專利名稱：用于抑制pf4和rantes相互作用的拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物，其在制備藥物中的用途。該多肽可制備用于與單核細胞募集有關(guān)的疾病的藥物。
背景技術(shù)：
動脈血管的動脈硬化構(gòu)成了心血管疾病的形態(tài)學(xué)背景。在這種情況下原始的單核細胞募集對于動脈硬化早期病變的產(chǎn)生有著決定性的意義。單核細胞在內(nèi)皮上的固定，即所謂的單核細胞阻滯，在心血管疾病病理學(xué)的初期表現(xiàn)出如動脈硬化、血管狹窄以及血栓等癥狀。已知的是，趨化因子如RANTES(調(diào)節(jié)激活正常T細胞表達和分泌)作為信號分子與該過程相關(guān)。在現(xiàn)有技術(shù)中已知的一級以及二級預(yù)防通過使用藥物如阿司匹林和氯吡格雷可以首先起到降低血脂以及抑制血小板的聚集和活化的作用。使用這類藥物的治療方法的缺點是，一方面只顯示出很小的特異性，另一方面這類藥物有嚴(yán)重的副作用，如肌病和高的出血危險。此外在現(xiàn)有技術(shù)中已知的是將RANTES-多肽用作拮抗劑。例如專利DE 10014516Al公開了使用metRANTES作為拮抗劑抑制RANTES受體CCR1。使用這類拮抗劑的缺點是，趨化因子作為信號分子大量參與了生理學(xué)過程，以至于使用這樣的拮抗劑會對生理過程造成不可預(yù)見的影響以及會表現(xiàn)出大量的副作用和嚴(yán)重后果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療藥物，它至少能克服現(xiàn)有技術(shù)中眾多缺點中的一種。本發(fā)明的目的特別在于提供一種具有較好特異性的治療藥物。本發(fā)明的目的可通過一種多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物來實現(xiàn)，其中該多肽具有如下結(jié)構(gòu)式⑴所示的SEQ ID NO :I的氨基酸序列C-X1-X2-Yfyts-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-Xi3-Xi4-Xi5-C(I) (SEQ ID NO :I)其中X1選自包含賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、組氨酸和/或天冬酰胺的組，或氨基酸缺失;X2選自包含谷氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酰胺的組，或氨基酸缺失；X3選自包含甘氨酸、絲氨酸和/或丙氨酸的組；X4選自包含賴氨酸、亮氨酸和/或精氨酸的組；X5選自包含絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和/或蘇氨酸的組；
X6選自包含絲氨酸、甘氨酸和/或蘇氨酸的組；X7選自包含天冬酰胺和/或谷氨酰胺的組；X8選自包含脯氨酸、酪氨酸和/或甘氨酸的組；X9選自包含甘氨酸、丙氨酸和/或絲氨酸的組；X10選自包含異亮氨酸、纈氨酸和/或天冬酰胺的 組；X11選自包含纈氨酸、異亮氨酸和/或天冬酰胺的組；X12選自包含苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和/或甲硫氨酸的組；X13選自包含異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和/或苯丙氨酸的組；X14選自包含蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和/或酪氨酸的組；X15選自包含精氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和/或天冬酰胺的組，或氨基酸缺失。有利的是，本發(fā)明多肽作為拮抗劑適合于抑制血小板因子4和RANTES的相互作用。“用于抑制血小板因子4和RANTES相互作用的拮抗劑”的概念可以通過本發(fā)明多肽、蛋白質(zhì)或其他的化合物來理解，其作為拮抗劑可以對血小板因子4和趨化因子RANTES的相互作用起到抑制作用。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明多肽對與血小板因子4(PF4)和趨化因子RANTES的相互作用相關(guān)的單核細胞募集有特殊的效果。在這里最特別的優(yōu)點是，本發(fā)明多肽對趨化因子的眾多功能不產(chǎn)生或者只產(chǎn)生很小的影響。本發(fā)明多肽的優(yōu)點尤其在于，它可以有選擇性地阻斷單核細胞的募集，例如在內(nèi)皮上。在本發(fā)明中“單核細胞募集”的概念的意思是單核細胞在內(nèi)皮上的移入和移出、單核細胞的固定以及擴散例如在內(nèi)皮的分裂。同樣，單核細胞的固定同樣以單核細胞的粘附或者以單核細胞阻滯表現(xiàn)出來，在生理學(xué)的情況下單核細胞的固定會造成剪切流動，例如在毛細血管、微血管或動脈血管中。本發(fā)明多肽很大的優(yōu)點是，具有高特異性，并且對眾多的、與趨化因子RANTES和PF4相關(guān)的新陳代謝過程，例如免疫或凝血系統(tǒng)沒有或者僅僅只有很小的副作用。特別是通過使用本發(fā)明多肽的藥物療法可以避免在常規(guī)的心血管疾病的藥物治療中出現(xiàn)的出血危險。本發(fā)明中“C”代表通常使用的半胱氨酸的氨基酸字母代碼，相應(yīng)的“Y”代表酪氨酸，“F”代表苯丙氨酸，“T”代表蘇氨酸，“S”代表絲氨酸。本發(fā)明多肽在氨基端和羧基端都有一個半胱氨酸殘基，其可以形成多肽的環(huán)化。本發(fā)明的優(yōu)點特別在于，環(huán)化的多肽具有更好的穩(wěn)定性。本發(fā)明多肽起效時間較長，因此所使用的量也較少。本發(fā)明中“多肽”的含義是使用合成的或非合成的肽類化合物，如純的或修飾的天然蛋白質(zhì)片段、天然形式的或重組的肽或蛋白質(zhì)。同時本發(fā)明中“多肽”的含義包括相應(yīng)多肽的藥理學(xué)可接受的鹽、藥理學(xué)可接受的衍生物和/或偶聯(lián)物。優(yōu)選的藥理學(xué)可接受的衍生物例如酯類、酰胺、N-?；?和/或O-酰基衍生物、羧基化的多肽、乙?；亩嚯?、磷酸化的多肽和/或糖基化的多肽。優(yōu)選的偶聯(lián)物例如糖-或聚乙二醇-偶聯(lián)物、生物素化的、放射性的或有熒光標(biāo)記的多肽。
