用于偶聯(lián)水溶性脂肪酸衍生物與蛋白質(zhì)的材料和方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于偶聯(lián)水溶性脂肪酸衍生物與蛋白質(zhì)的材料和方法。發(fā)明背景多種分子和/或化合物已描述用于偶聯(lián)于治療蛋白質(zhì)以便增加所偶聯(lián)蛋白質(zhì)在施用于患者后的半衰期(VeroneseFM和MeroA，BioDrugs2008；22：315-29；GregoriadisG等，IntJPharm2005；300：125-30；和ShechterY等；InternationalJournalofPeptideResearchandTherapeutics2007；第13卷：105-17)?？梢詫⒅舅?FA)偶聯(lián)于治療蛋白質(zhì)以形成長效衍生物。延長蛋白質(zhì)或肽半衰期的此原理是基于FA可以結(jié)合人血清白蛋白(HSA；也稱為白蛋白結(jié)合探針)的實情。FA與血流中人血清白蛋白的締合可以使治療蛋白質(zhì)的半衰期獲得實質(zhì)性延長，這是因為其將隨白蛋白一起通過新生兒Fc受體進行再循環(huán)。FA和其衍生物(例如相應(yīng)甲酯)顯示類似的白蛋白結(jié)合性質(zhì)(SpectorAA，JLipidRes1975；16：165-79)。此長效原理的一個著名實例為來自NovoNordisk的地特胰島素(insulindetemir)。在地特胰島素中，F(xiàn)A的羧基共價偶合于胰島素蛋白質(zhì)的賴氨酸的ε-氨基(參見例如US5,866,538；US6,011,007；和US6,869,930)。其它研究組已描述了類似方法(ShechterY等，BioconjChem2005；16：913-20；和SassonK等，JControlRelease2010；142：214-20)。舉例來說，這些研究組描述了含有活性NHS酯以供與蛋白質(zhì)的氨基偶合的可釋放FMOC系統(tǒng)。然而差異在于，在此構(gòu)想中，F(xiàn)A通過ω-位上的官能團連接于蛋白質(zhì)，由此使羧基保持完整。因此，可以制備與人血清白蛋白結(jié)合但隨時間解離的長效前藥，因為FMOC系統(tǒng)在生理條件下會經(jīng)歷緩慢水解(SassonK等，JControlRelease2010；142：214-20)。除脂肪酸外，還可以利用多種化學(xué)方法通過在水溶性聚合物與治療蛋白質(zhì)之間形成共價鍵來制備偶聯(lián)物。多肽藥物的聚乙二醇化在循環(huán)中對其進行保護并且改良其藥效學(xué)和藥物動力學(xué)特征(Harris和Chess，NatRevDrugDiscov.2003；2：214-21)。聚乙二醇化過程將乙二醇的重復(fù)單元(聚乙二醇(PEG))連接至多肽藥物。PEG分子具有較大流體動力學(xué)體積(球狀蛋白質(zhì)尺寸的5至10倍)，具有高度水溶性且水合、無毒、不具免疫原性且從身體快速清除。分子的聚乙二醇化可以導(dǎo)致藥物對酶促降解的抗性增強、體內(nèi)半衰期增加、給藥頻率降低、免疫原性降低、物理和熱穩(wěn)定性增強、溶解性增強、液體穩(wěn)定性增強和聚集減少。第一個聚乙二醇化藥物由FDA在二十世紀(jì)九十年代早期批準(zhǔn)。此后，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)了若干種聚乙二醇化藥物用于口服、注射和局部外表施用。聚唾液酸(PSA)也稱為聚乙酰神經(jīng)氨酸(CA)，為天然產(chǎn)生的多糖。其為具有α(2→8)酮苷鍵的N-乙?；窠?jīng)氨酸的均聚物，并且在其非還原末端含有鄰位二醇基。其帶負(fù)電荷且為人體的天然成分。其可以容易地由細菌大量地以預(yù)定物理特征產(chǎn)生(美國專利號5,846,951)。因為細菌產(chǎn)生的PSA在化學(xué)上和在免疫學(xué)上與在人體中產(chǎn)生的PSA相同，因此細菌PSA不具免疫原性，甚至在偶合至蛋白質(zhì)時也是如此。不同于一些聚合物，PSA酸可生物降解。聚乙酰神經(jīng)氨酸與過氧化氫酶(catalase)和天冬酰胺酶(asparaginase)的共價偶合已顯示會增強在蛋白水解酶或血漿存在下的酶穩(wěn)定性。與聚唾液酸化和未修飾天冬酰胺酶的體內(nèi)比較研究揭示，聚唾液酸化增加酶的半衰期(Fernandes和Gregoriadis，IntJPharm.2001；217：215-24)。PEG衍生物與肽或蛋白質(zhì)的偶合由Roberts等綜述(AdvDrugDelivRev2002；54：459-76)。一種用于偶合水溶性聚合物與治療蛋白質(zhì)的方法為通過蛋白質(zhì)的碳水化合物部分來偶聯(lián)聚合物。蛋白質(zhì)中碳水化合物的鄰位羥基(OH)容易被過碘酸鈉(NaIO4)氧化形成活性醛基(Rothfus和Smith，JBiolChem1963；238：1402-10；vanLenten和Ashwell，JBiolChem1971；246：1889-94)。隨后可以通過使用含有例如活性酰肼基的試劑將聚合物偶合至碳水化合物的醛基(WilchekM和BayerEA，MethodsEnzymol1987；138：429-42)。最近的技術(shù)為使用含有氨氧基的試劑，所述氨氧基與醛反應(yīng)形成肟鍵聯(lián)(WO96/40662、WO2008/025856)。描述水溶性聚合物與治療蛋白質(zhì)的偶聯(lián)的其它實例描述于以下文獻中：WO06/071801，其教導(dǎo)氧化馮威勒布蘭德因子(vonWillebrandfactor)中的碳水化合物部分且隨后使用酰肼化學(xué)與PEG偶合；美國公布號2009/0076237，其教導(dǎo)氧化rFVIII且隨后使用酰肼化學(xué)與PEG和其它水溶性聚合物(例如PSA、HES、葡聚糖)偶合；WO2008/025856，其教導(dǎo)氧化不同凝血因子(例如rFIX、FVIII和FVIIa)且隨后使用氨氧基化學(xué)通過形成肟鍵聯(lián)與例如PEG偶合；和美國專利號5,621,039，其教導(dǎo)氧化FIX且隨后使用酰肼化學(xué)與PEG偶合。盡管存在上述用于蛋白質(zhì)偶聯(lián)的材料和方法，但仍需要例如允許操縱和制備穩(wěn)定蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的新穎材料和方法。雖然脂肪酸可以提供結(jié)合HSA的益處，但脂肪酸通常在水性環(huán)境中難以操作并且可能隨時間從其蛋白質(zhì)結(jié)合搭配物釋放或移除。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于偶聯(lián)聚合物和水溶性脂肪酸衍生物與蛋白質(zhì)的材料和方法，此舉改良蛋白質(zhì)的藥效學(xué)和/或藥物動力學(xué)性質(zhì)，同時使與各種試劑相關(guān)的成本和患者接受者的健康風(fēng)險降至最低，其中偶聯(lián)反應(yīng)是由親核性催化劑催化。本發(fā)明提供用于在水溶液中偶聯(lián)水溶性脂肪酸衍生物與蛋白質(zhì)的材料和方法，由此產(chǎn)生穩(wěn)定的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，其中脂肪酸衍生物不隨時間釋放。在本發(fā)明的一個實施方案中，所提供的水溶性脂肪酸衍生物包含脂肪酸或脂肪酸酯連接于水溶性連接子，所述脂肪酸衍生物穩(wěn)定連接于治療蛋白質(zhì)。在另一實施方案中，脂肪酸衍生物在體外或體內(nèi)結(jié)合人血清白蛋白(HSA)。在另一實施方案中，脂肪酸衍生物-治療蛋白質(zhì)偶聯(lián)物相對于天然治療蛋白質(zhì)具有增加的半衰期。在另一實施方案中，前述脂肪酸衍生物包含飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。在一相關(guān)實施方案中，脂肪酸為飽和脂肪酸。在另一實施方案中，脂肪酸為支鏈脂肪酸。預(yù)期脂肪酸衍生物中的脂肪酸具有各種長度。在一個實施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含C10與C24之間的鏈長，包括具有奇數(shù)個碳數(shù)的合成脂肪酸。在一個實施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含選自由以下組成的組的鏈長：C10、C12、C14、C16、C18、C20、C20、C22和C24。在另一實施方案中，脂肪酸具有選自由C14、C16和C18組成的組的鏈長。在另一實施方案中，脂肪酸具有選自由C13、C15和C17組成的組的鏈長。在另一實施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸以所述脂肪酸上選自由以下組成的組的基團連接至水溶性連接子：末端羧基和ω基團。在另一實施方案中，脂肪酸以ω基團連接至水溶性連接子。在另一實施方案中，ω基團是選自由以下組成的組：羥基、氨基、硫基和羧基。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸為16-羥基十六烷酸。在另一實施方案中，提供一種脂肪酸衍生物，其中脂肪酸酯是選自由以下組成的組：甲酯和乙酯。在一個實施方案中，脂肪酸酯為16-羥基十六烷酸甲酯。本發(fā)明中涵蓋各種水溶性連接子。在一個實施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中水溶性連接子包含水溶性聚合物和至少一個連接至治療蛋白質(zhì)的官能團。在一個實施方案中，連接至治療蛋白質(zhì)的官能團能夠賦予負(fù)電荷或正電荷，由此使連接子可溶于水。在另一實施方案中，官能團是選自由以下組成的組：磺酸基、羧基、羥基、氨基、酰氨基、馬來酰亞氨基、氨氧基和酰肼基。在一個實施方案中，官能團為氨氧基。本發(fā)明中涵蓋眾多水溶性聚合物。在一個實施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中作為連接子的整體部分的水溶性聚合物是選自由以下組成的組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基淀粉(HAS)、羥乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、支鏈淀粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚(1-羥甲基亞乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)和磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。在另一實施方案中，水溶性聚合物為PEG。本文中也涵蓋各種長度的水溶性聚合物。在一個實施方案中，提供一種脂肪酸衍生物，其中水溶性聚合物包含選自由以下組成的組的鏈長：O3、O5、O7、O9、O11、O13和O15。在一個實施方案中，提供一種脂肪酸衍生物，其中水溶性連接子是選自由以下組成的組：3-氧雜戊烷-1，5-二氧基胺3，6，9-三氧雜十一烷-1，11-二氧基胺3，6，9，12，15-五氧雜十七烷-1，17-二氧基胺以及3，6，9，12，15，18，21-七氧雜二十三烷-1，23-二氧基胺在本發(fā)明的另一實施方案中，提供一種脂肪酸衍生物，其中脂肪酸衍生物通過肟鍵聯(lián)穩(wěn)定連接至治療蛋白質(zhì)。在另一實施方案中，肟鍵聯(lián)在水溶性連接子上的肟基與治療蛋白質(zhì)上氧化的碳水化合物的醛基之間形成。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供一種脂肪酸衍生物，其中脂肪酸衍生物通過水溶性連接子上的馬來酰亞氨基連接至治療蛋白質(zhì)上的游離巰基而穩(wěn)定連接至治療蛋白質(zhì)。在另一實施方案中，脂肪酸衍生物通過水溶性連接子上的N-羥基琥珀酰亞胺酯連接至治療蛋白質(zhì)上的游離氨基而穩(wěn)定連接至治療蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供一種脂肪酸衍生物，其中脂肪酸衍生物是選自由以下組成的組：a)下式的16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亞氨基)-十六烷酸鈉鹽：以及b)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯：本發(fā)明中涵蓋各種治療蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中治療蛋白質(zhì)是選自由以下組成的組：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、復(fù)合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管位蛋白樣多肽1(ANGPTL1)、血管位蛋白樣多肽2(ANGPTL2)、血管位蛋白樣多肽3(ANGPTL3)、血管位蛋白樣多肽4(ANGPTL4)、血管位蛋白樣多肽5(ANGPTL5)、血管位蛋白樣多肽6(ANGPTL6)、血管位蛋白樣多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-1、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-3、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-4、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-5、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-6、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-7、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-8、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-9、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-10、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-11、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-12、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-13、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-14、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