肽組合物和用于治療患者的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及肽組合物和使用肽組合物治療前驅(qū)糖尿病、糖尿病、肥胖、高血壓和代謝綜合征的方法。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及包含由所述氨基酸序列GGL（也稱為Diapin）、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL組成的至少一種肽的組合物。
【專利說明】肽組合物和用于治療患者的方法
[0001]本申請要求2011年2月11日提交的美國臨時專利申請第61/441，748號的權(quán)益。該臨時申請由此通過引用全部并入。
[0002]政府利益的聲明
[0003]本發(fā)明是在由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)授予的HL68878和HL89544的政府資助下進(jìn)行。政府對本發(fā)明具有一定權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及肽組合物和使用肽組合物治療前驅(qū)糖尿病、糖尿病、肥胖、高血壓和代謝綜合征的方法。
[0005]發(fā)明背景
[0006]我們身體將我們攝入的食物轉(zhuǎn)化為葡萄糖。血液運(yùn)輸葡萄糖到細(xì)胞，細(xì)胞將葡萄糖轉(zhuǎn)化為能量。通常，稱為胰島素的蛋白質(zhì)激素控制血液中葡萄糖水平。當(dāng)胰島素生成、胰島素作用、或兩者有缺陷時，會導(dǎo)致在血液中高水平的葡萄糖。糖尿病是特征為這些缺陷的
一組疾病。
[0007]糖尿病的三種最常見形式為I型糖尿病、2型糖尿病和妊娠期糖尿病。I型糖尿病(之前稱為胰島素依賴型糖尿病或青少年型糖尿病)通常發(fā)生在兒童或青少年中。當(dāng)身體的免疫系統(tǒng)破壞生成胰島素的胰腺細(xì)胞時，它會出現(xiàn)。具有I型糖尿病的人必須一天監(jiān)控它們血液中糖水平多次，并攝入胰島素(通過注射或者泵送)以維持恰當(dāng)水平。當(dāng)懷孕婦女不耐受葡萄糖時，出現(xiàn)妊娠期糖尿病。妊娠期糖尿病也需要治療以維持適宜的血糖水平以及避免嬰兒出現(xiàn)并發(fā)癥。具 有妊娠期糖尿病的婦女患上2型糖尿病的風(fēng)險增加。
[0008]2型糖尿病(之前稱為非胰島素依賴型糖尿病或者成年型糖尿病)通常發(fā)生在成年人中。當(dāng)細(xì)胞首先不能恰當(dāng)使用胰島素，然后胰腺失去生成胰島素能力時，它會出現(xiàn)。許多具有2型糖尿病的人通過飲食計劃、鍛煉方案、減肥和服用口服藥物來控制他們的血糖。一些具有2型糖尿病的人也許攝入胰島素。
[0009]糖尿病危害性大，因為在血液中太多糖能夠損害眼睛、腎臟、神經(jīng)和心臟。糖尿病的并發(fā)癥包括心臟病、中風(fēng)、高血壓、失明、其他眼部問題(例如糖尿病性視網(wǎng)膜病)、腎臟疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如知覺受損或者腳部或手部疼痛、食物消化減緩、腕管綜合征和勃起機(jī)能障礙)、截肢、牙周病、易患其他疾病(例如肺炎和流行性感冒)、活動能力受損以及抑郁。不受控制的糖尿病能夠?qū)е录毙酝{生命的事件，例如糖尿病酮癥酸中毒和高滲性昏迷。
[0010]糖尿病是美國成年人中腎衰竭、無損傷下肢截癱和失明新出現(xiàn)病例的主要原因。糖尿病是心臟病和中風(fēng)的主要原因。糖尿病在2007年美國致死主要原因中排第七?？傊?，具有糖尿病的人中死亡風(fēng)險約為沒有糖尿病同齡人的兩倍。根據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心，截止2011年I月，糖尿病影響2580萬人，占美國人總數(shù)的8.3%。另外預(yù)估7900萬成年人具有前驅(qū)糖尿病，該病狀是血糖水平比正常高，但未高到足以診斷為糖尿病。前驅(qū)糖尿病有時稱為空腹葡萄糖降低或者葡萄糖耐量降低。前驅(qū)糖尿病本身增加人們患上2型糖尿病、心臟病和中風(fēng)的風(fēng)險。許多前驅(qū)糖尿病患者在十年內(nèi)患上2型糖尿病。
[0011]除了生活方式干預(yù)外，通常使用藥物來治療前驅(qū)糖尿病和2型糖尿病患者以應(yīng)對糖尿病的并發(fā)癥。醫(yī)生處方控制血壓和血脂的藥物來降低心血管并發(fā)癥。通常，在具有正常腎功能的年輕和嚴(yán)重患者中，醫(yī)生處方口服藥物二甲雙胍以更加直接應(yīng)對導(dǎo)致糖尿病的缺陷。二甲雙胍抑制肝臟葡萄糖生成、增加胰島素敏感性、增加外周葡萄糖攝入、增加脂肪酸氧化以及降低由胃腸道吸收的葡萄糖。但是，在包括腎臟病癥、肺部疾病和肝臟疾病的具有可增加乳酸性酸中毒風(fēng)險病狀的人中禁止使用二甲雙胍。
[0012]其他最近批準(zhǔn)的藥物沒有顯示出比二甲雙胍更加有效，并且各自均具有它們一系列的禁忌癥。例如，羅格列酮是用作抗糖尿病藥的第一種胰島素敏化劑之一。它導(dǎo)致脂肪細(xì)胞對胰島素更加敏感。羅格列酮的年銷售量在2006年達(dá)到峰值$25億。因為羅格列酮可能與心血管事件風(fēng)險增加相關(guān)，所以歐洲藥品局建議在歐洲市場上停止銷售該藥。美國食品藥品管理局允許它仍在市場上銷售，但是至2010年9月23日起它受到明顯限制。
[0013]也已經(jīng)研究使用稱為人胰島素原C-肽的前體、以及C-肽的片段來治療糖尿病。參見國際公開 N0.WO 98/13384、WO 2002/022211、WO 2004/016647、WO 2006/129095 和 WO2007/015069。也參見，Ohtomo 等人，Diabetologia，41:287-291(1998) ;Sato 等人，Cell.Mol.Life Sc1.，61:727-732(2004) ;Hach 等人，Exp.Diabetes Res.:1-6(2008)和 Ido 等人，Science, 277:563-566 (1997)。
[0014]食品蛋白由二十種不同的氨基酸組成并且科學(xué)家已經(jīng)研究攝入葡萄糖時個別氨基酸的作用。參見，Gannon 和 NuttalI，IUBMB life,62:660-668(2010) ;Gannon 等人，Metabolism, 37:1081-1088(1988) ；Gannon 等人，Am.J.Clin.Nutr.,76:1302-1307(2002)和 Kalogeropoulou 等人,Metabolism, 57:1747-1752 (2008)。據(jù)報道,氨基酸亮氨酸和甘氨酸降低血糖應(yīng)答以及刺激另外的胰島素分泌。該作用需要攝入大量的氨基酸，但同時伴隨味道差、不均衡的氨基酸攝入以及損傷腎功能的擔(dān)憂。
`[0015]胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)是腸降血糖素激素。腸降血糖素激素通過應(yīng)答營養(yǎng)物質(zhì)消化的腸細(xì)胞分泌。GLP-1的主要生理作用呈現(xiàn)出與糖血控制相關(guān)。GLP-1刺激胰島素釋放，抑制胰高血糖素分泌，降低胃排空和增加飽腹感。在具有2型糖尿病的患者中，腸降血糖素作用降低，導(dǎo)致糖血控制變差。已經(jīng)報道向患者施用GLP-1能通過內(nèi)源性胰島素分泌來恢復(fù)血糖調(diào)節(jié)。也已經(jīng)報道GLP-1施用通過它對延遲胃排空和增加飽腹感的作用來減少能量攝入，因此它可導(dǎo)致體重減輕。最近批準(zhǔn)兩種GLP-受體激動劑/類似物用于治療2型糖尿病，艾塞那肽(exenatide) (Byetta'*)和利拉魯肽(Iiraglutide) (Victoza?)以及其他進(jìn)入臨床階段。也已經(jīng)批準(zhǔn)一周一次給藥的艾塞那肽(Bydureonl制劑。參見，Barnett等人，Diabetes, Obesity and Metabolism.接受的文章在線公開(2011)。
[0016]此外，研究已經(jīng)證實GLP-1受體的激動劑也作用于心血管相關(guān)的功能，例如心率和血壓。參見，Grieve 等人，British J.Pharm.，157a: 1340-1351 (2009)。在特定的研究中，喂食Dahl鹽敏感性(DSS)大鼠高鹽飲食，并單獨(dú)使用艾塞那肽模擬物(AC3174)或者聯(lián)合ACE抑制劑(卡托普利)來處理。與卡托普利相比，AC3174具有抗高血壓、胰島素敏化和腎臟保護(hù)作用。參見，Liu 等人，Cardiovascular Diabetology, 9 (32):1-10(2010)。
[0017]因此，本領(lǐng)域?qū)η膀?qū)糖尿病、糖尿病和它們的并發(fā)癥的新療法存在需求。本領(lǐng)域?qū)Ψ逝帧⒏哐獕汉痛x綜合征的新療法也存在需求。發(fā)明概要
[0018]本發(fā)明提供用于治療前驅(qū)糖尿病、糖尿病、肥胖、高血壓、代謝綜合征、糖血控制差、和降低的胰島素分泌的產(chǎn)品和方法。
