一種環(huán)己酮單加氧酶及其在合成埃索美拉唑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種環(huán)己麗單加氧酶，生產(chǎn)該環(huán)己麗單 加氧酶的基因工程菌的構(gòu)建，該環(huán)己麗單加氧酶的生產(chǎn)及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 質(zhì)子泉抑制劑（proton pump inhibitors, PPIs)用于治療酸相關(guān)性疾病，是近十 幾年來(lái)臨床應(yīng)用廣泛、療效最好的藥物。PPIs即H7K+-ATP酶抑制劑，其抑酸作用強(qiáng)，特異 性高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)久。胃酸分泌的最后步驟是胃壁細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子泉驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)H+與小管內(nèi)K+ 交換。研究認(rèn)為；血液中的PPIs進(jìn)入胃壁細(xì)胞后聚集在強(qiáng)酸性的分泌小管中，轉(zhuǎn)化為活性 的次礙醜胺類(lèi)化合物，與質(zhì)子泉的半脫氨酸殘基上的硫離共價(jià)結(jié)合，形成二硫鍵，使質(zhì)子泉 失活，從而抑制中樞或外周介導(dǎo)的胃酸分泌。與W往臨床應(yīng)用的抑制胃酸藥物肥受體枯抗 劑相比較，作用位點(diǎn)不同且有著不同的特點(diǎn)，即夜間的抑酸作用好、起效快，抑酸作用強(qiáng)且 時(shí)間長(zhǎng)、服用方便，所W能抑制基礎(chǔ)胃酸的分泌及組胺、己醜膽堿、胃泌素和食物刺激引起 的酸分泌。
[0003] PPIs已經(jīng)成為治療胃酸異常分泌及相關(guān)疾病的一線用藥。傳統(tǒng)的質(zhì)子泉抑制劑 為弱堿性的苯并咪哇化合物，如奧美拉哇、蘭索拉哇、雷貝拉哇及泮巧拉哇。后期的研究主 要集中在延長(zhǎng)單次給藥的抑酸持續(xù)時(shí)間。埃索美拉哇是奧美拉哇的S異構(gòu)體，是第一個(gè)發(fā) 展為異構(gòu)體的質(zhì)子泉抑制劑。后來(lái)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了右蘭索拉哇、左旋泮巧拉哇。2010年，全球 PPIs的銷(xiāo)售額達(dá)到139億美元，高居藥物銷(xiāo)售額第H位。
[0004] 中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1157614中公開(kāi)了一種在有機(jī)溶劑中在由鐵（IV)化合物和手性 支鏈或非支鏈烷基二元醇或芳族醇制得的手性鐵配合物和有機(jī)堿存在下，用過(guò)氧化氨類(lèi)衍 生物氧化前手性硫離而制得埃索美拉哇的方法。
[0005] 中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN101098867中公開(kāi)了一種在堿和手性鐵配合物存在下利用氨過(guò) 氧化物氧化前手性硫離制備艾普拉哇的方法。
[0006] 中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1193971公開(kāi)了將奧美拉哇、蘭索拉哇或雷貝拉哇在水與有機(jī)溶 劑的混合溶液中提純出對(duì)映體含量高的S-或R-構(gòu)型的方法。
[0007] 上述合成單一構(gòu)型的化合物制備工藝均存在利用拆分工藝收率較低、成本較高、 或需要使用價(jià)格昂貴的貴金屬催化劑等缺點(diǎn)。
[0008] 硫離單加氧酶是一類(lèi)依賴(lài)于黃素的單加氧酶，可W活化利用H線態(tài)的氧氣分子， 使硫離氧化成手性的亞諷。該過(guò)程需要還原態(tài)的黃素輔酶（FADHz或者FMNH2)，反應(yīng)結(jié)束后 輔酶轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的氧化態(tài)FAD+或者FMN+，后者在NADPH的存在下轉(zhuǎn)變成對(duì)應(yīng)的還原型輔酶， 實(shí)現(xiàn)輔酶再生。反應(yīng)同時(shí)還產(chǎn)生了一個(gè)電〇2,對(duì)酶活不利，因此需要加入過(guò)氧化氨酶使之消 除。機(jī)理如下：
[0009]
[0010] 采用生物氧化法制備亞諷具有立體選擇性好，過(guò)度氧化副產(chǎn)物低，綠色環(huán)保等優(yōu) 點(diǎn)而受到關(guān)注。美國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)US5840552中披露了用微生物催化的不對(duì)稱(chēng)氧化合成S-奧 美拉哇的方法，青霉菌和不動(dòng)桿菌均表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)化能力和立體選擇性；US20130017580 披露了用不動(dòng)桿菌來(lái)源的氧化酶催化的不對(duì)稱(chēng)合成S-奧美拉哇的方法，但是底物投料濃 度僅有50g/L，且酶的熱穩(wěn)定性較差，25C反應(yīng)速度慢，40小時(shí)W上才能轉(zhuǎn)化徹底，難W放 大生產(chǎn)。
