一種藜蘆生物堿的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種藜蘆生物堿的制備方法，屬于有機化學領域范疇。本制備方法以藜蘆藥材為原料，經過提取、萃取、上柱、結晶等一系列步驟，制備出藜蘆生物堿，含量達到80％～98％。本發(fā)明的制備工藝安全合理，在制備藜蘆生物堿的過程中，沒有采用加熱工序，不但最大程度的保證生物堿被充分提取分離，同時減少了由于加熱情況下造成的產品活性成分的破壞和副產物的產生，提高了產品的得率和安全性。經多批工業(yè)化生產驗證，本發(fā)明提供的工藝穩(wěn)定性、重復性好，質量可控，具有很強的實用性。
【專利說明】一種藜蘆生物堿的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有抗病毒作用的藜蘆生物堿制備方法，屬于有機化學領域范疇。
【背景技術】
[0002]藜蘆(Falsehellebore Root and Rhizome)為百合科藜蘆屬植物藜蘆的干燥根及根狀莖。始載于《神農本草經》，味苦，性辛、寒，有毒。歸肺，胃經?！侗静菥V目》載入草部，毒草類，有吐風痰，殺蟲毒等功效。
[0003]藜蘆中主要化學成分是生物堿，由于其生理活性強烈，其生物堿類成分與很多其他中藥合用時會產生化學反應，出現意外，因此藜蘆在中藥中一直是以毒性很大而著稱。如在《儒門事親》的十八反歌云:“本草明言十八反，諸參辛芍叛藜蘆……”。
[0004]隨著現代對藜蘆藥理作用研究的深入，表明藜蘆的生物活性主要體現在其所含生物堿對心血管系統的作用，特點為在產生明顯而持久降壓的同時，伴有心跳變慢等作用。研究還表明，藜蘆生物堿表現出的毒性，主要是因為其作用于動物及人體運動神經、感覺神經及迷走神經的麻痹作用，引起臨床上的中毒反應。
[0005]雖然藜蘆在傳統印象中是一種毒性較大的中藥，目前較為廣泛的應用于殺蟲劑。其作用機理是藜蘆堿經蟲體表面或吸食進入消化系統，造成局部刺激，引起反射性蟲體興奮，繼之抑制蟲體感覺神經末梢，經傳導和抑制中樞神經而致害蟲死亡。此外，由于藜蘆在其他很多方面具有較強的生理活性，仍然在臨床上得到較為廣泛的應用，尤其是目前已經發(fā)現其在抗腫瘤方面有獨特的作用，藜蘆已經成為目前研究的一個熱點。
[0006]因此，運用現`代中藥分離純化技術，將藜蘆中主要活性藜蘆生物堿進行分離純化，并對其藥理活性、作用機制進行深入系統的研究，將會對傳統中藥藜蘆在應用方面起到突破和提高作用。
[0007]目前從已經公開的文獻和專利中，對藜蘆生物堿的分離純化報道比較少見，而且一般都還處在粗提物的階段或者只是對其中某一兩種成分的分離純化。此外，文獻中在對藜蘆進行提取過程一般采用加熱回流或煎煮、濃縮等方式，使得藜蘆生物堿不但含量低、雜質多，而且會產生破壞作用，產生新的副產物，從而導致深入研究的難度進一步加大。
[0008]針對以上現狀，本發(fā)明通過大量的實驗研究，提供了一種獨特的分離純化藜蘆生物堿的方法。本方法采用冷浸提取的方法，結合藜蘆生物堿的理化性質，通過多次酸化后再堿化游離的方法，對藜蘆生物堿進行分離純化，并運用了萃取、樹脂分離及重結晶技術，最終得到了含量高、雜質少、副產物低的藜蘆生物堿。經檢測，采用本發(fā)明提供的技術手段，得到的藜蘆生物堿含量達到80%~98%,本品中的藜蘆生物堿是由原黎蘆堿、乙酰原黎蘆堿、黎蘆生堿、芥芬胺、黎蘆胺，紅玉芥芬胺等成分組成的藜蘆總生物堿。
[0009]在申請?zhí)?200510025582.X名為《藜蘆生物堿在治療腫瘤方面的應用》的發(fā)明專利中公開了藜蘆生物堿在制備治療腫瘤藥物中的應用，該專利中只是請求對藜蘆生物堿的應用及作用機理進行保護，而未提及藜蘆生物堿的制備方法。藜蘆生物堿在抗腫瘤方面的應用研究在相關文獻方面報道已經很多，因此申請其應用保護顯然不合理。