-15、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體IA、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體IB、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體II、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、心臟營養(yǎng)素-1、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體、畸胎癌源性生長因子(cripto)、潛伏蛋白(cryptic)、細胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞趨化因子1、細胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞趨化因子2α、細胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞趨化因子2β、β內(nèi)皮細胞生長因子、內(nèi)皮素1、表皮生長因子、表皮素(epigen)、表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin)、上皮源性嗜中性粒細胞引誘劑、成纖維細胞生長因子4、成纖維細胞生長因子5、成纖維細胞生長因子6、成纖維細胞生長因子7、成纖維細胞生長因子8、成纖維細胞生長因子8b、成纖維細胞生長因子8c、成纖維細胞生長因子9、成纖維細胞生長因子10、成纖維細胞生長因子11、成纖維細胞生長因子12、成纖維細胞生長因子13、成纖維細胞生長因子16、成纖維細胞生長因子17、成纖維細胞生長因子19、成纖維細胞生長因子20、成纖維細胞生長因子21、酸性成纖維細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α1、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α2、生長相關(guān)蛋白、生長相關(guān)蛋白α、生長相關(guān)蛋白β、生長相關(guān)蛋白γ、肝素結(jié)合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝細胞瘤源性生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、角化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體α、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子受體、神經(jīng)生成素、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板源性內(nèi)皮細胞生長因子、血小板源性生長因子、血小板源性生長因子A鏈、血小板源性生長因子AA、血小板源性生長因子AB、血小板源性生長因子B鏈、血小板源性生長因子BB、血小板源性生長因子受體α、血小板源性生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、干細胞因子(SCF)、干細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉(zhuǎn)化生長因子α、轉(zhuǎn)化生長因子β、轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β1.2、轉(zhuǎn)化生長因子β2、轉(zhuǎn)化生長因子β3、轉(zhuǎn)化生長因子β5、潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白I、轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白II、轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白III、胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型纖溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲狀腺素、組織纖溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體化激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、Humira(阿達木單抗(adalimumab))、Prolia(迪諾賽單抗(denosumab))、Enbrel(依那西普(etanercept))、表1中的蛋白質(zhì)、或其生物活性片段、衍生物或變異體。在另一實施方案中，治療蛋白質(zhì)為FVIIa。在另一實施方案中，治療蛋白質(zhì)為FVIII。在另一實施方案中，治療蛋白質(zhì)為FIX。本文也涵蓋制備脂肪酸衍生物的方法。在一個實施方案中，提供一種制備本文所述的脂肪酸衍生物的方法，其包括：a)氧化脂肪酸上的ω-羥基以在所述脂肪酸上產(chǎn)生醛基；和b)使包含活性氨氧基的水溶性連接子與所述醛基偶合以形成穩(wěn)定肟鍵聯(lián)，其中所述脂肪酸衍生物可溶于水。在一個實施方案中，提供前述方法，其中通過選自由以下組成的組的氧化試劑氧化ω-羥基：戴斯馬丁高碘烷試劑(DessMartinperiodinanereagent)、Tempo試劑、利用乙二酰氯/DMSO進行斯文氧化(Swernoxidation)、過釕酸四丙銨(TPAP)、鉻VI試劑，如柯林斯試劑(Collinsreagent)、氯鉻酸吡啶鎓(PCC)和重鉻酸吡啶鎓。在另一實施方案中，氧化試劑為戴斯馬丁高碘烷。在另一實施方案中，提供前述方法，其中脂肪酸為飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。在另一實施方案中，脂肪酸為飽和脂肪酸。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供前述方法，其中脂肪酸為支鏈脂肪酸。根據(jù)另一實施方案，也提供前述方法，其中脂肪酸包含C10與C24之間的鏈長，包括具有奇數(shù)個碳數(shù)的合成脂肪酸。在一個實施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含選自由以下組成的組的鏈長：C10、C12、C14、C16、C18、C20、C20、C22和C24。在另一實施方案中，脂肪酸具有選自由C14、C16和C18組成的組的鏈長。在另一實施方案中，脂肪酸具有選自由C13、C15和C17組成的組的鏈長。在另一實施方案中，提供前述方法，其中水溶性連接子包含水溶性聚合物和至少一個氨氧基。本發(fā)明中預(yù)期眾多水溶性聚合物用于前述方法中。在一個實施方案中，提供前述方法，其中水溶性聚合物是選自由以下組成的組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基淀粉(HAS)、羥乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、支鏈淀粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚(1-羥甲基亞乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)和磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。在一個實施方案中，水溶性聚合物為PEG。也涵蓋各種長度的水溶性聚合物。在一個實施方案中，提供前述方法，其中水溶性聚合物包含選自由以下組成的組的鏈長：O5、O7、O9、O11、O13和O15。在另一實施方案中，提供前述方法，其中水溶性連接子是選自由以下組成的組：a)下式的3-氧雜戊烷-1，5-二氧基胺：b)下式的3，6，9-三氧雜十一烷-1，11-二氧基胺：c)下式的3，6，9，12，15-五氧雜十七烷-1，17-二氧基胺：以及d)下式的3，6，9，12，15，18，21-七氧雜二十三烷-1，23-二氧基胺：在另一實施方案中，提供前述方法，其中水溶性連接子為下式的3，6，9-三氧雜十一烷-1，11-二氧基胺：在另一實施方案中，提供前述方法，其中水溶性連接子為下式的3，6，9，12，15-五氧雜十七烷-1，17-二氧基胺：本文中涵蓋制備脂肪酸衍生物的其它方法。在一個實施方案中，提供一種制備前述脂肪酸衍生物的方法，其包括：a)酯化脂肪酸上的羧基以在脂肪酸上產(chǎn)生酯；b)通過在步驟a)的脂肪酸上引入甲磺?；罨舅嵘系摩?羥基；和c)通過取代步驟b)的甲磺?；鶃砼己习钚园毖趸乃苄赃B接子，由此形成穩(wěn)定的氧基胺-亞甲基鍵；其中所述脂肪酸衍生物可溶于水。在一個實施方案中，提供前述方法，其中通過選自由以下組成的組的酯化劑酯化羧基：乙酰氯、酸存在下的甲醇、酸存在下的乙醇、重氮甲烷和碘甲烷。在另一實施方案中，酯化劑為乙酰氯。在另一實施方案中，提供前述方法，其中通過選自由以下組成的組的活化劑活化ω-羥基：甲磺酰氯、甲苯磺酰氯和硝基苯磺酰氯。在一個實施方案中，活化劑為甲磺酰氯。預(yù)期各種脂肪酸可用于前述方法中。在一個實施方案中，提供前述方法，其中脂肪酸為飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。在另一實施方案中，脂肪酸為飽和脂肪酸。在另一實施方案中，脂肪酸為支鏈脂肪酸。在另一實施方案中，提供前述方法，其中脂肪酸包含C10與C24之間的鏈長，包括具有奇數(shù)個碳數(shù)的合成脂肪酸。在一個實施方案中，提供前述脂肪酸衍生物，其中脂肪酸包含選自由以下組成的組的鏈長：C10、C12、C14、C16、C18、C20、C20、C22和C24。在另一實施方案中，脂肪酸具有選自由C14、C16和C18組成的組的鏈長。在另一實施方案中，脂肪酸具有選自由C13、C15和C17組成的組的鏈長。也預(yù)期各種水溶性聚合物可用于前述方法中。在一個實施方案中，提供前述方法，其中水溶性連接子包含水溶性聚合物和至少一個氨氧基。在另一實施方案中，水溶性聚合物是選自由以下組成的組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基淀粉(HAS)、羥乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、支鏈淀粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇?、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚(1-羥甲基亞乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)和磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。在另一實施方案中，水溶性聚合物為PEG。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供前述方法，其中水溶性聚合物包含選自由以下組成的組的鏈長：O3、O5、O7、O9、O11、O13和O15。在另一實施方案中，水溶性連接子是選自由以下組成的組：本發(fā)明中也涵蓋制備偶聯(lián)蛋白質(zhì)的方法。在一個實施方案中，提供一種制備偶聯(lián)治療蛋白質(zhì)的方法，其包括：使治療蛋白質(zhì)上氧化的碳水化合物部分與前述脂肪酸衍生物(或如本文所述的水溶性聚合物)在允許偶聯(lián)的條件下接觸；所述碳水化合物部分通過與包含選自由過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)和過釕酸鉀(KRuO4)組成的組的氧化劑的緩沖液一起孵育而氧化；其中肟鍵聯(lián)在氧化的碳水化合物部分與脂肪酸衍生物上的活性氨氧基之間形成；并且其中肟鍵聯(lián)形成由選自由以下組成的組的親核性催化劑催化：鄰氨基苯甲酸、間氨基苯甲酸、對氨基苯甲酸、對氨基苯磺酸、鄰氨基苯甲酰胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰甲氧基苯胺、間甲氧基苯胺和對甲氧基苯胺。在另一實施方案中，提供前述方法，其中治療蛋白質(zhì)是選自由以下組成的組：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、復(fù)合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、血管位蛋白樣多肽1(ANGPTL1)、血管位蛋白樣多肽2(ANGPTL2)、血管位蛋白樣多肽3(ANGPTL3)、血管位蛋白樣多肽4(ANGPTL4)、血管位蛋白樣多肽5(ANGPTL5)、血管位蛋白樣多肽6(ANGPTL6)、血管位蛋白樣多肽7(ANGPTL7)、玻粘蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-1、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-3、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-4、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-5、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-6、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-7、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-8、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-9、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-10、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-11、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-12、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-13、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-14、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-15、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體IA、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