。與此相似，一個(gè)或多個(gè)或全部的 三個(gè)⑶R可以移植入全套VH或VL域，然后篩選A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員?？梢允褂每贵wHl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8 或 G9 的 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3中的一個(gè)或多個(gè)，或HCDR組，和/或可以使用抗體!11、82、05、0535、08、卩8、卩1、8738或G9 的 LCDR1、LCDR2 或 LCDR3 中的一個(gè)或多個(gè)，或抗體 H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的LCDR組。與此相似，可以使用本文公開的其它VH和VL域、⑶R組和HCDR組和/或IXDR組。A-FN和/或纖連蛋白的ED-A可被用于篩選用于制備治療肺癌的藥物的結(jié)合成員，例如抗體分子。該篩選可以為本文其它處公開的全套的篩選。A-FN和/或纖連蛋白的ED-A還可以被用于篩選用于制備治療淋巴瘤的藥物的結(jié)合成員，例如抗體分子。該篩選可以為本文其他處公開的全套的篩選。免疫球蛋白可變區(qū)的主要部分(substantial portion,重要部分)可包含至少三個(gè)CDR區(qū)，以及它們其間的構(gòu)架區(qū)。該部分還包括第一和第四框架區(qū)的任意一個(gè)或兩個(gè)的至少約50 %，該50 %為第一框架區(qū)的C末端50 %和第四框架區(qū)的N末端50 %?？勺儏^(qū)的主要部分的N末端和C末端的其它殘基可以為那些通常與自然產(chǎn)生的可變區(qū)不相關(guān)的。例如，通過(guò)重組DNA技術(shù)制造的本發(fā)明的結(jié)合成員的構(gòu)建可以導(dǎo)致為方便克隆和其它操作步驟而引入的連接子編碼的N-和C-末端殘基的引入。其它的操作步驟包括引入連接子從而將本文其他處公開的可變區(qū)連接起來(lái)成為包括抗體恒定區(qū)、其它的可變區(qū)(例如在雙體抗體的產(chǎn)生中的)或可檢測(cè)/功能標(biāo)記的其它蛋白質(zhì)序列，如本文其它處更詳細(xì)討論的。雖然結(jié)合成員可包含一對(duì)VH和VL域，基于VH或VL域序列的單一結(jié)合域也可以被用于本發(fā)明中。已知單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，尤其是VH域，能夠以特殊的形式結(jié)合靶抗原。例如，見以上對(duì)dAb的討論。在任一單一結(jié)合域的情況下，這些域可以被用于篩選能夠形成可結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的雙域結(jié)合成員的互補(bǔ)域。這可以通過(guò)使用如W092/01047中公開的所謂的分級(jí)雙組合法(hierarchical dual combinatorial approach)(其全文通過(guò)引用結(jié)合到本文中作為參考)的噬菌體展示篩選方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中包含H或L鏈克隆的單個(gè)菌落被用于感染編碼另外一條鏈(L或H)的克隆的完整庫(kù)，根據(jù)噬菌體展示技術(shù)(如參考文獻(xiàn)中描述的)來(lái)選擇得到的雙鏈結(jié)合成員。在Marksl992中也公開了該技術(shù)。
用于本發(fā)明的結(jié)合成員還可包含抗體恒定區(qū)或其部分，例如人抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL域可在其C-末端連接到包括人C K或CA鏈的抗體輕鏈恒定區(qū)，例如CA。與此相似，基于VH域的結(jié)合成員可以以其C-末端連接到來(lái)源于任何抗體同種型，例如IgG、IgA、IgE和IgM和任意同種型亞類，尤其是IgGl和IgG4，的免疫球蛋白重鏈的全部或部分(例如，CHl域)。具有這些特性并且穩(wěn)定可變區(qū)的任何合成的或其它的恒定區(qū)變體也可使用在本發(fā)明的實(shí)施例中。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可使用可檢測(cè)標(biāo)記或功能標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記可為產(chǎn)生或能被誘導(dǎo)產(chǎn)生信號(hào)的任何分子，包括但是不限定于熒光劑、放射性標(biāo)記、酶、化學(xué)發(fā)光劑或光敏劑。因此，結(jié)合可以被檢測(cè)，和/或通過(guò)檢測(cè)熒光或冷光、放射性、酶活性或光吸收率來(lái)被測(cè)量。使用所屬領(lǐng)域已知的常規(guī)化學(xué)，可檢測(cè)標(biāo)記可以被連接到用于本發(fā)明的抗體。這里有多種通過(guò)其標(biāo)記可產(chǎn)生被外部裝置檢測(cè)到的信號(hào)的方法，例如，通過(guò)表觀檢查、電磁輻射、熱和化學(xué)試劑。標(biāo)記還可以結(jié)合于另外的結(jié)合用于本發(fā)明的抗體的結(jié)合成員，或結(jié)合于支持物。被標(biāo)記的結(jié)合成員，例如標(biāo)記了可檢測(cè)標(biāo)記的scFv，可以在體內(nèi)或體外診斷中使用，和/或治療使用。例如，放射標(biāo)記的結(jié)合成員(例如，連接放射性同位素的結(jié)合成員)可以用于放射性診斷和放射性治療?？梢赃B接于用于本發(fā)明的結(jié)合成員的放射性同位素包括如94mTc、99mTc,186Re,188Re,203Pb,67Ga,68Ga,47Sc,111In,97Ru,62Cu,64Cu,86Y,88Y,90Y,121Sn,161Tb,153Sm^166Ho,105RK 177Liu 1231、1241、125I 和 131I 的同位素。例如，用于本發(fā)明的標(biāo)記有可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合成員可用于檢測(cè)、診斷或監(jiān)控人或動(dòng)物的肺癌?；蛘撸糜诒景l(fā)明的標(biāo)記有可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合成員可用于檢測(cè)、診斷或監(jiān)控人或動(dòng)物的淋巴瘤。本發(fā)明的結(jié)合成員可用于制造用于診斷肺癌的診斷產(chǎn)品。本發(fā)明的結(jié)合成員還可用于制造用于診斷淋巴瘤的診斷產(chǎn)品。本發(fā)明提供了檢測(cè)或診斷人或動(dòng)物的肺癌的方法，包含以下步驟:(a)將本發(fā)明的結(jié)合成員，例如標(biāo)記了可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合成員，給藥于人或動(dòng)物，該結(jié)合成員結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-AJP(b)確定該結(jié)合成員在人或動(dòng)物身體的肺中是否存在；其中結(jié)合成員定位到人或動(dòng)物肺顯示了肺癌的存在。本發(fā)明還提供了檢測(cè)或診斷人或動(dòng)物的淋巴瘤的方法，包含以下步驟:(a)將本發(fā)明的結(jié)合成員，例如標(biāo)記了可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合成員，給藥于人或動(dòng)物，該結(jié)合成員結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-AJP(b)確定該結(jié)合成員在人或動(dòng)物身體的淋巴系統(tǒng)中是否存在；其中結(jié)合成員定位至人或動(dòng)物淋巴系統(tǒng)顯示了淋巴瘤的存在。