專利名稱：一種靶向銀杏內(nèi)酯b固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種靶向血腦屏障的銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
阿爾茲海默癥(AD)是一種常見的老年慢性退行性神經(jīng)疾病，患者腦組織萎縮，特別是海馬和基底前神經(jīng)元脫失。阿爾茲海默癥患者具有兩大病理特征形成了核心成分為 β-淀粉蛋白(Αβ)的細胞外老年斑(SP)，形成以過度磷酸化的Tau蛋白為主要成分的病變神經(jīng)元內(nèi)纖維纏結(jié)(NFTs)。病理學(xué)家推測兩種病理特征最終引起神經(jīng)元/軸突障礙或軸突死亡，從而導(dǎo)致腦細胞凋亡最終產(chǎn)生癡呆癥狀。目前被FDA和歐洲醫(yī)藥評價署批準用于治療AD的藥物只有5種。其中4種是乙酰膽堿酯酶抑制藥(AChEI)，這類藥物的作用是可以彌補AD患者腦中丟失膽堿能神經(jīng)元所造成的功能性后果。銀杏內(nèi)酯是從銀杏中提取出的一類萜類內(nèi)酯類活性化合物，主要成分包括銀杏內(nèi)酯Α、B、C、J、M、K、L，白果內(nèi)酯等，其中以銀杏內(nèi)酯B (GB)的活性最強。銀杏內(nèi)酯B是通過提高乙酰膽堿酯酶(AChE)活性從而促進乙酰膽堿合成，而提高腦中乙酰膽堿含量，彌補AD 患者腦中丟失膽堿能神經(jīng)元所造成的功能性后果，達到抵抗AD的功效，銀杏內(nèi)酯還具有以下作用一是具有類似于腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，可以促進胚基底前腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)育。二是具有類似于神經(jīng)生長因子的作用，可有效抑制基底前腦膽堿能神經(jīng)元凋亡及對皮層神經(jīng)元凋亡的保護作用。本發(fā)明設(shè)想使用銀杏內(nèi)酯B作為治療阿爾茲海默癥的藥物，但是要將GB有效運輸至腦細胞內(nèi)有以下兩大障礙首先銀杏內(nèi)酯B為脂溶性藥物，不溶于水的特性限制了其體內(nèi)吸收分布特性，并且GB在體內(nèi)的半衰期只有2 3小時，如果單純以口服或溶液劑注射給藥方式，藥物無法大量有效的到達并且蓄積在腦組織。其次血腦屏障(BBB)是大腦的天然屏障，其細胞間特有的緊密連接有效的阻止了外源性物質(zhì)進入腦細胞，包括藥物或包裹了藥物的藥物遞送系統(tǒng)。而物質(zhì)透過BBB主要通過以下5中途徑(I)親水小分子通過緊密連接的被動轉(zhuǎn)運；(2)親脂物質(zhì)的跨胞轉(zhuǎn)運；(3)轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)運葡萄糖、氨基酸、膽堿等小分子營養(yǎng)物質(zhì)；(4)受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)等大分子多肽；(5)通過靜電作用力吸附陽離子物質(zhì)后胞吞入腦。為解決上述所描述的問題，本專利發(fā)明一種靶向BBB的銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，優(yōu)勢在于固體脂質(zhì)納米粒的骨架內(nèi)核為脂質(zhì)材料，可有效與銀杏內(nèi)酯B融合，且生物相容性佳，解決藥物吸收差問題。固體脂質(zhì)納米粒外殼選用泊羅沙姆 (Pluronic)等表面活性劑，Pluronic長鏈中含有聚氧乙烯基團,其柔性親水特性能避免載藥固體脂質(zhì)納米粒被體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，延長其在體循環(huán)中的時間，解決藥物在體內(nèi)停留時間短的問題。血腦屏障上有介導(dǎo)葉酸以及其體內(nèi)活性形態(tài)四氫葉酸的受體存在，選擇葉酸作為靶向配基修飾泊羅沙姆兩端，利用其和大腦內(nèi)皮細胞上葉酸受體的親和力，使整個固體脂質(zhì)納米?？梢酝ㄓ纱竽X細胞表面葉酸受體介導(dǎo)作用胞吞入腦。