體IB、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體II、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、心臟營養(yǎng)素-1、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體、畸胎癌源性生長因子、潛伏蛋白、細胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞趨化因子1、細胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞趨化因子2α、細胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞趨化因子2β、β內(nèi)皮細胞生長因子、內(nèi)皮素1、表皮生長因子、表皮素、表皮調(diào)節(jié)素、上皮源性嗜中性粒細胞引誘劑、成纖維細胞生長因子4、成纖維細胞生長因子5、成纖維細胞生長因子6、成纖維細胞生長因子7、成纖維細胞生長因子8、成纖維細胞生長因子8b、成纖維細胞生長因子8c、成纖維細胞生長因子9、成纖維細胞生長因子10、成纖維細胞生長因子11、成纖維細胞生長因子12、成纖維細胞生長因子13、成纖維細胞生長因子16、成纖維細胞生長因子17、成纖維細胞生長因子19、成纖維細胞生長因子20、成纖維細胞生長因子21、酸性成纖維細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α1、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α2、生長相關(guān)蛋白、生長相關(guān)蛋白α、生長相關(guān)蛋白β、生長相關(guān)蛋白γ、肝素結(jié)合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝細胞瘤源性生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、角化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體α、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子受體、神經(jīng)生成素、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板源性內(nèi)皮細胞生長因子、血小板源性生長因子、血小板源性生長因子A鏈、血小板源性生長因子AA、血小板源性生長因子AB、血小板源性生長因子B鏈、血小板源性生長因子BB、血小板源性生長因子受體α、血小板源性生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、干細胞因子(SCF)、干細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉(zhuǎn)化生長因子α、轉(zhuǎn)化生長因子β、轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β1.2、轉(zhuǎn)化生長因子β2、轉(zhuǎn)化生長因子β3、轉(zhuǎn)化生長因子β5、潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白I、轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白II、轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白III、胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型纖溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、植物凝集素蓖麻毒素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲狀腺素、組織纖溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體化激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、Humira(阿達木單抗(adalimumab))、Prolia(迪諾賽單抗(denosumab))、Enbrel(依那西普(etanercept))、表1中的蛋白質(zhì)、或其生物活性片段、衍生物或變異體。在另一實施方案中，提供前述方法，其中治療蛋白質(zhì)為FVIIa。在另一實施方案中，提供前述方法，其中治療蛋白質(zhì)為FVIII。在另一實施方案中，提供前述方法，其中治療蛋白質(zhì)為FIX。在另一實施方案中，提供前述方法，其中氧化劑為過碘酸鈉(NaIO4)。在另一實施方案中，提供前述方法，其中親核性催化劑為間甲苯胺。在另一實施方案中，提供前述方法，其進一步包括純化經(jīng)過偶聯(lián)的治療蛋白質(zhì)。在另一實施方案中，提供前述方法，其中通過如本文所述的方法制備脂肪酸衍生物。本發(fā)明還涵蓋制備脂肪酸衍生物的其它方法。在一個實施方案中，提供一種制備前述脂肪酸衍生物的方法，其包括：a)酯化脂肪酸上的羧基以在所述脂肪酸上產(chǎn)生酯；和b)使包含活性馬來酰亞氨基的水溶性連接子與游離巰基(SH)偶合，由此形成穩(wěn)定的硫醚鍵；其中所述脂肪酸衍生物可溶于水。在另一實施方案中，提供一種制備前述脂肪酸衍生物的方法，其包括：a)酯化脂肪酸上的羧基以產(chǎn)生脂肪酸酯；b)使由步驟a)產(chǎn)生的脂肪酸與疊氮試劑反應(yīng)由此產(chǎn)生相應(yīng)脂肪酸疊氮化物；c)氫化步驟b)的脂肪酸疊氮化物以產(chǎn)生相應(yīng)脂肪酸胺；和d)使包含活性NHS基團的水溶性連接子與游離氨基偶合，由此形成穩(wěn)定的鍵；其中所述脂肪酸衍生物可溶于水。圖式圖1示出水溶性連接子3-氧雜戊烷-1，5-二氧基胺的合成。發(fā)明詳述治療蛋白質(zhì)的藥理學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)可以通過利用聚合化合物(如本發(fā)明的脂肪酸和脂肪酸衍生物)進行化學(xué)修飾和偶聯(lián)而得到改良。添加如本文所述的水溶性脂肪酸衍生物為一種改良治療蛋白質(zhì)的性質(zhì)的方法，所述治療蛋白質(zhì)如凝血蛋白質(zhì)因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)或ADAMTS13蛋白酶，以及其它已知蛋白質(zhì)或其生物活性/治療活性片段。治療蛋白質(zhì)在本發(fā)明的某些實施方案中，前述多肽和多核苷酸由以下治療蛋白質(zhì)示例：酶、抗原、抗體、受體、凝血蛋白、生長因子、激素和配體。在某些實施方案中，治療蛋白質(zhì)為凝血蛋白，如因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)或ADAMTS13蛋白酶。在某些實施方案中，治療蛋白質(zhì)為免疫球蛋白、細胞因子，如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、復(fù)合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、血管位蛋白，例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、人血管位蛋白樣多肽ANGPTL1至7、玻粘蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-1、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-3、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-4、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-5、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-6、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-7、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-8、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-9、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-10、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-11、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-12、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-13、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-14、骨型態(tài)發(fā)生蛋白-15、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體IA、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體IB、骨型態(tài)發(fā)生蛋白受體II、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、心臟營養(yǎng)素-1、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體、畸胎癌源性生長因子、潛伏蛋白、細胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞趨化因子1、細胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞趨化因子2α、細胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞趨化因子2β、β內(nèi)皮細胞生長因子、內(nèi)皮素1、表皮生長因子、表皮素、表皮調(diào)節(jié)素、上皮源性嗜中性粒細胞引誘劑、成纖維細胞生長因子4、成纖維細胞生長因子5、成纖維細胞生長因子6、成纖維細胞生長因子7、成纖維細胞生長因子8、成纖維細胞生長因子8b、成纖維細胞生長因子8c、成纖維細胞生長因子9、成纖維細胞生長因子10、成纖維細胞生長因子11、成纖維細胞生長因子12、成纖維細胞生長因子13、成纖維細胞生長因子16、成纖維細胞生長因子17、成纖維細胞生長因子19、成纖維細胞生長因子20、成纖維細胞生長因子21、酸性成纖維細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α1、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α2、生長相關(guān)蛋白、生長相關(guān)蛋白α、生長相關(guān)蛋白β、生長相關(guān)蛋白γ、肝素結(jié)合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝細胞瘤源性生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、角化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體α、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子受體、神經(jīng)生成素、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4、制瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板源性內(nèi)皮細胞生長因子、血小板源性生長因子、血小板源性生長因子A鏈、血小板源性生長因子AA、血小板源性生長因子AB、血小板源性生長因子B鏈、血小板源性生長因子BB、血小板源性生長因子受體α、血小板源性生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、干細胞因子(SCF)、干細胞因子受體、TNF，包括TNF0、TNF1、TNF2、轉(zhuǎn)化生長因子α、轉(zhuǎn)化生長因子β、轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β1.2、轉(zhuǎn)化生長因子β2、轉(zhuǎn)化生長因子β3、轉(zhuǎn)化生長因子β5、潛伏轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白I、轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白II、轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白III、胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型纖溶酶原活化因子受體、血管內(nèi)皮生長因子和嵌合蛋白和其生物活性或免疫學(xué)活性片段。在某些實施方案中，治療蛋白質(zhì)為α-干擾素、β-干擾素和γ-干擾素、集落刺激因子，包括粒細胞集落刺激因子、成纖維細胞生長因子、血小板源性生長因子、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、植物蛋白質(zhì)，如凝集素和蓖麻毒素、腫瘤壞死因子和相關(guān)等位基因、腫瘤壞死因子受體的可溶性形式、白介素受體和白介素受體的可溶性形式、生長因子，如組織生長因子，如TGFα或TGFβ和表皮生長因子、激素、生長調(diào)節(jié)素、色素激素、下丘腦釋放因子、抗利尿激素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、促甲狀腺素、組織纖溶酶原活化因子和免疫球蛋白，如IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體化激素、雌激素、皮質(zhì)類固醇、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、DNA酶、整合素、凝血酶、造血生長因子、瘦素、糖苷酶、Humira(阿達木單抗)、Prolia(迪諾賽單抗)、Enbrel(依那西普)和其片段，或包含任何上述蛋白質(zhì)或其片段的任何融合蛋白。除前述蛋白質(zhì)外，下表1也提供本發(fā)明所涵蓋的治療蛋白質(zhì)：本文提供的治療蛋白質(zhì)不應(yīng)視為排外的。