[0010]在申請?zhí)枮?00910052376.6名為《高純度藜蘆胺和介芬胺的制備方法》的專利中，提供了一種高純度藜蘆胺(VERATRAMINE)和介芬胺(JERVINE)的制備方法。該方法將藜蘆藥材原料粉碎、乙醇回流提取、大孔吸附樹脂富集、層析柱精制等步驟，最終制成高純度的藜蘆胺和介芬胺。本專利內容是針對藜蘆中諸多生物堿中的兩種進行分離純化，雖然該專利中沒有明確指出最終產品的得率，由于在制備過程中多次使用了加熱提取和濃縮等步驟，其得率也必將很低。此外其專利申請保護的目標產物與本發(fā)明的目標產物也有本質的不同。
[0011]在申請?zhí)枮?01110363836.4名為《高純度甾體生物堿計明胺的制備方法》中，公開了一種藜蘆生物堿計明胺的制備方法。該方法采用了水解法經過一系列工藝制備計明胺生物堿，其制備工藝中不但采用了加熱回流提取的方式，而且使用了乙醚、氯仿等易爆、毒性溶劑，在實際生產中有很大風險和危害，此外其申請保護的目標產物與本發(fā)明專利目標產物也有本質不同。
[0012]綜上，本發(fā)明提供的制備工藝生產出的藜蘆生物堿具有保留了藜蘆本身生物堿多樣性的特征，制備過程中最大程度避免了活性成分的破壞和損失，所以具有得率高、生產成本低等優(yōu)勢。

【發(fā)明內容】

[0013]本發(fā)明提供了一種制備藜蘆生物堿的方法。
[0014]本發(fā)明的目的是根據藜蘆生物堿的理化性質，采用酸性溶劑洗脫提取、堿性條件下萃取，再對藜蘆生物堿進行充分富集，最后結合運用離子交換的原理，生產出高含量、低雜質的藜蘆生物堿。
[0015]根據本發(fā)明的比較優(yōu) 選的實施方案，制備藜蘆生物堿方法包括如下步驟:
[0016](I)取藜蘆藥材，粉碎成粗粉，加入含一定pH值的酸性水溶液進行冷浸提取，控制提取溫度、時間和提取次數；
[0017](2)合并提取液、過濾，濾液在攪拌狀態(tài)下加入堿水溶液適量，調節(jié)溶液至一定pH值，再加入適量有機溶劑進行萃取，靜置一段時間，分取有機層；
[0018](3)有機層加水繼續(xù)萃取數次，分離并棄去水層，取有機層；
[0019](4)在有機層中加入適量的一定pH值的酸水溶液，再次進行萃取，靜置，分取水層；
[0020](5)取水層溶液，過一定型號的樹脂柱，上柱完成后，加水充分洗脫去除其它雜質后，改用一定濃度堿性水溶液洗脫，收集洗脫液，冷卻至一定溫度，靜置，過濾，得藜蘆生物喊粗品；
[0021](6)取藜蘆生物堿粗品，加入適量含水有機溶劑，攪拌，靜置結晶，過濾，干燥，即得藜蘆生物堿。
[0022]上述步驟(1)中所述的“酸性水溶液”是指含有一定量鹽酸或硫酸的水溶液，pH值范圍為2.5~3.5 ;提取的溫度為5~25°C。溫度過低，則提取率較低，溫度過高，則藜蘆生物堿會產生較大的分解破壞，產生大量副產物。本提取方法是根據藜蘆生物堿易溶于酸性水溶液中的原理，因此采用酸性水冷浸提取既可以保證藜蘆生物堿被充分提取出來，又避免了加熱產生的破壞，同時不再使用有機溶劑，大大減少了生產成本。
[0023]上述步驟(2)中所用的堿水溶液是指氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀或碳酸氫鈉的水溶液，優(yōu)選為2%的碳酸氫鈉水溶液；溶液的pH值為7.5~9.5,優(yōu)選為8.5 ;萃取所用的溶劑為乙酸乙酯或正丁醇，優(yōu)選為乙酸乙酯。本步驟是根據藜蘆生物堿在PH值大于7.5時易溶于有機溶劑而可以被萃取的原理，將藜蘆生物堿轉溶至有機溶劑中，而其他水溶性雜質難溶于有機溶劑，從而達到初步純化的效果。
[0024]上述步驟⑶中所用加水量為有機溶劑體積的0.2~I倍量，萃取的次數為I~3次，優(yōu)選2次。本步驟主要是通過多次萃取，可以將水溶性雜質充分分離去除，達到進一步除雜的效果。
[0025]上述步驟(4)中萃取所用一定PH值的酸水溶液是指含有一定量鹽酸或硫酸的水溶液，其PH值范圍為5.5~6.5 ;本步驟主要是通過在弱酸性條件下，再次將藜蘆生物堿萃取至水層中，不但去除了部分小極性水溶性雜質，同時也為下一步過柱做好準備。