本發(fā)明多肽的長度最多不超過25個氨基酸是有利的。優(yōu)選的本發(fā)明多肽的氨基酸的數(shù)目為15-25個氨基酸，特別優(yōu)選為15-22個。在實驗中可以確定的是，多肽的長度會對其效果產(chǎn)生影響。尤其令人驚奇的是，具有這樣長度的氨基酸序列對單核細胞阻滯有抑制作用。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽的氨基酸數(shù)目為18-23個，進一步優(yōu)選為18-22個，在非常優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽的氨基酸數(shù)目為19-22個，在進一步優(yōu)選的實施方案中，氨基酸的數(shù)目為20-21個。本發(fā)明多肽尤其優(yōu)選為22個氨基酸。本發(fā)明多肽中“氨基酸數(shù)目”的含義當(dāng)然意味著多肽的氨基酸序列長度。在本發(fā)明多肽優(yōu)選的實施方案中X1S賴氨酸，或者在氨基酸序列的X1位置上為氨基酸缺失，特別優(yōu)選的是X1為賴氨酸。此外在本發(fā)明多肽優(yōu)選的實施方案中谷氨酸適合于X2，或者在該位置上為氨基酸缺失。特別優(yōu)選的是X2為谷氨酸。令人驚奇的是在乂1和/或 X2位置上有氨基酸缺失的多肽能夠發(fā)揮拮抗作用。X1和X2位置適合設(shè)置為氨基酸缺失。X3優(yōu)選為小的、中性的和柔性的氨基酸。在本發(fā)明多肽優(yōu)選的實施方案中X3選自包含甘氨酸和/或絲氨酸的組，特別優(yōu)選為甘氨酸?？梢源_定的是，該氨基酸對多肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有積極的作用。這樣的穩(wěn)定性提高的特別的優(yōu)點在于，其可以使得多肽穩(wěn)定性提高，以至于多肽和趨化因子PF4的相互作用時間可以延長。因此提高了的多肽的穩(wěn)定性可以增強多肽的拮抗性。在本發(fā)明多肽優(yōu)選的實施方案中X4為賴氨酸。X5優(yōu)選自包含絲氨酸、甘氨酸和/或蘇氨酸的組。在本發(fā)明多肽優(yōu)選的實施方案中X5為絲氨酸。這種多肽的實施方案可以以有利的方式來改善多肽的溶解性。多肽溶解性的提高特別可以提高多肽在水中的可適用性。這就有可能簡化多肽的給藥，即通?；谒慕o藥方式。此外通過多肽溶解性的提高可以改善多肽在體內(nèi)含水系統(tǒng)中的分散性，特別是在血液中的分散性。X6優(yōu)選為絲氨酸。在多肽的進一步優(yōu)選實施方案中，X7為天冬酰胺。X8為優(yōu)選自包含脯氨酸和/或酪氨酸的組的氨基酸。X8特別優(yōu)選為脯氨酸。在本發(fā)明多肽特別優(yōu)選的實施方案中X9為甘氨酸。可以確定的是，在氨基酸序列的這個位置上的甘氨酸可以使得多肽的連接穩(wěn)定性非常驚人。X10和X13各自獨立地優(yōu)選自包含纈氨酸和/或異亮氨酸的組。在本發(fā)明多肽優(yōu)選的實施方案中X1。為異亮氨酸。在本發(fā)明多肽進一步優(yōu)選的實施方案中，X13為異亮氨酸。在本發(fā)明多肽特別優(yōu)選的實施方案中，X1C^P X13均為異亮氨酸?？梢源_定的是，在多肽的Xki和X13上的異売氣酸有助于提聞多妝構(gòu)象的穩(wěn)定性。X11優(yōu)選為纈氨酸。X12優(yōu)選自包含苯丙氨酸和/或酪氨酸的組，X12特別優(yōu)選為苯丙氨酸。X14優(yōu)選為蘇氨酸。X15優(yōu)選為精氨酸，此外在X15位置上也可以為氨基酸缺失。Xp X2和/或X15優(yōu)選為氨基酸缺失。優(yōu)選的是Xp X2或X15氨基酸中的一個被除去，同樣X1和X2位置上也可以都設(shè)置為氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的進一步實施方案中，Xp X2和X15都可以設(shè)置為氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的優(yōu)選實施方案中，自X3到X14的范圍內(nèi)設(shè)置為無氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的優(yōu)選實施方案中，X5為絲氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，和/或X13為異亮氨酸。在本發(fā)明多肽的優(yōu)選實施方案中，X5為絲氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，X13為異亮氨酸?？梢源_定的是，X5為絲氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，X13為異亮氨酸的多肽具有非常優(yōu)異的拮抗能力。在本發(fā)明多肽的一個進一步優(yōu)選實施方案中，X5為絲氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，X13為異亮氨酸，X1為氨基酸缺失，和/或X15為氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的非常優(yōu)選實施方案中，X5為絲氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，X13為異亮氨酸，X1為氨基酸缺失，X15為氨基酸缺失。這樣設(shè)置的多肽同樣具有非常優(yōu)異的拮抗能力。在本發(fā)明多肽的另一個優(yōu)選實施方案中，X5為絲氨酸，X8為酪氨酸，X9為甘氨酸，X1。為異亮氨酸，X13為異亮氨酸，X1為氨基酸缺失，和/或X15為氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的非常優(yōu)選的實施方案中，X5為絲氨酸，X8為酪氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，X13為異亮氨酸，X1為氨基酸缺失，X15為氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的另一個優(yōu)選的實施方案中，X3為絲氨酸，X5為絲氨酸，X8為酪氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，X13為異亮氨酸，X1為氨基酸缺失，和/或X15為氨基酸缺 失。在本發(fā)明多肽的非常優(yōu)選的實施方案中，X3為絲氨酸，X5為絲氨酸，X8為酪氨酸，X9為 甘氨酸，X10為異亮氨酸，X13為異亮氨酸，X1為氨基酸缺失，X15為氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的另一個優(yōu)選實施方案中，X3為絲氨酸，X5為絲氨酸，X8為脯氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，X13為異亮氨酸，X1為氨基酸缺失，X2為氨基酸缺失，和/或X15為氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的非常優(yōu)選的實施方案中，X3為絲氨酸，X5為絲氨酸，X8為脯氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，X13為異亮氨酸，X1為氨基酸缺失，X2為氨基酸缺失，X15為氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的一個進一步優(yōu)選的實施方案中。X3為絲氨酸，X5為絲氨酸，X8為酪氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，X12為酪氨酸，X13為異亮氨酸，X1為氨基酸缺失，X2為氨基酸缺失，和/或X15為氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的非常優(yōu)選的實施方案中，X3為絲氨酸，X5為絲氨酸，X8為酪氨酸，X9為甘氨酸，X10為異亮氨酸，X12為酪氨酸，X13為異亮氨酸，X1為氨基酸缺失，X2為氨基酸缺失，X15為氨基酸缺失。在本發(fā)明多肽的進一步優(yōu)選的實施方案中可以這樣設(shè)置，本發(fā)明多肽具有如下結(jié)構(gòu)式⑵所示的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽CKEYFYTSGKCSNPAWFVTRC (2) (SEQ ID NO 2)和/或相對于結(jié)構(gòu)式⑵所示的SEQ ID NO 2的氨基酸序列，根據(jù)結(jié)構(gòu)式⑵的SEQ ID NO :2的氨基酸序列的多肽至少有一個或幾個氨基酸缺失、氨基酸替代和/或氨基酸插入。