反而是根據(jù)本文提供的揭示內(nèi)容顯而易見，本發(fā)明的方法適用于根據(jù)本發(fā)明需要連接水溶性脂肪酸衍生物的任何蛋白質(zhì)。舉例來說，治療蛋白質(zhì)描述于US2007/0026485中，所述文獻以引用的方式整體并入本文。凝血蛋白在一個方面中，本發(fā)明的起始材料為凝血蛋白，其可以來源于人血漿，或通過重組工程改造技術(shù)產(chǎn)生，如以下專利中所述：美國專利號4,757,006；美國專利號5,733,873；美國專利號5,198,349；美國專利號5,250,421；美國專利號5,919,766；和EP306968。如凝血蛋白等治療蛋白質(zhì)由蛋白水解酶快速降解并且由抗體中和，所述凝血蛋白包括因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)和ADAMTS13蛋白酶。這種現(xiàn)象縮短其半衰期和循環(huán)時間，由此限制其治療效果。相對較高的劑量和頻繁施用為達到和維持這些治療凝血蛋白的所要治療或預(yù)防作用所必需。因此，難以獲得充分的劑量調(diào)節(jié)并且需要頻繁靜脈內(nèi)施用對患者的生活方式造成限制。如本文所述，本發(fā)明涵蓋凝血蛋白，包括(但不限于)因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)和ADAMTS13蛋白酶。如本文所用，術(shù)語“凝血蛋白”是指顯示出與特定天然凝血蛋白相關(guān)的生物活性的任何因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威勒布蘭德因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)和ADAMTS13蛋白酶。凝血級聯(lián)分為三個不同區(qū)段：內(nèi)源性、外源性和共同途徑(Schenone等，CurrOpinHematol.2004；11：272-7)。所述級聯(lián)涉及一系列絲氨酸蛋白酶(酶原)和蛋白質(zhì)輔因子。需要時，非活性酶原前驅(qū)體轉(zhuǎn)化為活性形式，其隨后轉(zhuǎn)化級聯(lián)中的下一個酶。內(nèi)源性途徑需要凝血因子VIII、IX、X、XI和XII。內(nèi)源性途徑的起始發(fā)生于前激肽釋放素、高分子量激肽原、因子XI(FXI)和因子XII(FXII)暴露于帶負(fù)電荷的表面時。也需要由血小板分泌的鈣離子和磷脂。外源性途徑在血管的血管內(nèi)腔受到損傷時起始。膜糖蛋白組織因子暴露且接著結(jié)合于循環(huán)的因子VII(FVII)和少量已經(jīng)存在的其活化形式FVIIa。此結(jié)合促進FVII完全轉(zhuǎn)化為FVIIa并且隨后在鈣和磷脂存在下促進因子IX(FIX)轉(zhuǎn)化為因子IXa(FIXa)和因子X(FX)轉(zhuǎn)化為因子Xa(FXa)。FVIIa與組織因子的締合通過使FVII的底物(FIX和FX)結(jié)合位點更接近和通過誘導(dǎo)構(gòu)形變化而增強蛋白水解活性，所述構(gòu)形變化增強FVIIa的酶促活性。FX的活化為所述兩條途徑的共同點。因子Va(FVa)和Xa與磷脂和鈣一起將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶(凝血酶原酶復(fù)合物)，凝血酶接著裂解纖維蛋白原形成纖維蛋白單體。所述單體聚合形成纖維蛋白股束。因子XIIIa(FXIIIa)使這些股束彼此共價鍵結(jié)形成剛性網(wǎng)狀物。FVII轉(zhuǎn)化為FVIIa也由多種蛋白酶催化，所述蛋白酶包括凝血酶、FIXa、FXa、因子XIa(FXIa)和因子XIIa(FXIIa)。為抑制所述級聯(lián)的早期，組織因子途徑抑制劑靶向FVIIa/組織因子/FXa產(chǎn)物復(fù)合物。因子VIIaFVII(也稱為穩(wěn)定因子或前轉(zhuǎn)化素(proconvertin))為維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶糖蛋白，其在止血和凝血中具有關(guān)鍵作用(Eigenbrot，CurrProteinPeptSci.2002；3：287-99)。FVII在肝臟中合成且分泌為48kD單鏈糖蛋白。FVII與所有維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶糖蛋白共享由以下組成的類似蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)：負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)膜相互作用的具有9-12個殘基的氨基端γ-羧基谷氨酸(Gla)結(jié)構(gòu)域、羧基端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(催化結(jié)構(gòu)域)和兩個含有介導(dǎo)與組織因子的相互作用的鈣離子結(jié)合位點的表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域。γ-谷氨?；然复呋肿拥陌被瞬糠种蠫la殘基的羧化。羧化酶依賴于維生素K的還原形式以便發(fā)揮其作用，維生素K被氧化為環(huán)氧化物形式。需要維生素K環(huán)氧化物還原酶來將維生素K的環(huán)氧化物形式再轉(zhuǎn)化為還原形式。大部分FVII在血漿中以酶原形式循環(huán)并且此形式的活化導(dǎo)致精氨酸152與異亮氨酸153之間的肽鍵裂解。所產(chǎn)生的活化型FVIIa由NH2來源的輕鏈(20kD)與COOH端來源的重鏈(30kD)通過單個二硫鍵(Cys135至Cys262)連接而組成。輕鏈含有膜結(jié)合Gla結(jié)構(gòu)域，而重鏈含有催化結(jié)構(gòu)域。FVII的血漿濃度由遺傳和環(huán)境因素決定，為約0.5mg/mL(Pinotti等，Blood.2000；95：3423-8)。不同F(xiàn)VII基因型可以導(dǎo)致平均FVII水平產(chǎn)生若干倍的差異。血漿FVII水平在健康女性中在懷孕期間升高，并且也隨年齡而增加，且在女性和患有高甘油三酯血癥的人中較高。在所有促凝血因子中FVII具有最短的半衰期(3-6h)。FVIIa的平均血漿濃度在健康個體中為3.6ng/mL，且FVIIa的循環(huán)半衰期與其它凝血因子相比相對較長(2.5h)。遺傳性FVII缺乏為一種罕見的常染色體隱性出血性病癥，發(fā)病率據(jù)估計在普通人群中為每500,000人1例(Acharya等，JThrombHaemost.2004；2248-56)。因抑制劑造成的后天性FVII缺乏也極罕見。也已報導(dǎo)缺乏的發(fā)生與如頭孢菌素(cephalosporins)、青霉素(penicillins)和口服抗凝血劑等藥物有關(guān)的病例。此外，已報導(dǎo)自發(fā)發(fā)生或與其它病狀(如骨髓瘤、敗血癥、再生障礙性貧血)、白介素-2和抗胸腺細胞球蛋白療法伴隨發(fā)生的后天性FVII缺乏。參考多核苷酸和多肽序列包括例如保藏編號J02933(基因組序列)、M13232(cDNA)(Hagen等PNAS1986；83：2412-6)和P08709(多肽序列)(以引用的方式整體并入本文)。FVII的多種多態(tài)現(xiàn)象已有描述，例如參見Sabater-Lleal等(HumGenet.2006；118：741-51)(以引用的方式整體并入本文)。因子IXFIX為一種維生素K依賴性血漿蛋白，其通過在鈣離子、磷脂和FVIIIa存在下將FX轉(zhuǎn)化為其活性形式而參與內(nèi)源性凝血途徑。FIX的主要催化能力是作為對FX內(nèi)的特定精氨酸-異亮氨酸鍵具有特異性的絲氨酸蛋白酶。FIX由FXIa活化，F(xiàn)XIa使活化肽從FIX切除從而產(chǎn)生包含由一個或多個二硫鍵保持的兩條鏈的活化型FIX分子。FIX缺乏為隱性X-連鎖血友病B的原因。血友病A和B為特征分別在于FVIII和FIX多肽缺乏的遺傳性疾病。缺乏的根本原因常為FVIII和FIX基因突變的結(jié)果，所述兩個基因均位于X染色體上。血友病的傳統(tǒng)療法通常涉及靜脈內(nèi)施用自正常個體匯集的血漿或半純化的凝血蛋白。所述制劑可能受致病性病原體或病毒污染，如感染性朊病毒、HIV、細小病毒、A型肝炎和C型肝炎。因此，對不需要使用人血清的治療劑存在迫切需要。FIX活性降低的程度與血友病B的嚴(yán)重程度成正比。血友病B的當(dāng)前治療由以血漿來源或重組的FIX替代缺失的蛋白質(zhì)(也稱為FIX取代或替代治療或療法)。FIX的多核苷酸和多肽序列例如可見于UniProtKB/Swiss-Prot保藏編號P00740和美國專利號6,531,298中。因子VIII凝血因子VIII(FVIII)在血漿中以極低濃度循環(huán)并且與馮威勒布蘭德因子(VWF)非共價結(jié)合。在止血時，F(xiàn)VIII與VWF分離并且通過增強在鈣和磷脂或細胞膜存在下活化的速率而充當(dāng)活化型因子IX(FIXa)介導(dǎo)的FX活化的輔因子。FVIII合成為具有結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)A1-A2-B-A3-C1-C2的約270-330kD的單鏈前驅(qū)體。當(dāng)從血漿純化時(例如“血漿來源”或“血漿”)，F(xiàn)VIII由重鏈(A1-A2-B)和輕鏈(A3-C1-C2)構(gòu)成。輕鏈的分子質(zhì)量為80kD，而由于B結(jié)構(gòu)域內(nèi)的蛋白水解，重鏈在90-220kD的范圍內(nèi)。FVIII也合成為重組蛋白以供在治療上用于出血病癥。已設(shè)計各種體外測定來測定重組FVIII(rFVIII)作為治療藥物的潛在功效。這些測定模擬內(nèi)源性FVIII的體內(nèi)作用。FVIII的體外凝血酶處理導(dǎo)致其促凝血活性快速增強并隨后降低，如通過體外測定所測量。此活化和失活與重鏈和輕鏈兩者中的特異性有限蛋白水解相符，所述蛋白水解改變FVIII中不同結(jié)合表位的可用性，例如使FVIII從VWF解離和結(jié)合磷脂表面或改變與某些單克隆抗體的結(jié)合能力。FVIII缺乏或功能異常與最常出現(xiàn)的出血病癥血友病A有關(guān)。選用于管理血友病A的治療為利用血漿來源或rFVIII濃縮物的替代療法?；加蠪VIII水平低于1％的嚴(yán)重血友病A的患者通常進行旨在保持FVIII在劑量之間高于1％的預(yù)防療法?？紤]到循環(huán)中各種FVIII產(chǎn)物的平均半衰期，此結(jié)果通常可以通過每周給予FVIII兩至三次來達成。參考多核苷酸和多肽序列包括例如UniProtKB/Swiss-ProtP00451(FA8_HUMAN)；GitschierJ等，CharacterizationofthehumanFactorVIIIgene，Nature，312(5992)：326-30(1984)；VeharGH等，StructureofhumanFactorVIII，Nature，312(5992)：337-42(1984)；ThompsonAR.StructureandFunctionoftheFactorVIIIgeneandprotein，SeminThrombHemost，2003：29；11-29(2002)。馮威勒布蘭德因子馮威勒布蘭德因子(VWF)為在血漿中以大小在約500至20,000kD范圍內(nèi)的一系列多聚體形式循環(huán)的糖蛋白。VWF的多聚體形式由250kD多肽亞基通過二硫鍵連接在一起構(gòu)成。VWF介導(dǎo)血小板與受損血管壁的內(nèi)皮下層的最初粘著。僅較大多聚體顯示止血活性。推測內(nèi)皮細胞分泌VWF的較大聚合形式而VWF的具有低分子量的形式(低分子量VWF)由蛋白水解裂解產(chǎn)生。具有較大分子質(zhì)量的多聚體儲存于內(nèi)皮細胞的Weibel-Pallade體中并且在受刺激時釋放。VWF由內(nèi)皮細胞和巨核細胞合成為在很大程度上由重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成的前VWF原。信號肽裂解時，前VWF通過位于其C端區(qū)域中的二硫鍵二聚化。二聚體用作多聚化的原體，其中多聚化受制于游離末端之間的二硫鍵。組裝成多聚體后，前肽序列被蛋白水解移除(Leyte等，Biochem.J.274(1991)，257-261)。根據(jù)VWF的所克隆cDNA預(yù)測的初級翻譯產(chǎn)物為2813個殘基的前驅(qū)多肽(前VWF原)。前VWF原由22個氨基酸的信號肽和741個氨基酸的前肽組成，其中成熟VWF包含2050個氨基酸(RuggeriZ.A.，和Ware，J.，F(xiàn)ASEBJ.，308-316(1993))。VWF缺乏引起馮威勒布蘭德病(vonWillebranddisease；VWD)，其特征在于明顯程度或高或低的出血表型。3型VWD為最嚴(yán)重形式，其中VWF完全缺失，而1型VWD涉及VWF的量減少并且其表型可極輕微。2型VWD涉及VWF的明顯缺乏并且可如同3型VWD一樣嚴(yán)重。2型VWD具有許多亞型，其中一些與高分子量多聚體的缺失或減少有關(guān)。2a型馮威勒布蘭德病(VWD-2A)的特征在于中等和較大多聚體均缺失。VWD-2B的特征在于最高分子量的多聚體缺失。與VWF有關(guān)的其它疾病和病癥在本領(lǐng)域中為已知的。前VWF原的多核苷酸和氨基酸序列可分別以GenBank保藏編號NM_000552和NP_000543獲得。本發(fā)明的其它凝血蛋白描述于本領(lǐng)域中，例如MannKG，ThrombHaemost，1999；82：165-74。A.多肽在一個方面中，本發(fā)明的起始材料為蛋白質(zhì)或多肽。如本文所述，術(shù)語治療蛋白質(zhì)是指顯示出與治療蛋白質(zhì)有關(guān)的生物活性的任何治療蛋白質(zhì)分子。在本發(fā)明的一個實施方案中，治療蛋白質(zhì)分子為全長蛋白質(zhì)。所涵蓋的治療蛋白質(zhì)分子包括全長蛋白質(zhì)、全長蛋白質(zhì)的前驅(qū)體、全長蛋白質(zhì)的生物活性亞基或片段、以及任何這些形式治療蛋白質(zhì)的生物活性衍生物和變異體。因此，治療蛋白質(zhì)包括具有以下特征者：(1)具有與由參考核酸編碼的多肽或本文所述的氨基酸序列在至少約25個、約50個、約100個、約200個、約300個、約400個或更多個氨基酸的區(qū)域上的氨基酸序列同一性大于約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％或更高的氨基酸序列；和/或(2)特異性結(jié)合針對包含如本文所述的參考氨基酸序列的免疫原或其免疫原性片段和/或其保守性修飾變異體產(chǎn)生的抗體，例如多克隆抗體或單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“重組治療蛋白質(zhì)”包括通過重組DNA技術(shù)獲得的任何治療蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，所述術(shù)語涵蓋如本文所述的蛋白質(zhì)。