在標(biāo)記有可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合成員中，可通過(guò)檢測(cè)出標(biāo)記來(lái)確定可檢測(cè)標(biāo)記是否存在。用于本發(fā)明的結(jié)合成員和對(duì)損傷中的靶細(xì)胞具有殺滅或細(xì)胞毒素作用(細(xì)胞毒性作用)的分子和針對(duì)這樣的損 傷中的細(xì)胞外基質(zhì)成分的抗體的之間的連接或融合可以被用于本發(fā)明中。例如，殺滅或細(xì)胞毒素分子可以為白細(xì)胞介素-2 (IL-2)、阿霉素、白細(xì)胞介素-12 (IL-12)、干擾素-Y (IFN-Y)、腫瘤壞死因子a (TNFa)或組織因子(優(yōu)選截短的)。這樣的結(jié)合物可以被治療性使用，例如本文提到的淋巴瘤的治療?；蛘撸@樣的結(jié)合物可以治療性使用，用于本文提到的肺癌的治療。在例如W001/62298(其通過(guò)引用結(jié)合到本文中作為參考)中描述了結(jié)合成員與殺滅或毒性分子的融合或連接的產(chǎn)生和應(yīng)用。本發(fā)明提供了治療肺癌的方法，該方法包含將治療有效量的包含用于本發(fā)明的結(jié)合成員的藥物給藥于個(gè)體。本發(fā)明還提供了治療淋巴瘤的方法，該方法包含將治療有效的包含用于本發(fā)明的結(jié)合成員的藥物給藥于個(gè)體。該結(jié)合成員可以為(i)通過(guò)細(xì)胞相互作用對(duì)祀細(xì)胞具有殺滅或細(xì)胞毒素作用的分子和(ii)纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員的結(jié)合物。本發(fā)明提供了用于本發(fā)明的結(jié)合成員在制備用于治療肺癌的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的結(jié)合成員在制備治療淋巴瘤的藥物中的用途。該結(jié)合成員可以與本文所描述的施加殺滅或細(xì)胞毒性作用的分子連接或融合。該結(jié)合成員可以為α)通過(guò)細(xì)胞相互作用對(duì)靶細(xì)胞具有殺滅或細(xì)胞毒素作用的分子和(ii)本發(fā)明的人纖連蛋白的結(jié)合成員的結(jié)合物。本文中還描述的是(i)通過(guò)細(xì)胞相互作用對(duì)祀細(xì)胞具有殺滅或細(xì)胞毒素作用的分子和(ii)根據(jù)用于本發(fā) 明的人纖連蛋白的結(jié)合成員的結(jié)合物。這樣的結(jié)合物優(yōu)選包含含有殺滅或細(xì)胞毒素分子和所述的結(jié)合成員的融合蛋白質(zhì)，或者其中該結(jié)合成員為雙鏈或多鏈，包含殺滅或細(xì)胞毒素分子和所述的結(jié)合成員的多肽鏈成分的融合蛋白質(zhì)。優(yōu)選，該結(jié)合成員是單鏈多肽，例如單鏈抗體分子，如scFv。包含殺滅或細(xì)胞毒素分子和單鏈Fv抗體分子的融合蛋白質(zhì)可以用于本發(fā)明。通過(guò)細(xì)胞相互作用對(duì)靶細(xì)胞起作用的殺滅或細(xì)胞毒素分子，可以直接與靶細(xì)胞相互作用，可以與靶細(xì)胞上的膜結(jié)合受體相互作用，或干擾細(xì)胞膜的電化學(xué)勢(shì)。與膜結(jié)合受體相互作用的分子包括趨化因子、細(xì)胞因子和激素。干擾細(xì)胞膜電化學(xué)勢(shì)的化合物包括溶血素、離子載體、作用于離子通道的藥物。在示例性優(yōu)選的實(shí)施例中，該分子是白細(xì)胞介素_2、組織因子(優(yōu)選為截短的)或阿霉素。另一個(gè)實(shí)施例可使用白細(xì)胞介素-12、干擾素-Y、IP-1O和腫瘤壞死因子-a (TNF- a )。如下文中進(jìn)一步討論的，特異性的結(jié)合成員優(yōu)選為抗體或包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。方便地，特異性結(jié)合成員可以為單鏈多肽，如單鏈抗體。這可以方便生產(chǎn)包含單鏈抗體和殺滅或細(xì)胞毒素分子(例如，白細(xì)胞介素-2或組織因子)的融合蛋白?？赏ㄟ^(guò)將不同多肽的抗體VH域和抗體VL域聯(lián)合的方法來(lái)產(chǎn)生抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，例如在完整抗體中或如Fab的抗體片段或雙體抗體中。當(dāng)特異性結(jié)合成員是雙鏈或多鏈分子(例如，分別為Fab或完整抗體)，殺滅或細(xì)胞毒素分子可以結(jié)合為與特異性結(jié)合成員的一個(gè)或多個(gè)多肽鏈結(jié)合的融合多肽。結(jié)合成員可以通過(guò)肽鍵與殺滅或細(xì)胞毒素分子結(jié)合，即在包含所述分子和特異性結(jié)合成員或其多肽鏈成分的融合多肽中。參見Taniguchi et al.(1983)Nature302,305-310 ；MaED-A et al.(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.115:1040-1047 ；Devos etal.(1983)Nucl.Acids Res.11:4307-4323中在制備包含IL-2的融合多肽中有用的IL-2序列信息。Scarpati et al.(1987)Biochemistry 26:5234-5238 和 Ruf et al.(1991)J.Biol.Chem.226:15719-15725提供了截短組織因子的序列信息。用于連接的其它方法包括化學(xué)連接，尤其是使用雙功能試劑的交聯(lián)(例如使用DOUBLE-REAGENTS 交聯(lián)劑選擇指導(dǎo)，Pierce)。當(dāng)需要緩釋時(shí)，例如當(dāng)該殺滅或細(xì)胞毒素分子是阿霉素或其它的干擾細(xì)胞膜的電化學(xué)勢(shì)的分子時(shí)，化學(xué)連接可以為通過(guò)特異性結(jié)合成員(如抗體或抗體片段的多肽)的伯胺基與如阿霉素的殺滅或細(xì)胞毒素分子的氧化糖部分(六碳氨糖)之間形成席夫堿(亞胺)的方法。本文還描述的是編碼用于本發(fā)明的結(jié)合成員的分離的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。核酸可以編碼如上所定義的CDR或CDR組或VH域或VL域或抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗體分子，例如scFv或IgG，例如IgGl。該核酸序列可編碼本文公開的VH和VL域。本文還描述的是以包含至少一個(gè)如上所述的多核苷酸的質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的結(jié)構(gòu)物。還描述了包含一個(gè)或多個(gè)以上所述結(jié)構(gòu)物的重組宿主細(xì)胞。描述了編碼任意⑶R或CDR組或VH域或VL域或抗體 抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗體分子，例如如提供的scFv或IgGl或IgG4，的核酸，以及被編碼產(chǎn)品的產(chǎn)生方法，該方法包含編碼核酸的表達(dá)。通過(guò)在合適的條件下培養(yǎng)含有該核酸的宿主細(xì)胞可以方便的實(shí)現(xiàn)表達(dá)。在通過(guò)VH或VL域的表達(dá)來(lái)產(chǎn)生之后，或可使用任何合適的技術(shù)來(lái)分離和/或純化結(jié)合成員，然后根據(jù)情況使用。核酸可以包含DNA或RNA，可以為完全或部分合成。