[0019]本發(fā)明提供用于治療病狀的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL組成的至少一種肽、或者肽的藥學(xué)上可接受的鹽，其中該病狀是前驅(qū)糖尿病、糖尿病、肥胖、高血壓、代謝綜合征、糖血控制差、或降低的胰島素分泌。此外，本發(fā)明提供用于治療病狀的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包含由氨基酸序列 GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL、或dLGdL組成的至少一種肽、或者肽的藥學(xué)上可接受的鹽，其中該病狀是前驅(qū)糖尿病、糖尿病、肥胖、高血壓、代謝綜合征、糖血控制差、或降低的胰島素分泌。
[0020]也提供在糖尿病患者中預(yù)防、減少、或改善與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL組成的至少一種肽、或者肽的藥學(xué)上可接受的鹽，其中與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥是心血管疾病、慢性腎臟病、腎衰竭、膀胱問題、勃起機(jī)能障礙、胃輕癱、眼部疾病、糖尿病性神經(jīng)病、足或皮膚潰瘍、或者下肢截肢。此外，本發(fā)明提供在糖尿病患者中預(yù)防、減少、或改善與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包含由氨基酸序列GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或 dLGdL 組成的至少一種肽或者肽的藥學(xué)上可接受的鹽，其中與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥是心血管疾病、慢性腎臟病、腎衰竭、膀胱問題、勃起機(jī)能障礙、胃輕癱、眼部疾病、糖尿病性神經(jīng)病、足或皮膚潰瘍、或者下肢截肢。
[0021]在所有上述方法中，能夠?qū)㈦脑贜-末端處乙?；?、在C-末端處酰胺化、或者兩者兼有。能夠通過口服、腹膜內(nèi)、眼睛、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑來施用組合物。
[0022]通過本發(fā)明提供的藥物組合物包括組合物，其包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, Gd LdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或 dLGdL 組成的至少一種肽、或者肽的藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的賦形劑。它們也包括組合物，其中藥物組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、或GLL組成的至少一種肽、或者肽的藥學(xué)上可接受的鹽、和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在組合物中，能夠?qū)㈦脑贜-末端乙?；?、在C-末端處酰胺化、或者兩者兼有。
[0023]本發(fā)明提供用于施用藥物組合物的試劑盒，該藥物組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、GGdL、GdLG、GdLL、GLdL、GdLdL、dLLG、LdLG、dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或 dLGdL 組成的至少一種肽、或者所述肽的藥學(xué)上可接受的鹽、以及藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中試劑盒包括組合物、施用組合物的說明書以及用于向患者施用組合物的裝置。此外，本發(fā)明提供試劑盒，其中藥物組合物包含由所述氨基酸序列GGL、GLG、或GLL組成的至少一種肽。在試劑盒中，能夠?qū)㈦脑贜-末端處乙酰化、在C-末端處酰胺化、或者兩者兼有。
[0024]心血管疾病(CVD)是糖尿病患者中致死的主要原因，占約三分之二的死亡數(shù)。因此，將CVD風(fēng)險最小化是管理前驅(qū)糖尿病和糖尿病患者的主要臨床目標(biāo)。本發(fā)明提供改善血糖控制以及同時降低心血管事件和其他糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險。
[0025]附圖簡述[0026]圖1顯示在C57BL/6J小鼠中口服負(fù)荷甘氨酸和葡萄糖之后甘氨酸對血糖的作用。
[0027]圖2顯示在C57BL/6J小鼠中口服負(fù)荷亮氨酸和葡萄糖之后亮氨酸對血糖的作用。
[0028]圖3顯示在KKay糖尿病小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖之后Diapin抑制血糖的增加。
[0029]圖4顯示在KKay糖尿病小鼠中口服負(fù)荷淀粉之后Diapin抑制血糖的增加。
[0030]圖5顯示在KKay糖尿病小鼠中Diapin降低隨機(jī)血糖。
[0031]圖6顯示在KKay糖尿病小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖和Diapin 30min之后Diapin刺
激胰島素分泌。
[0032]圖7顯示在KKay糖尿病小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖和Diapin 30min之后Diapin刺激GLP-1分泌。
[0033]圖8顯示Diapin以時間和劑量依賴性方式降低KKay糖尿病小鼠的血糖水平。
[0034]圖9顯示在C57BL/6J小鼠中Diapin對空腹血糖沒有作用。
[0035]圖10顯示ip注射葡萄糖至C57B/6J小鼠之后Diapin抑制血糖的增加。
[0036]圖11顯示ip注射葡萄糖至C57BL/6J小鼠之后另一種肽GGH對血糖沒有作用。
[0037]圖12顯示ip注射葡萄糖至C57BL/6J小鼠之后兩種其他肽(LGG和LGL)對血糖的作用。
[0038]圖13顯示在C57BL/6J小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖之后肽LLG對血糖的作用。
[0039]圖14顯示在C57BL/6J小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖之后肽GLG和GLL對血糖的作用。
[0040]圖15顯示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin和具有酰胺化的C-末端的Diapin對血糖的作用。
[0041]圖16顯示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin和具有乙?；腘-末端的Diapin對血糖的作用。
[0042]圖17顯示在C57BL/6J小鼠中血糖口服施用葡萄糖之后具有酰胺化的C-末端和乙?；腘-末端的Diapin對血糖的作用。
[0043]圖18顯示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖30min之前給予的Diapin對血糖的作用。
[0044]圖19顯示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之前I小時給予的Diapin對血糖的作用。
[0045]圖20顯示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin和二肽對血糖的作用。
[0046]圖21顯示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin和二肽對血糖水平的作用。
[0047]圖22顯示在ob/ob小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin的作用。
[0048]圖23顯示在db/db小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin對血糖水平的作用。
[0049]圖24顯示在高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中口服施用葡萄糖之后Diapin對血糖水平的作用。
[0050]圖25顯示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后D-Diapin(由D-異構(gòu)體氨基酸組成)對降低血糖水平的作用。
[0051]圖26顯示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后和ip施用Diapin之后Diapin對血糖水平的作用。
[0052]圖27顯示在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后修飾的二肽對血糖水平的作用。
[0053]發(fā)明詳述