氨基酸替代優(yōu)選涉及的序列范圍是選自結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO 2的氨基酸序列中的第9位至第20位的氨基酸，即從第9位的甘氨酸至第20位的蘇氨酸的序列范圍。優(yōu)選的是一個或幾個選自包含甘氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和/或丙氨酸的組的氨基酸被選自包含絲氨酸、酪氨酸、異亮氨酸和/或甘氨酸的組的氨基酸所替代。這樣的氨基酸替代的一個優(yōu)點是，可以增強多肽的穩(wěn)定性和/或改善多肽的拮抗效果。這樣的氨基酸替代優(yōu)選自包括甘氨酸對應(yīng)絲氨酸，非末端半胱氨酸對應(yīng)絲氨酸，脯氨酸對應(yīng)酪氨酸，纈氨酸對應(yīng)異亮氨酸，苯丙氨酸對應(yīng)酪氨酸，和/或丙氨酸對應(yīng)甘氨酸的替代。這樣的氨基酸替代相互之間可以任意混合。尤其優(yōu)選的是，至少選自結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的第11位非末端半胱氨酸被絲氨酸替代。這樣的替代其優(yōu)勢在于，可以改善多肽的溶解性，特別是在水中的溶解性。尤其優(yōu)選的是，選自結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽，在其實施方案中，氨基酸替代優(yōu)選自甘氨酸對應(yīng)絲氨酸，半胱氨酸對應(yīng)絲氨酸，和/或脯氨酸對應(yīng)酪氨酸的第9至第14位的氨基酸替代，即結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO 2的氨基酸序列中從甘氨酸到脯氨酸的序列范圍。在該序列范圍中優(yōu)選至少含有一個這樣的替代，優(yōu)選至少結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO :2的氨基酸序列的第11位半胱氨酸被絲氨酸替換。此外在進一步優(yōu)選的實施方案中，脯氨酸被酪氨酸所替代，和/或甘氨酸被絲氨酸所替代。在氨基酸序列的第11位上的半胱氨酸的替代可以和其他任意的氨基酸替代組合，尤其可以同脯氨酸被酪氨酸和/或甘氨酸被絲氨酸的替代組合。同樣優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案是，選自結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽，其氨基酸替代涉及第15至第20位上的氨基酸，即從丙氨酸到蘇氨酸。在該氨基酸范圍內(nèi)氨基酸替代優(yōu)選自包含丙氨酸對應(yīng)甘氨酸、纈氨酸對應(yīng)異亮氨酸和/或苯丙氨酸對 應(yīng)酪氨酸。特別優(yōu)選的是，丙氨酸被甘氨酸所替換。優(yōu)選的是，至少選自結(jié)構(gòu)式(2)的SEQID NO 2的氨基酸序列的第16位的纈氨酸被異亮氨酸所替換，特別優(yōu)選為至少兩個纈氨酸被異亮氨酸所替換，其中優(yōu)選將第16和第19位上的纈氨酸替換為異亮氨酸。同樣可以優(yōu)選的是，每一個選自結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO :2的氨基酸序列的纈氨酸都被異亮氨酸所替換。在本發(fā)明進一步的優(yōu)選實施方案中，苯丙氨酸可被酪氨酸所替換。在本發(fā)明進一步的實施方案中優(yōu)選的是，選自結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO :2的氨基酸序列，其第15位上的丙氨酸被甘氨酸所替換，第16位上的纈氨酸被異亮氨酸所替換，第19位上的纈氨酸被纈氨酸所替換?？梢源_定的是，這樣的氨基酸替換可以使得多肽的連接有著非常驚人的穩(wěn)定性。氨基酸替換和/或氨基酸缺失可以相互間任意組合，特別是氨基酸替換可以相互間任意組合。此外本發(fā)明多肽還可以具有氨基酸缺失的實施方案。優(yōu)選的氨基酸缺失包括賴氨酸、谷氨酸和/或精氨酸。氨基酸缺失優(yōu)選涉及結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的第2位上的賴氨酸、第3位上的谷氨酸、和/或第21位上的精氨酸。氨基酸缺失可以相互間任意組合。優(yōu)選缺失一個氨基酸，同時也可以這樣設(shè)置，既使第2位上的賴氨酸缺失，又使第21位上的精氨酸缺失。在進一步的實施方案中，可以使第2位上的賴氨酸、第3位上的谷氨酸、和第21位上的精氨酸缺失。選自結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO :2的氨基酸序列，其第4至第20位的氨基酸范圍內(nèi)優(yōu)選設(shè)置為沒有氨基酸缺失。在特別優(yōu)選的實施方案中，在第4至第8位的氨基酸范圍內(nèi)既沒有氨基酸缺失也沒有氨基酸替代。選自結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO :2的氨基酸序列在第9至第20位的氨基酸范圍內(nèi)具有2個氨基酸替代，優(yōu)選為3個氨基酸替代，進一步優(yōu)選為4個氨基酸替代，再進一步優(yōu)選為5個氨基酸替代，通過研究可以確定，這樣的氨基酸序列具有優(yōu)異的拮抗性能。在這樣的實施方案中，多肽的氨基酸數(shù)目為15至25個是有利的，優(yōu)選為18至23個氨基酸，特別優(yōu)選為19至22個，進一步優(yōu)選為20至21個，尤其優(yōu)選為22個氨基酸。本發(fā)明多肽、其生理學(xué)可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物，其非常適合的一種實施方案是，具有如下述結(jié)構(gòu)式(3)所示的SEQ ID NO 3的氨基酸序列CKEYFYTSGKSSNPGIVFITRC(3)(SEQ ID NO :3).通過研究可以確定的是，具有如結(jié)構(gòu)式(3)所示的SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽有非常高的拮抗?jié)摿?。尤其可以確定的是，這樣的多肽有非常優(yōu)異的拮抗效果。尤其可以確定的是，具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽對于可導(dǎo)致單核細胞阻滯增強的RANTES和PF4之間的相互作用有顯著的以及可復(fù)現(xiàn)的抑制作用。特別的優(yōu)勢在于，具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(3)所示的SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽對RANTES和PF4的相互作用特別有效。因此具有趨化因子功能的進一步干擾可以被減弱甚至被消除。這就有可能使得本發(fā)明多肽對與單核細胞募集或其他白細胞種類如嗜曙紅細胞的依賴RANTES的募集相關(guān)的疾病，尤其是心血管疾病有針對性很強的應(yīng)用。