專(zhuān)利名稱(chēng):用于治療IL-1β相關(guān)疾病的方法
本申請(qǐng)根據(jù)35 U.S. C. §119要求于2006年12月20日提交的美國(guó)臨 時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/871,046,于2007年3月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?60/908,389,和于2007年4月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/911,033的 利益,所述專(zhuān)利的公開(kāi)內(nèi)容整體引入本文作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防2型糖尿病、肥胖、高血糖癥、高胰島 素血癥、1型糖尿病、胰島素抗性以及特征在于胰島素抗性的疾病狀態(tài)和 病癥的方法。此種方法可以用于治療患有2型糖尿病、肥胖、高血糖癥、 高胰島素血癥、1型糖尿病、胰島素抗性以及特征在于胰島素抗性的疾病 狀態(tài)和病癥的哺乳動(dòng)物受試者,或預(yù)防其在風(fēng)險(xiǎn)受試者中的發(fā)生。發(fā)明背景本公開(kāi)涉及用于治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的2型糖尿病、肥胖、高血 糖癥、高胰島素血癥、1型糖尿病、胰島素抗性以及特征在于胰島素抗性 的疾病狀態(tài)和病癥的方法。此種方法可以用于治療患有2型糖尿病、肥胖、 高血糖癥、高胰島素血癥、1型糖尿病、胰島素抗性以及特征在于胰島素 抗性的疾病狀態(tài)和病癥的哺乳動(dòng)物(例如人)受試者,或預(yù)防其在風(fēng)險(xiǎn)受 試者中的發(fā)生。糖尿病是在一般群體中具有約1%的流行率的人代謝病癥(Foster, D. W., Harrison's Principles of Internal Medicine, 第114章,第661-678 頁(yè),第IO版,McGraw-Hill, New York)。該疾病自身表現(xiàn)為一系列激 素誘導(dǎo)的代謝異常,其最終導(dǎo)致?tīng)可鏀?shù)個(gè)器官系統(tǒng)(包括眼、腎、神經(jīng)和血管)的、使人衰弱的、嚴(yán)重長(zhǎng)期并發(fā)癥。在病理學(xué)上,該疾病的特征在于在電子顯微鏡下可見(jiàn)的基底膜損傷。糖尿病可以分成2種臨床綜合征,1 型和2型糖尿病。1型或胰島素依賴(lài)型糖尿病(IDDM)也稱(chēng)為幼年型, 是慢性自身免疫疾病,其特征在于胰島中產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞的大量喪失。 因?yàn)檫@些細(xì)胞被漸進(jìn)地破壞,所以分泌的胰島素量減少,當(dāng)胰島素分泌量 降低到正常所需的血液葡萄糖水平下時(shí),最終導(dǎo)致高血糖癥(在血中異常 高水平的葡萄糖)。盡管關(guān)于這種免疫應(yīng)答的確切觸發(fā)因素未知,但I(xiàn)DDM 患者具有高水平的抗胰P細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的抗體。然而,并非具有高 水平的這些抗體的所有患者都發(fā)展IDDM。1型糖尿病特征性地顯示極低或不可測(cè)量的血漿胰島素并伴隨升高的 胰高血糖素。不管確切病因是什么,大多數(shù)l型患者具有針對(duì)其自身胰細(xì) 胞的循環(huán)抗體,包括針對(duì)胰島素、郎格罕氏島細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和谷氨酸脫羧 酶的抗體。特異地針對(duì)p細(xì)胞(胰島素生產(chǎn)細(xì)胞)的免疫應(yīng)答導(dǎo)致1型糖 尿病。用于l型糖尿病患者的目前療法是胰島素注射,也可以包括對(duì)膳食 的改變,以便使起因于天然胰島素缺乏(其反過(guò)來(lái)又源自p細(xì)胞損傷)的 高血糖癥降到最低。