[0054]在一方面中，本發(fā)明提供待向前驅(qū)糖尿病或糖尿病患者施用的肽。本發(fā)明的肽的例子為GGL (本文稱為“Diapin”)、GLG、LGL、LLG、LGG和GLL。本發(fā)明的肽的其他例子為GL和LG。本發(fā)明還提供肽GGL、GLG、LGL、LLG、LGG和GLL，其中每種亮氨酸獨(dú)立地為L-異構(gòu)體或者D-異構(gòu)體的形式。本發(fā)明的肽的其他例子為LG和GL，其中亮氨酸為D-異構(gòu)體形式。通過本領(lǐng)域已知的方法化學(xué)合成或通過蛋白消化衍生得到本發(fā)明的肽。
[0055]如本文所使用，除非文本中另有明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一種”、和“所述”包括復(fù)數(shù)參照物。
[0056]本領(lǐng)域已知，在沒有不利地影響肽或蛋白的活性下，可以替代肽或蛋白中氨基酸為化學(xué)上類似的氨基酸。因此，據(jù)具體推算，在本發(fā)明的肽中甘氨酸或亮氨酸殘基可被化學(xué)上類似的氨基酸殘基取代，例如不同的脂肪族氨基酸殘基或者氨基酸異構(gòu)體。其他脂肪族氨基酸為丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸。也據(jù)具體推算，在沒有不利地影響肽的活性下，可將化學(xué)上類似的氨基酸加入本發(fā)明的肽的一個或多個末端。
[0057]除了甘氨酸之外，相同的氨基酸全部包含至少一個手性碳原子。因此，這些氨基酸作為成對的立體異構(gòu)體存在，分別稱為L-異構(gòu)體和D-異構(gòu)體。大部分天然存在的蛋白質(zhì)和肽全部由L-異構(gòu)體形式組成。D-異構(gòu)體氨基酸可影響肽或蛋白的構(gòu)象以及可導(dǎo)致增加穩(wěn)定性或改變活性。
[0058]在肽的一些實施方案中，亮氨酸被D-亮氨酸替代。例如在一些實施方案中，肽是甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸(GGL)、或者是甘氨酸-甘氨酸-D-亮氨酸(GGdL)、或者是甘氨酸-亮氨酸-甘氨酸(GLG)、或者是甘氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸(GdLG)、或者是亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(LLG)、或者是D-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(dLLG)、或者是亮氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸(LdLG)、或者是D -亮氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸(dLdLG)、或者是亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(LLG)、或者是D-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸(dLLG)、或者是亮氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸(LdLG)、或者是D-亮氨酸-D-亮氨酸-甘氨酸(dLdLG)、或者是亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸(LGG)、或者是D-亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸(dLGG)、或者是甘氨酸-亮氨酸_亮氨酸(GLL)、或者是甘氨酸-D-亮氨酸-亮氨酸(GdLL)、或者是甘氨酸-亮氨酸-D-亮氨酸(GLdL)、或者是甘氨酸-D-亮氨酸-D-亮氨酸(GdLdL)、或者是亮氨酸-甘氨酸(LG)、或者是D-亮氨酸-甘氨酸(dLG)、或者是甘氨酸-亮氨酸(GL)、或者是甘氨酸-D-亮氨酸(GdL)。本發(fā)明的肽可單獨(dú)使用或者用作兩種或多種肽的混合物。就混合物而言，肽的每個可能亞組合均被本發(fā)明具體涵蓋。
[0059]在一些實施方案中，本發(fā)明的肽經(jīng)化學(xué)修飾。在一些實施方案中，將本發(fā)明的肽在N-末端處乙酰化。在一些實施方案中,將本發(fā)明的肽在C-末端處酰胺化。在一些實施方案中，將本發(fā)明的肽在N-末端處乙?；驮贑-末端處酰胺化。通過本領(lǐng)域已知的方法將肽乙?；王０坊?。在本公開的一些實施方案中，將肽糖基化、羧化、磷酸化、酯化、或轉(zhuǎn)化為酸式加成鹽和/或任選二聚化、多聚化、聚乙二醇化或另外綴合。
[0060]在一些實施方案中，肽包含替代肽鍵的一個或多個非肽鍵。例如，肽包含替代肽鍵的酯鍵、醚鍵、硫醚鍵或者酰胺鍵。
[0061]在另一方面中，提供本發(fā)明的肽的至少一種組合物。本發(fā)明的組合物的例子是包含肽GGL、GLG、LGL, LLG, LGG和GLL、或其藥學(xué)上可接受的鹽的一種或多種的組合物。本發(fā)明的組合物的其他例子是包含肽GL和LG、或其藥學(xué)上可接受的鹽的一種或多種的組合物。本發(fā)明的組合物的其他例子是包含GGL、GLG、GLL、LLG、LGG、LGL、GGdL、GdLG, GdLL, GLdL,GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL, dLGdL、或其藥學(xué)上可接受的鹽的組合物。本發(fā)明的組合物可包括其他組分，其包括其他氨基酸。就組合物而言，肽的每個可能亞組合被本發(fā)明具體涵蓋。
[0062]如本文所使用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)適于接觸人和低級動物組織而不會造成不適當(dāng)毒性、刺激、過敏反應(yīng)等、并且具有合理的益處/危險比率的那些鹽?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的任何非毒性鹽或者酯的鹽，一旦向接受者施用即能夠提供直接或間接本發(fā)明的化合物。藥學(xué)上可接受的鹽是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，Berge等人在Pharmaceutical Sciences, 66:1-19 (1977)中詳細(xì)描述的藥學(xué)上可接受的鹽。
[0063]據(jù)預(yù)估，本發(fā)明的肽、或其混合物可用作組合物中唯一活性產(chǎn)物成分。因此，在本發(fā)明的一方面中，提供一種或多種本發(fā)明的肽的組合物，其中本發(fā)明的一種或多種肽是唯一活性成分。因此，本公開的實施方案是基本上由至少一種肽、或其藥學(xué)上可接受的鹽組成的組合物，該至少一種肽由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL組成。另一實施方案是基本上由至少一種肽、或其藥學(xué)上可接受的鹽組成的組合物，該至少一種肽由氨基酸序列GL或LG組成。又一實施方案是基本上由至少一種肽、或其藥學(xué)上可接受的鹽組成的組合物，該至少一種肽由氨基酸序列 GGL、GLG、GLL、LLG、LGG、LGL、GGdL、GdLG, GdLL, GLdL,GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL, dLGdL組成。就組合物而言，肽的每個可能亞組合被本發(fā)明具體涵蓋。
[0064]在又進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的至少一種肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。
[0065]在一些實施方案中，藥物`組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、GGdL、GdLG,GdLL, GLdL, GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或 dLGdL 組成的至少一種肽、或者
肽的藥學(xué)上可接受的鹽、以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，藥物組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、或GLL組成的至少一種肽、或者肽的藥學(xué)上可接受的鹽、以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，藥物組合物包含由氨基酸序列GGL組成的肽、或者肽的藥學(xué)上可接受的鹽、以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。就藥物組合物而言，肽的每個可能亞組合被本發(fā)明具體涵蓋。
[0066]取決于施用的特定方式和劑型，使用例如載體、溶劑、穩(wěn)定劑、佐劑、稀釋劑等的藥學(xué)上可接受的賦形劑來配制本發(fā)明的藥物組合物。取決于配制和施用途徑，通常配制組合物以得到生理上相容的pH、以及范圍為約3的pH至約11的pH、約pH 3至約pH 7。在可選擇的實施方案中，將pH調(diào)整至約pH 5.0至約pH 8的范圍。在各方面中，組合物包含如本文所述的治療有效量的至少一種肽、以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。組合物可包括用于治療或預(yù)防細(xì)菌生長的次要活性成分(例如但不限于，抗菌或抗微生物試劑)。