本發(fā)明多肽、其生理學(xué)可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物的另一個優(yōu)選的實施方案是，具有如下述結(jié)構(gòu)式(4)所示的SEQ ID NO 4的氨基酸序列 CEYFYTSGKSSNPGIVFITC(4)(SEQ IDNO 4).本發(fā)明多肽、其生理學(xué)可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物的另一個優(yōu)選的實施方案是，具有如下述結(jié)構(gòu)式(5)所示的SEQ ID NO 5的氨基酸序列CEYFYTSGKSSNYGIVFITC(5)(SEQ ID NO 5).本發(fā)明多肽、其生理學(xué)可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物的另一個優(yōu)選的實施方案是，具有如下述結(jié)構(gòu)式(6)所示的SEQ ID NO 6的氨基酸序列CEYFYTSSKSSNYGIVFITC(6)(SEQ ID NO 6).本發(fā)明多肽、其生理學(xué)可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物的另一個優(yōu)選的實施方案是，具有如下述結(jié)構(gòu)式(7)所示的SEQ ID NO 7的氨基酸序列CYFYTSSKSSNPGIVFITC(7)(SEQ ID NO 7).優(yōu)選實施方案中的多肽的優(yōu)點在于，這樣的多肽優(yōu)選具有增強了的穩(wěn)定性。這就有可能使得大量的多肽可以到達目標(biāo)位置并與蛋白質(zhì)或肽結(jié)合物穩(wěn)定地發(fā)生相互作用。多肽的高穩(wěn)定性尤其有可能使得多肽在體內(nèi)和體外都可使用。優(yōu)選實施方案中的多肽的另一個優(yōu)點在于，多肽在水中具有較高的溶解性。較高的溶解性尤其使得多肽簡單方便地使用。此外還可以如下設(shè)置每一個L-氨基酸都被D-賴氨酸所替換。這樣可以進一步提聞多妝的穩(wěn)定性。本發(fā)明多肽根據(jù)通用的多肽的合成方法制備。有利的是，本發(fā)明多肽作為拮抗劑適合于抑制血小板因子4和RANTES的相互作用。本發(fā)明多肽尤其能抑制RANTES和血小板因子4的相互作用。本發(fā)明多肽、其生理學(xué)可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物作為拮抗劑適用于抑制RANTES和血小板因子4的相互作用?；诒景l(fā)明多肽的優(yōu)良性質(zhì)，其適合作為藥物使用。發(fā)明的另一個目標(biāo)涉及本發(fā)明多肽的用途，即在生產(chǎn)藥物中的用途，尤其在優(yōu)選的實施方案中。本發(fā)明可以用通常的方式給藥，優(yōu)選非消化道給藥，例如口服給藥、經(jīng)皮給藥、皮下給藥和/或靜脈給藥。例如本發(fā)明多肽可以采用體外給藥的方式，如在血管搭橋移植之前，或者經(jīng)由靜脈內(nèi)給藥，例如在導(dǎo)管介入或支架植入之前或之后。
對于這樣的應(yīng)用來說，在水中具有非常好的溶解性有很大的優(yōu)勢。除了暫時性的或者急性的治療之外，本發(fā)明多肽的優(yōu)勢還在于可以在較長時間周期內(nèi)給藥。本發(fā)明多肽同樣可以以延長釋放或者推遲釋放形式之一給藥。例如以長效注射或者滲透泵的形式給藥。本發(fā)明多肽同樣可以以編碼每個多肽的核酸的形式給藥。在這里核酸分子被包含在常用的遺傳載體中。優(yōu)選以編碼每個多肽的D NA序列的形式給藥。同樣可以安排為，以編碼本發(fā)明多肽的RNA序列的形式給藥。本發(fā)明的另一個主題是編碼本發(fā)明多肽的核酸，其含有的核酸序列優(yōu)選包含編碼具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(I)的SEQ ID NO :1、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO :2、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(4)的SEQ ID NO :4、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(5)的SEQ ID NO :5、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(6)的SEQ ID NO :6、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(7)的SEQ ID NO 7的氨基酸序列的多肽的核酸序列。就本發(fā)明所使用的核酸而言，其涉及到DNA和RNA。技術(shù)人員熟知為編碼根據(jù)上述結(jié)構(gòu)式或序列的多肽的DNA序列。編碼具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3氨基酸序列的多肽的核酸分子的一個實例具有如下述結(jié)構(gòu)式⑶所示的SEQ ID NO 8的DNA序列5' -TGCAAGGAATATTTCTACACTTCCGGGAAATCCTCCAATCCTGGAATTGTGTTCATCACTAGATGT-3; (8)(SEQ ID NO 8).技術(shù)人員熟知另外一種編碼具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3氨基酸序列的多肽的DNA序列。此外已知的是，核酸的序列的改變是允許的，例如通過遺傳密碼的簡并性。編碼具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽的核酸分子的一個實例具有如下述結(jié)構(gòu)式(9)所示的SEQ ID NO 9的DNA序列5' -TGCAAGGAATATTTCTACACTTCCGGGAAATGTTCCAATCCTGCCGTGGTGTTCGTCACTAGATGT-3' (9)(SEQ ID NO 9).編碼具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(4)的SEQ ID NO :4氨基酸序列的多肽的核酸分子的一個實例具有如下述結(jié)構(gòu)式(10)所示的SEQ ID NO 10的DNA序列5' -TGCGAATATTTCTACACTTCCGGGAAATCCTCCAATCCTGGAATTGTGTTCATCACTTGT-3' (10)(SEQ ID NO : 10)·編碼具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(5)的SEQ ID NO :5氨基酸序列的多肽的核酸分子的一個實例具有如下述結(jié)構(gòu)式(11)所示的SEQ ID NO 11的DNA序列5' -TGCGAATATTCTACACTTCCGGGAAATCCTCCAATTACGGAATTGTGTTCATCACTTGT-3' (11)(SEQ ID NO 11).編碼具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(6)的SEQ ID NO :6氨基酸序列的多肽的核酸分子的一個實例具有如下述結(jié)構(gòu)式(12)所示的SEQ ID NO 12的DNA序列5' -TGCGAATATTTCTACACTTCCTCTAAATCCTCCAATTACGGAATTGTGTTCATCACTTGT-3' (12)(SEQ ID NO : 12)·編碼具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(J)的SEQ ID NO :7氨基酸序列的多肽的核酸分子的一個實例具有如下述結(jié)構(gòu)式(13)所示的SEO ID NO 13的DNA序列5' -TGCTATTTCTACACTTCCTCTAAATCCTCCAATCCTGGAATTGTGTTCATCACTTGT-3' (13) (SEQ ID NO : 13)·