也可以就胰島素的施用來(lái)改變膳食,以抵消該激素的低血糖效應(yīng)o當(dāng)肌肉、脂肪和肝細(xì)胞無(wú)法正常地響應(yīng)胰島素時(shí),發(fā)生2型糖尿病(也 稱(chēng)為非胰島素依賴(lài)型糖尿病(NIDDM)、成年發(fā)病型、成年型)。這種無(wú) 法響應(yīng)(稱(chēng)為胰島素抗性)的原因可能是這些細(xì)胞上胰島素受體數(shù)目的減 少,或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的功能障礙,或兩者。p細(xì)胞最初通過(guò)增加胰島素 輸入量來(lái)補(bǔ)償這種胰島素抗性。隨著時(shí)間的過(guò)去,這些細(xì)胞變得無(wú)法產(chǎn)生 足夠的胰島素以維持正常的葡萄糖水平,從而指示逸艮至2型糖尿病。2 型糖尿病由遺傳的和獲得性的危險(xiǎn)因素組合引起,包括高脂肪膳食、缺乏 鍛煉和衰老。糖尿病群體中超過(guò)90%的患有2型糖尿病,并且該發(fā)病率持 續(xù)上升,正在成為M界死亡、發(fā)病和健康護(hù)理消費(fèi)的主要因素(Amos 等人,Diabetic Med. 14: S1-85, 1997)。2型糖尿病是特征在于葡萄糖和脂質(zhì)代謝缺陷的復(fù)雜疾病。 一般地存在許多代謝參數(shù)的擾亂,包括空腹血漿葡萄糖水平、游離脂肪酸水平和甘油三酯水平上的增加,以及HDL/LDL比率的降低。如上所述,糖尿病的 一個(gè)主要根本病因被認(rèn)為是外周組織,主要是肌肉和脂肪中胰島素抗性的 增加。2型糖尿病的病因尚未獲得充分了解。據(jù)認(rèn)為,既發(fā)生靶組織對(duì)胰 島素作用的抵抗也發(fā)生減少的胰島素分泌("P細(xì)胞衰竭")。負(fù)責(zé)胰島素 體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要胰島素應(yīng)答組織是肝,在其中胰島素刺激糖原合成且抑制 糖異生;肌肉,在其中胰島素刺激葡萄糖攝取和糖原刺激葡萄糖攝取且抑 制脂解。因此,作為糖尿病的結(jié)果,血液中存在升高水平的葡萄糖,這可 以導(dǎo)致葡萄糖介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和隨后的發(fā)病(腎病、神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病等)。 胰烏素抗性與2型糖尿病的t艮強(qiáng)相關(guān)。目前,存在用于治療2型糖尿病的各種藥理學(xué)方法(Scheen等人, Diabetes Care, 22 (9) : 1568-1577, 1999)。它們經(jīng)由不同作用才莫式而 發(fā)揮作用1 )磺酰脲類(lèi)(例如,格列美脲(glimepiride)、格列生脲(glisentide)、 磺酰脲(sulfonylurea)、 AY31637 )實(shí)質(zhì)性地刺激胰島素分泌;2 )雙胍類(lèi)(例 如,二甲雙胍(metformin))通過(guò)促進(jìn)葡萄糖利用、降低肝臟葡萄糖生產(chǎn)和 減少腸道葡萄糖輸出而發(fā)揮作用;3) a-葡糖苷酶抑制劑(例如,阿卡波糖 (acarbose)、米格列醇(miglitol))減緩碳7JC化合物消化和由此自腸道的吸收 和減少餐后高血糖;4)瘞唑烷二酮類(lèi)(例如,曲格列酮(troglitazone)、吡 格列酮(pioglitazone)、羅格列酮(rosiglitazone)、格列吡漆(glipizide)、巴格 歹'J嗣(balaglitazone)、 利格歹'J酉同(rivoglitazone)、茶格歹0酉同(netoglitazone)、 曲格列酮(troglitazone)、恩格列酮(englitazone)、 AD 5075、 T 174、 YM268、 R 102380、 NC2100、 NIP 223、 NIP 221、 MK0767、環(huán)格列酮(ciglitazone)、 adaglitazone、 CLX0921、達(dá)格列酮(darglitazone)、 CP 92768、 BM 152054)增強(qiáng)胰島素作用,由此促進(jìn)外周組織中的葡萄糖利用;5)胰高血糖素樣肽, 包括DPP4抑制劑(例如,西他列汀(sitagliptin));和6)胰島素刺激組 織葡萄糖利用和抑制肝臟葡萄糖輸出。