[0067]合適的賦形劑包括例如載體分子，其包括大的、緩慢代謝的大分子，例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、和無活性病毒粒子。其他示例性賦形劑包括抗氧化劑(例如但不限于，抗壞血酸)、螯合劑(例如但不限于EDTA)、碳水化合物(例如但不限于糊精、羥基烷基纖維素、和羥基烷基甲基纖維素)、硬脂酸、液體(例如但不限于油類、水、鹽水、甘油和乙醇)潤濕或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。
[0068]適合遞送本發(fā)明的肽的藥物組合物以及制備它們的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。這些組合物和制備它們的方法可在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,The Science and Practice of Pharmacy,第二十版，Lippincott Williams & White,Baltimore, Md.(2000)中找到?？蓪⒈景l(fā)明的肽配制為立即和/或緩慢釋放。
[0069]在又一方面中，本發(fā)明提供用于治療病狀的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL組成的至少一種肽、或者肽的藥學(xué)上可接受的鹽，其中病狀是前驅(qū)糖尿病、糖尿病、肥胖、高血壓、代謝綜合征、糖血控制差、或降低的胰島素分泌。本發(fā)明也提供用于治療病狀的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包含由氨基酸序列GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL、或dLGdL組成的至少一種肽、或者肽的藥學(xué)上可接受的鹽，其中該病狀是前驅(qū)糖尿病、糖尿病、肥胖、高血壓、代謝綜合征、糖血控制差、或降低的胰島素分泌。就方法而言，肽的每個可能亞組合被本發(fā)明具體涵蓋。
[0070]在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于治療前驅(qū)糖尿病或糖尿病患者的方法，其包括向患者施用包含肽GGL、GLG、LGL、LLG和GLL的至少一種的組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明也提供用于治療前驅(qū)糖尿病或糖尿病患者的方法，其包括向患者施用包含肽GL或LG的至少一種的組合物。在一些實施方案中,糖尿病是I型糖尿病。在一些實施方案中，糖尿病是2型糖尿病。待施用的組合物的量是治療有效的，從而達(dá)到以下至少之一:降低血糖水平；刺激胰島素分泌；刺激GLP-1分泌；降低胰島素抵抗；以及改善糖血控制。
[0071]術(shù)語“治療(treating) ” (或者此詞的其他形式，例如“療法(treatment) ”或“治療(treat)”)本文中用于表示施用本發(fā)明的組合物減輕患者的癥狀和/或減少、抑制、或消除與病狀相關(guān)的特定癥狀或事件。因此，術(shù)語“療法(treantment)”包括防止病狀在患者中發(fā)生，特別是當(dāng)患者容易患上病狀 時；減少或抑制病狀；和/或改善或逆轉(zhuǎn)病狀。在這種情況下，本發(fā)明的方法涉及預(yù)防病狀，理解，術(shù)語“預(yù)防”并不要求病狀被完全阻止。而且，如本文所使用，術(shù)語預(yù)防是指熟練技術(shù)人員識別易感病狀的人群，使得在病狀發(fā)作之前可進(jìn)行本發(fā)明的組合物的施用的能力。此術(shù)語并不意味著病狀必須完全消除。
[0072]如本文所使用的“有效量”是指本發(fā)明的肽足夠表現(xiàn)出可檢測治療效果的量。通過例如臨床癥狀的改善、或者預(yù)防、減輕或改善并發(fā)癥來測定效果。患者的精確有效量取決于患者的體重、尺寸、和健康；病狀的性質(zhì)和程度；以及施用選擇的治療劑或者治療劑的組合。通過在醫(yī)生的技術(shù)和判斷內(nèi)的常規(guī)實驗來測定給定情況的治療有效量。
[0073]在一些實施方案中，本發(fā)明提供治療肥胖、高血壓或代謝綜合征的方法。相應(yīng)地，本發(fā)明的一個實施方案是治療肥胖的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包括由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG、GLL、LG、或GL組成的至少一種肽、或其藥學(xué)上可接受的鹽。另一實施方案是治療高血壓的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包括由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG、GLL、LG、或GL組成的至少一種肽、或其藥學(xué)上可接受的鹽。另一實施方案是治療代謝綜合征的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG、GLL、LG、或GL組成的至少一種肽、或其藥學(xué)上可接受的鹽。在任一上述實施方案中，在肽中一個或多個亮氨酸被亮氨酸的D-異構(gòu)體獨(dú)立地取代。就方法而言，肽的每個可能亞組合被本發(fā)明具體涵蓋。
[0074]在又一方面中，本發(fā)明提供在前驅(qū)糖尿病或糖尿病患者中治療、減少和/或改善與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的方法，其包括向患者施用組合物，其包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL組成的至少一種肽。本發(fā)明也提供在前驅(qū)糖尿病或糖尿病患者中預(yù)防、減少和/或改善與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的方法，其包括向患者施用組合物，其包含由氨基酸序列GL或LG組成的至少一種肽。它也提供在糖尿病患者中預(yù)防、減少、或改善與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL組成的至少一種肽、或者所述肽的藥學(xué)上可接受的鹽。它也提供在糖尿病患者中預(yù)防、減少、或改善與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，該組合物包含由氨基酸序列GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, GdLdL, dLLG、LdLG,dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL或dLGdL組成的至少一種肽、或者所述肽的藥學(xué)上可接受的鹽。就方法而言，肽的每個可能亞組合被本發(fā)明具體涵蓋。在一些實施方案中，糖尿病是I型糖尿病。在一些實施方案中，糖尿病是2型糖尿病。施用預(yù)防、減少或改善至少一種與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的治療有效量的組合物，這些并發(fā)癥包括但不限于以下:心血管疾病[例如，冠狀動脈病(有時稱為缺血性心臟病)、腦血管疾病(例如中風(fēng)或者短暫性缺血發(fā)作)、心力衰竭、粥樣硬化、或者動脈末梢疾病];慢性腎臟?。荒I衰竭；膀胱問題；勃起機(jī)能障礙；胃輕癱；眼部疾病(例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、白內(nèi)障或青光眼)；糖尿病性神經(jīng)病(外周、自主、近側(cè)或病灶)；足或皮膚潰瘍；或下肢截肢。
[0075]可通過任何合適的途徑來施用本發(fā)明的化合物。例如，能夠通過口服、眼睛、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)(“ip”)、鼻內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑來施用本發(fā)明的組合物。
[0076]適合于口服施用的配制物包括例如固體、半固體和液體體系，例如，片劑；含有多種或納米粒子、液體或粉末的軟和硬膠囊；錠劑(包括填充液體型)；咀嚼劑；凝膠；快速消化劑型；膜；胚珠；噴霧劑。在一些實施方案中，施用本領(lǐng)域已知的遞送媒介物來配制口服施用的本發(fā)明的肽，其包括但 不限于微球體、脂質(zhì)體、腸包衣干燥乳劑或者納米粒子。