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對由于血腦屏障對外源性物質(zhì)的抵御作用而導(dǎo)致的藥物無法進入腦組織，從而腦部疚病無法得到有效治療的問題，設(shè)計了一種葉酸靶向材料修飾的載藥固體脂質(zhì)納米粒，利用大腦內(nèi)皮細胞表面的葉酸受體特異性識別葉酸配基和受體介導(dǎo)的吞噬作用，以及脂性的納米粒材料與大腦細胞膜親和力強和納米粒吞噬透膜途徑，幫助載藥固體脂質(zhì)納米粒有效進入腦內(nèi)發(fā)揮藥效。本發(fā)明提供了以葉酸修飾的乳化劑作為靶向材料(或靶向乳化劑)，脂質(zhì)材料作為載體的一種載銀杏內(nèi)酯B的固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，具體制備過程是(I)將脂質(zhì)材料與靶向乳化劑混合，水浴加熱至50 80°C至熔融。(2)將藥物完全溶解在適量的甲醇、二氯甲烷、丙酮、氯仿之一或任意組合的有機溶劑中。(3)將藥物溶液傾倒入(I)中，保溫攪拌，直至溶劑揮發(fā)完全，此時藥物已經(jīng)很好的融合在液態(tài)脂質(zhì)中。(4)將水溶性物質(zhì)(如普通乳化劑)溶解在注射用水中，加熱至50 80°C(5)將(4)傾倒入等溫(3)中，50 80°C條件下攪拌2 4小時，形成初乳。(6)將(5)形成的初乳進行高速分散，得到熔融的固體脂質(zhì)納米粒，迅速將熔融的固體脂質(zhì)納米粒用冰水浴冷卻，繼續(xù)攪拌5 50min直至完全固化。(7)將(6)的固體脂質(zhì)納米粒擠壓通過O. 8 μ m微孔濾膜5遍,得粒徑80 200nm 的革巴向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒溶液。藥物是銀杏內(nèi)酯B，但不局限于此，藥物還可以是銀杏內(nèi)酯A、C、J、M、K、L和白果內(nèi)酯以及它們的組合物。靶向乳化劑為合成的葉酸-泊羅沙姆(FA-Pluronic)，葉酸-磷脂或其他葉酸修飾的具有表面活性的乳化劑。脂質(zhì)材料可以是單取代、雙取代、三取代的脂肪酸(硬脂酸、棕櫚酸、山崳酸、月桂酸等)甘油酯，脂肪酸或其他脂質(zhì)中的一種或幾種混合物。藥物與脂質(zhì)材料的質(zhì)量比在I : 10 I : 50之間，優(yōu)選I : 20;祀向乳化劑與普通乳化劑的質(zhì)量比在I : 2 I : 5之間，優(yōu)選2 3 ;脂質(zhì)材料與全部乳化劑的質(zhì)量比在 I : 2 2 : I之間，優(yōu)選2 I ;藥物與注射用水的用量的質(zhì)量體積比為I : 2 2 : 1， 優(yōu)選I : 2。高速分散的轉(zhuǎn)速可以在5000 100000轉(zhuǎn)/分鐘之間，時間在4 10分鐘之間， 優(yōu)選7500轉(zhuǎn)/分鐘，時間4 6分鐘。本發(fā)明提供了一種靶向血腦屏障的銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，其中使用合成的葉酸修飾的乳化劑為靶向乳化劑，制得的靶向固體脂質(zhì)納米粒用光散射粒度儀測得粒徑在80 200nm之間，用原子力顯微鏡觀察結(jié)果顯示為類球形或橢圓形(見附圖 I)。該固體脂質(zhì)納米粒被含有聚氧乙烯鏈段的泊羅沙姆包裹，能避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬， 有效延長藥物在體內(nèi)循環(huán)時間。納米粒外側(cè)的葉酸配基可被腦上皮細胞的葉酸受體識別， 包裹藥物的脂性材料與細胞膜親和力強，幫載藥納米粒通過受體介導(dǎo)吞噬和納米粒吞噬途徑透膜進入細胞內(nèi)，從而達到治療腦部疾病的目的。


圖I是一種靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒原子力顯微鏡圖。圖2是葉酸修飾的泊羅沙姆的核磁1H圖譜圖3是圖I中化學(xué)位移在4. 5ppm-8. 5ppm局部峰位放大圖
具體實施例方式通過下面實施例說明本發(fā)明的具體實施方式