參考本文中所顯示的核酸序列，包含具有規(guī)定序列的DNA分子，并且包含其中U取代T的具有規(guī)定序列的RNA分子，除非環(huán)境另有所需。還描述了產(chǎn)生抗體VH可變區(qū)的方法，該方法包括使編碼核酸進(jìn)行表達(dá)。這樣的方法還包含在產(chǎn)生所述的抗體VH可變區(qū)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。產(chǎn)生方法可包含分離和/或純化產(chǎn)品的步驟。產(chǎn)生方法可包含將該產(chǎn)品配置到包括至少一種附加成分，如藥物可接受的賦形劑的組合物中。用于在各種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是熟知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、絲狀真菌、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物。所屬領(lǐng)域中已經(jīng)很好的建立了抗體和抗體片段在原核細(xì)胞中的表達(dá)。對(duì)于綜述，見，例如Pluckthunl991。一般的細(xì)菌宿主是 Ε.coli。對(duì)于所述的領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，作為產(chǎn)生結(jié)合成員的一個(gè)選擇，在培養(yǎng)的真核細(xì)胞中的表達(dá)也是可利用的(能得到的)，例如Chadd&Chamow (2001),Andersen&Krummen (2002), Larrick&Thomas (2001)。在所屬領(lǐng)域中可獲得的用于表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑素瘤細(xì)胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、人胚視網(wǎng)膜細(xì)胞和許多其它細(xì)胞。可以選擇或構(gòu)建合適的載體，包含合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、多聚腺苷酸序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因或其它合適的序列。載體可以為合適的質(zhì)粒，例如噬粒，或病毒，如噬菌體('phage)。例如，從Sambrook&Russell (2001)可知更多的細(xì)節(jié)。在Ausubell999中詳細(xì)描述了許多已知的核酸操作的技術(shù)和方法，例如制備核酸構(gòu)建、突變、測(cè)序、在細(xì)胞中引入DNA和基因表達(dá)，和蛋白質(zhì)分析。宿主細(xì)胞可包含本文所描述的核酸。這樣的宿主細(xì)胞可在體外并且可以進(jìn)行培養(yǎng)。這樣的宿主細(xì)胞可在體內(nèi)。宿主細(xì)胞在體內(nèi)的存在可以允許用于本發(fā)明的結(jié)合成員作為“內(nèi)抗體(intrabody) ”或細(xì)胞內(nèi)抗體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。內(nèi)抗體可被用于基因治療。還描述了包含將本文公開的核酸引入宿主細(xì)胞的方法。該引入可使用任意現(xiàn)有的方法。對(duì)于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒(例如牛痘，或?qū)τ诶ハx細(xì)胞，桿狀病毒)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。將核酸引入到宿主細(xì)胞，尤其是真核細(xì)胞中，可使用病毒或質(zhì)粒系統(tǒng)。質(zhì)粒系統(tǒng)可以游離存在于或整合到宿主細(xì)胞內(nèi)或到人工染色體中。結(jié)合可以是通過(guò)在單一或多位點(diǎn)的單拷貝或多拷貝的隨機(jī)或定點(diǎn)整合。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。在引入之后，可使該核酸表達(dá)，例如通過(guò)在該基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。通過(guò)所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)品的純化。該核酸可以被整合到宿主細(xì)胞的基因組(例如，染色體)中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)插入促進(jìn)與基因組的再結(jié)合的序列來(lái)提高整合。還描述了包含使用在表達(dá)系統(tǒng)中的如上所述的構(gòu)建物從而表達(dá)如上的結(jié)合成員或多肽的方法。用于本發(fā)明的結(jié)合成員被設(shè)計(jì)用于人或動(dòng)物主體，例如人，中的診斷或治療方法。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可用于淋巴瘤的診斷和治療?；蛘撸糜诒景l(fā)明的結(jié)合成員可用于肺癌的診斷和治療。因此，本發(fā)明提供了治療方法，其包含將所提供的結(jié)合成員，包含這樣的結(jié)合成員的藥物組合物進(jìn)行給藥，和 這樣的結(jié)合成員在給藥藥物的生產(chǎn)中的應(yīng)用，例如在包含將該結(jié)合成員與藥物可接受賦形劑配制的藥物或藥物組合物的制造方法中。藥物可接受的載體是熟知的，并且可被所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員根據(jù)被選的活性化合物的特性和給藥模式進(jìn)行改變。用于本發(fā)明的結(jié)合成員通常以藥物組合物的形式被給藥，其可包含除了該結(jié)合成員之外的至少一個(gè)成分。因此，本發(fā)明的和根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可包含(除了活性成分)藥物可接受賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的其它物質(zhì)。這樣的物質(zhì)應(yīng)該是無(wú)毒的，并且不應(yīng)干擾活性成分的效力。載體和其它物質(zhì)的準(zhǔn)確性質(zhì)會(huì)取決于給藥途徑，其可以為口服的、吸入的或通過(guò)注射，例如靜脈注射。用于口服給藥的藥物組合物，如，例如納米體等也可以考慮在本發(fā)明中。這樣口服配方可以為藥片、膠囊、粉末、液體或半固體的形式。藥片可包含固體載體，如凝膠或佐劑。液體藥物組合物一般包含液體載體，如水、石油、動(dòng)物或植物油、礦物油或合成油?？梢园ㄉ睇}溶液、葡萄糖或其它的糖溶液或二醇類，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對(duì)于靜脈注射，或在疾病位點(diǎn)的注射，活性成分是注射用藥物可接受的水溶液形式，其是無(wú)熱原的并且具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。所述領(lǐng)域中相關(guān)的一般技術(shù)人員能夠使用例如等壓媒介，如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液來(lái)制備合適的溶液。根據(jù)需要，可以使用防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。對(duì)于所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員，制備藥物配方的多種方法是已知的。見,例如Robinson，1978。