[0026]上述步驟(5)中所用的“一定型號的樹脂柱”為離子交換樹脂柱，其型號可以為D061、NKC-9和D001SS，優(yōu)選D061 ;—定濃度的堿性水溶液是指濃度為0.1%~1%的氨水溶液、氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀的水溶液，優(yōu)選為0.5%的氫氧化鈉水溶液；結晶的溫度為O~20°C，優(yōu)選為4°C，溫度過高則很難結晶或結晶不充分，溫度過低則析出雜質較多。
[0027]上述步驟(6)中，“含水有機溶劑”是指濃度為10%~40%的乙醇一水、甲醇--水或丙酮一水溶液，優(yōu)選15%~20%。有機溶劑濃度太低，則結晶純化作用不明顯，有機溶劑濃度過高則產品得率低。溶劑的用量為藜蘆生物堿重量的3~8倍量，優(yōu)選4~6倍量。
[0028]本發(fā)明通過科學可行的方法以藜蘆藥材為原料，經過提取、萃取、上柱、結晶等一系列步驟，特別是根據藜蘆生物堿具有熱不穩(wěn)定、在不同PH條件下溶解性有較大差異的性質，將藜蘆生物堿進行科學合理分離純化，巧妙的制備出藜蘆生物堿。
[0029]本發(fā)明的優(yōu)勢在于按照本發(fā)明提供的工藝安全合理，在藜蘆生物堿的過程中，沒有采用加熱工序，不但在最大程度上保證生物堿被充分提取分離，同時減少了由于加熱情況下造成的產品活性成分的破壞和副產物的產生，提高了產品的得率和安全性。
[0030]根據上述技術方案，得到的藜蘆生物含量達到80%~98%。
[0031]本發(fā)明提供的技術方案經多批工業(yè)化生產驗證，工藝穩(wěn)定性、重復性好，質量可控，具有很強的實用性。
【具體實施方式】
[0032]下列實施例旨在進一步舉例描述本發(fā)明，不應理解為對本發(fā)明范圍的限制。
[0033]實施例1
[0034](I)取藜蘆藥材5kg，粉碎成粗粉，分別加入pH值為3.0的的鹽酸水溶液25L進行冷浸提取，提取溫度為25°C，提取2次，每次3小時。
[0035](2)合并提取液、過濾，濾液在攪拌狀態(tài)下加入為2%的碳酸氫鈉水溶液調節(jié)溶液至pH至8.5，再加入15L 乙酸乙酯進行萃取，靜置I小時，分取乙酸乙酯層。
[0036](3)在乙酸乙酯中加水分別5L萃取2次，分離并棄去水層，取乙酸乙酯層。
[0037](4)在乙酸乙酯中加入pH值為6的鹽酸水溶液IOL進行萃取，靜置，分取水層。
[0038](5)取水層溶液，過型號為D061的樹脂柱，上柱完成后，加水25L洗脫后，改用0.5 %的氫氧化鈉水溶液洗脫，收集洗脫液，冷卻至4°C，靜置，過濾，得藜蘆生物堿粗品610go
[0039](6)取上述藜蘆生物堿粗品，加入到3L濃度為15%的乙醇-水溶劑中，攪拌，靜置結晶，過濾，干燥，即得藜蘆生物堿310g。
[0040]經檢測，上述藜蘆生物堿的含量為98.0%。
[0041]實施例2
[0042](I)取藜蘆藥材10kg，粉碎成粗粉，分別加入pH值為3.5的的鹽酸水溶液45L進行冷浸提取，提取溫度為15°C，提取2次，每次2小時。
[0043](2)合并提取液、過濾，濾液在攪拌狀態(tài)下加入為I %的氫氧化鈉水溶液調節(jié)溶液至pH至9.0，再加入30L正丁醇進行萃取，靜置2小時，分取正丁醇層。
[0044](3)正丁醇中加水分別加水IOL萃取3次，分離并棄去水層，取正丁醇層。
[0045](4)在有機層中加入pH值為5.5的硫酸水溶液15L進行萃取,靜置,分取水層。
[0046](5)取水層溶液，過型號為D001SS的樹脂柱，上柱完成后，加水30L洗脫后，改用0.8%的氨水溶液洗脫，收集洗脫液，冷卻至10°C，靜置，過濾，得藜蘆生物堿粗品950g。
[0047](6)取上述藜蘆生物堿粗品，加入到5.7L濃度為20%的丙酮-水溶劑中，攪拌，靜置結晶，過濾，干燥，即得藜蘆生物堿466g。
[0048]經檢測，上述藜蘆生物堿的含量為92.1 %。
[0049]實施例3
[0050](I)取藜蘆藥材10kg，粉碎成粗粉，分別加入pH值為2.5的的硫酸水溶液50L進行冷浸提取，提取溫度為25°C，提取3次，每次2小時。
[0051](2)合并提取液、過濾，濾液在攪拌狀態(tài)下加入為0.8%的氫氧化鉀水溶液調節(jié)溶液至PH至7.5，再加入25L乙酸乙酯進行萃取，靜置2小時，分取乙酸乙酯層。