，但本發(fā)明的保護范圍，不局限于此。實施例IFA-PluronicF68的合成⑴I. 15g對甲苯磺酰氯(TsCl)和800 μ I三乙胺置于三頸燒瓶中，加入適量無水二氯甲烷溶解。將溶有5. 00gPluronicF68的二氯甲烷溶液逐滴加入其中，室溫氮氣保護條件下磁力攪拌反應(yīng)12小時。產(chǎn)物濃縮之后沉淀于適量冰乙醚中， 抽濾得沉淀物。重復(fù)溶解沉淀兩次，沉淀物真空干燥24小時，得到F68-0TS。(2)取鄰苯二甲酰亞胺鉀(PI)O. 91g置于三口燒瓶中，加適量無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，120°C， 攪拌分散溶解；向其中滴加入溶有4. 00gF68-0Ts的DMF溶液，120°C，氮氣保護下反應(yīng)6小時。產(chǎn)物旋蒸除去DMF之后，加適量無水二氯甲烷超聲溶解，離心除去其中的不溶物質(zhì)，重復(fù)三次，合并上清液。濃縮之后沉淀于適量冰乙醚中，抽濾得沉淀物。重復(fù)溶解-沉淀兩次，沉淀物室溫下真空干燥24小時得到F68-PI。(3)取250 μ I水合肼置于三頸燒瓶中，用適量無水乙醇溶解，向其中逐漸滴加溶有2. 61gF68-PI的乙醇溶液，80°C、氮氣保護下反應(yīng) 12小時。濃縮產(chǎn)物，將其沉淀于適量無水冰乙醚中，抽濾得沉淀物。重復(fù)乙醇溶解-乙醚沉淀兩次，沉淀物室溫下真空干燥24小時得到F68-NH2。(4)取葉酸O. 30g, N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)O. 115g，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)O. 15g置于三頸燒瓶中，用適量二甲基亞砜溶解，氮氣保護避光條件，室溫下反應(yīng)2小時對葉酸進行活化。加入2. 00gF68-NH2，避光反應(yīng) 12小時。產(chǎn)物用攔截分子量3500Da的透析袋透析I天，初始I小時換水一次，3次之后改為3小時換水一次。I天之后將透析液離心，舍棄沉淀物(包括未被透出的葉酸以及二環(huán)己脲)，取上清液再透析一天，4小時換水一次。直接冷凍干燥即得，經(jīng)核磁1H表征產(chǎn)物為 FA-PluronicF68(見附圖 2，附圖 3)。實施例2靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒的制備取150mg單硬脂酸甘油酯、 30mgFA-PluronicF68水浴加熱至60°C至熔融，將溶有7. 5mg銀杏內(nèi)酯B的甲醇溶液逐漸滴加進去，保持60°C，磁力攪拌2h，使得藥物與脂質(zhì)材料混合均勻，直到甲醇揮盡。加入15ml 加熱至60°C的溶解有45mgPluronicF68的水溶液，磁力攪拌2h得到初乳，60°C，7500r/min 高速分散初乳6min,立即放置到4°C的冰水浴中固化5min成型,擠壓過O. 8 μ m濾膜5遍, 得到靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒溶液。粒徑大小為125. 8nm,多分散系數(shù)O. 380。實施例3靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒的制備取150mg單硬脂酸甘油酯、 30mgFA-PluronicF68水浴加熱至80攝氏度至熔融，將溶有7. 5mg銀杏內(nèi)酯B的甲醇溶液逐漸滴加進去，保持80°C，磁力攪拌2h，使得藥物與脂質(zhì)材料混合均勻，直到甲醇揮盡。加入15ml加熱至80°C的溶解有45mgPluronicF68的水溶液，磁力攪拌2h得到初乳，80°C，7500r/min高速分散初乳6min，立即放置到4°C的冰水浴中固化5min成型，擠壓過O. 8 μ m 濾膜5遍，得到靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒溶液。粒徑大小為125.4nm，多分散系數(shù) O.319。實施例4靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒的制備取150mg單硬脂酸甘油酯、 30mgFA-PluronicF68水浴加熱至80攝氏度至熔融，將溶有5. Omg銀杏內(nèi)酯B的甲醇溶液逐漸滴加進去，保持80°C，磁力攪拌2h，使得藥物與脂質(zhì)材料混合均勻，直到甲醇揮盡。加入IOml加熱至80°C的溶解有40mgPluroniCF68的水溶液，磁力攪拌2h得到初乳，80°C， 10000r/min高速分散初乳4min，立即放置到4°C的冰水浴中固化5min成型，擠壓過O. 8 μ m 濾膜5遍，得到靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒溶液。粒徑大小為146.5nm，多分散系數(shù) O. 279。