技術(shù)人員熟知其他的編碼具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(I)的SEQ ID NO :1、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO :2、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(4)的SEQ ID NO :4、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(5)的SEQ ID NO :5、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(6)的SEQ ID NO :6、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(7)的SEQ ID NO 7的氨基酸序列的多肽的DNA序列。同樣，技術(shù)人員熟知編碼具有根據(jù)結(jié)構(gòu)式(I)的SEQ IDNO :1、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO :2、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(4)的SEQ ID NO :4、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(5)的SEQ ID NO :5、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(6)的SEQ ID NO :6、根據(jù)結(jié)構(gòu)式(7)的SEQ ID NO 7的氨基酸序列的多肽的RNA序列。優(yōu)選的本發(fā)明多肽的個人給藥劑量范圍為IOmg/天/75kg體重至IOOOmg/天/75kg體重，非常優(yōu)選為50mg/天/75kg體重至200mg/天/75kg體重，尤其優(yōu)選為150mg/天/75kg體重。本發(fā)明多肽、其生理學(xué)可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物和/或核酸對于與單核細胞募集相關(guān)的疾病的治療和/或預(yù)防處置、診斷和/或治療均適用。例如心血管疾病和/或炎癥，尤其是動脈硬化、狹窄、高血壓和/或移植排斥反應(yīng)，屬于這類疾病。
本發(fā)明多肽和/或核酸適用于哺乳動物的治療，尤其是人類。本發(fā)明多肽會對單核細胞在內(nèi)皮的粘附產(chǎn)生影響。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明多肽尤其優(yōu)選的實施方案能夠抑制由RANTES和PF4的異嗜相互作用導(dǎo)致的單核細胞阻滯的增強。有利的是，尤其優(yōu)選的實施方案在實驗中對由RANTES和PF4的異嗜相互作用導(dǎo)致的單核細胞阻滯的增強顯示出比迄今已知的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合物都更強的抑制作用。本發(fā)明多肽的一個特殊的優(yōu)點可以通過這樣的方式實現(xiàn)，通過本發(fā)明多肽的給藥，可以減弱或消除動脈硬化的形成，手術(shù)后或用藥后的再狹窄，例如在氣囊擴張術(shù)，經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術(shù)或者分流術(shù)之后的再狹窄。本發(fā)明多肽的特殊優(yōu)點在于，本發(fā)明多肽可以減弱或消除在終末期的，或者臨床的疾病或者形態(tài)學(xué)上的動脈硬化的變化時單核細胞在內(nèi)皮上的進一步募集。本發(fā)明多肽的特殊優(yōu)點在于，本發(fā)明多肽尤其適用于預(yù)防治療例如有高血壓威脅的病人。采用這樣的預(yù)防治療是非常有利的，其有可能使得本發(fā)明多肽對與所有趨化因子相關(guān)的過程不產(chǎn)生或產(chǎn)生很小的副作用。本發(fā)明的另一主題相應(yīng)地涉及本發(fā)明多肽、其生理學(xué)可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物的用途，即在生產(chǎn)治療和/或預(yù)防選自以下的組中的疾病的藥物中的用途，該組包括-同單核細胞募集相關(guān)的疾病，如心血管疾病和/或炎癥，尤其是動脈硬化、動脈粥樣硬化、動脈粥樣斑、狹窄、再狹窄、高血壓、關(guān)節(jié)炎、心肌炎、自身免疫疾病包括腦脊髓炎、腸炎、梗塞例如心肌梗塞或腦血管梗塞后的再灌注、移植排斥和/或皮膚病，如牛皮癬，和/或-與其他白細胞種類如嗜曙紅細胞的依賴RANTES的募集相關(guān)的疾病，尤其是過敏性疾病，如哮喘或肺炎。尤其是在治療人的動脈粥樣硬化病變時，使用本發(fā)明多肽對病程有很好的效果。本發(fā)明多肽尤其可以通過單核細胞阻滯來減弱動脈硬化病變的惡化。本發(fā)明多肽的另一個優(yōu)點是，可以減弱或者甚至消除器官和/或組織移植后的排斥反應(yīng)。本發(fā)明多肽的優(yōu)點尤其在于，沒有或者只產(chǎn)生很小的副作用。這就有可能使得本發(fā)明多肽可以用于疾病預(yù)防。此外本發(fā)明多肽的優(yōu)點尤其在于，由于本發(fā)明多肽的特異性可以避免對進一步的新陳代謝過程產(chǎn)生影響，以至于使得可以例如對有高血壓危險的病人或預(yù)防動脈硬化病變進行預(yù)防給藥。本發(fā)明的另一主題涉及包含本發(fā)明多肽的藥物，優(yōu)選包含根據(jù)結(jié)構(gòu)式(I)的SEQID NO :1的氨基酸序列的多肽、其生理學(xué)可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物。本發(fā)明藥物特別優(yōu)選包含選自包含按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3、按照結(jié)構(gòu)式(4)的SEQ ID NO :4、按照結(jié)構(gòu)式(5)的SEQ IDNO :5、按照結(jié)構(gòu)式(6)的SEQ ID NO :6、按照結(jié)構(gòu)式(7)的SEQ IDNO :7的氨基酸序列的多肽的組。本發(fā)明藥物尤其優(yōu)選包含按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明藥物優(yōu)選具有按照上述結(jié)構(gòu)式或SEQ ID編號中的一個的多肽，本發(fā)明藥物可以設(shè)置為具有按照幾種結(jié)構(gòu)式或SEQ ID編號的多肽。包含本發(fā)明多肽的藥物尤其適用于例如人類的體內(nèi)治療。