根據(jù)治療條件，組合物可以單獨(dú)給藥或與其它治療組合同時(shí)或依次地給藥，或與另外的治療劑一起作為組合制劑。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以作為與其它的藥物成分結(jié)合的組合治療的部分。組合治療可被用于產(chǎn)生顯著的協(xié)同效應(yīng)，尤其是用于本發(fā)明的結(jié)合成員與一種或多種其它藥物的組合。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可與另外的治療劑同時(shí)給藥或依次給藥或作為組合制劑，用于治療本文所列出的一種或多種病癥。例如，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以與現(xiàn)有的治療淋巴瘤的治療劑組合使用。現(xiàn)有的治療非霍奇金淋巴瘤的治療劑包括:利妥昔單抗(Rituximab);和組合的環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、Hydroxyrubicin (阿霉素(Adriamycin))、長(zhǎng)春新堿(Oncovin)(長(zhǎng)春新堿)和強(qiáng)的松(CHOP化學(xué)療法方案)?，F(xiàn)有的治療霍奇金淋巴瘤的治療劑包括:組合的阿霉素、博來(lái)霉素、長(zhǎng)春堿和氮烯唑胺(ABVD化學(xué)療法方案)?；蛘?，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以與現(xiàn)有的治療肺癌的治療劑組合使用?，F(xiàn)有的治療非小細(xì)胞肺癌的治療劑包括:順鉬(cisplatin)或卡鉬(carboplatin),與吉西他濱(gemcitabine)、紫杉醇、多烯紫杉醇、依托泊苷或長(zhǎng)春瑞濱(Vinorelbine)的組合?，F(xiàn)有的治療小細(xì)胞肺癌的治療劑包括:順鉬或依托泊苷，單獨(dú)或與卡鉬、吉西他濱、紫杉醇、長(zhǎng)春瑞濱、拓?fù)涮婵?Topotecan)、或依立替康(irinotecan)的組合 ο用于本發(fā)明的結(jié)合成員和一種或多種以上的另外的藥物成分可以用于制造藥物。該藥物可以為用于個(gè)體的單獨(dú)或組合給藥，因此可包含結(jié)合成員和作為組合制劑或獨(dú)立制劑的附加成分。獨(dú)立制劑可被用于方便獨(dú)立的和依次的或同時(shí)的給藥，并允許通過(guò)不同途徑進(jìn)行多種成分給藥，例 如口服或腸胃外給藥。根據(jù)本發(fā)明，提供的組合物可以給藥于哺乳動(dòng)物。給藥可以以“治療有效量”，這是充分顯示對(duì)患者有效的量。這樣的有效性可為至少改善了至少一種癥狀。給藥的實(shí)際量和給藥的速率和時(shí)間過(guò)程會(huì)取決于被治療的(病癥)特性和嚴(yán)重程度，被治療的特定的哺乳動(dòng)物，個(gè)體患者的臨床情況，病癥的起因，遞呈組合物的位點(diǎn)，結(jié)合成員的類型，給藥的方法，給藥的時(shí)序安排和執(zhí)業(yè)醫(yī)生已知的其他因素。處方治療，例如劑量的確定，是在一般從業(yè)者和其他的醫(yī)生的責(zé)任范圍內(nèi)的，并且取決于癥狀的嚴(yán)重程度和/或被治療疾病的發(fā)展?？贵w的合適劑量在所屬領(lǐng)域中是熟知的(Ledermannl991和Bagshawel991)?？墒褂帽疚闹酗@示的,或Physician' s Desk Reference (2003)中的適合于給藥藥物類型的確切劑量?？赏ㄟ^(guò)比較動(dòng)物模型中用于本發(fā)明的結(jié)合成員的體外和體內(nèi)的活性來(lái)確定結(jié)合成員的治療有效量或合適的劑量。從小鼠或其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有效劑量推斷出對(duì)人的有效劑量的方法是已知的。精確的劑量取決于多種因素，包括該抗體是用于診斷、預(yù)防還是治療，治療區(qū)的尺寸和位置，抗體的準(zhǔn)確性質(zhì)(例如完整抗體、片段或雙體抗體)和連接于該抗體的任意可檢測(cè)標(biāo)記或其它分子的性質(zhì)。對(duì)于全身應(yīng)用，一般抗體的劑量在ΙΟΟμ g至Ig的范圍內(nèi)，對(duì)于局部應(yīng)用在I μ g至Img的范圍內(nèi)。可以以初始較高的負(fù)荷劑量，隨后一個(gè)或多個(gè)降低的劑量來(lái)給藥?？贵w可為完整抗體，例如IgGl或IgG4同種型。這是對(duì)成人患者的單次治療的劑量，對(duì)于小孩和嬰兒其可以按比例進(jìn)行調(diào)整，或者還可對(duì)于其它抗體形式根據(jù)分子量按比例調(diào)整。治療可以以每天、一周兩次、每周或每個(gè)月的間隔時(shí)間重復(fù)，根據(jù)醫(yī)生自由決定。治療可以為每二至四周的皮下給藥，和每四至八周的靜脈給藥。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，治療是周期性的，兩次給藥之間的時(shí)間為約二周或更多，例如，約三周或更多，約四周或更多，或約一月一次。在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，可在手術(shù)之前和/或之后提供治療，可以直接在手術(shù)治療的解剖位點(diǎn)進(jìn)行給藥或應(yīng)用。提供了包括以下實(shí)驗(yàn)示例的本說(shuō)明書，所述領(lǐng)域的一般技術(shù)人員會(huì)明白本發(fā)明的其它方面和實(shí)施例。實(shí)驗(yàn)材料和方法抗體之前已經(jīng)描述了抗ED-B抗體片段scFv(L19)的分離(Pini et al.1998)。使用公開發(fā)表的方法從ETH-2庫(kù)分離母源抗ED-A抗體(Giovannoni,Nucleic.Acid Research,2001,29(5):E27)。在以下的部分中描述了母源抗ED-A抗體的親和力成熟，產(chǎn)生高親和力抗ED-A抗體。母源抗ED-A抗體的親和力成熟母源抗ED-A抗體(ETH-2-源抗體)被用作構(gòu)建親和力成熟庫(kù)的模板。使用部分簡(jiǎn)并引物，對(duì)于 VH 的 5 ' -CTGGAGCCTGGCGGACCCAGCTCATMNNMNNMNNGCTAAAGGTGAATCCAGA-3' (SEQ ID NO: 17)和對(duì)于 VL 的 5' -CCAGGITTCTGCTGGTACCAGGCTAA MNNMNNMNNGCTAACACTCTGACTGGCCCTGC-3'(所有的寡核苷酸購(gòu)自 Operon Biotechnologies,Cologne，Germany)，在 VH CDRl 的 31、32 和 33 的位置以及 VL CDRl 的 31、31a 和 32 的位置產(chǎn)生隨機(jī)突變的方法中，通過(guò)PCR引入庫(kù)的VH CDRl (DP47種系)和VL CDRl (DPK22種系)的序列可變性。使用引物 LMB31ong(5' -CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3' ) (SEQ ID NO:19)和fdseqlongC -GA CGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3' ) (SEQ ID NO:20)以凝膠純化的VH和VL片段作為模板，通過(guò)PCR拼接將VH VL組合拼接成scFv形式。