[0077]口服施用的液體劑型包括但不限于藥學(xué)上可接受的乳劑、微乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。除了活性肽之外，液體劑型可含有本領(lǐng)域通常使用的惰性稀釋劑，例如，水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯酸芐酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、二甲基甲酰胺、油類(特別地，棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄欖、蓖麻、和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯、及其混合物。除了惰性稀釋劑之外，口服組合物還可包括佐劑，例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑、和芳香劑。
[0078]口服施用的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、粉劑、和顆粒劑。在這些固體劑型中，使活性肽與至少一種惰性、藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體，例如檸檬酸鈉或者磷酸二鈣和/或以下混合:a)填料或填充劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、和硅酸；b)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、和阿拉伯膠；c)濕潤劑，例如甘油；d)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、土豆或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽、和碳酸鈉；e)溶液阻滯劑，例如石蠟；f)吸收促進(jìn)劑，例如季銨化合物；g)潤濕劑，例如，鯨蠟醇和甘油單硬脂酸酯；h)吸收劑，例如高嶺土和膨潤土；以及i)潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、硫酸十二烷基酯鈉、及其混合物。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，劑型也可包括緩沖劑?；钚曰衔锱c如上所示一種或多種賦形劑也可在微膠囊劑型中。使用諸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的這些賦形劑也可將類似類型的固體組合物采用為在軟和硬填充明膠膠囊中的填料。使用藥物配制領(lǐng)域眾所周知的諸如腸溶衣和其他涂料的涂料和殼料可制備片劑、包衣片劑(dragees)、膠囊劑、丸劑、和顆粒劑的固體劑型。使用合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑，根據(jù)已知技術(shù)可配制可注射制劑，例如，無菌可注射水性或油質(zhì)混懸劑。無菌可注射制劑也可為在無毒非腸道可接受的稀釋劑或溶劑中無菌可注射溶液劑、混懸劑或乳劑，例如在1，3_ 丁二醇中的溶液。可利用的可接受的媒介物和溶劑是水、林格氏溶液、U.S.P.和等張氯化鈉溶液。此外，無菌、固定油是通?？刹捎玫娜軇┗驊腋〗橘|(zhì)。用于該目的，可采用任何溫和固定油，包括合成甘油單酯或甘油二酯。此外，諸如油酸的脂肪酸用于制備注射劑。例如，通過過濾透過細(xì)菌阻隔過濾器、或者通過在使用之前能夠溶解或分散在無菌水或其他無菌可注射介質(zhì)中的無菌固體組合物中并入殺菌劑能夠消毒可注射配制物。
[0079]具體涵蓋使用本發(fā)明的組合物聯(lián)合本領(lǐng)域已知的其他糖尿病藥物來治療前驅(qū)糖尿病或者糖尿病患者。在一些實施方案中，使用本發(fā)明的組合物治療使得可降低一種或多種其他糖尿病藥物的劑量，因而減少與一種或多種其他藥物相關(guān)的副作用。在一些實施方案中，其他糖尿病藥物是胰島素。在一些實施方案中，其他糖尿病藥物是雙胍(例如二甲雙胍)。在一些實施方案中，其他糖尿病藥物是噻唑烷二酮(例如吡格列酮)。在一些實施方案中，其他糖尿病藥物是DPP-4抑制劑(例如西他列汀)。換而言之，能夠聯(lián)合諸如用于待治療病狀的監(jiān)護(hù)標(biāo)準(zhǔn)所使用的那些其他藥物來使用本發(fā)明的組合物。在一些實施方案中，藥物是他汀(statin)(包括但不限于阿伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀羅蘇伐他汀、氟伐他汀、和匹伐他汀)。在一些實施方案中，藥物是降低血壓藥物[包括但不限于，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑 ，例如卡托普利、賴諾普利、和雷米普利；血管緊張肽II受體阻斷劑，例如氯沙坦、奧美沙坦和纈沙坦；β阻斷劑，例如美托洛爾、納多洛爾和噴布洛爾；以及鈣通道阻斷劑，例如氨氯地平、地爾硫卓和硝苯地平]。
[0080]在又另一方面中，本發(fā)明提供用于向需要其的患者施用本發(fā)明的組合物的試劑盒，其中試劑盒包括本發(fā)明的組合物、使用組合物的說明書以及用于向患者施用組合物的裝置。在一些實施方案中，使用試劑盒施用藥物組合物，該藥物組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、LLG、LGL、LGG、GGdL、GdLG、GdLL、GLdL、GdLdL、dLLG、LdLG、dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL或dLGdL組成的至少一種肽、或肽的藥學(xué)上可接受的鹽、以及藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中試劑盒包括組合物、施用組合物的說明書以及用于向患者施用組合物的裝置。在一些實施方案中，試劑盒包括藥物組合物，該藥物組合物包含由所述氨基酸序列GGL、GLG、或GLL組成的至少一種肽。就試劑盒而言，肽的每個可能亞組合被本發(fā)明具體涵蓋。
實施例
[0081]通過參照詳細(xì)描述本發(fā)明的示例性實施方案的以下實施例來更加完整理解本發(fā)明。
[0082]實施例1
[0083]測定氨基酸甘氨酸和亮氨酸對血糖的作用。
[0084]在口服負(fù)荷甘氨酸和葡萄糖之后甘氨酸對血二糖的作用[0085]在由Jackson Lab (Bar Harbor, Maine)中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。通過灌胃給予禁食小鼠葡萄糖(2mg/g體重，在圖1中菱形線，η = 10)或者甘氨酸(0.35mg/g bw,在圖1中方形線，η = 10)和葡萄糖。測定給予葡萄糖之后0、30、60、90、和120min時血糖。
[0086]與對照組相比，在甘氨酸組中任何時間點(diǎn)下血糖水平均未顯著改變。
_7] 在口服負(fù)荷亮氨酸和葡萄糖之后亮氨酸對血糖的作用
[0088]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。通過灌胃給予禁食小鼠葡萄糖(2mg/g體重，在圖2中菱形線，η = 10)或者亮氨酸(0.35mg/g bw，在圖2中方形線，η = 10)和葡萄糖。測定給予葡萄糖之后0、30、60、90、和120min時血糖。
[0089]實施例2
[0090]當(dāng)在糖尿病小鼠中口服攝入葡萄糖或淀粉時，Diapin(本發(fā)明的肽GGL)強(qiáng)有力地降低血糖水平。而且，在KKay糖尿病小鼠中在未禁食條件下Diapin也降低血糖水平[Yamauchi 等人，Nat.Med.，7 (8):971-946 (2001)]。參見圖 3。
[0091]在糖尿病小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖之后Diapin抑制血糖的增加
[0092]在Diapin組中在30、60、90和120min處血糖水平顯著低于對照組中那些。
[0093]在糖尿病小鼠中在口服負(fù)荷淀粉之后Diapin抑制血糖的增加
[0094]在由Jackson Lab中購買的成年雄性KKay糖尿病小鼠中進(jìn)行試驗。在對照組中(在圖4中菱形線，η = 10), 口服施用2mg/g bw的劑量的淀粉。在Diapin組(在圖4中方形線，η = 9),分別口服施用在2mg/g bw和lmg/g bw的劑量下的淀粉和Diapin。在灌胃淀粉和Diapin之后測定在0、30、60、90和120min處血糖。
[0095]在Diapin組中在30、60、90和120min處血糖顯著低于對照組中那些。
[0096]Diapin降低在糖尿病小鼠中隨機(jī)血糖
[0097]在由Jackson Lab中購買的成年雄性KKay糖尿病小鼠中進(jìn)行試驗。在未禁食條件下，在對照組(在圖5中菱形線，η = 9)中，口服給予蒸餾水以及在Diapin組(在圖5中方形線，η = 9)中，口服給予在lmg/g bw下Diapin。在灌胃Diapin之后測定在0、30、60、90、120、150 和 180min 處血糖。
[0098]在Diapin組中在60、90、120、150和180min處血糖水平顯著低于對照組中那些。
[0099]實施例3
[0100]Diapin本身刺激在KKay糖尿病小鼠中胰島素分泌。而且，Diapin也增加在糖尿病小鼠中GLP-1分泌。
[0101]Diapin刺激在糖尿病小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖和Diapin之后胰島素分泌