如本文所用，“內(nèi)源性治療蛋白質(zhì)”包括來源于意欲接受治療的哺乳動物的治療蛋白質(zhì)。所述術(shù)語也包括由存在于所述哺乳動物中的轉(zhuǎn)基因或任何其它外來DNA轉(zhuǎn)錄的治療蛋白質(zhì)。如本文所用，“外源性治療蛋白質(zhì)”包括并非來源于意欲接受治療的哺乳動物的凝血蛋白。如本文所用，“血漿來源的凝血蛋白”或“血漿”包括在獲自哺乳動物的血液中發(fā)現(xiàn)的具有參與凝血途徑的性質(zhì)的蛋白質(zhì)的任何形式。如本文所用，“生物活性衍生物”或“生物活性變異體”包括分子的具有與所述分子實質(zhì)上相同的功能和/或生物性質(zhì)(如結(jié)合性質(zhì))和/或相同結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(如肽骨架或基本聚合單元)的任何衍生物或變異體?！邦愃莆铩?、“變異體”或“衍生物”為與天然產(chǎn)生的分子在結(jié)構(gòu)上實質(zhì)上類似并且具有相同生物活性(盡管在一些情況下有一定程度的不同)的化合物。舉例來說，多肽變異體是指與參考多肽共享實質(zhì)上類似的結(jié)構(gòu)并且具有相同生物活性的多肽。變異體或類似物與所述類似物所來源的天然產(chǎn)生的多肽相比基于涉及以下方面的一個或多個突變在其氨基酸序列組成方面有所不同：(i)多肽的一個或多個末端和/或天然產(chǎn)生的多肽序列(例如片段)的一個或多個內(nèi)部區(qū)域的一個或多個氨基酸殘基缺失，(ii)在多肽的一個或多個末端(通常為“添加”或“融合”)和/或天然產(chǎn)生的多肽序列的一個或多個內(nèi)部區(qū)域(通常為“插入”)插入或添加一個或多個氨基酸，或(iii)一個或多個氨基酸取代天然產(chǎn)生的多肽序列中的其它氨基酸。舉例來說，“衍生物”是指已修飾(例如化學(xué)修飾)的與參考多肽共享相同或?qū)嵸|(zhì)上類似的結(jié)構(gòu)的多肽。在各種實施方案中，類似物、變異體或衍生物設(shè)計成允許例如將另一分子偶聯(lián)至蛋白質(zhì)類似物、變異體或衍生物，由此形成本發(fā)明的偶聯(lián)的蛋白質(zhì)。變異體或類似物多肽包括插入變異體，其中一個或多個氨基酸殘基添加至本發(fā)明的治療蛋白質(zhì)氨基酸序列。插入可位于蛋白質(zhì)的任一個或兩個末端，和/或可位于治療蛋白質(zhì)氨基酸序列的內(nèi)部區(qū)域中。在任一個或兩個末端具有另外的殘基的插入變異體包括例如融合蛋白和包括氨基酸標(biāo)簽或其它氨基酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。在一個方面中，凝血蛋白分子任選地含有N-端Met，尤其在分子在如大腸桿菌(E.coli)等細菌細胞中重組表達時。在缺失變異體中，如本文所述的治療蛋白質(zhì)多肽中的一個或多個氨基酸殘基被移除。缺失可以在治療蛋白質(zhì)多肽的一個或兩個末端實現(xiàn)，和/或通過移除治療蛋白質(zhì)氨基酸序列內(nèi)部的一個或多個殘基來實現(xiàn)。因此，缺失變異體包括治療蛋白質(zhì)多肽序列的片段。在取代變異體中，治療蛋白質(zhì)多肽的一個或多個氨基酸殘基被移除并且被替代殘基置換。在一個方面中，取代在性質(zhì)上為保守性的并且此類型的保守性取代在本領(lǐng)域中為熟知的?；蛘?，本發(fā)明涵蓋也為非保守性的取代。示范性保守性取代描述于Lehninger，[Biochemistry，第2版；WorthPublishers，Inc.，NewYork(1975)，第71-77頁]中并且緊接著在下文進行闡述。保守性取代或者，示范性保守性取代緊接著在下文進行闡述。保守性取代IIB.多核苷酸編碼本發(fā)明治療蛋白質(zhì)的核酸包括例如且不限于基因、前mRNA、mRNA、cDNA、多態(tài)變異體、等位基因、合成和天然產(chǎn)生的突變體。編碼本發(fā)明治療蛋白質(zhì)的多核苷酸也包括(但不限于)具有以下特征者：(1)在嚴(yán)格雜交條件下與編碼如本文所述的參考氨基酸序列的核酸和其保守性修飾變異體特異性雜交；(2)具有與如本文所述的參考核酸序列在至少約25個、約50個、約100個、約150個、約200個、約250個、約500個、約1000或更多個核苷酸(至多成熟蛋白質(zhì)的1218個核苷酸的全長序列)的區(qū)域上的核苷酸序列同一性大于約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或更高的核酸序列。示范性“嚴(yán)格雜交”條件包括在42℃下于50％甲酰胺、5×SSC、20mMNa·PO4(pH6.8)中雜交；和在55℃下于1×SSC中洗滌30分鐘。應(yīng)了解，這些示范性條件可以基于欲雜交序列的長度和GC核苷酸含量進行變化。本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)公式適于確定適當(dāng)雜交條件。參見Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)§§9.47-9.51。“天然產(chǎn)生”的多核苷酸或多肽序列通常來自哺乳動物，包括(但不限于)靈長類動物，例如人；嚙齒動物，例如大鼠、小鼠、倉鼠；牛、馬、綿羊或任何哺乳動物。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)可以是重組分子(例如異源分子和編碼野生型序列或其變異體的分子，或天然產(chǎn)生的分子)。C.治療蛋白質(zhì)的產(chǎn)生治療蛋白質(zhì)的產(chǎn)生包括本領(lǐng)域中已知用于進行以下的任何方法：(i)通過遺傳工程改造產(chǎn)生重組DNA，(ii)通過例如但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔或顯微注射將重組DNA引入原核或真核細胞中，(iii)培養(yǎng)所述經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細胞，(iv)表達治療蛋白質(zhì)，例如組成性表達或誘導(dǎo)后表達，和(v)分離所述凝血蛋白，例如從培養(yǎng)基或通過收集轉(zhuǎn)化細胞進行分離，以便獲得純治療蛋白質(zhì)。在其它方面中，治療蛋白質(zhì)通過在特征在于產(chǎn)生藥理學(xué)上可接受的凝血蛋白分子的適合原核或真核宿主系統(tǒng)中表達來產(chǎn)生。真核細胞的實例為哺乳動物細胞，如CHO、COS、HEK293、BHK、SK-Hep和HepG2。多種載體用于制備治療蛋白質(zhì)且選自真核和原核表達載體。用于原核表達的載體的實例包括質(zhì)粒，如(但不限于)pRSET、pET和pBAD，其中原核表達載體中所用的啟動子包括(但不限于)lac、trc、trp、recA或araBAD中的一者或多者。用于真核表達的載體的實例包括：(i)用于在酵母中表達的載體，如(但不限于)pAO、pPIC、pYES或pMET，所用的啟動子如(但不限于)AOX1、GAP、GAL1或AUG1；(ii)用于在昆蟲細胞中表達的載體，如(但不限于)pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC，所用的啟動子如(但不限于)PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或polh；和(iii)用于在哺乳動物中表達的載體，如(但不限于)pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV，且在一個方面中載體來源于病毒系統(tǒng)，如(但不限于)痘病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒，所用的啟動子如(但不限于)CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌動蛋白。在本發(fā)明的各種實施方案中，治療蛋白質(zhì)通過將水溶性脂肪酸衍生物或水溶性連接子偶聯(lián)至治療蛋白質(zhì)上的一個或多個碳水化合物進行修飾。因此在一個實施方案中，治療蛋白質(zhì)為糖蛋白并且純化自允許糖基化的宿主細胞(即，蛋白質(zhì)在體內(nèi)糖基化并且隨后以糖蛋白形式純化)。在各種實施方案中，治療蛋白質(zhì)為或不為糖蛋白并且在從宿主細胞純化后在體外進行糖基化。體外糖基化方法在本領(lǐng)域中為熟知的(參見例如Meynial-SallesI和CombesD，JournalofBiotechnology1996，46：1-14；/SoláRJ和GriebenowK，BioDrugs2010，24：9-21)。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以(1)純化治療蛋白質(zhì)；(2)修飾治療蛋白質(zhì)以允許在體外(任選地位點特異性)糖基化(例如氨基酸缺失/插入/取代)；和(3)根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序在體外對經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)進行糖基化。D.施用在一個實施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)治療蛋白質(zhì)可以通過注射，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)注射進行施用。為向人或測試動物施用包含本發(fā)明的偶聯(lián)治療蛋白質(zhì)的組合物，在一個方面中，組合物包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載劑。術(shù)語“藥學(xué)上”或“藥理學(xué)上可接受”是指分子實體和組合物在使用如下文所述在本領(lǐng)域中熟知的路徑施用時穩(wěn)定、抑制蛋白質(zhì)降解(如聚集和裂解產(chǎn)物)，并且此外不產(chǎn)生過敏反應(yīng)或其它不良反應(yīng)。“藥學(xué)上可接受的載劑”包括任何和所有臨床上適用的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑等，包括上文揭示的藥劑。如本文所用，“有效量”包括適于治療疾病或病癥或緩解疾病或病癥的癥狀的劑量。在一個實施方案中，“有效量”包括適于治療患有如本文所述的出血病癥的哺乳動物的劑量。組合物可以口服、局部外用、透皮、腸胃外、通過吸入噴霧、陰道、直腸或通過顱內(nèi)注射來施用。如本文所用的術(shù)語腸胃外包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腦池內(nèi)注射或輸注技術(shù)。也涵蓋通過靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、乳房內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、眼球后、肺內(nèi)注射和或在特定部位手術(shù)植入進行施用。一般來說，組合物基本上不含熱原質(zhì)以及可能會對接受者有害的其它雜質(zhì)。組合物的單次或多次施用可以采用由主治醫(yī)師選擇的劑量水平和模式進行。為預(yù)防或治療疾病，適當(dāng)劑量將取決于如上文所述欲治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重性和病程、藥物是出于預(yù)防還是治療的目的施用、先前療法、患者的病史和對藥物的反應(yīng)，以及主治醫(yī)師的判斷。本發(fā)明也涉及包含有效量的如本文所定義的偶聯(lián)治療蛋白質(zhì)的藥用組合物。藥用組合物可以進一步包含藥學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑、鹽、緩沖劑或賦形劑。藥用組合物可用于治療上文定義的出血病癥。本發(fā)明的藥用組合物可為溶液或凍干產(chǎn)品。藥用組合物的溶液可以經(jīng)受任何適合凍干過程。作為另一方面，本發(fā)明包括包含本發(fā)明的組合物以有利于用于施用至受試者的方式封裝的試劑盒。在一個實施方案中，這種試劑盒包括本文所述的化合物或組合物(例如包含偶聯(lián)治療蛋白質(zhì)的組合物)封裝于如密封瓶或器皿等容器中，具有描述所述化合物或組合物在實施方法時的使用的標(biāo)簽粘附于容器上或包括于包裝中。在一個實施方案中，試劑盒含有具有包含偶聯(lián)治療蛋白質(zhì)的組合物的第一容器和具有用于第一容器中的組合物的生理學(xué)上可接受的復(fù)原溶液的第二容器。在一個方面中，化合物或組合物以單位劑型封裝。試劑盒可以進一步包括適于根據(jù)特定施用路徑施用組合物的裝置。試劑盒優(yōu)選含有描述治療蛋白質(zhì)或肽組合物的使用的標(biāo)簽。脂肪酸、脂肪酸衍生物和蛋白質(zhì)-脂肪酸衍生物偶聯(lián)物在一個方面中，本文提供的治療蛋白質(zhì)衍生物(即偶聯(lián)的治療蛋白質(zhì))分子結(jié)合于水溶性脂肪酸衍生物。如本文所用，“水溶性脂肪酸衍生物”包含脂肪酸(即羧酸)偶聯(lián)于如本文所述的水溶性連接子(例如氨氧基連接子)。根據(jù)本發(fā)明，所述脂肪酸衍生物為穩(wěn)定的(即不從蛋白質(zhì)釋放)，可溶于水并且能夠結(jié)合人血清白蛋白。A.脂肪酸脂肪酸(即FA或FAs)包括(但不限于)根據(jù)本發(fā)明能夠結(jié)合人血清白蛋白的飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、支鏈脂肪酸(Mukheriji等，ProgLipidRes2003；42：359-76)和其衍生物。舉例來說，脂肪酸具有以下一般結(jié)構(gòu)：飽和FA：一般結(jié)構(gòu)飽和FA甲酯：一般結(jié)構(gòu)飽和FA乙酯：一般結(jié)構(gòu)根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案，脂肪酸也包含各種替代結(jié)構(gòu)(例如甲酯或乙酯)或其它結(jié)構(gòu)，如在ω-位置含有末端基團(例如羥基、氨基、硫基和羧基)。在一個實施方案中，脂肪酸為天然產(chǎn)生的脂肪酸。在各種實施方案中，脂肪酸為短鏈脂肪酸(例如少于6個碳)、中鏈脂肪酸(例如6至12個碳)、長鏈脂肪酸(例如長于12個碳)或極長鏈脂肪酸(例如長于22個碳)。在另一實施方案中，脂肪酸的碳在4個與28個之間。在一個實施方案中，脂肪酸呈順式構(gòu)型。在另一實施方案中，脂肪酸呈反式構(gòu)型。