以Ncol/Notl雙消化該拼接的VH-VL片段，并且克隆到Ncol/Notl消化pHENl噬粒載體(Hoogenboom etal., 1991) ο根據(jù)(Viti et al., 2000),得到的連接產(chǎn)物被電穿孔進(jìn)入到電感受態(tài)E.coliTG-1細(xì)胞，產(chǎn)生包含1.5xl07單獨(dú)抗體克隆的庫(kù)，其被用于篩選具有提高的親和力的結(jié)合ED-A的抗體?？?ED-A抗體的選擇使用BIAcore分析，在以上所述的抗體庫(kù)篩選以比母源抗ED-A抗體更高的親和力結(jié)合ED-A的抗體。該BIAcore分析中使用的抗原(11A12)包含人纖連蛋白的ED-A域，并且具有以下的氨基酸序列(SEQ ID NO:120):MRSYRTEIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQ TEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESP QGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIG TQSTAIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDSSSV VVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLENVRSHHHHHH抗原(11A12)的核苷酸序列(SEQ ID NO:121)如下:atgagatcctaccgaacagaaattgacaaaccatcccagatgcaagtgaccgatgttcaggacaacagcattagtgtcaagtggctgccttcaagttcccctgttactggttacagagtaaccaccactcccaaaaatggaccaggaccaacaaaaactaaaactgcaggtccagatcaaacagaaatgactattgaaggc
ttgcagcccacagtggagtatgtggttagtgtctatgctcagaatccaagcggagagagtcagcctctggttcagactgcagtaaccaacattgatcgccctaaaggactggcattcactgatgtggatgtcgattccatcaaaattgcttgggaaagcccacaggggcaagtttccaggtacagggtgacctactcgagccctgaggatggaatccatgagctattccctgcacctgatggtgaagaagacactgcagagctgcaaggcctcagaccgggttctgagtacacagtcagtgtggttgccttgcacgatgatatggagagccagcccctgattggaacccagtccacagctattcctgcaccaactgacctgaagttcactcaggtcacacccacaagcctgagcgcccagtggacaccacccaatgttcagctcactggatatcgagtgcgggtgacccccaaggagaagaccggaccaatgaaagaaatcaaccttgetcctgacagcteatccgtggttgtatcaggacttatggtggccaccaaatatgaagtgagtgtctatgctcttaaggacactttgacaagcagaccagctcagggagttgtcaccactctggagaatgtcagatctcatcaecatcaccatcactaa使用分別在5’和3’含有BamHI和BglII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增該抗原的核苷酸序列。用BamHI和BgIII限制性內(nèi)切酶消化得到的PCR產(chǎn)物和載體PQE12 (QIAGEN)，隨后以具有插入載體率為3: I的反應(yīng)被連接。得到的載體被測(cè)序從而檢查該序列是否正確?？乖闹苽淙缦?10ml2TY、Amp、l%葡萄糖中的TGl電感受態(tài)預(yù)培養(yǎng)物在有I μ I的11Α12的DNA微量提取的存在下被電穿孔。然后預(yù)培養(yǎng)物被稀釋1: 100 (8ml加入到800ml的2ΤΥ、Amp、I %葡萄糖中)，并且生長(zhǎng)至0D600為0.4-0.6，然后以IPTG誘導(dǎo)過(guò)夜。第二天，破碎細(xì)胞，上清液被過(guò)濾(微孔過(guò)濾器，0.22 μ m)。在離心和澄清培養(yǎng)液之后，使用FPLC的Hitrap柱純化11A12。再生Ni/柱如下:以5倍柱體積(CV)的H20沖洗該柱，隨后通過(guò)用3CV的0.5MEDTA/0.2M Tris pH8將老化的鎳沖洗出柱外。此后，用5CV的H20沖洗柱子。然后用2CV的IOOmM的NiS04裝柱，然后用幾CV的H20沖洗柱子。然后用5CV的裂解液(20mM咪唑/250mM NaCl/PBS pH7.4)來(lái)平衡柱子。然后過(guò)濾細(xì)胞裂解物(微孔過(guò)濾器，0.45 μ m)，并且將其負(fù)載在柱子上(手工)。然后該柱子被放回FPLC，流動(dòng)裂解液(大約3CV)直至UV信號(hào)穩(wěn)定(恒定)。然后開始洗脫程序:5CV的級(jí)數(shù)為0%至100%的洗脫液(400mM咪唑/250mM NaCl/PBS pH7.4)。收集含有被洗脫抗原的部分，并且在PBS中滲析過(guò)夜?？笶D-A抗體的表達(dá)和純化抗ED-A抗體的表達(dá)和純化如下:10ml2TY、Amp、l%葡萄糖中的TGl電感受態(tài)預(yù)培養(yǎng)物在有1μ I的抗ED-A抗體之一的DNA微量提取物的存在下被電穿孔。然后預(yù)培養(yǎng)物被稀釋I: 100 (8ml加入到800ml的2ΤΥ、Amp、I %葡萄糖)，并且生長(zhǎng)至0D600為0.4-0.6，然后以IPTG誘導(dǎo)過(guò)夜。第二天，破碎細(xì)胞，過(guò)濾上清液(微孔過(guò)濾器，0.22 μ m)。以蛋白質(zhì)A-瓊脂糖柱來(lái)純化scFv,三乙胺(Triethylemmine)被用于從柱上洗脫scFv。含有被洗脫scFv的部分于4°C在PBS中滲析過(guò)夜。然后將該scFv部分裝上Superdex75柱，以0.5ml/min流動(dòng)的PBS,收集0.25ml部分。單體部分被用于進(jìn)行BIAcore分析。BIAcore 分析 I用HBS-EP緩沖液BIAC0RE，0.0lM Hepes ρΗ7.4,0.15Μ NaCl,3mM EDTA,0.005%表面活性劑P20(試驗(yàn)使用同樣的緩沖液)，以5μ 1/min的流速?zèng)_洗BIAcore芯片過(guò)夜。抗原(11A12)在醋酸緩沖液(pH4.0)中被稀釋到50 μ g/ml的濃度，通過(guò)注入50 μ I的N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和乙基- N-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)的混合物使芯片上的COOH基團(tuán)活化。將40 μ I的11Α21抗原注入到芯片上，以30 μ I的乙醇胺來(lái)封閉殘余的游離COOH基團(tuán)。在以0.22 μ m過(guò)濾之后，將20 μ I的每種細(xì)菌的上清液注入到芯片上并且監(jiān)控與抗原的實(shí)時(shí)相互作用。BIAcore 分析 2使用表面等離子共振來(lái)測(cè)量母源抗ED-A抗體和抗ED-A抗體Β2、C5、D5、C8、F8、Β7和G9的km，kMf和KD。使用與實(shí)驗(yàn)中相同的緩沖液以5 μ 1/min的緩沖液流速平衡芯片過(guò)夜。以該流速進(jìn)行完全覆蓋程序。用醋酸鹽緩沖液pH4.00(BIAC0RE提供)將抗原11A12稀釋1: 25至終濃度20 μ g/ml。然后混合NHS和EDC，并且注入50 μ I從而活化CM5芯片上的COOH基團(tuán)。然后注入40 μ I的抗原(持續(xù)約40" ) ο然后注入30 μ I的乙醇胺從而封閉可能存在的游離COOH的反應(yīng)。