[0102]在成年雄性KKay糖尿病小鼠中進(jìn)行試驗。在禁食條件下，在對照組(在圖6中白色柱子，η =11)中，口服施用1.5mg/g bw劑量的葡萄糖。在Diapin組(在圖6中黑色柱子，η = 11)中，分別口服施用lmg/g bw和1.5mg/g bw的Diapin和葡萄糖。收集口服施用葡萄糖和Diapin之后30min的血樣樣品。使用FreeStyle葡萄糖計來監(jiān)控血糖以及通過 ELISA(Alpco，Cat#80-1NSMS-E01)來測定胰島素。
[0103]Diapin刺激在KKay糖尿病小鼠中胰島素分泌。
[0104]Diapin刺激在糖尿病小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖和DiaDin之后GLP-1分泌
[0105]在成年雄性KKay糖尿病小鼠中進(jìn)行試驗。在禁食條件下，在對照組(在圖7中白色柱子，η = 11)中，口服施用1.5mg/g bw的劑量下葡萄糖以及在Diapin組(在圖7中黑色柱子，η = 11)中，分別口服施用lmg/g bw和1.5mg/g bw的Diapin和葡萄糖。收集口服施用葡萄糖和Diapin之后30min的血樣樣品。通過ELISA(Alpco, Cat#43-GP1HU_E01)來測定GLP-1。
[0106]Diapin也增加在糖尿病小鼠中GLP-1分泌。
[0107]實施例4
[0108]由飲食攝入的Diapin以時間和劑量依賴性方式降低在KKay糖尿病小鼠中隨機(jī)血糖水平。
[0109]在成年雄性KKay糖尿病小鼠中進(jìn)行試驗。將小鼠分為三組，各組10只動物，并在試驗期間禁食、和無限制規(guī)律喂食(對照)、喂食、與6g Diapin/kg混合喂食、或者與12gDiapin/kg混合喂食。在開始(O周)、以及4周內(nèi)此后每周清晨測定血糖水平。結(jié)果顯示在圖8中。
[0110]在使用與Diapin混合喂食的兩組中血糖水平均顯著低于對照組中那些。
[0111]實施例5
[0112]當(dāng)血糖水平在正常水平時，Diapin沒有降低在非糖尿病C57BL/6J小鼠中血糖水平。
[0113]在C57BL/6J小鼠中Diapin對空腹血糖水平?jīng)]有作用
[0114]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。給予小鼠水(在圖9中菱形線，η = 6)或者Diapin(2mg/g bw,在圖9中方形線，η = 6)。測定在口服施用Diapin 之后在 0、30、60、90、120、150 和 180min 處血糖。
[0115]在各組之間血糖水平?jīng)]有顯著差異。
[0116]實施例6
[0117]Diapin、LGL、LGG降低在非糖尿病C57BL/6J小鼠中在腹膜內(nèi)負(fù)荷葡萄糖之后血糖水平。相比之下，肽GGH不能降低。
[0118]Diapin抑制在ip注射葡萄糖之后血糖的增加
[0119]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗?？诜o予禁食小鼠水(在圖10中菱形線,η = 10)或者Diapin(lmg/gbw,在圖10中方形線,η = 10)。在口服施用Diapin之后10分鐘ip注射來給予葡萄糖。測定給予葡萄糖之后0、30、60、90、和120min時血糖。
[0120]在Diapin組中在30、60、90和120min處血糖水平顯著低于對照組中那些。
[0121]肽GGH對在ip注射葡萄糖之后血糖沒有顯著作用
[0122]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。給予禁食小鼠水(在圖11中菱形線，η = 10)或者GGH(lmg/g bw,在圖11中方形線,η = 10)。在口服施用GGH之后10分鐘通過ip注射來給予葡萄糖。測定給予葡萄糖之后0、30、60、90、和120min時血糖。
[0123]相比對照小鼠，在GGH組中在任意時間點(diǎn)下血糖水平均未顯著改變。
[0124]在ip注射葡萄糖之后肽LGG和LGL抑制血糖增加
[0125]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。給予禁食小鼠水(在圖12中菱形線,η = 10)或者LGL(lmg/g bw,在圖12中方形線,η = 10)、或者LGG(lmg/g bw，在圖12中三角線，η = 10)。在口服施用LGG或LGL之后10分鐘通過ip注射來給予葡萄糖。測定給予葡萄糖之后0、30、60、90、和120min時血糖。
[0126]在LGL組中在30、60、90和120min處血糖水平顯著低于對照組中那些。肽LGG降低在30和60min處血糖水平。
[0127]實施例7
[0128]在負(fù)荷甸甸糖的非糖尿病C57BL/6J小鼠中妝LGL、GLG、LLG、和GLL顯者降低血糖水平。
[0129]在口服負(fù)荷葡萄糖之后LLG對血 糖的作用
[0130]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。在對照組(在圖13中菱形線,η =10)中，口服施用2mg/g bw的劑量的葡萄糖。在Diapin和LLG組(方形線或三角線，η = 9)中，分別口服施用在2mg/g bw和lmg/g bw的劑量下葡萄糖和Diapin或者葡萄糖和LLG。在灌胃葡萄糖和Diapin之后測定在0、30、60、90和120min處血糖。
[0131]LLG顯示與Diapin類似的作用。
[0132]在口服負(fù)荷葡萄糖之后肽GLG和GLL對血糖的作用
[0133]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。在對照組(在圖14中菱形線，η = 10)中，口服施用2mg/gbw的劑量的葡萄糖。在GLG和GLL組(在圖14中三角線或圓點(diǎn)線，η = 9)中，分別口服施用在2mg/g bw和lmg/g bw的劑量下的葡萄糖和GLG或GLL。測定在灌胃葡萄糖和GLG或GLL之后在0、30、60、90和120min處血糖。
[0134]肽GLG和GLL分別顯示D`iapin的類似作用。
[0135]實施例8
[0136]酰胺化和乙?；瘺]有使Diapin降低葡萄糖作用下降。通過在Bergstrom等人，J.Biol.Chem.，280:23114-23121 (2005)中描述的方法酰胺化Diapin和/或通過在John等人，Eur.J.Med.Res.，13:73-78 (2008)中描述的方法來乙酰化。
[0137]酰胺化對Diapin的作用
[0138]在由Jackson Lab購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。在對照組(在圖15中菱形線，η = 10)中，口服施用2mg/g bw的劑量的葡萄糖。在Diapin組(在圖15中三角線，η = 9)中，分別口服施用在2mg/g bw和lmg/g bw的劑量下葡萄糖和Diapin。在酰胺化Diapin組(在圖15中方形線，η = 9)中，分別口服施用在2mg/g bw和lmg/g bw的劑量下葡萄糖和酰胺化Diapin。在灌胃葡萄糖、Diapin和酰胺化Diapin之后測定在O、
0.5、1、1.5和2小時下血糖。
[0139]在Diapin組和酰胺化Diapin組中在0、0.5、1、1.5和2小時下血糖水平顯著低于
對照中那些。
[0140]Diapin乙釀化的作用
[0141]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。在Diapin組(在圖16中菱形線,η = 10)中，分別口服施用在2g/kg bw和lg/kg bw的劑量下葡萄糖和Diapin。在乙?；疍iapin組(在圖16中方形線,η = 10)中，分別口服施用在2g/kg bw和lg/kg bw的劑量下葡萄糖和乙?；疍iapin。在灌胃葡萄糖、Diapin、和乙?；疍iapin之后測定在0、0.5、1、1.5和2小時處血糖。
[0142]在Diapin組中在0、0.5、1、1.5和2小時處血糖水平顯著不同于在乙酰化Diapin組中那些。
[0143]雙重修飾對Diapin的作用
[0144]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。在Diapin組(在圖17中三角線，η = 9)中，分別口服施用在2g/kg bw和lg/kg bw的劑量下葡萄糖和Diapin。在酰胺化/乙?；疍iapin組(方形線，η = 9)中，分別口服施用在2g/kg bw和lg/kg bw的劑量下葡萄糖和酰胺化/乙?；疍iapin。在灌胃葡萄糖、Diapin和酰胺化/乙?；疍iapin之后測定在0、0.5、1、1.5和2小時處血糖。
[0145]在Diapin組中在0、0.5、1、1.5和2小時處血糖水平顯著不同于在酰胺化/乙酰化Diapin組中那些。
[0146]實施例9
[0147]當(dāng)在葡萄糖施用之前口服施用時，Diapin降低血糖水平。
[0148]在口服施用葡萄糖之前30min給予Diapin的作用
[0149]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。給予禁食小鼠水(在圖18中菱形線，η = 10)或者Diapin(lmg/g bw,在圖18中方形線，η = 10),然后在30min之后口服灌胃葡萄糖2g/kgbw。在給予葡萄糖之后測定在0、30、60和120min處血糖。