在一個實施方案中，脂肪酸為長度在12個碳與20個碳之間的飽和脂肪酸。所述脂肪酸在本領(lǐng)域中為已知的，例如C12(十二烷酸、月桂酸)、C14(十四烷酸、肉豆蔻酸)、C16(十六烷酸、棕櫚酸)、C18(十八烷酸、硬脂酸)和C20(二十烷酸、花生酸)。不飽和脂肪酸的實例為豆蔻油酸(C14:1)、棕櫚油酸(C16:1)、油酸(C18:1)、亞麻油酸(C18:2)和花生四烯酸(C20:4)。所述脂肪酸大多數(shù)可購得并且可以通過不同化學(xué)方法制備(RecentDevelopmentsintheSynthesisofFattyAcidDerivatives，編者：KnotheG和DerksenJTB，AOCSPress1999，ISBN1-893997-00-6)。在本發(fā)明的各種實施方案中，脂肪酸包含4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50個碳。B.脂肪酸衍生物本發(fā)明提供可結(jié)合人血清白蛋白的一類新穎活化脂肪酸衍生物(FA衍生物)的制備。所述FA衍生物含有允許在水溶液中處理和操作FA衍生物的水溶性間隔子或連接子(即不同于本發(fā)明的脂肪酸衍生物所來源的相應(yīng)脂肪酸，本發(fā)明的脂肪酸衍生物可溶于水)。在一個實施方案中，所述FA衍生物含有活性氨氧基，其允許FA衍生物與治療蛋白質(zhì)的氧化型碳水化合物部分(主要為N-聚糖)偶合形成穩(wěn)定的肟鍵聯(lián)。如本文所用，“穩(wěn)定的”鍵聯(lián)意謂所形成的共價鍵“不可釋放”或不可水解。通過碳水化合物進行化學(xué)修飾對于如FVIII、FIX和FVIIa等凝血蛋白形成具有高殘余活性的偶聯(lián)物來說可能為優(yōu)選選擇。舉例來說且不加限制，以下策略代表根據(jù)本發(fā)明制備含有活性氨氧基的水溶性FA衍生物的一個實施方案。策略1：利用戴斯馬丁高碘烷對FA衍生物(例如16-羥基十六烷酸)的ω-羥基進行氧化以產(chǎn)生醛基。在下一步驟中，使含有水溶性PEG鏈的二氨氧基連接子(例如3，6，9-三氧雜十一烷-1，11-二氧基胺)與此醛基偶合以形成穩(wěn)定肟鍵聯(lián)。以下流程代表根據(jù)策略1的一個實例：步驟1：用戴斯馬丁試劑對16-羥基硬脂酸進行選擇性氧化以產(chǎn)生16-氧代硬脂酸。粗產(chǎn)物通過色譜使用硅膠作為分離劑進行純化。步驟2：使16-氧代硬脂酸鈉鹽的16-氧代部分與3，6，9-三氧雜十一烷-1，11-二氧基胺反應(yīng)。粗產(chǎn)物通過色譜使用硅膠作為分離劑進行純化?；蛘撸诹硪粚嵤┓桨钢?，采用以下策略來制備含有活性氨氧基的水溶性FA衍生物。策略2：利用乙酰氯對ω-羥基脂肪酸(例如16-羥基十六烷酸)的羧基進行酯化。此甲酯衍生物的ω-羥基用甲磺酰氯活化以便引入更好的離去基團。接著使甲磺?；c含有水溶性PEG鏈的二氨氧基連接子(例如3，6，9-三氧雜十一烷-1，11-二氧基胺)反應(yīng)以形成穩(wěn)定的氨氧基-亞甲基鍵。任選地，可以在堿性溶液中水解甲酯以產(chǎn)生游離羧基。以下流程代表根據(jù)策略2的一個實例：步驟1：16-羥基十六烷酸的羧基部分通過使用乙酰氯作為甲基化試劑形成甲酯加以保護。步驟2：通過用甲磺酰基(其為更好的離去基團)取代羥基來活化16-羥基十六烷酸甲酯的16-羥基部分。步驟3：16-甲磺酰基十六烷酸甲酯的16-甲磺?；糠忠噪p官能3，6，9-三氧雜十一烷-1，11-二氧基胺的一個氨氧基部分取代。粗產(chǎn)物通過色譜使用硅膠作為分離劑進行純化。本發(fā)明也涵蓋另一策略。本發(fā)明例如不限于利用氨氧基化學(xué)來與氧化的碳水化合物殘基的醛基偶合。如本文所述，也涵蓋使用其它化學(xué)，包括(但不限于)：使用酰肼與醛基偶合、使用NHS與氨基偶合以及使用馬來酰亞胺與治療蛋白質(zhì)的游離SH-基團偶合。舉例來說，使如上文所述制備的脂肪酸甲酯與如本文所述的市售MAL-PEG-COOH(mal-PEG(12)-COOH/IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)反應(yīng)。作為另一實例，使具有反應(yīng)性氨基的脂肪酸酯與如本文所述的市售NHS-PEG-NHS(NHS-dPEG(4)-NHS/IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)反應(yīng)。水溶性連接子包括(但不限于)水溶性聚合物(例如PEG)。連接子可以由含有一個或多個增加水溶性的官能團的任何化學(xué)結(jié)構(gòu)組成。這些官能團可具有形成負(fù)電荷或正電荷的能力，由此使得連接子可溶于水。在一個實施方案中，此官能團包括(但不限于)磺酸基或羧基。此外可以使用任何極性官能團，其使得連接子可溶于水。其實例為羥基、氨基、酰氨基、馬來酰亞氨基、氨氧基和酰肼基，以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯和磺酸基NHS酯。在各種實施方案中，水溶性連接子包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷基淀粉(HAS)、羥乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、支鏈淀粉、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚環(huán)氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、聚(1-羥甲基亞乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)和磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基銨(MPC)。在一個實施方案中，水溶性聚合物為PEG。在本發(fā)明的各種實施方案中，水溶性聚合物包含約3至25個氧之間的鏈長。舉例來說，在本發(fā)明的各種實施方案中，水溶性聚合物包含3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25個氧。C.蛋白質(zhì)-脂肪酸衍生物偶聯(lián)物本發(fā)明涵蓋氨氧基連接子系統(tǒng)(即其中水溶性脂肪酸衍生物包含氨氧基連接子)。舉例來說，在本發(fā)明的一個實施方案中，應(yīng)用羥基胺或羥基胺衍生物與醛(例如利用過碘酸鈉進行氧化后碳水化合物部分上的醛)形成肟基的反應(yīng)來制備蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。舉例來說，首先用如過碘酸鈉(NaIO4)等氧化劑對糖蛋白(例如本發(fā)明的治療蛋白質(zhì))進行氧化(RothfusJA和SmithEL.，JBiolChem1963，238，1402-10；以及VanLentenL和AshwellG.，JBiolChem1971，246，1889-94)。糖蛋白的過碘酸鹽氧化是基于1928年描述的經(jīng)典馬拉普瑞德反應(yīng)(Malapradereaction)，所述反應(yīng)是利用過碘酸鹽對鄰二醇進行氧化形成活性醛基(MalapradeL.，Analyticalapplication，BullSocChimFrance，1928，43，683-96)。這種氧化劑的其它實例為四乙酸鉛(Pb(OAc)4)、乙酸錳(MnO(Ac)3)、乙酸鈷(Co(OAc)2)、乙酸鉈(TlOAc)、硫酸鈰(Ce(SO4)2)(US4,367,309)或過釕酸鉀(KRuO4)(Marko等，JAmChemSoc1997，119，12661-2)?！把趸瘎币庵^在生理學(xué)反應(yīng)條件下能夠氧化碳水化合物中的鄰二醇由此產(chǎn)生活性醛基的溫和氧化性化合物。第二步驟為含有氨氧基的聚合物(例如脂肪酸衍生物)與氧化的碳水化合物部分偶合形成肟鍵聯(lián)。在本發(fā)明的一個實施方案中，此步驟可以在催化量的親核性催化劑苯胺或苯胺衍生物存在下進行(DirksenA和DawsonPE，BioconjugateChem.2008；ZengY等，NatureMethods2009；6：207-9)。苯胺催化顯著加速肟連接，從而允許使用極低濃度的試劑。在本發(fā)明的另一實施方案中，肟鍵聯(lián)通過用NaCNBH3還原形成烷氧基胺鍵聯(lián)而穩(wěn)定化。其它催化劑在下文描述。在另一實施方案中，此步驟在間甲苯胺存在下進行。在本發(fā)明的一個實施方案中，偶聯(lián)水溶性連接子(例如脂肪酸衍生物)與蛋白質(zhì)的反應(yīng)步驟分別且依序進行(即，起始材料(例如治療蛋白質(zhì)、水溶性連接子等)、試劑(例如氧化劑、苯胺等)和反應(yīng)產(chǎn)物(例如治療蛋白質(zhì)上氧化的碳水化合物、活化的氨氧基水溶性連接子等)在個別反應(yīng)步驟之間分離)。在另一實施方案中，完成本發(fā)明的偶聯(lián)反應(yīng)所必需的起始材料和試劑在單一容器中進行。在一個實施方案中，將天然蛋白質(zhì)與氨氧基-聚合物試劑混合。隨后，添加氧化劑且進行偶聯(lián)反應(yīng)。關(guān)于氨氧基技術(shù)的其它信息可見于以下參考文獻中，所述參考文獻各自以引用的方式整體并入本文：EP1681303A1(HAS化紅血球生成素)；WO2005/014024(由肟連接基團連接的聚合物與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物)；WO96/40662(含氨氧基連接子化合物和其在偶聯(lián)物中的應(yīng)用)；WO2008/025856(經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì))；PeriF等，Tetrahedron1998，54，12269-78；Kubler-KielbJ和PozsgayV.，JOrgChem2005，70，6887-90；LeesA等，Vaccine2006，24(6)，716-29；和HerediaKL等，Macromolecules2007，40(14)，4772-9。水溶性連接子的偶合可以通過與蛋白質(zhì)直接偶合(例如通過蛋白質(zhì)上的游離巰基或游離氨基)或通過本文所述的連接子分子進行。在一個方面中，偶聯(lián)是通過在形成穩(wěn)定的鍵下使水溶性連接子與治療蛋白質(zhì)直接偶合(或通過連接子系統(tǒng)偶合)來進行。因此，在本發(fā)明的各種實施方案中，本文所述的脂肪酸衍生物設(shè)計成允許與治療蛋白質(zhì)偶合。舉例來說，脂肪酸衍生物設(shè)計成包括各種末端反應(yīng)性基團，如本文所述。在某些方面中，治療蛋白質(zhì)通過多種化學(xué)方法中的任一種偶聯(lián)至水溶性脂肪酸衍生物(RobertsJM等，AdvanDrugDeliveryRev2002；54：459-76)。舉例來說，在一個實施方案中，通過使用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯使脂肪酸衍生物偶聯(lián)至蛋白質(zhì)的游離氨基來對治療蛋白質(zhì)進行修飾。在另一實施方案中，使用馬來酰亞胺化學(xué)來使水溶性脂肪酸衍生物偶合至游離SH基團。在另一實施方案中，水溶性脂肪酸衍生物通過使用酰肼或氨氧基化學(xué)偶合至預(yù)先氧化后的治療蛋白質(zhì)的碳水化合物部分。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過使用含有活性N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯的水溶性脂肪酸衍生物通過賴氨酸殘基對治療蛋白質(zhì)進行修飾。所述衍生物在溫和條件下通過形成穩(wěn)定酰胺鍵與治療蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基反應(yīng)。在本發(fā)明的另一實施方案中，涵蓋通過蛋白質(zhì)或脂肪酸衍生物中任一者之一上的羧基與蛋白質(zhì)或脂肪酸衍生物的氨基之間的肽鍵，或蛋白質(zhì)或脂肪酸衍生物的羧基與治療蛋白質(zhì)或脂肪酸衍生物的羥基之間的酯鍵進行連接。治療蛋白質(zhì)借以共價鍵結(jié)至脂肪酸衍生物的另一鍵聯(lián)是通過席夫堿(Schiffbase)，例如蛋白質(zhì)上的游離氨基與脂肪酸末端所形成的醛基之間反應(yīng)形成的席夫堿。在一個方面中，所產(chǎn)生的席夫堿通過利用NaCNBH3特異性還原形成仲胺來穩(wěn)定化。一種替代方法為通過在預(yù)先氧化后利用NH4Cl進行還原胺化而在脂肪酸衍生物中產(chǎn)生末端游離氨基?？梢允褂秒p官能試劑來連接兩個氨基或兩個羥基。舉例來說，利用如BS3(雙(磺酸基琥珀酰亞氨基)辛二酸酯/Pierce，Rockford，IL)等試劑使含有氨基的脂肪酸衍生物偶合至蛋白質(zhì)的氨基。此外，也例如使用如磺酸基-EMCS(N-ε-馬來酰亞氨基己酰氧基)磺酸基琥珀酰亞胺酯/Pierce)等異雙官能交聯(lián)試劑來連接氨基與硫醇基。在另一方法中，制備具有活性酰肼基的脂肪酸衍生物并使其偶合至預(yù)先氧化且產(chǎn)生醛官能團后的蛋白質(zhì)的碳水化合物部分。如上所述，治療蛋白質(zhì)的游離氨基與脂肪酸衍生物的1-羧基反應(yīng)形成肽鍵或在1-羧酸基與蛋白質(zhì)上的羥基或其它適合活性基團之間形成酯鍵。在各種實施方案中，治療蛋白質(zhì)與脂肪酸衍生物以化學(xué)計算量連接或締合(例如1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶7、1∶8、1∶9或1∶10等)。在各種實施方案中，1-6、7-12或13-20個脂肪酸衍生物連接至蛋白質(zhì)。在其它實施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個脂肪酸衍生物連接至蛋白質(zhì)。在各種實施方案中，對治療蛋白質(zhì)進行修飾以引入糖基化位點(即除天然糖基化位點以外的位點)。所述修飾可使用所屬領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來完成。此外，治療蛋白質(zhì)在通過一個或多個碳水化合物部分偶聯(lián)至水溶性連接子之前可以在體內(nèi)或體外糖基化。這些經(jīng)過糖基化的位點可以用作偶聯(lián)蛋白質(zhì)與水溶性連接子的標(biāo)靶(美國專利申請?zhí)?0090028822，美國專利申請?zhí)?009/0093399，美國專利申請?zhí)?009/0081188，美國專利申請?zhí)?007/0254836，美國專利申請?zhí)?006/0111279，和DeFreesS.等，Glycobiology，2006，16，9，833-43)。在一個實施方案中，與天然治療蛋白質(zhì)產(chǎn)物相比，偶聯(lián)的蛋白質(zhì)保留天然治療蛋白質(zhì)產(chǎn)物的完整功能活性，并且提供延長的體內(nèi)半衰期。