專利名稱：可用于治療人或動物免疫相關(guān)性疾病的白介素-4治療性疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于治療人或動物免疫相關(guān)性疾病的白介素-4治療性疫苗。
背景技術(shù)：
到目前為止，人們對細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體(病毒、細(xì)菌、寄生蟲等)所引起的慢性傳染病仍缺乏比較有效的治療辦法，疫苗預(yù)防效果也不理想。從理論上講，這類慢性傳染病需要宿主產(chǎn)生堅強的一類(Thl)抗感染免疫反應(yīng)才能清除病原體，但如何誘導(dǎo)機體產(chǎn)生堅強的Thl抗感染免疫反應(yīng)仍然是個難題。根據(jù)申請人長期的探索研究發(fā)現(xiàn)，這類慢性傳染病的臨床發(fā)病階段大多數(shù)都表現(xiàn)為很強的二類( 抗感染免疫反應(yīng)，即以Th2抗感染免疫反應(yīng)為主；而亞臨床感染則大多數(shù)都表現(xiàn)為很強的Thl抗感染免疫反應(yīng)，即以Thl抗感染免疫反應(yīng)為主。進一步的研究證明，一類和二類免疫反應(yīng)的產(chǎn)生并不是同步發(fā)生的，相輔相成的形式，而是相互抑制的，此起彼伏的形式。IL-4是誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，如果能降低宿主體內(nèi)IL-4的含量，即可有效的抑制Th2免疫反應(yīng)，從而促進Thl免疫反應(yīng)的發(fā)生。實驗證明，給宿主注射抗IL-4抗體即可達到此目的。但由于抗體的半衰期較短(IgG的半衰期約21- 天)，需要反復(fù)多次注射，不但提高了成本，而且易引起過敏反應(yīng)。 急需一種成本低廉、且不會引起過敏反應(yīng)的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一類制備簡單、成本低廉、且安全可靠的可用于治療人或動物免疫相關(guān)性疾病的白介素-4治療性疫苗。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的可用于治療人或動物免疫相關(guān)性疾病的白介素-4治療性疫苗，是以白介素-4的天然或人工合成的完整蛋白或蛋白片段(多肽或寡肽，在做疫苗前需進一步與其它抗原大分子相偶聯(lián))做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或偶聯(lián)蛋白疫苗；或以白介素-4的完整基因或基因片段做抗原基因或主要抗原基因制成的任何形式的基因疫苗或融合基因疫苗；或以任何載體克隆IL-4的完整基因或基因片段、以任何表達系統(tǒng)擴增基因所制的基因疫苗，或表達IL-4的完整蛋白或蛋白片段(多肽或寡肽)做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或融合蛋白疫苗；如果所選擇的表達載體屬于活載體，也可做成活載體基因工程疫苗。所述疫苗中可添加有醫(yī)學(xué)上常規(guī)的疫苗佐劑。本發(fā)明的疫苗不但可用于治療人或動物的慢性傳染病和寄生蟲病，還可進一步推廣應(yīng)用到癌癥、某些類型的過敏反應(yīng)等與免疫相關(guān)的疾病治療中去。根據(jù)所制備的疫苗形式不同，本發(fā)明的疫苗的實施方式可有多種如鋁膠佐劑、油佐劑、脂質(zhì)體佐劑等疫苗，可采用皮下注射、皮內(nèi)注射和肌肉注射等多種不同方式；如果是活載體疫苗，除了以上注射方式外，還可采用口服、吸入、滴鼻、滴眼等不同方式。本發(fā)明是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷“給宿主注射抗IL-4抗體，需要反復(fù)多次注射，不但提高了成本，而且易引起過敏反應(yīng)”，而提出的技術(shù)方案，即采用IL-4疫苗的形式對宿主進行主動免疫治療，一般，首次免疫即可達到約2 3個月的有效時間，二次免疫即可達到約半年的有效治療時間，經(jīng)過1 3次的免疫治療，即可達到康復(fù)的目的。與直接應(yīng)用抗IL-4抗體治療相比，有應(yīng)用次數(shù)少，用量低等特點，這樣，不但大大降低了治療成本，而且，大大降低了產(chǎn)生過敏反應(yīng)的可能性。