以20 μ 1/min的流速試驗(yàn)每個(gè)樣品。注入20 μ I的未稀釋的單體蛋白質(zhì)(如其從凝膠過(guò)濾中出來(lái)的)。瓦解時(shí)間持續(xù)約200"。然后注入10 μ I的HCl IOmM從而再生芯片。以不同稀釋程度，即1: 2稀釋(在PBS中)重復(fù)注入單體蛋白質(zhì)，然后以HCl再生。此之后第三次注入以1: 4稀釋的蛋白質(zhì)，再次進(jìn)行以HCl再生。使用BIAevaluation軟件測(cè)試每個(gè)抗ED-A抗體的km、koff和KD值。 淋巴瘤切片的免疫組織化學(xué)在低溫丙酮(_20°C)中固定Ramos淋巴瘤切片(section) 10分鐘,載玻片(slide,切片)于室溫(RT)干燥30分鐘。然后將該載玻片侵入TBS5至10分鐘，用紙弄干載玻片的背面而不碰觸切片。然后以> ΙΟΟμ I的TBS(50mM TRISUOOmM NaCl、調(diào)節(jié)到pH7.4,0.01%抑肽酶)中的20%胎牛血清(FCS)來(lái)封閉切片30分鐘。倒掉封閉液，載玻片浸沒(méi)在TBS5分鐘。100 μ I攜帶有myc-標(biāo)記的一抗scFv F8 ( 20ng/ μ I),以及10 μ I的生物素化的抗myc抗體9E10(0D0.25，1: 20稀釋)在TBS/3% BSA中稀釋，然后加入到載玻片。作為陰性對(duì)照，以相同的方法進(jìn)行Ramos淋巴瘤切片免疫組織化學(xué)染色，但是省略掉一抗，即myc-標(biāo)記scFv抗ED-A抗體F8。該載玻片在保濕室中孵育I小時(shí)。用TBS清洗載玻片，然后加入在TBS/3%BSA中1: 150稀釋的鏈霉親和素-堿性磷酸酶，在保濕室中孵育30分鐘。然后用TBS清洗載玻片兩次達(dá)5分鐘，用紙干燥載玻片的背面。500 μ I的堅(jiān)牢紅底物(5mg的堅(jiān)牢紅粉末加入到5ml的堅(jiān)牢紅溶液中[49ml TRIS-HCl，0.1M，ρΗ8.2 ；1.0ml N，N- 二甲基甲酰胺;IOmg 萘酚 AS-MX-磷酸鹽和 50 μ I 左旋咪唑溶液(lml0.1M TRIS-HCl pH8.2,240.8mg左旋咪唑粉末)]并且用孔徑0.45 μ m的過(guò)濾器過(guò)濾)加入到每個(gè)載玻片，載玻片在保濕室中孵育15分鐘。通過(guò)以塑料巴氏吸管直接將去離子水施加到每個(gè)切片上的方式用去離子水清洗載玻片兩次，然后放在水中。然后將載玻片轉(zhuǎn)移到Gillis Hematoxilin溶液中50分鐘,然后快速轉(zhuǎn)移到水中，并且用水沖洗6次。最后，用Glycergel (DakoCytomation,Glostrup,丹麥)封固劑來(lái)封固載玻片,用使用Axiovision軟件(Carl Zeiss)的AxiovertS100TV 顯微鏡(Carl Zeiss, Feldbach,瑞士)來(lái)進(jìn)行分析。肺癌切片的免疫組織化學(xué)染色小細(xì)胞肺癌(小細(xì)胞癌)的切片和幾個(gè)非小細(xì)胞肺癌(鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、細(xì)支氣管肺泡癌和大細(xì)胞癌)的切片以攜帶了 myc-標(biāo)記的scFv抗ED-A抗體來(lái)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，如前所述(見，例如Brack et al.2006)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，切片與scFv抗ED-A抗體D5 (終濃度2-15118/1^)和二抗(單克隆抗-myc抗體9E10)同時(shí)一起孵育。用兔抗小鼠免疫球蛋白抗體(Dakocytomation, Glostrup,丹麥),然后通過(guò)小鼠單克隆堿性磷酸酶_抗堿性磷酸酶復(fù)合體(Dakocytomation)檢測(cè)結(jié)合的抗體。堅(jiān)牢紅(Sigma)被用作磷酸酶底物,切片用蘇木精(Sigma)復(fù)染。最后，用Glycergel (DakoCytomation,Glostrup,丹麥)封固劑來(lái)封固切片，用使用 Axiovision 軟件(Carl Zeiss)的 Axiovert SlOOTV 顯微鏡(Carl Zeiss,Feldbach, Switzerland)來(lái)進(jìn)行分析。益果篩選抗ED-A抗體BIAcore 分析 IBIAcore分析產(chǎn)生了每個(gè)抗ED-A抗體的圖，分析其從而推導(dǎo)出抗體對(duì)抗原的親合力，如下:每個(gè)圖的X軸對(duì)應(yīng)于 時(shí)間，Y軸對(duì)應(yīng)于共振單位(顯示試驗(yàn)抗體對(duì)覆蓋在BIAcore芯片上的抗原的結(jié)合親和力的測(cè)量)。每個(gè)圖顯示了 3個(gè)峰值和I個(gè)谷值，其對(duì)應(yīng)于緩沖液的變換，因此與結(jié)果分析無(wú)關(guān)。每個(gè)圖的上升部代表結(jié)合階段。圖中該部分的曲線越陡，抗體與抗原的結(jié)合越快。每個(gè)圖中的下降部分代表了抗體從抗原解離的階段。圖中該部分的曲線越平緩，抗體從抗原的解離就越慢。抗ED-A 抗體 H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8 和 G9 都顯示了比它們所起源的母源抗ED-A抗體更平緩的解離曲線，說(shuō)明它們以比母源抗ED-A抗體更高的親和力結(jié)合ED-A, A-FN也是同樣。抗體E5、FU F8和Hl的圖顯示出所有被試驗(yàn)的抗ED-A抗體中最平緩的解離曲線。抗體111、05、0535、08、？8和？1的結(jié)合曲線比從母源抗ED-A抗體觀察到的要平緩，而抗體B2、B7、E8和G9的結(jié)合曲線的陡度與從母源抗ED-A抗體觀察到的一樣。但是，因?yàn)镮PTG-誘導(dǎo)的E.coli TG-1細(xì)胞的細(xì)菌上清液被用于抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的BIAcore分析,所試驗(yàn)的抗體樣品的濃度未知,但是很可能低于用于比較的母源抗-ED-A抗體樣品的濃度。因此，由于用于BIAcore分析的樣品中抗體的濃度低，抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8和G9的結(jié)合曲線可能人為地低。但是，因?yàn)闈舛炔伙@著影響B(tài)IAcore分析中抗體從其靶抗原的解離，從抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、FU B7、ES和G9觀察到的平緩的解離曲線表示這些抗體至少以與母源抗-ED-A抗體相等，或可能更高的親和力結(jié)合ED-A。BIAcore 分析 2使用BIAevaluation軟件評(píng)價(jià)了每個(gè)抗ED-A抗體的km、k0ff和KD值。表2中詳細(xì)表示了母源抗ED-A抗體和抗ED-A抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9對(duì)抗原11A12的km、k0ff和KD值?？笶D-A抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9都具有比它們起源的母源抗ED-A抗體更好的對(duì)抗原11A12的Kd值，顯示這些抗原以比母源抗ED-A抗體更高的親和力結(jié)合ED-A，A-FN也是同樣。淋巴瘤切片的免疫組織化學(xué)人原發(fā)性Romas淋巴瘤(非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤(博基特氏淋巴瘤))切片以抗ED-A scFv F8抗體的免疫組織化學(xué)染色顯示了新生血管的強(qiáng)烈和特異性染色。