[0150]在Diapin組中在30、60和120min處血糖水平顯著低于對照組中那些。
[0151]在口服施用葡萄糖之前I小時下給予的Diapin的作用
[0152]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。給予禁食小鼠水(在圖19中菱形線,η = 10)或者Diapin(lmg/g bw,在圖19中方形線,η = 10),然后在I小時之后灌胃葡萄糖2g/kg bw。在給予葡萄糖之后測定在0、30、60和120min處血糖。
[0153]在Diapin組中在30、60min處血糖水平顯著低于對照組中那些。
[0154]實施例10
[0155]在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后二肽GG沒有顯著降低血糖水平。
[0156]Diapin和二肽GG和GL對口服施用葡萄糖之后血 糖水平的作用
[0157]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。給予禁食小鼠葡萄糖200mg/kg bw(在圖20中菱形線,η = 10)或者葡萄糖200mg/kg bw加上Diapin (在圖20 中方形線，lmg/g bw,n = 10)、GG(在圖 20 中圓點(diǎn)線,0.67mg/g bw,n = 10)或者 GL (在圖20中三角線,0.67mg/g bw, η = 10)。在給予葡萄糖之后測定在30、60、90和120min處血糖。Diapin用作試驗的陽性對照。
[0158]Diapin顯著降低在30、60、90和120min處血糖水平。肽GL降低在30min處血糖水平，而與Diapin相比,肽GG不會顯著降低血糖水平。
[0159]Diapin和二肽LG對口服施用葡萄糖之后血.糖水平的作用
[0160]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。給予禁食小鼠葡萄糖200mg/kg bw(在圖21中三角線，η = 10)、葡萄糖200mg/kg bw加上Diapin (在圖21中方形線，lmg/g bw,n = 10)、或者LG(在圖21中三角線,0.67mg/g bw,n = 10)。在給予葡萄糖之后測定在30、60、90和120min處血糖。Diapin用作試驗的陽性對照。
[0161]在降低血糖水平上二肽LG顯示比Diapin更短暫的作用。在所有測定時間點(diǎn)下Diapin降低血糖水平,而二肽LG僅在30和60min處降低血糖水平。[0162]實施例η
[0163]Diapin 降低在 ob/ob 小鼠[Liu 等人，Diabetes，52 (6):1409-16(2003)]中口服施
用葡萄糖之后的血糖水平。
[0164]在由Jackson Lab中購買的成年雄性B6.V-Lepob/J小鼠中進(jìn)行試驗。通過灌胃給予禁食小鼠葡萄糖2mg/g(n = 10)或者葡萄糖2mg/g bw加上Diapin (lmg/g bw,n = 10)。在給予葡萄糖和Diapin之后測定在30、60、90和120min處血糖水平。
[0165]如在圖22中所示，Diapin抑制在ob/ob小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖之后血糖的增加。
[0166]實施例12
[0167]Diapin 也降低在 db/db 小鼠中[Chen 等人，Cell, (3):491-495 (1996) and Hummel等人，Science，153 (740):1127-1128(1966)] 口服施用葡萄糖之后血糖水平。
[0168]在由Jackson Lab中購買的成年雄性BKS.Cg_m+/+Leprdb/J小鼠中進(jìn)行試驗。通過灌胃給予禁食小鼠葡萄糖2mg/g bw(n = 10)或葡萄糖2mg/g bw加上Diapin (lmg/g bw,η = 10) ο測定在給予 葡萄糖和Diapin之后30、60、90和120min處血糖水平。
[0169]如在圖23中所示，Diapin抑制在db/db小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖之后血糖的增加。
[0170]實施例13
[0171]Diapin降低在高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中[Tomas等人，Diabetes Obes.Metab.，13(1):26-33(2011)和 Dezaki 等人，Diabetes，55 (12):3486-93(2006)] 口服施用葡萄糖之后的血糖水平。
[0172]喂食由Jackson Lab中購買的野生型雄性C57BL/6J小鼠高脂肪飲食[具有來自脂肪的60%卡路里的嚙齒類食物(Research Diets Inc.Cat#:D12492)]八周以誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠模型的肥胖。然后，通過灌胃給予禁食小鼠葡萄糖2mg/g bw(n= 10)或者葡萄糖2mg/g bw加上Diapin (lmg/g bw,n = 10)。在給予葡萄糖和Diapin之后測定在30、60、90和120min處血糖水平。
[0173]如在圖24中所顯示，Diapin抑制在高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖之后血糖的增加。
[0174]實施例14
[0175]在C57BL/6J小鼠中甘氨酸-甘氨酸-D-亮氨酸(D-Diapin)對口服施用葡萄糖之后降低血糖水平具有延長作用。
[0176]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。通過灌胃給予禁食小鼠葡萄糖 2mg/g bw (η = 10)或葡萄糖 2mg/g bw 加上 D-Diapin (lmg/g bw,n = 10)或Diapin (lmg/g bw,n = 10)。在給予葡萄糖之后測定在30、60、90、120、和180min處血糖水平。
[0177]如在圖25中所顯示，在C57BL/6J小鼠中口服負(fù)荷葡萄糖之后降低血糖水平D-Diapin比Diapin更加有效。
[0178]實施例15
[0179]Diapin降低在C57BL6J小鼠中口服施用葡萄糖和ip Diapin施用之后血糖水平。
[0180]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。通過灌胃給予禁食小鼠葡萄糖 2mg/g bw(n = 14)或者葡萄糖 2mg/g bw 加上 Diapin (lmg/g bw, ip, η = 14)或者Diapin (lmg/g bw,n = 14)。在給予葡萄糖和Diapin之后測定在30、60、90和120min處血糖。結(jié)果顯示在圖26中。
[0181]實施例16
[0182]修飾的二肽對在C57BL/6J小鼠中口服施用葡萄糖之后血糖水平具有不同的作用。測定的修飾的二肽是酰胺化GL 二肽和二肽LG的D-異構(gòu)體。
[0183]在由Jackson Lab中購買的成年雄性C57BL/6J小鼠中進(jìn)行試驗。通過灌胃給予禁食小鼠葡萄糖2mg/g bw(n = 12)或者葡萄糖2mg/g bw加上Diapin (lmg/g bw, ip, η =12)、或者二肽(0.67mg/g bw，n = 12)。在給予葡萄糖和肽之后測定在30、60、90和120min處血糖。結(jié)果顯示在圖27中。
[0184]盡管依據(jù)具體實施方案已經(jīng)描述本發(fā)明，但理解，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員更改和修改。因此，應(yīng)當(dāng)僅將權(quán)利要求中出現(xiàn)的那些限制放置在本發(fā)明中。
[0185]在本申請中所引用 的所有文件均通過引用方式以描述它們的公開全部并入本文中。
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療病狀的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，所述組合物包含由氣基Ife序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL組成的至少一種妝、或者所述妝的藥學(xué)上可接受的鹽， 其中所述病狀是前驅(qū)糖尿病、糖尿病、肥胖、高血壓、代謝綜合征、糖血控制差、或降低的胰島素分泌。