圖1 給實驗BALB/c小鼠分別于誘導(dǎo)過敏反應(yīng)前3周和1周皮下(s. c.)接種實施例ι所制備的(見下面實施例1) IL-4基因重組油佐劑疫苗，另設(shè)pET-32載體油佐劑疫苗和生理鹽水免疫對照組。于第0周和第3周分別用低劑量(5μ g)雞卵清白蛋白(OVA)鋁膠疫苗腹腔接種，以致敏小鼠，于第5周用高劑量(80 μ g，溶解在50 μ 1 PBS中)OVA由鼻孔滴入，以誘導(dǎo)產(chǎn)生過敏反應(yīng)。結(jié)果顯示IL-4基因重組油佐劑疫苗免疫組與pET-32載體油佐劑疫苗組和生理鹽水免疫對照組相比，IL-4基因重組油佐劑疫苗可顯著降低OVA-IgE特異性抗體的產(chǎn)生。圖2 給實驗BALB/c小鼠分別于利什曼寄生蟲接種前3周和1周腹腔(i. p.)接種實施例1所制備的(見下面實施例1) IL-4基因重組鋁膠疫苗，另設(shè)pET-32載體鋁膠疫苗和生理鹽水免疫對照組。適量利什曼寄生蟲皮下(s. c.)注射接種于小鼠后肢足墊。接種后每周用卡尺測量一次足墊處的病變大小，持續(xù)8 10周。結(jié)果表明，IL-4基因重組疫苗能夠顯著降低利什曼寄生蟲的感染。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1 小鼠IL-4基因重組疫苗的構(gòu)建與疫苗制備根據(jù)小鼠IL-4的全基因編碼序列，設(shè)計一對合適的引物，通過RT-PCR方法擴增 IL-4cDNA序列。然后，經(jīng)過DNA序列測定，證明所擴增的cDNA序列準(zhǔn)確無誤后，再將其克隆至pET-32融合表達載體的適當(dāng)部位，并進一步將重組質(zhì)粒以及pET-32融合表達載體空白對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入適當(dāng)表達用大腸桿菌菌株中，經(jīng)過規(guī)模發(fā)酵，提取純化IL-4融合蛋白以及載體對照所表達的硫氧還原蛋白。將純化IL-4融合蛋白或載體對照所表達的硫氧還原蛋白與油佐劑或鋁膠佐劑等按適當(dāng)比例混合后根據(jù)純化IL-4融合蛋白的含量不同，對油佐劑疫苗，可將油/蛋白水溶液的體積比控制在(1 1) (3 1)；對鋁膠佐劑疫苗，可將鋁膠/蛋白水溶液的體積比控制在(1 1) (1 5)；要求每頭份疫苗中IL-4融合蛋白或載體對照硫氧還原蛋白的量約為15-20 μ g ；每頭份疫苗的體積約為0. Iml ；或根據(jù)獸醫(yī)藥典操作規(guī)程制備，進一步勻漿乳化(按所用勻漿機的操作規(guī)程進行)制成實驗用疫苗。所述油佐劑為由94% (V/V)礦物油(10號白油)、6% (V/V)的Span-80、2% (g/V) 硬脂酸鋁加熱溶解后形成的淡黃色油狀液體；油佐劑為疫苗蛋白溶液與油佐劑經(jīng)乳化而形成的粘稠的乳白色油包水型疫苗。一般采用注射接種，為現(xiàn)有技術(shù)中常用的產(chǎn)品，是目前在動物用滅活疫苗中使用較廣的佐劑。