包含本發(fā)明多肽的藥物的一種優(yōu)選用途是治療和/或預(yù)防與單核細胞募集相關(guān)的疾病，例如心血管疾病和/或炎癥，尤其是動脈硬化、動脈粥樣硬化、動脈粥樣斑、狹窄、再狹窄、高血壓、關(guān)節(jié)炎、心肌炎、自身免疫疾病包括腦脊髓炎、腸炎、梗塞例如心肌梗塞或腦血管梗塞后的再灌注、移植排斥和 /或皮膚病，如牛皮癬，和/或與其他白細胞種類如嗜曙紅細胞的依賴RANTES的募集相關(guān)的疾病，尤其是過敏性疾病，如哮喘或肺炎。同時本發(fā)明的主題是包含編碼本發(fā)明多肽的核酸的藥物。在這里核酸分子包含在常用的遺傳載體中。本發(fā)明的另一主題涉及抑制單核細胞阻滯的藥物，其包含本發(fā)明多肽、其生理學(xué)可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物，優(yōu)選包含按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽?！耙种茊魏思毎铚乃幬铩痹诒景l(fā)明中的含義是該藥物對與單核細胞例如在內(nèi)皮上固定的單核細胞阻滯相關(guān)的疾病有積極的影響。尤其可以減弱或者甚至消除動脈硬化斑的形成。本發(fā)明多肽的應(yīng)用可以優(yōu)選減弱和/或完全或幾乎完全消除單核細胞募集和/或其在活性內(nèi)皮上的固定尤其是在動脈硬化斑或心內(nèi)膜上的固定。因此，本發(fā)明特別地涉及以下方面I. 一種多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物，其特征在于，該多肽具有如下述結(jié)構(gòu)式(I)所示的SEQ ID NO :I的氨基酸序列 C-X1-X2-YFYTS-X3-X4-Xs-^6--^7-^8-^9--^lO--^ll--^12--^13--^14--^15-C(I) (SEQ IDNO :I)其中X1選自包含賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、組氨酸和/或天冬酰胺的組，或氨基酸缺失;X2選自包含谷氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酰胺的組，或氨基酸缺失；X3選自包含甘氨酸、絲氨酸和/或丙氨酸的組；X4選自包含賴氨酸、亮氨酸和/或精氨酸的組；X5選自包含絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和/或蘇氨酸的組；X6選自包含絲氨酸、甘氨酸和/或蘇氨酸的組；X7選自包含天冬酰胺和/或谷氨酰胺的組；
X8選自包含脯氨酸、酪氨酸和/或甘氨酸的組；X9選自包含甘氨酸、丙氨酸和/或絲氨酸的組；X10選自包含異亮氨酸、纈氨酸和/或天冬酰胺的組；X11選自包含纈氨酸、異亮氨酸和/或天冬酰胺的組；X12選自包含苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和/或甲硫氨酸的組；X13選自包含異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和/或苯丙氨酸的組；X14選自包含蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和/或酪氨酸的組；X15選自包含精氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和/或天冬酰胺的組，或具有一種 氨基酸缺失。2.按照第I項所述的多肽，其特征在于，該多肽的氨基酸數(shù)目為19-22個。3.按照第I或2項所述的多肽，其特征在于，X1為賴氨酸或缺失。4.按照前述各項的多肽，其特征在于，X2為谷氨酸或缺失。5.按照前述各項的多肽，其特征在于，X3為選自包含甘氨酸和/或絲氨酸的組。6.按照前述各項的多肽，其特征在于，X5為絲氨酸。7.按照前述各項的多肽，其特征在于，X8為選自包含脯氨酸和/或酪氨酸的組。8.按照前述各項的多肽，其特征在于，X9為甘氨酸。9.按照前述各項的多肽，其特征在于，Xltl為異亮氨酸。10.按照各項的多肽，其特征在于，X12為選自包含苯丙氨酸和/或酪氨酸的組。11.按照前述各項的多肽，其特征在于，X13為異亮氨酸。12.按照前述各項的多肽，其特征在于，X15為選自包含精氨酸或缺失。13.按照前述各項的多肽，其特征在于，該多肽具有如下述結(jié)構(gòu)式(2)所示的SEQID NO 2的氨基酸序列CKEYFYTSGKCSNPAWFVTRC (2) (SEQ ID NO :2)和/或相對于按照結(jié)構(gòu)式⑵的SEQ ID NO 2的氨基酸序列，按照結(jié)構(gòu)式⑵的SEQ IDNO :2的氨基酸序列的多肽至少有一個或幾個氨基酸缺失、氨基酸替代和/或氨基酸插入。14.按照前述各項的多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物，其特征在于，該多肽具有如下述結(jié)構(gòu)式(3)所示的SEQ ID NO 3的氨基酸序列CKEYFYTSGKSSNPGIVFITRC(3)(SEQ ID NO :3).15.按照前述各項的多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物，其特征在于，該多肽具有如下述結(jié)構(gòu)式(4)所示的SEQ ID NO 4的氨基酸序列CEYFYTSGKSSNPGIVFITC(4)(SEQ ID NO :4).。16.按照前述各項的多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物，其特征在于，該多肽具有如下述結(jié)構(gòu)式(5)所示的SEQ ID NO 5的氨基酸序列CEYFYTSGKSSNYGIVFITC(5)(SEQ ID NO :5).。17.按照前述各項的多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物，其特征在于，該多肽具有如下述結(jié)構(gòu)式(6)所示的SEQ ID NO 6的氨基酸序列CEYFYTSSKSSNYGIVFITC(6)(SEQ ID NO :6).。18.按照前述各項的多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物，其特征在于，該多肽具有如下述結(jié)構(gòu)式(7)所示的SEQ ID NO 7的氨基酸序列CYFYTSSKSSNPGIVFITC(7)(SEQ ID NO :7).。19.前述各項的多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物作為拮抗劑抑制RANTES和血小板因子4的相互作用的用途。20.前述各項的多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物在生產(chǎn)藥物中的用途。21.前述各項的多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物在生產(chǎn)治療和/或預(yù)防選自以下的組中的疾病的藥物中的用途，該組包括-同單核細胞募集相關(guān)的疾病，如心血管疾病和/或炎癥，尤其是動脈硬化、動脈粥樣硬化、動脈粥樣斑、狹窄、再狹窄、高血壓、關(guān)節(jié)炎、心肌炎、自身免疫疾病包括腦脊髓 炎、腸炎、梗塞后的再灌注、移植排斥和/或皮膚病，和/或-與其他的白細胞種類如嗜曙紅細胞的依賴RANTES的募集相關(guān)的疾病，尤其是過敏性疾病，如哮喘或肺炎。22. 一種藥物，其包含按照前述各項的多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物。23.抑制單核細胞阻滯的藥物，其包含按照前述各項的多肽、其藥理學(xué)上可接受的鹽、衍生物和/或偶聯(lián)物。24. 一種核酸，其包含編碼前述各項的多肽的核酸序列。25. 一種藥物，其包含編碼前述各項的多肽的核酸。