相比之下，在陰性對(duì)照中，其中除了省略了抗ED-A scFv F8抗體，原發(fā)性Romas淋巴瘤在相同的條件下染色，未觀察到原發(fā)性Romas淋巴瘤包括新生血管的染色。這表明本發(fā)明的抗ED-A scFv抗體特異性地靶定于淋巴瘤的新生血管。因此，ED-A可作為淋巴瘤中基于結(jié)合成員(例如抗體)的靶定方法的一般目標(biāo)。肺癌切片的免疫組織化學(xué)一般在某些類別的癌癥中發(fā)現(xiàn)“泛腫瘤抗體(pantumoral antibodies) ”是困難的，例如赫賽汀(Here印tin)僅染色20%的乳腺癌。圖1顯示了抗ED-A抗體F8特異性地定位于肺癌的新生血管。尤其是，抗ED-A抗體F8在小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的新生血管都特異性定位。非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的 75% -85%，而小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的 15% -25%。圖1還表明抗ED-A抗體特異性地定位于所試驗(yàn)的所有非小細(xì)胞肺癌亞型，即鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、細(xì)支氣管肺泡癌和大細(xì)胞癌。因此圖1的結(jié)果令人驚奇地表明抗ED-A抗體，F(xiàn)8，染色所試驗(yàn)的肺癌的所有組織學(xué)類型。因此，ED-A可以作為肺癌中基于結(jié)合成員(例如，抗體)的靶定方法的一般 目標(biāo)。測(cè)序抗ED-A 抗體 Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8 和 G9 都是 scFv 抗體，使用常規(guī)的方法進(jìn)行測(cè)序。圖3中顯示了抗ED-A抗體Hl的核苷酸序列。圖4中顯示了抗ED-A抗體Hl的氨基酸序列。優(yōu)選的編碼抗ED-A 抗體 B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8 和 G9 的 VH 和 / 或 VL的核苷酸序列與編碼抗ED-A抗體Hl的VH和/或VL的核苷酸序列是一致的，除了編碼輕鏈(VL)和重鏈(VH)的HlCDRl的核苷酸序列被表I中示出的各個(gè)抗體的編碼輕鏈(VL)和重鏈(VH)⑶Rl的核苷酸序列所取代。優(yōu)選的編碼抗ED-A scFv F8雙體抗體的VH和/或VL的核苷酸序列與編碼抗ED-A抗體Hl的VH和/或VL的核苷酸序列是一致的，除了編碼輕鏈(VL)和重鏈(VH)的HlCDRl的核苷酸序列被表I中列出的抗ED-A抗體F8的編碼輕鏈(VL)和重鏈(VH)CDRl的核苷酸序列所取代。優(yōu)選的編碼連接抗ED-A scFv F8雙體抗體的VH和VL的連接子的核苷酸序列是 gggtccagtggcggt (SEQ ID NO:29)?？笶D-A 抗體 B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8 和 G9 與抗 ED-A 抗體 Hl 具有相同的氨基酸序列，除了輕鏈(VL)和重鏈(VH)的HlCDRl的氨基酸序列被表I中列出的(顯示的)各個(gè)(respective，相應(yīng))抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)⑶Rl的氨基酸序列所取代?？笶D-AscFv F8雙體抗體的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的氨基酸序列是一致的，除了輕鏈(VL)和重鏈(VH)的Hl⑶Rl的氨基酸序列被表I中列出的抗ED-A F8的輕鏈(VL)和重鏈(VH)CDRI的氨基酸序列所取代，Hl中的連接子的氨基酸序列被連接子氨基酸序列GSSGG (SEQ IDNO:28)取代?？笶D-A抗體B2VH域(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:23取代了 Hl的VH⑶R1?？笶D-A抗體C5VH域(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:43取代了 Hl的VH⑶R1。抗ED-A抗體D5VH域(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:53取代了 Hl的VH⑶R1?？笶D-A抗體E5VH域(SEQ ID NO:61)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:63取代了 Hl的VH⑶R1?？笶D-A抗體C8VH域(SEQ ID NO:71)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:73取代了 Hl的VH⑶R1。抗ED-A抗體F8VH域(SEQ ID NO:81)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:83取代了 HlI的VH CDR1。抗ED-A F8雙體抗體的VH域與抗ED-A抗體F8的VH域具有相同的氨基酸序列(即SEQ ID NO:81)。抗ED-A抗體FlVH域(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:93取代了 Hl的VH⑶R1?？笶D-A抗體B7VH域(SEQ ID NO: 101)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:103取代了 Hl的VH CDRl。抗ED-A抗體E8VH域(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:113取代了 Hl的VH⑶R1?？笶D-A抗體G9VH域(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:33取代了 Hl的VH⑶R1?？笶D-A抗體B2VL域(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VL域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:26取代了 HI的VL CDRI?？笶D-A抗體C5VL域(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VL域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:46取代了 Hl的VL⑶R1?？笶D-A抗體D5VL域(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VL域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:56取代了 Hl的VL⑶R1?？笶D-A抗體E5VL域(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VL域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:66取代了 HI的VL CDRI。抗ED-A抗體C8VL域(SEQ ID NO:72)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VL域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:76取代了 HI的VL CDRl。抗ED-A抗體F8VL域(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VL域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:86取代了 Hl的VL CDRl?？