在另一實施方案中，相對于天然蛋白質(zhì)，偶聯(lián)的蛋白質(zhì)保留至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140或150百分比(％)生物活性。在一相關(guān)方面中，偶聯(lián)的蛋白質(zhì)和天然凝血蛋白的生物活性利用發(fā)色活性與凝血因子抗原值的比率進行測定(凝血因子∶Chr∶凝血因子∶Ag)。在本發(fā)明的另一實施方案中，偶聯(lián)的蛋白質(zhì)的半衰期相對于天然治療蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期減少或增加0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。親核性催化劑如本文所述，水溶性脂肪酸衍生物與治療蛋白質(zhì)的偶聯(lián)可以利用苯胺來催化。苯胺強烈催化醛和酮與胺形成如腙和肟等穩(wěn)定亞胺的水相反應(yīng)。下圖比較未催化與苯胺催化的肟連接反應(yīng)(根據(jù)KohlerJJ，ChemBioChem2009；10：2147-50改編)。然而，考慮到與苯胺相關(guān)的眾多健康風(fēng)險，需要替代催化劑。本發(fā)明提供苯胺衍生物作為替代肟連接催化劑。所述苯胺衍生物包括(但不限于)鄰氨基苯甲酸、間氨基苯甲酸、對氨基苯甲酸、對氨基苯磺酸、鄰氨基苯甲酰胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰甲氧基苯胺、間甲氧基苯胺和對甲氧基苯胺。下圖比較未催化與間甲苯胺催化的肟連接反應(yīng)(PCT/US2011/45873)：在本發(fā)明的一個實施方案中，使用間甲苯胺(也稱為間甲苯胺、間甲基苯胺、3-甲基苯胺或3-氨基-1-甲基苯)來催化本文所述的偶聯(lián)反應(yīng)。間甲苯胺與苯胺具有類似物理性質(zhì)和基本上相同的pKa值(間甲苯胺：pKa4.73，苯胺：pKa4.63)。本發(fā)明的親核性催化劑適用于肟連接(例如使用氨氧基鍵聯(lián))或腙形成(例如使用酰肼化學(xué))。在本發(fā)明的各種實施方案中，偶聯(lián)反應(yīng)中所提供親核性催化劑的濃度為0.1、0.2、0.3、0.5、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50mM。在一個實施方案中，所提供的親核性催化劑在1mM至10mM之間。在本發(fā)明的各種實施方案中，偶聯(lián)反應(yīng)的pH范圍在4.0與7.0之間、4.5與7.0之間、5.0與6.5之間、5.0與6.5之間。在各種實施方案中，偶聯(lián)反應(yīng)的pH為pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5。在一個實施方案中，pH在5.5至6.5之間。偶聯(lián)的蛋白質(zhì)的純化在各種實施方案中，需要對已與氧化劑一起孵育的蛋白質(zhì)和/或已與本發(fā)明的水溶性脂肪酸衍生物偶聯(lián)的治療蛋白質(zhì)進行純化。本領(lǐng)域中已知眾多純化技術(shù)并且包括(但不限于)色譜法、過濾法和沉淀法(參見例如GuidetoProteinPurification，Meth.Enzymology第463卷(由BurgessRR和DeutscherMP編著)，第2版，AcademicPress2009)。以下實施例不欲對本發(fā)明造成限制，而是僅為本發(fā)明的特定實施方案的示例。實施例實施例1制備同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]2ONH2同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]2ONH2根據(jù)Boturyn等(Tetrahedron1997；53：5485-92)在兩步驟有機反應(yīng)中采用經(jīng)過修改的伯胺的加布里埃爾合成法(Gabriel-Synthesis)合成含有兩個活性氨氧基的3氧雜戊烷-1，5-二氧基胺(圖1)。在第一步驟中，使一分子2，2-二氯二乙基醚與兩分子內(nèi)-N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亞胺在DMF中反應(yīng)。通過在乙醇中進行肼解反應(yīng)從所得中間體制備所要同雙官能產(chǎn)物。實施例2制備同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]6ONH2同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]6ONH2根據(jù)Boturyn等(Tetrahedron1997；53：5485-92)在兩步驟有機反應(yīng)中采用經(jīng)過修改的伯胺的加布里埃爾合成法合成含有兩個活性氨氧基的3，6，9，12，15-五氧雜-十七烷-1，17-二氧基胺。在第一步驟中，使一分子六乙二醇二氯與兩分子內(nèi)N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亞胺在DMF中反應(yīng)。通過在乙醇中進行肼解反應(yīng)從所得中間體制備所要同雙官能產(chǎn)物。實施例3制備同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]4ONH2根據(jù)Boturyn等(Tetrahedron1997；53：5485-92)在兩步驟有機反應(yīng)中采用經(jīng)過修改的伯胺的加布里埃爾合成法合成含有兩個活性氨氧基的同雙官能連接子NH2[OCH2CH2]4ONH2(3，6，9-三氧雜十一烷-1，11-二氧基胺)。在第一步驟中，使一分子雙-(2-(2-氯乙氧基)-乙基)-醚與兩分子內(nèi)N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亞胺在DMF中反應(yīng)。通過在乙醇中進行肼解反應(yīng)從所得中間體制備最終同雙官能產(chǎn)物。實施例4制備16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亞氨基)-十六烷酸鈉鹽根據(jù)Halligan和Nair(Arkivoc2006(ii)101-106)以及Hubbs和Heathcock(JAmChemSoc，2003；125：12836-43)在兩步驟反應(yīng)中合成脂肪酸-氨氧基連接子16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亞氨基)-十六烷酸鈉鹽。中間體1：16-氧代十六烷酸鈉鹽在0℃下向16-羥基十六烷酸(800mg，2.9mmol)于二氯甲烷(10ml)和四氫呋喃(20ml)中的冷溶液(0℃)中添加戴斯馬丁高碘烷(1636mg，3.7mmol)。將混合物在氬氣氛圍下在0℃下攪拌3.5小時并且在室溫下攪拌2.5小時。接著添加硫代硫酸鈉于飽和碳酸氫鈉溶液中的15％溶液，將混合物在室溫下攪拌1.5小時。用乙醚萃取中間體1，經(jīng)過硫酸鈉脫水后，蒸發(fā)有機層至干燥并且通過管柱色譜使用作為分離劑的硅膠和甲苯/乙酸乙酯溶劑混合物進行純化。產(chǎn)率：34％(白色固體)。產(chǎn)物：16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基亞氨基)-十六烷酸鈉鹽向3，6，9-三氧雜十一烷-1，11-二氧基胺(146mg，0.65mmol)于無水四氫呋喃(3ml)中的溶液中添加中間體1(19.1mg，0.07mmol)。將混合物在氬氣氛圍下在室溫下攪拌1.5小時。接著將混合物蒸發(fā)至干燥并且通過管柱色譜使用作為分離劑的硅膠和二氯甲烷/甲醇/休尼格堿(Huenig’sbase)的溶劑混合物進行純化。產(chǎn)率：71％(白色固體)。質(zhì)譜(ESI)：[M+2H]+的m/z＝477,3529實施例5制備16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯根據(jù)Hang等(JAmChemSoc2007；129：2744-5)在三步驟反應(yīng)中合成脂肪酸甲酯-氨氧基連接子16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯。中間體1：16-羥基十六烷酸甲酯在0℃下在2分鐘內(nèi)向16-羥基十六烷酸(3000mg，10.79mmol)于無水甲醇(27ml)中的冷(0℃)溶液中添加乙酰氯(3.837ml，53.96mmol)，接著將混合物在室溫下在在氬氣氛圍下攪拌3.5小時。隨后將混合物蒸發(fā)至干燥，殘余物溶解于二氯甲烷(100ml)中，用飽和碳酸氫鈉溶液(2×50ml)和鹽水溶液(1×50ml)洗滌。經(jīng)過硫酸鈉脫水后，將收集的有機層蒸發(fā)至干燥并且在室溫下真空干燥。產(chǎn)率：92％(白色固體)。中間體2：16-甲磺?；樗峒柞ハ蛑虚g體1(2807mg，9.80mmol)于二氯甲烷(40ml)中的冷溶液(0℃)中添加三乙胺(1.502ml，10.78mmol)，接著在0℃下在10分鐘內(nèi)逐滴添加預(yù)先冷卻(0℃)的甲磺酰氯(0.834ml，10.78mmol)于二氯甲烷(5ml)中的溶液。將混合物在0℃下攪拌30分鐘并且在室溫下攪拌2.75小時。接著混合物用二氯甲烷(150ml)稀釋，用水(1×100ml)、飽和碳酸氫鈉溶液(2×100ml)和鹽水溶液(1×100ml)洗滌。經(jīng)過硫酸鈉脫水后，將收集的有機層蒸發(fā)至干燥并且在室溫下真空干燥。產(chǎn)率：95％(白色淡黃色固體)。產(chǎn)物：16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯在室溫下在氬氣氛圍下持續(xù)1小時向3，6，9-三氧雜十一烷-1，11-二氧基胺(517mg，2.30mmol)于無水N，N-二甲基甲酰胺(22ml)中的溶液中逐滴添加中間體2(70mg，0.19mmol)于無水N，N-二甲基甲酰胺(7ml)中的溶液；將混合物在不同溫度(室溫，50℃，80℃)下攪拌2天以完成反應(yīng)。接著將混合物蒸發(fā)至干燥，粗產(chǎn)物通過管柱色譜使用作為分離劑的硅膠和二氯甲烷/甲醇的溶劑混合物進行純化。產(chǎn)率：31％(無色部分固化白色油狀物)。質(zhì)譜(ESI)：[M+H]+的m/z＝493.3824實施例616-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯與凝血因子VIII的碳水化合物部分的偶合使用兩步驟程序制備FA-rFVIII。在第一步驟中，用NaIO4氧化rFVIII并且通過陰離子交換色譜(AEC)進行純化。隨后用FA-氨氧基試劑修飾氧化的rFVIII。用NaIO4(最終濃度200μM)氧化rFVIII(45mg起始材料)。30分鐘(22℃)的孵育時間后，通過添加1ML-半胱氨酸水溶液(最終濃度：10mM)終止氧化反應(yīng)。氧化的rFVIII通過陰離子交換色譜利用EMDTMAE(M)進行純化。接著將25μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根據(jù)實施例3制備)于DMSO中的溶液添加至洗脫液(蛋白質(zhì)濃度2mg/ml)中并且偶合反應(yīng)在4℃下進行18小時。隨后通過HIC利用苯基瓊脂糖4FF對FA-rFVIII偶聯(lián)物進一步純化。最終通過UF/DF使用30kD膜(MILLIPORE)濃縮洗脫液。實施例716-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯與凝血因子IX的碳水化合物部分的偶合將10mgrFIX溶解于反應(yīng)緩沖液(20mML-組氨酸、5mMCaCl2、150mMNaCl，pH6.0)中得到2.5mg/ml的最終濃度。向此溶液中添加5mMNaIO4水溶液以得到100μM的最終濃度。反應(yīng)混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在4℃下孵育1小時。接著將混合物裝載至預(yù)平衡的PD-10脫鹽管柱上以便移除過量NaIO4。向此混合物中添加8μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根據(jù)實施例3制備)于DMSO中的溶液并且偶合反應(yīng)在4℃下在pH6.0下進行18小時。偶聯(lián)物接著通過IEX利用Q-瓊脂糖FF進一步純化。最終，洗脫液通過UF/DF使用Vivaspin裝置進行濃縮。實施例816-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯與凝血因子VIIa的碳水化合物部分的偶合將10mgrFVIIa溶解于反應(yīng)緩沖液((50mMHepes、150mM氯化鈉、5mM氯化鈣，pH6.0)中得到2.0mg/ml的最終濃度。向此溶液中添加5mMNaIO4水溶液以得到50μM的最終濃度。反應(yīng)混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在4℃下孵育1小時。接著將混合物裝載至預(yù)平衡的PD-10脫鹽管柱上以便移除過量NaIO4。向此混合物中添加8μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根據(jù)實施例3制備)于DMSO中的溶液并且偶合反應(yīng)在4℃下在pH6.0下進行18小時。偶聯(lián)物接著通過IEX利用Q-瓊脂糖FF進一步純化。最終，洗脫液通過UF/DF使用Vivaspin裝置進行濃縮。實施例916-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯與凝血因子VIII的碳水化合物部分的偶合將10mgrFVIII溶解于Hepes緩沖液(50mMHepes、150mMNaCl、5mM氯化鈣，pH6.0)中得到2mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。接著將10μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根據(jù)實施例3制備)于DMSO中的溶液添加至FVIII溶液中。隨后制備親核性催化劑間甲苯胺的水溶液(50mM)并且在15分鐘內(nèi)添加至混合物中以得到10mM的最終濃度。最終添加40mM過碘酸鈉水溶液以得到400μM的濃度。反應(yīng)混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在22℃的溫度下孵育120分鐘。接著通過添加L-半胱氨酸水溶液(1M)以得到反應(yīng)混合物中10mM的最終濃度并且孵育60分鐘來終止反應(yīng)。隨后將反應(yīng)混合物裝載至填充有Q-瓊脂糖FF的IEX管柱(1.6×8cm)上。