具體實施例方式用于闡明本發(fā)明的實施例如下材料和方法細胞培養(yǎng)來自人胳帶的內(nèi)皮細胞(HUVEC,human umbilical vein endothelial cells,promoCell，德國漢堡)在內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(PromoCell，德國漢堡)中培養(yǎng)，使用2至4代以后的細胞。單核細胞Mono Mac 6_細胞(MM6，DSMZ)在RPMl 1640培養(yǎng)基(PAA實驗室，帕興(Pasching)，奧地利)中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加了 10%的胎牛血清，2mML谷氨酰胺(Biowhittaker), ImM丙酮酸鈉,50 μ g/ml慶大霉素和9 μ g/ml胰島素(MM6培養(yǎng)基)。將濃度為2 X105ml的細胞接種于24孔板中的2ml MM6培養(yǎng)基中，并且在細胞用于實驗之前于37°C下在含5%的CO2的潮濕氣氛中培養(yǎng)3至4天。多肽按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽，按照結(jié)構(gòu)式(15)的SEQ IDNO :15的氨基酸序列的小鼠-直系同源物以及按照結(jié)構(gòu)式(14)的SEQ ID NO : 14的氨基酸序列的調(diào)節(jié)肽通過基于t-Boc的多肽固相化學(xué)合成法，在使用4-苯甲基羥胺樹脂的情況下合成。多肽的分子量通過電噴霧質(zhì)譜分析法確定(Dawson PE,Kent SB. (2000)Annu RevBiochem. 69 :923-960, Hackeng TM, Griffin JH, Dawson PE. (1999)Proc Natl Acad SciUSA.，Vol 96，S.10068-10073)。
實施例I等離振子共振研究可用于分析包含按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽對RANTES和PF4異相聚集形成的抑制效果。等離振子共振研究可使用HBS-EP 緩沖液(IOmM HEPES, 150mMNaCl,0. 005% Tween20，pH7. 4)中進行。Cl芯片(Biacore AB，Uppsala，瑞典)的兩個細胞流動腔通過注入50 μ I乙基(二甲基氨丙基)碳二亞胺/N-羥基-琥珀酰亞胺(O. 2Μ/0. 05Μ，Pierce公司)活化，并且緊接著將20 μ I鏈霉抗生物素蛋白灌注于其表面。接下來在細胞表面連續(xù)4次注射20 μ I乙二胺(1Μ, pH8, Sigma-Aldrich)使其失活。N-末端生物素化的人血小板因子4 (bPF4)通過基于t_Boc的多肽固相化學(xué)合成法和 PF4 的自然化學(xué)連接法來合成(Dawson PE, Kent SB. (2000) Annu Rev Biochem. 69 923-960，Hackeng TM,Griffin JH,Dawson PE. (1999)Proc Natl Acad Sci USA. ,Vol 96，
S.10068-10073)。該bPF4在Cl傳感芯片的葡聚糖表面上固定，其中將HBS-EP緩沖液中的200 μ g/ml的bPF4注射于流動腔表面，核磁單位(RU)采用240。不用bPF4處理的第二個流動腔作為對照。RANTES (O. 5 μ M，重組人 RANTES，Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)，或者 O μ Μ、10μM、50μM以及100μM不同濃度的RANTES(0.5μM)及包含按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ IDNO 3氨基酸序列的多肽在HBS-EP緩沖液中室溫下預(yù)孵育一夜，在bPF4的流動腔上各注射15 μ I肽/RANTES混合物，并觀察RANTES的結(jié)合180秒。結(jié)合的過程和測試都通過Biacore2000設(shè)備(Biacore AB)以5 μ Ι/min的流速進行。RANTES結(jié)合的傳感圖通過BIAevaluation 3. O軟件(Biacore AB)對非特異性的背景信號進行校正,對每一次注射確定平衡核磁單位(RU)。結(jié)果表明，按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽對RANTES和PF4的相互作用有依賴于濃度的抑制作用，其中在固定化的PF4上的RANTES的結(jié)合物在按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽的存在下濃度下降了 100 μ M。實施例2等離振子共振研究可用于分析具有按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3的氨基酸序列、按照結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO :2的氨基酸序列的多肽以及調(diào)節(jié)肽對RANTES和PF4異相聚集形成的抑制效果。在進一步的實驗中，在實施例I所述的條件下，將RANTES(0. 5 μ Μ)的結(jié)合或者含有0μΜ、10μΜ、50μΜ以及ΙΟΟμΜ不同濃度的包含按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3、按照結(jié)構(gòu)式⑵的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽的RANTES (0.5 μ Μ)的結(jié)合、或者按照如下所示結(jié)構(gòu)式(14)的SEQ ID NO 14的氨基酸序列的調(diào)節(jié)肽預(yù)先孵育，用于研究KEYFYTSGK(14) (SEQ ID NO :14)研究發(fā)現(xiàn)，在該實驗中，在多肽濃度為10 μ Μ、50 μ M和100 μ M時，具有按照結(jié)構(gòu)式
(3)的SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽比具有按照結(jié)構(gòu)式(2)的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽對RANTES和PF4的相互作用有更明顯有效的抑制作用。具有按照結(jié)構(gòu)式(14)的SEQ ID NO : 14的氨基酸序列的調(diào)節(jié)肽在濃度為100 μ M時未表現(xiàn)出可證明的抑制作用。實施例3