[0011]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中合成拉哇類(lèi)藥物采用的拆分工藝中收率較低，W及采用貴金屬催 化工藝中成本較高、收率較低及后處理難W進(jìn)行等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種催化活性高、反應(yīng) 收率高、對(duì)環(huán)境友好的環(huán)己麗單加氧酶進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)氧化反應(yīng)合成單一構(gòu)型的拉哇類(lèi)藥物。 本發(fā)明還提供了該環(huán)己麗單加氧酶的基因，含有該基因的重組表達(dá)載體、重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體 及該環(huán)己麗單加氧酶的高效制備方法，W及該環(huán)己麗單加氧酶在催化前手性硫離化合物成 單一構(gòu)型的亞諷中的用途。
[0013] 本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案W解決上述技術(shù)問(wèn)題：
[0014] 本發(fā)明的第一方面提供了一種分離的環(huán)己麗單加氧酶，其是如下（a)、化）或（C) 的蛋白質(zhì)：
[0015] (a)由SEQ ID No:2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[001引 SEQ ID No:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)由環(huán)境DNA編碼，具有氧化硫離的功 能，是一種新的環(huán)己麗單加氧酶。
[0017] 化）在（a)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基衍生的 具有環(huán)己麗單加氧酶活性的蛋白質(zhì)。
[001引其中，所述的"幾個(gè)"是指2個(gè)至小于100個(gè)，更佳的是10個(gè)。比如添加一個(gè)外分 泌信號(hào)膚的融合蛋白，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)送樣的融合蛋白同樣具有環(huán)己麗單加氧酶活性。也就是 說(shuō)，只要由（a)衍生的蛋白質(zhì)具有環(huán)己麗單加氧酶活性，且衍生方式如上所述，都可W達(dá)到 本發(fā)明的發(fā)明目的。根據(jù)本發(fā)明，在如SEQ ID No:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)分子中進(jìn)行 1~5個(gè)氨基酸殘基的突變，仍然保持環(huán)己麗單加氧酶活性。
[001 引（C)和（a)的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性且具有環(huán)己 麗單加氧酶活性的蛋白質(zhì)。
[0020] SEQ ID No:2所示的環(huán)己麗單加氧酶和已知的環(huán)己麗單加氧酶序列具有顯著的差 異性，例如與不動(dòng)桿菌來(lái)源的CHMO之間的同一性為80%。
[0021] 在本文中，氨基酸序列之間的同一性是根據(jù)序列的全長(zhǎng)進(jìn)行計(jì)算，優(yōu)選采用NCBI Bias化程序進(jìn)行比對(duì)，默認(rèn)參數(shù)。
[0022] 本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種分離的核酸，其編碼本發(fā)明的環(huán)己麗單加氧酶。 優(yōu)選地，所述核酸是由SEQ ID No: 1所示核巧酸序列組成的。
[0023] SEQ ID No: 1所示的核巧酸序列組成的核酸來(lái)源于環(huán)境DNA，其可^從±壤樣本中 分離獲得，也可W從含有該核酸的重組表達(dá)載體中或重組轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可W全基 因人工合成獲得。
[0024] 本發(fā)明中，SEQ ID No:l所示的基因命名為BYKY-M0,全長(zhǎng)1629bp。其中，其編碼 序列（CD巧從第1個(gè)堿基起至第1626個(gè)堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA。該 序列無(wú)內(nèi)含子，其編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo:2所示。
[00巧]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，編碼SEQ ID No:2的氨基酸序列的 核巧酸序列不僅僅局限于SEQ ID No: 1。本發(fā)明的環(huán)己麗單加氧酶基因的核巧酸序列也可 W是編碼序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的其他任何核巧酸序列。另外，還可W通 過(guò)適當(dāng)引入替換、缺失或插入來(lái)提供多聚核巧酸的同系物。本發(fā)明中多聚核巧酸的同系物 可W通過(guò)對(duì)核巧酸序列SEQ ID No:l的一個(gè)或多個(gè)堿基在保持酶活性范圍內(nèi)進(jìn)行替換、缺 失或添加來(lái)制得。
[0026] SEQ ID No: 1的同系物也指啟動(dòng)子變體。在所述的核巧酸序列之前的啟動(dòng)子或信 號(hào)序列可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核巧酸的替換、插入或缺失而改變，但送些改變對(duì)啟動(dòng)子的功能 沒(méi)有負(fù)面影響。而且通過(guò)改變啟動(dòng)子的序列或甚至用來(lái)自不同種生物體的更有效的啟動(dòng)子 完全替換，可提局目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。