2.一種用于治療病狀的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，所述組合物包含由氨基酸序列 GGdL、GdLG、GdLL、GLdL、GdLdL、dLLG、LdLG、dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL、或 dLGdL組成的至少一種肽、或者所述肽的藥學(xué)上可接受的鹽， 其中所述病狀是前驅(qū)糖尿病、糖尿病、肥胖、高血壓、代謝綜合征、糖血控制差、或降低的胰島素分泌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述病狀是前驅(qū)糖尿病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述病狀是糖尿病。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述病狀是肥胖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述病狀是高血壓。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述病狀是代謝綜合征。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列GGL組成的肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列GLG組成的肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列LGL組成的肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列LLG組成的肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列LGG組成的肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列GLL組成的肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列GGdL組成的肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列GdLG組成的肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列GdLL組成的肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列GLdL組成的肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列GdLdL組成的肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列dLLG組成的肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列LdLG組成的肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列dLdLG組成的肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列dLGG組成的肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列dLGL組成的肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列LGdL組成的肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物至少包含由所述氨基酸序列dLGdL組成的肽。
26.一種在糖尿病患者中預(yù)防、減少、或改善與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，所述組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、LGL、LLG、LGG或GLL組成的至少一種肽、或者所述肽的藥學(xué)上可接受的鹽。
27.一種在糖尿病患者中預(yù)防、減少、或改善與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥的方法，其包括向患者施用有效量的組合物，所述組合物包含由氨基酸序列GGdL、GdLG, GdLL, GLdL, GdLdL,dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL或dLGdL組成的至少一種肽、或者所述肽的藥學(xué)上可接受的鹽。
28.根據(jù)權(quán)利要 求26或權(quán)利要求27所述的方法，其中所述與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥是心血管疾病、慢性腎臟病、腎衰竭、膀胱問題、勃起機(jī)能障礙、胃輕癱、眼部疾病、糖尿病性神經(jīng)病、足或皮膚潰瘍、或者下肢截肢。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項所述的方法，其中將所述肽在N-末端處乙酰化。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項所述的方法，其中將所述肽在C-末端處酰胺化。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項所述的方法，其中將所述肽在N-末端處乙酰化和在C-末端處酰胺化。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項所述的方法，其中通過口服、腹膜內(nèi)、眼睛、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑來施用所述組合物。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項所述的方法，其中通過口服途徑來施用所述組合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項所述的方法，其中通過腹膜內(nèi)途徑來施用所述組合物。
35.一種藥物組合物，其包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、GGdL、GdLG, GdLL, GLdL,GdLdL, dLLG、LdLG, dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL或dLGdL組成的至少一種肽、或者所述肽的藥學(xué)上可接受的鹽、以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含由所述氨基酸序列GGL、GLG、或GLL組成的至少一種肽。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含由所述氨基酸序列GGL組成的肽。
38.一種藥物組合物，其基本上由至少一種肽、和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑組成，所述至少一種肽由氨基酸序列 GGL、GLG、GLL、LLG、LGL、LGG、GGdL, GdLG, GdLL, GLdL,GdLdL、dLLG、LdLG、dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或 dLGdL 組成。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的藥物組合物，其中所述肽是由所述氨基酸序列GGL、GLG、GLL、LLG、LGL、或 LGG 組成的肽。
40.根據(jù)權(quán)利要求35-39中任一項所述的藥物組合物，其中將所述肽在N-末端處乙?；?。
41.根據(jù)權(quán)利要求35-39中任一項所述的藥物組合物，其中將所述肽在C-末端處酰胺化。
42.根據(jù)權(quán)利要求35-39中任一項所述的藥物組合物，其中將所述肽在N-末端處乙?；蛘咴贑-末端處酰胺化。
43.一種用于施用藥物組合物的試劑盒，所述藥物組合物包含由氨基酸序列GGL、GLG、GLL、GGdL、GdLG、GdLL、LLG、LGL、LGG、GLdL、GdLdL、dLLG、LdLG、dLdLG、dLGG、dLGL、LGdL 或dLGdL組成的至少一種肽、或者所述肽的藥學(xué)上可接受的鹽、以及藥學(xué)上可接受的賦形劑， 其中所述試劑盒包括所述組合物、施用所述組合物的說明書以及用于向患者施用所述組合物的裝置。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述藥物組合物包含由所述氨基酸序列GGL、GLG、或GLL組成的至少一種肽。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中將所述肽在N-末端處乙?；?br> 46.根據(jù)權(quán)利要求43 或權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中將所述肽在C-末端處酰胺化。
47.根據(jù)權(quán)利要求43或權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中將所述肽在N-末端處乙?；驮贑-末端處酰胺化。
【文檔編號】A61P3/10GK103458911SQ201280008561
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月11日
【發(fā)明者】Y·E·陳, C·薛, J·張 申請人:密歇根大學(xué)董事會