管柱用20管柱體積的平衡緩沖液(20mMHepes、5mMCaCl2，pH7.4)洗滌并且FA-rFVIII偶聯(lián)物用緩沖液B(20mMHepes、5.mMCaCl2、0.5MNaCl，pH7.4)洗脫。最終使用Hepes緩沖液7.4(20mMHepes、150mMNaCl、5mMCaCl2，pH7.4)作為滲濾緩沖液利用Vivaspin裝置對產(chǎn)物進行UF/DF。實施例1016-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氨基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯與凝血因子IX的碳水化合物部分的偶合將7mgrFIX溶解于His緩沖液(20mMHis、150mMNaCl、5mMCaCl2，pH6.0)中得到2mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。接著將7μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根據(jù)實施例3制備)于DMSO中的溶液添加至FIX溶液中。隨后制備親核性催化劑間甲苯胺的水溶液(50mM)并且在15分鐘內(nèi)添加至混合物中以得到10mM的最終濃度。最終添加40mM過碘酸鈉水溶液以得到250μM的濃度。反應(yīng)混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在22℃的溫度下孵育120分鐘。隨后在室溫下通過添加L-半胱氨酸(最終濃度：5mM)歷時30分鐘淬滅反應(yīng)。通過陰離子交換色譜對FA-rFIX偶聯(lián)物進行純化。反應(yīng)混合物用10ml緩沖液A(50mMHepes、5mMCaCl2，pH7.5)稀釋并且裝載至用緩沖液A平衡的5mlHiTrapQFF管柱(GEHealthcare，F(xiàn)airfield，CT)上。使用相同緩沖液用5CV洗滌管柱。接著用緩沖液B(50mMHepes、1MNaCl、5mMCaCl2，pH7.5)洗脫管柱。含有偶聯(lián)物的洗脫份通過UF/DF使用由再生纖維素制成的10kD膜進行濃縮。以含有150mMNaCl和5mMCaCl2的20mMHepes緩沖液(pH7.2)進行最終滲濾步驟。實施例1116-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯與凝血因子VIIa的碳水化合物部分的偶合將10mgrFVIIa溶解于Hepes緩沖液(50mMHepes、150mM氯化鈉、5mM氯化鈣，pH6.0)中。接著將10μl10％(w/v)16-(2-(2-(2-(2-氨氧基乙氧基)-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基氨基)-十六烷酸甲酯(根據(jù)實施例3制備)于DMSO中的溶液添加至FVIIa溶液中。隨后制備親核性催化劑間甲苯胺的水溶液(50mM)并且在15分鐘內(nèi)添加至混合物中以得到10mM的最終濃度。最終添加40mM過碘酸鈉水溶液以得到250μM的濃度。反應(yīng)混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在22℃的溫度下孵育120分鐘。隨后在室溫下通過添加L-半胱氨酸(最終濃度：5mM)歷時30分鐘淬滅反應(yīng)。通過陰離子交換色譜對FA-rFVIIa偶聯(lián)物進行純化。反應(yīng)混合物用10ml緩沖液A(50mMHepes，pH7.4)稀釋并且裝載至用緩沖液A平衡的5mlHiTrapQFF管柱(GEHealthcare，F(xiàn)airfield，CT)上。使用相同緩沖液用5CV洗滌管柱。接著用緩沖液B(50mMHepes、1MNaCl、5mMCaCl2，pH7.4)洗脫管柱。含有偶聯(lián)物的洗脫份通過UF/DF使用由再生纖維素制成的10kD膜進行濃縮。以含有150mMNaCl和5mMCaCl2的20mMHepes緩沖液(pH7.2)進行最終滲濾步驟。實施例12在親核性催化劑存在下含有活性氨氧基的FA衍生物與氧化的碳水化合物部分的偶合也提供含有活性氨氧基的FA衍生物與氧化的治療蛋白質(zhì)(如本文表1中所述的蛋白質(zhì))的偶合。為偶合含有氨氧基的FA衍生物，首先用NaIO4(濃度：200μM)氧化治療蛋白質(zhì)(例如EPO、G-CSF或胰島素；參見表1；濃度：0.5-3mg/ml)的碳水化合物部分(主要為N-聚糖)。接著通過添加L-半胱氨酸(最終濃度：5mM)終止反應(yīng)，并且通過UF/DF分離試劑。滲濾后，使用25M過量添加FA氨氧基試劑(即FA衍生物)，并且偶合反應(yīng)在親核性催化劑間甲苯胺(濃度：10mM)存在下在輕緩攪拌下在室溫下于pH6.0下進行1小時。隨后將反應(yīng)混合物裝載至離子交換(IEX)管柱上。管柱用＞5CV洗滌緩沖液洗滌并且用線性NaCl梯度洗脫偶聯(lián)物。最終對含有偶聯(lián)物的洗脫份進行UF/DF。實施例13在親核性催化劑存在下含有活性氨氧基的FA衍生物與氧化的碳水化合物部分的偶合為使含有氨氧基的FA衍生物與治療蛋白質(zhì)的碳水化合物部分偶合，將蛋白質(zhì)(例如EPO、G-CSF或胰島素；參見表1；濃度：0.5-3mg/ml)與NaIO4(濃度：300μM)一起在親核性催化劑間甲苯胺(濃度：10mM)存在下在室溫下在pH6.0下孵育1小時。接著通過添加L-半胱氨酸(最終濃度：5mM)終止反應(yīng)，并且將反應(yīng)混合物裝載至離子交換(IEX)管柱上。管柱用＞5CV洗滌緩沖液洗滌并且用線性NaCl梯度洗脫偶聯(lián)物。最終對含有偶聯(lián)物的洗脫份進行UF/DF。實施例14在親核性催化劑存在下含有活性氨氧基的FA衍生物與氧化的凝血蛋白的偶合可在濃度范圍為2-20mM的親核性催化劑(如間甲苯胺)存在下進行含有活性氨氧基的FA衍生物與氧化的凝血蛋白(如FIX、FVIII和FVIIa，如上述實施例中所述)的偶合。實施例15制備水溶性MAL脂肪酸連接子以兩步驟合成法制備在ω位含有水溶性PEG鏈并且含有活性MAL基團的脂肪酸連接子：步驟1：制備16-羥基十六烷酸甲酯：根據(jù)實施例3在甲醇中在室溫下用乙酰氯酯化市售16-羥基十六烷酸5小時，得到相應(yīng)甲酯(Hang等，Chemicalprobesfortherapiddetectionoffatty-acylatedproteinsinmammaliancells，JACS2007；129：2744-5)。步驟2：制備MAL脂肪酸連接子：在室溫下在THF中采用光延反應(yīng)(Mitsunobureaction)使16-羥基十六烷酸甲酯與市售MAL-PEG-COOH(mal-Peg(12)-COOH/IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)反應(yīng)過夜(Toyokuni等，SynthesisofaNewHeterobifunctionalLinker，N-[4-(Aminooxy)butyl]-maleimide，forFacileAccesstoaThiol-Reactive18F-LabelingAgent，BioconjugateChem2003；14：1253-9)。實施例16制備水溶性NHS脂肪酸連接子通過使用四步驟合成法制備在ω位含有水溶性PEG鏈并且含有末端活性NHS酯的脂肪酸連接子：步驟1：制備16-溴十六烷酸甲酯在回流溫度下用甲醇和催化量的濃硫酸酯化市售16-溴十六烷酸過夜，得到相應(yīng)甲酯(Zinic等，PositionallyIsomericOrganicGelators：Structure-GelationStudy，RacemicversusEnantiomericGelators，andSolvationEffects，ChemEurJ2010；16：3066-82)。步驟2：制備16-疊氮基十六烷酸甲酯使16-溴十六烷酸甲酯與疊氮化鈉在乙腈中在回流溫度下反應(yīng)四天得到相應(yīng)疊氮化物(Zinic等，PositionallyIsomericOrganicGelators：Structure-GelationStudy，RacemicversusEnantiomericGelators，andSolvationEffects，Chem.Eur.J.2010；16：3066-82)。步驟3：制備16-氨基十六烷酸甲酯在甲醇中在3巴下用鈀/活性炭對16-疊氮基十六烷酸甲酯進行催化氫化三小時，得到相應(yīng)胺(Zinic等，PositionallyIsomericOrganicGelators：Structure-GelationStudy，RacemicversusEnantiomericGelators，andSolvationEffects，Chem.Eur.J.2010；16：3066-82)。步驟4：制備NHS脂肪酸連接子使16-氨基十六烷酸甲酯與市售NHS-PEG-NHS(NHS-dPEG(4)-NHS/IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)在1，4-二噁烷中在室溫下反應(yīng)三天，得到NHS脂肪酸連接子(Cline等，TheAminolysisofN-HydroxysuccinimideEsters.AStructure-ReactivityStudy，JACS1987；109：3087-91)。實施例17蛋白質(zhì)FA偶聯(lián)物的分析表征通過使用酶聯(lián)免疫吸附測定(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay；ELISA)系統(tǒng)在體外驗證根據(jù)本文的實施例制備的FA-rFVIII、rFIX或FVIIa樣品的白蛋白結(jié)合性質(zhì)。將96孔盤用針對人血清白蛋白(HSA)的多克隆抗體涂布。下一步驟為用PBS-明膠緩沖液阻斷ELISA盤。接著使HSA結(jié)合于抗體，隨后結(jié)合稀釋至不同濃度的FA-蛋白質(zhì)樣品。最后利用過氧化物酶標(biāo)記的抗VIII、抗FIX或抗FVIIa抗體檢測HSA-蛋白質(zhì)樣品。使用四甲基-聯(lián)苯胺(TMB)作為底物檢測過氧化物酶活性。利用ELISA讀取器在450nm下測量顯色強度。通過在x軸上繪出不同樣品濃度并在y軸上繪出其相應(yīng)吸光度值評估FA-蛋白質(zhì)與HSA的結(jié)合。實施例18制備含有氨氧基的水溶性聚乙二醇化脂肪酸連接子使用如實施例1中所述的3-氧雜戊烷-1，5-二氧基胺在三步驟合成法中制備含有水溶性PEG鏈并在ω位具有連接至脂肪酸羧基的氨氧基部分的脂肪酸連接子。步驟1：制備N-(9-芴基甲氧基羰基)-3-氧雜戊烷-1，5-二氧基胺使3-氧雜戊烷-1，5，二氧基胺與氯甲酸9-芴基甲酯在1，4-二噁烷中在環(huán)境溫度下反應(yīng)1小時。在減壓下蒸發(fā)溶液并且粗產(chǎn)物采用硅膠色譜以二氯甲烷/甲醇20/1(v/v)作為溶劑混合物進行純化，得到純的受到單FMOC保護的二氧基胺(Boturyn等，SynthesisofFluorescentProbesfortheDetectionofAbasicSitesinDNA，Tetrahedron1997；第53卷，第15號，5485-92)。步驟2：制備十六烷酸(2-(2-(N-(9-芴基甲氧基羰基)氨氧基)乙氧基)乙氧基)酰胺使N-(9-芴基甲氧基羰基)-3-氧雜戊烷-1，5-二氧基胺與市售棕櫚酸N-羥基琥珀酰亞胺酯在THF中在環(huán)境溫度下反應(yīng)過夜得到受到單FMOC保護的氨氧基-脂肪酸偶聯(lián)物(Jong等，SynthesisofceramidesusingN-hydroxysuccinimideesters，JournalofLipidResearch1972；第13卷，819-22)。步驟3：制備十六烷酸(2-(2-氨氧基乙氧基)乙氧基)酰胺使受到單FMOC保護的氨氧基-脂肪酸偶聯(lián)物與吡啶在二氯甲烷中在環(huán)境溫度下反應(yīng)得到脫除保護基的氨氧基-脂肪酸連接子作為最終產(chǎn)物(Boturyn等，SynthesisofFluorescentProbesfortheDetectionofAbasicSitesinDNA，Tetrahedron1997；第53卷，第15號，5485-92)。實施例19MAL脂肪酸連接子與A1PI的偶合如實施例15中所述采用光延反應(yīng)通過使16-羥基十六烷酸甲酯與市售MAL-PEG-COOH(mal-Peg(12)-COOH/IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)反應(yīng)制備含有MAL基團的脂肪酸連接子。使此連接子與A1PI的游離SH基團偶合。將10mg經(jīng)過純化的A1PI(濃度：1mg/ml)溶解于反應(yīng)緩沖液(20mM磷酸鹽、5mMEDTA，pH7.0)中并且添加10μL5％(w/v)MAL脂肪酸連接子于DMSO中的溶液至A1PI溶液中。修飾反應(yīng)在室溫下進行2小時，接著使用L-半胱氨酸(最終濃度：10mM)進行淬滅步驟。添加L-半胱氨酸后，反應(yīng)混合物在輕緩攪拌下在相同溫度下再孵育1小時。經(jīng)過修飾的A1PI用平衡緩沖液(25mM磷酸鹽，pH6.5)稀釋以將溶液導(dǎo)電率校正至＜4.5mS/cm，并裝載至管柱體積(CV)為5ml的預(yù)填充HiTrapQFF(GE-Healthcare)上。接著管柱用10CV平衡緩沖液(流速：2ml/min)平衡。最終用洗脫緩沖液(25mMNa2HPO4、1MNaCl，pH6.5)以線性梯度洗脫PEG-A1PI。實施例20NHS脂肪酸連接子與凝血因子VIII的偶合如實施例16中所述通過使16-羥基十六烷酸甲酯與市售NHS-PEG-NHS(NHS-dPEG(4)-NHS(IRISBiotechGmbH，Marktredwitz，Germany)反應(yīng)制備含有NHS基團的脂肪酸連接子。使此連接子與凝血因子VIII的賴氨酸殘基的游離氨基偶合。將10mgrFVIII溶解于Hepes緩沖液(50mMHepes、150mMNaCl、5mM氯化鈣，pH6.0)中得到2mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。接著向FVIII溶液中添加10μl10％(w/v)NHS脂肪酸連接子于DMSO中的溶液。反應(yīng)混合物在黑暗中在輕緩攪拌下在22℃的溫度下孵育120分鐘。接著通過添加甘氨酸水溶液(1M)以得到反應(yīng)混合物中20mM的最終濃度來終止反應(yīng)?；旌衔镌谑覝叵略谳p緩攪拌下孵育15分鐘并隨后裝載至填充有Q-瓊脂糖FF的IEX管柱(1.6×8cm)上。管柱用20管柱體積的平衡緩沖液(20mMHepes、5mMCaCl2，pH7.4)洗滌并且FA-rFVIII偶聯(lián)物用緩沖液B(20mMHepes、5mMCaCl2、0.5MNaCl，pH7.4)洗脫。最終使用Hepes緩沖液7.4(20mMHepes、150mMNaCl、5mMCaCl2，pH7.4)作為滲濾緩沖液利用Vivaspin裝置對產(chǎn)物進行UF/DF。