所述鋁膠佐劑也為動物用滅活疫苗中使用較廣的佐劑。實施例2 小鼠IL-4基因重組疫苗的安全性試驗與過敏反應(yīng)試驗按實施例1的方法，將純化IL-4融合蛋白或載體對照所表達的硫氧還原蛋白用生理鹽水適當(dāng)稀釋后與油佐劑或鋁膠佐劑按1 1的體積比混合制備成IL-4融合蛋白疫苗或載體對照硫氧還原蛋白疫苗。制備好的IL-4融合蛋白疫苗分低(0. 1ml，約1頭份)、中 (0. 25ml，約2.5頭份)、高(0. 5ml，約5頭份)三個不同劑量組分別免疫BALB/c小鼠，另設(shè) pET-32載體疫苗和生理鹽水對照組，每組5只小鼠，皮下多點注射。間隔3周，分別進行第二次和第三次免疫注射。疫苗注射后分別觀察小鼠有無不良反應(yīng)、過敏、死亡等現(xiàn)象。結(jié)果表明小鼠接種疫苗后發(fā)育良好，精神狀態(tài)和食欲均正常，接種部位有一過性腫脹、發(fā)熱等不良反應(yīng)，尤其在高劑量組表現(xiàn)更為明顯。對于油佐劑苗，高劑量組小鼠，由于疫苗吸收較慢，有輕度肉芽腫反應(yīng)。實施例3 小鼠IL-4基因重組疫苗增強抗腫瘤活性的試驗按實施例1的方法，將純化的IL-4融合蛋白或載體對照所表達的硫氧還原蛋白用生理鹽水適當(dāng)稀釋后與鋁膠佐劑按11的比例混合制備實驗或?qū)φ找呙?。要求每頭份疫苗中IL-4融合蛋白或載體對照硫氧還原蛋白的量約為15 20μ g ；每頭份疫苗的體積約為0. Iml0給實驗小鼠分別于腫瘤細(xì)胞攻擊前3周和1周腹腔(i. p.)接種實施例1所制備的IL-4基因重組鋁膠疫苗，另設(shè)pET-32載體鋁膠疫苗和生理鹽水免疫對照組。腫瘤接種后每隔3天檢查一次腫瘤生長情況，實驗60天結(jié)束。結(jié)果表明，IL-4基因重組疫苗能夠顯著降低腫瘤的發(fā)生率(見表1)。表1 小鼠IL-4基因重組疫苗增強抗腫瘤活性的試驗結(jié)果(每組10只，數(shù)據(jù)為存
活率％ )
權(quán)利要求
1.可用于治療人或動物免疫相關(guān)性疾病的白介素-4治療性疫苗，其特征在于其是以白介素-4的天然或人工合成的完整蛋白或蛋白片段做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或偶聯(lián)蛋白疫苗。
2.可用于治療人或動物免疫相關(guān)性疾病的白介素-4治療性疫苗，其特征在于其是以白介素-4的完整基因或基因片段做抗原基因或主要抗原基因制成的任何形式的基因疫苗或融合基因疫苗。
3.可用于治療人或動物免疫相關(guān)性疾病的白介素-4治療性疫苗，其特征在于其是以任何載體克隆IL-4的完整基因或基因片段、以任何表達系統(tǒng)擴增基因所制的基因疫苗，或表達IL-4的完整蛋白或蛋白片段做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或融合蛋白疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的可用于治療人或動物免疫相關(guān)性疾病的白介素-4 治療性疫苗，其特征在于所述疫苗中添加有醫(yī)學(xué)上常規(guī)的疫苗佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可用于治療人或動物免疫相關(guān)性疾病的白介素-4治療性疫苗，其是以白介素-4的天然或人工合成的完整蛋白或蛋白片段做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或偶聯(lián)蛋白疫苗；或以白介素-4的完整基因或基因片段做抗原基因或主要抗原基因制成的任何形式的基因疫苗或融合基因疫苗。本發(fā)明采用IL-4疫苗的形式對宿主進行主動免疫治療，一般，首次免疫即可達到約2～3個月的有效時間，二次免疫即可達到約半年的有效治療時間，經(jīng)過1～3次的免疫治療，即可達到康復(fù)的目的。與直接應(yīng)用抗IL-4抗體治療相比，有應(yīng)用次數(shù)少，用量低等特點，這樣，不但大大降低了治療成本，而且，大大降低了產(chǎn)生過敏反應(yīng)的可能性。
文檔編號A61P37/00GK102266551SQ201110174918
公開日2011年12月7日 申請日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者劉永慶 申請人:劉永慶