笶D-A F8雙體抗體的VL域與抗ED-A抗體F8具有相同的氨基酸序列(即SEQ ID NO:82)?？笶D-A抗體FlVL域(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VL域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:96取代了 Hl的VL⑶R1?？笶D-A抗體B7VL域(SEQ ID NO: 102)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VL域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:106取代了 Hl的VL CDRl?？笶D-A抗體E8VL域(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VL域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:116取代了 Hl的VL⑶R1?？笶D-A抗體G9VL域(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VL域的氨基酸序列一致，除了 SEQ ID NO:36取代了 Hl的VL⑶R1?？蛇x地，抗ED-A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8、G9和 scFv F8 雙體抗體的VH域的位置5的氨基酸可以為亮氨酸殘基(L)而不是纈氨酸殘基(V)，如圖4A所示。此外，或者抗 ED-A 抗體 Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8、G9 和 scFv F8 雙體抗體的 VL域的位置18的氨基酸可以為精氨酸殘基(R)而不是賴氨酸殘基(K)，如圖4C所示。參考文獻(xiàn)本說(shuō)明書任何地方列出的所有的文獻(xiàn)，包括在上文的任何地方列出的，通過(guò)引用其全文而結(jié)合于本文中，用于所有的目的。Amit et al.(1986)，Science，233:747-753.
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Wess In:BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness，12(42)表 I抗ED-A親和力成熟抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL) CDRl的核苷酸和氨基酸序列
權(quán)利要求
1.結(jié)合纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域-A(ED-A)同種型的結(jié)合成員在制備用于治療淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用，其中所述結(jié)合成員連接具有殺滅或細(xì)胞毒素活性的分子，或連接放射性同位素。
2.結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員在制備將連接所述結(jié)合成員的分子遞呈至淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述分子具有殺滅或細(xì)胞毒素活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述分子是可檢測(cè)標(biāo)記或是放射性同位素。
5.結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員在制造用于診斷淋巴瘤的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述結(jié)合成員結(jié)合所述纖連蛋白的ED-A。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述抗體包含VH域和VL域，其中所述VH域包含構(gòu)架和一組互補(bǔ)決定區(qū)HCDRl、HCDR2和HCDR3，且其中所述VL域包含一組互補(bǔ)決定區(qū)IXDRl、IXDR2和IXDR3以及構(gòu)架，其中: HCDRl具 有氨基酸序列SEQ ID NO:83， HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:4, HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:5 ； LCDRl具有氨基酸序列SEQ ID NO:86， LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:7，和 LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:8。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述VH域構(gòu)架和/或所述VL域構(gòu)架是人種系構(gòu)架。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述抗體包含SEQID NO:81中示出的VH域；或者包含SEQ ID NO:81中示出的VH域，但所述VH域的位置5的氨基酸為亮氨酸殘基(L)而不是纈氨酸殘基(V)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述抗體包含SEQID NO:82中示出的VL域；或者包含SEQ ID NO:82中示出的VL域，但所述VL域的位置18的氨基酸為精氨酸殘基(R)而不是賴氨酸殘基(K)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述抗體包括單鏈Fv或者是雙體抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述抗體包括單鏈Fv或者是雙體抗體，包含SEQ ID NO:81中示出的VH域，但所述VH域的位置5的氨基酸為亮氨酸殘基(L)而不是纈氨酸殘基(V)，且進(jìn)一步包含SEQ ID NO:82中示出的VL域，但所述VL域的位置18的氨基酸為精氨酸殘基(R)而不是賴氨酸殘基(K)。
14.一種診斷淋巴瘤的體外方法，其中使用結(jié)合纖連蛋白的ED-A的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與肺癌和淋巴瘤相關(guān)的抗原。本發(fā)明涉及一種結(jié)合纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域(ED-A)同種型的結(jié)合成員，用于檢測(cè)和治療肺癌和淋巴瘤。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供結(jié)合纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域-A(ED-A)同種型的結(jié)合成員在制備用于治療淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用，其中所述結(jié)合成員連接具有殺滅或細(xì)胞毒素活性的分子，或連接放射性同位素。
文檔編號(hào)A61K47/48GK103212072SQ201310127909
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2008年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日
發(fā)明者達(dá)里奧·內(nèi)里, 亞歷山德拉·維拉, 伊夫林·特拉赫塞爾, 雅舍-尼古拉·雷巴克 申請(qǐng)人:菲洛根股份公司