[0052](3)乙酸乙酯中加水分別加水8L萃取2次，分離并棄去水層，取乙酸乙酯層。
[0053](4)在有機層中加入pH值為6.5的硫酸水溶液IOL進行萃取,靜置,分取水層。
[0054](5)取水層溶液，過型號為NKC-9的樹脂柱，上柱完成后，加水20L洗脫后，改用0.5%的氫氧化鉀溶液洗脫，收集洗脫液，冷卻至2°C，靜置，過濾，得藜蘆生物堿粗品860g。
[0055](6)取上述藜蘆生物堿粗品，加入到5.16L濃度為20%的甲醇-水溶劑中，攪拌，靜置結晶，過濾，干燥，即得藜蘆生物堿419g。
[0056]經檢測，上述藜蘆生物堿的含量為85.2%。
【權利要求】
1.一種藜蘆生物堿的制備方法，由以下幾步組成: (1)取藜蘆藥材，粉碎成粗粉，加入含一定PH值的酸性水溶液進行冷浸提取，控制提取溫度、時間和提取次數； (2)合并提取液、過濾，濾液在攪拌狀態(tài)下加入堿水溶液適量，調節(jié)溶液至一定pH值，再加入適量有機溶劑進行萃取，靜置一段時間，分取有機層； (3)有機層加水繼續(xù)萃取數次，分離并棄去水層，取有機層； (4)在有機層中加入適量的一定pH值的酸水溶液，再次進行萃取，靜置，分取水層； (5)取水層溶液，過一定型號的樹脂柱，上柱完成后，加水充分洗脫去除其它雜質后，改用一定濃度堿性水溶液洗脫，收集洗脫液，冷卻至一定溫度，靜置，過濾，得藜蘆生物堿粗品; (6)取藜蘆生物堿粗品，加入適量含水有機溶劑，攪拌，靜置結晶，過濾，干燥，即得藜蘆生物堿。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的“酸性水溶液”是指含有一定量鹽酸或硫酸的水溶液，PH值范圍為2.5~3.5 ;提取的溫度為5~25°C。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所用的堿水溶液是指氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀或碳酸氫鈉的水溶液，優(yōu)選為2 %的碳酸氫鈉水溶液；溶液的PH值為7.5~9.5，優(yōu)選為8.5 ;萃取所用的溶劑為乙酸乙酯或正丁醇，優(yōu)選為乙酸乙酯。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中所用加水萃取的次數為I~3次，優(yōu)選2次。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(4)中萃取所用一定pH值的酸水溶液是指含有一定量鹽酸或硫酸的水溶液，其PH值范圍為5.5~6.5。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)中所用的“一定型號的樹脂柱”為離子交換樹脂柱，其型號可以為D061、NKC-9和D001SS，優(yōu)選D061 定濃度的堿性水溶液是指濃度為0.1%~I %的氨水溶液、氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀的水溶液,優(yōu)選為0.5%的氫氧化鈉水溶液；結晶的溫度為O~20°C，優(yōu)選為4°C。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于上述步驟(6)中“含水有機溶劑”是指濃度為10%~40%的乙醇一水、甲醇一水或丙酮一水溶液，優(yōu)選15%~20% ;溶劑的用量為藜蘆生物堿重量的3~8倍量,優(yōu) 選4~6倍量。
【文檔編號】A61K36/896GK103520431SQ201210228703
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年7月4日 優(yōu)先權日:2012年7月4日
【發(fā)明者】楊永安, 鐘慧, 金顯友, 易銘, 魏元剛, 袁繼文, 黃全書, 季浩 申請人:江蘇天晟藥業(yè)有限公司