[0027] SEQ ID No: 1的同系物還指在標(biāo)準(zhǔn)條件下能夠與SEQ ID No: 1所示序列的多聚 核酸進(jìn)行雜交的多聚核酸。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行雜交可根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中描述的 方式進(jìn)行；Cold Spring Harbor L油oratory Press,分子生物學(xué)中的通用方案（Qirrent Protocols in Molecular Biology)。具體來(lái)說(shuō)，雜交可W按照如下步驟進(jìn)行；將一個(gè)載有 被轉(zhuǎn)錄的待測(cè)DNA或RNA分子的膜與一個(gè)標(biāo)記探針在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交；雜交緩沖 液的組成為0.1 wt% SDS、5wt%硫酸右旋糖巧、一盒1/20的稀釋抑制劑W及2~8XSSC ; 20 X SSC為3M氯化鋼和0. 3M的巧樣酸組成的溶液；雜交溫度為50~70°C ;在培養(yǎng)幾個(gè)小 時(shí)或過(guò)夜后，用清洗緩沖液清洗膜；清洗溫度為室溫，更優(yōu)選為雜交溫度；清洗緩沖液的組 成為6 X SSC+0.1 wt % SDS溶液，更優(yōu)選為5 X SSC+0.1 wt % SDS ;當(dāng)用送種清洗緩沖液清洗 完膜后，就可W通過(guò)DNA或RNA分子內(nèi)被雜交的探針上的標(biāo)記來(lái)識(shí)別DNA或RNA分子。
[0028] 本發(fā)明的第H個(gè)方面提供了一種包含本發(fā)明的環(huán)己麗單加氧酶基因的重組表達(dá) 載體。其可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的環(huán)己麗單加氧酶基因或其突變體的核酸序列連 接于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的表達(dá)載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如市售的質(zhì) 粒、粘粒、瞻菌體或病毒載體等，優(yōu)選質(zhì)粒載體。較佳地，可通過(guò)下述方法制得本發(fā)明的重組 表達(dá)載體；將通過(guò)PCR擴(kuò)增所得的目的核酸片段與表達(dá)載體祀T28a分別用NdeI和化ndllI 酶切，形成互補(bǔ)的粘性末端，經(jīng)T4DNA連接酶連接，形成含有本發(fā)明的環(huán)己麗單加氧酶基因 的重組表達(dá)質(zhì)粒祀T28a-BYKY-M0或含有編碼其突變體的核酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0029] 本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種包含本發(fā)明的重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。 可通過(guò)將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中制得。所述的宿主細(xì)胞可為本領(lǐng)域常規(guī) 的宿主細(xì)胞，只要能滿(mǎn)足重組表達(dá)載體可穩(wěn)定地自行復(fù)制，且所攜帶的本發(fā)明的環(huán)己麗單 加氧酶基因可被有效表達(dá)即可。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌化COli)，更優(yōu)選E. COli BL21 〇)E3)。 將前述重組表達(dá)質(zhì)粒BYKY-MO或其突變體轉(zhuǎn)化至E. COli BL2UDE3)中，即可獲得本發(fā)明優(yōu) 選的基因工程菌株，即E. COli化21 0E3)/祀T28a-BYKY-M0或其突變體。轉(zhuǎn)化方法可選擇本 領(lǐng)域常規(guī)方法，如電轉(zhuǎn)法、熱擊法等，較佳地選擇熱擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化即可，熱擊條件較佳的是： 42 °C，熱擊45砂。
[0030] 本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供一種重組環(huán)己麗單加氧酶的制備方法，其包括如下的 步驟；培養(yǎng)本發(fā)明的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，W及從培養(yǎng)物中獲得重組環(huán)己麗單加氧酶。
[0031] 本發(fā)明中催化硫離進(jìn)行氧化反應(yīng)形成亞諷的催化劑，可W是上述產(chǎn)生重組環(huán)己麗 單加氧酶的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物，也可W是通過(guò)將該培養(yǎng)物離必分離后得到的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞或者 用其加工的制品。送里"加工的制品"是指由轉(zhuǎn)化體得到的提取物、或通過(guò)對(duì)提取物中的環(huán) 己麗單加氧酶進(jìn)行分離和/或純化得到的分離產(chǎn)品，或者通過(guò)固定化轉(zhuǎn)化體細(xì)胞或提取物 或轉(zhuǎn)化體的分離產(chǎn)品而得到的固定化制品。
[0032] 本發(fā)明的第六個(gè)方面提供了一種本發(fā)明的環(huán)己麗單加氧酶或重組環(huán)己麗單加氧 酶在催化奧美拉哇硫離進(jìn)行氧化反應(yīng)形成埃索美拉哇中的應(yīng)用。
[0033] 所述的奧美拉哇硫離如下式I所示：
[0034]
[0035] 所述的奧美拉哇硫離化合