對活性內(nèi)皮上單核細胞阻滯的抑制作用。研究了單核細胞Mono Mac 6_細胞在活性內(nèi)皮細胞上的相互作用。將含有被IL_13(白介素I β ,Peprotech, 10ng/ml, 12小時)活化的匯合HUVEC-細胞層的培養(yǎng)皿置于流動腔中。Mono Mac 6細胞(0. 5 X IO6細胞/ml)在含有0.5%牛血清白蛋白(Serva)的ρΗ7· 3標(biāo)準(zhǔn)Hank溶液(含有IOmM Hepes的HBSS溶液)中再懸浮，并且保持在冰上。在實驗5分鐘之前，向ΜΜ6單核細胞中添加Ca2+和Mg2+，及最終濃度分別為 ImM 和 60ηΜ 的趨化因子 RANTES (Peprotech, Rockey Hill, NJ, USA)和 PF4 (ChromaTec,Greifswald)和6 μ M的具有按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3、按照結(jié)構(gòu)式⑵的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽、具有按照結(jié)構(gòu)式(14)的SEQ ID NO: 14的序列的調(diào)節(jié)肽，并且升溫至37°C。然后將經(jīng)過這樣預(yù)處理的細胞在I. 5dyn/cm2的剪切力下借助于Olympus公司的1X50型顯微鏡灌注于內(nèi)皮上。通過同內(nèi)皮細胞相互作用粘附的單核細胞的數(shù)目將通過使用視頻攝像機(3CCD，JVC)和記錄儀在多視角下確定。得到的數(shù)據(jù)取平均值(η = 5) 土標(biāo)準(zhǔn) 差(P < O. 02)，對控制效果進行評估。可以確定的是，具有結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽對RANTES和PF4的異嗜性相互作用的增強有明顯的抑制作用，例如可以達到80%，而具有結(jié)構(gòu)式⑵的SEQ ID NO :2的氨基酸序列的多肽的抑制作用較弱。結(jié)構(gòu)式(14)的SEQ ID Ν0:14的氨基酸序列的調(diào)節(jié)肽相比而言無明顯的抑制作用。實施例4對動脈硬化小鼠模型的體內(nèi)研究使用9至12周大的雌性ApoE-/-同窩出生的小鼠(The Jackson Lab, BarHarbor,Maine,USA)作為動脈硬化的模型。在12周內(nèi)這些小鼠以高脂肪喂養(yǎng)(21% Fett ；Altromin C1061)。在這段時間內(nèi)對兩組小鼠每周三次腹膜內(nèi)注射50 μ g的鹽溶液中的按照如下所示結(jié)構(gòu)式(15)的SEQ ID NO :15的氨基酸序列的多肽，CKEYFYTSSKSSNLAVVFVTRC(15)(SEQ ID NO 15)(η = 12只小鼠)或者按照如下所示結(jié)構(gòu)式(14)的SEQ ID NO 14的氨基酸序列的調(diào)節(jié)肽KEYFYTSGK(14) (SEQ ID NO :14)(η = 7只小鼠)。一組未被處理的小鼠(η = 12)作為對照。將小鼠殺死用于組織學(xué)研究。在實驗期間小鼠都健康并未表現(xiàn)出患病跡象。從實驗開始至實驗結(jié)束都抽取血樣。白細胞數(shù)通過血細胞計數(shù)法確定，并收集血清，膽固醇水平通過Infinity膽固醇設(shè)備(Thermo Electron, Melbourne,澳大利亞)來確定。在主動脈根部和胸腹部主動脈處確定動脈硬化的程度，其中脂類沉積物通過油紅-O-染料染色(Veillard NR, Kwak B, Pelli G, Mulhaupt F, James Rff, Proudfoot AE,Mach F. Antagonism of RANTES receptors reduces atherosclerotic plaque formationin mice. Circ Res. 2004 ；94 :253-61)并借助于計算機圖像分析(Dikus 軟件，Hilgers,Aachen)來量化。在通過心臟和主動脈的5 μ m的橫斷切片中確認(rèn)動脈粥樣硬化病變區(qū)域。對每個主動脈根，借助彼此相距50 μ m的6個切片的脂類染色區(qū)域來確定動脈粥樣硬化病變區(qū)域。動脈粥樣硬化病變區(qū)域分布在各個切面的染色表面上。沿著腹部中位線打開胸腹部主動脈，在正面解剖下用油紅-O-染料染色病變區(qū)域。計算脂類沉積物的量，其中染色區(qū)域的面積通過均分胸腹部主動脈染色的總面積來評估?？梢源_定的是，用結(jié)構(gòu)式(15)的SEQ ID NO :15氨基酸序列的多肽和結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO :3氨基酸序列的多肽的小鼠-直系同源物處理過的小鼠，與用調(diào)節(jié)肽處理過的小鼠相比，動脈粥樣硬化病變的進展明顯減弱。此外可以確定的是，表現(xiàn)出動脈硬化斑的主動脈根部區(qū)域，相對于處理過的小鼠中的總的瓣膜表面同樣有明顯的減弱效果。同樣可以確定的是，動脈粥樣硬化病變中的巨噬細胞也明顯減少。因此可以表明，按照結(jié)構(gòu)式(3)的SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽的小鼠-直系同源物可以減緩體內(nèi)動脈粥樣硬化的進展，因此本發(fā)明多肽可 以用于臨床治療。
權(quán)利要求
1.一種多肽或其藥理學(xué)上可接受的鹽，其包含如下述結(jié)構(gòu)式(3)所示的SEQ ID N03的氨基酸序列CKEYFYTSGKSSNPGIVFITRC(3)(SEQ ID NO 3)
2.按照權(quán)利要求I的多肽，其中所述多肽是酯、酰胺、N-酰基和/或O-?；苌?、羧基化的多肽、乙?；亩嚯摹⒘姿峄亩嚯暮?或糖基化的多肽。
3.按照權(quán)利要求I的多肽，其中所述多肽是糖-偶聯(lián)物或聚乙二醇-偶聯(lián)物、生物素化的多肽、放射性標(biāo)記的或熒光標(biāo)記的多肽。
4.按照權(quán)利要求1-3中任一項的多肽或其藥理學(xué)上可接受的鹽作為RANTES和血小板因子4的相互作用的拮抗劑的用途。
5.按照權(quán)利要求1-3中任一項的多肽或其藥理學(xué)上可接受的鹽用于生產(chǎn)抑制RANTES和血小板因子4的相互作用的藥物的用途。
6.按照權(quán)利要求1-3中任一項的多肽或其藥理學(xué)上可接受的鹽用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防選自下組中的疾病的藥物的用途與單核細胞募集相關(guān)的疾病，如心血管疾病和/或炎癥，尤其是動脈硬化、動脈粥樣硬化、不穩(wěn)定斑塊、狹窄、再狹窄、高血壓、關(guān)節(jié)炎、心肌炎、自身免疫疾病包括腦脊髓炎、炎性腸病、梗塞后的再灌注損傷、移植排斥和/或皮膚??；和/或與其他的白細胞群體如嗜曙紅細胞的RANTES依賴性募集相關(guān)的疾病，尤其是過敏性疾病，如哮喘或肺炎。
7.一種藥物，其包含權(quán)利要求1-3中任一項的多肽或其藥理學(xué)上可接受的鹽。
8.抑制單核細胞阻滯的藥物，其包含權(quán)利要求1-3中任一項的多肽或其藥理學(xué)上可接受的鹽。
9.一種核酸,其包含編碼權(quán)利要求1-3中任一項的多肽的核酸序列。
全文摘要
用于抑制PF4和RANTES相互作用的拮抗劑，本發(fā)明涉及按照結(jié)構(gòu)式(1)的SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽，及其在制備用于治療與單核細胞募集有關(guān)的疾病的藥物中的用途。
文檔編號A61P17/00GK102911260SQ20121036604
公開日2013年2月6日 申請日期2006年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者C·韋伯, P·馮·洪德爾斯豪森, R·克嫩 申請人:卡羅勒斯治療公司