權(quán)利要求
1.一種靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，其特征在于該靶向脂質(zhì)納米粒處方包含藥物、脂質(zhì)材料、普通乳化劑、葉酸修飾的乳化劑(靶向乳化劑)及注射用水；制備工藝包括①將脂質(zhì)材料和靶向乳化劑，攪拌加熱至50 80°C熔融，在保溫攪拌條件下加入溶于少量有機溶劑的藥物溶液，直至溶劑揮發(fā)完全，形成均勻藥物脂質(zhì)溶液，②將普通乳化劑溶解在注射用水中，加熱至50 80°C，③將②傾倒入等溫的①中，50 80°C條件下繼續(xù)攪拌2 4小時，形成初乳，再進行高速分散，得到熔融的固體脂質(zhì)納米粒，④迅速將上述熔融的固體脂質(zhì)納米粒在攪拌下用冰水浴冷卻5 50min，直至完全固化，⑤將固化的脂質(zhì)納米粒擠壓過O. 8 μ m濾膜5遍,得到祀向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，其特征在于藥物是銀杏內(nèi)酯8，但不局限于此，藥物還可以是銀杏內(nèi)酯么、(、1、1、1(、1^和白果內(nèi)酯以及它們的組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，其特征在于脂質(zhì)材料可以是單取代、雙取代、三取代的脂肪酸(硬脂酸、棕櫚酸、山崳酸、月桂酸等) 甘油酯，脂肪酸或其他脂質(zhì)(如膽固醇)中的一種或幾種混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種銀杏內(nèi)酯B靶向固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，其特征在于普通乳化劑可以是各種型號泊羅沙姆，磷脂和其他具有表面活性的乳化劑(如吐溫、膽酸鈉)中的一種或幾種組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，其特征在于葉酸修飾的乳化劑為靶向材料，具體為合成的葉酸-泊羅沙姆(FA-Pluronic)、葉酸-磷脂或其他葉酸修飾的具有表面活性的乳化劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，其特征在于處方中藥物與脂質(zhì)材料的質(zhì)量比在I : 10 I : 50之間，優(yōu)選I : 20;祀向乳化劑與普通乳化劑的質(zhì)量比在I : 2 I : 5之間，優(yōu)選2 3 ;脂質(zhì)材料與全部乳化劑的質(zhì)量比在I: 2 2 : I之間，優(yōu)選2 I ;藥物與注射用水的用量的質(zhì)量體積比為I : 2 2 : 1， 優(yōu)選I : 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法，其特征在于制備工藝①中的有機溶劑可以是甲醇、二氯甲烷、丙酮、氯仿之一或任意組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒的制備方法，其特征在于制備工藝③中高速分散的轉(zhuǎn)速可以在5000 100000轉(zhuǎn)/分鐘之間，時間在4 10分鐘之間，優(yōu)選7500轉(zhuǎn)/分鐘，時間4 6分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種靶向銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒及其制備方法。以銀杏內(nèi)酯B為治療藥物，固體脂質(zhì)材料為載體，葉酸修飾的表面活性劑作為靶向材料，表面活性劑和葉酸修飾的表面活性劑以一定比例混合物作為乳化劑，用水包油乳化法制得靶向血腦屏障的銀杏內(nèi)酯B固體脂質(zhì)納米粒。粒徑為80～200nm，多分散系數(shù)0.30±0.10。該固體脂質(zhì)納米粒利用腦細胞表面的葉酸受體介導(dǎo)的吞噬作用和納米粒吸附腦細胞膜的吞噬途徑，達到腦靶向的作用。
文檔編號A61P25/28GK102579342SQ20121003450
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者欒立標, 胡娟 申請人:中國藥科大學(xué)