上述藥理學(xué)方法可以單個(gè)地或以聯(lián) 合療法來(lái)利用。然而,每種方法具有其局限性和不良反應(yīng)。隨著時(shí)間過(guò)去, 大部分2型糖尿病受試者會(huì)喪失其對(duì)這些活性劑的反應(yīng)。胰島素治療一般開(kāi)始于膳食、鍛煉和口服藥物無(wú)法充分地控制血液葡萄糖之后。胰島素治 療的缺點(diǎn)是需要藥物注射、低血糖癥的可能性和體重增長(zhǎng)。IL-lj3是由許多不同細(xì)胞類(lèi)型,包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,分泌的促 炎細(xì)胞因子。當(dāng)作為炎癥反應(yīng)的一部M放時(shí),IL-ip造成一系列生物效 應(yīng),這主要通過(guò)誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)來(lái)介導(dǎo),所述其他炎癥介質(zhì)例如促腎上 腺皮質(zhì)激素、血小板因子-4、前歹寸腺素E2 (PGE2) 、 IL-6和IL-8。 IL-1卩 通過(guò)激活I(lǐng)L-1受體(其存在于幾乎所有細(xì)胞類(lèi)型上),誘導(dǎo)局部和全身的 炎癥效應(yīng)。白介素-1 (IL-1)細(xì)胞因子家族已被提示牽涉許多疾病狀態(tài)。 IL-1家族成員包括IL-la、 IL-ip和IL-lRa。盡管通過(guò)其與IL-1受體 (IL-1R1和IL-1R2 )結(jié)合的能力而相關(guān)聯(lián),但這些細(xì)胞因子的每一個(gè)都 是不同的,由不同基因表達(dá)且具有不同的一級(jí)M酸序列。此外,這些細(xì) 胞因子的生理活性可以彼此區(qū)分。已公開(kāi)了指示IL-ip明顯牽涉于糖尿病 中的實(shí)驗(yàn)。Maedler等人,J Clin Invest ( 2002 ) 110: 851-860提示在2型糖尿病 中慢性高血糖癥可能損害胰p-細(xì)胞,引起受損的胰島素分泌,而且指出 IL-ip是在1型糖尿病的自身免疫過(guò)程中發(fā)揮作用的促炎細(xì)胞因子,并且 可以抑制P細(xì)胞功能。特別地,他們檢驗(yàn)了如下假設(shè)IL-lj5可能介導(dǎo)高 葡萄糖水平的有害作用。用根皮苷(phlorizin)治療糖尿病動(dòng)物使血漿葡萄 糖正?;?,且阻止p細(xì)胞表達(dá)IL-1(5。據(jù)說(shuō)這牽涉2型糖尿病中葡萄糖毒 性(glucotoxicity)的發(fā)病機(jī)理的炎癥過(guò)程,并且他們將IL-ip/NF-KB途徑鑒 定為在這種病癥中保存p細(xì)胞的量和功能的標(biāo)耙。Donath等人,J Mol med (2003) 81: 455-470指出IL-lp在胰島p誦 細(xì)胞死亡的凋亡途徑(這導(dǎo)致胰島素不足和糖尿病)中的明顯意義,并且 提出了在1型和2型糖尿病中設(shè)計(jì)以阻斷P-細(xì)胞凋亡的抗炎治療方法。WO 2004/002512涉及IL-1受體拮抗劑(IL-lRa )和/或吡咯烷二石克代 氨甲酸酯(PDTC)用于治療或預(yù)防2型糖尿病的用途。然而,針對(duì)IL-Ra 多肽在2型糖尿病治療中的治療性應(yīng)用所建議的頻率給藥(每24小時(shí)注射 一次),可能導(dǎo)致患者M(jìn)性的問(wèn)題,從而降低這種治療形式的有效性和/或限制對(duì)其的需求。因此,仍需要用于治療2型糖尿病的有效方法,特別 是不需要爭(zhēng)天注射的那些方法。Larsen等人,New England Journal of Medicine( 2007 )356: 1517-1526 描述了重組IL-1受體拮抗劑(IL-lRa、阿那白滯素(anakinra))用于治療 2型糖尿病的用途。然而,每天1次100 mg阿那白滯素給藥持續(xù)13周可 能導(dǎo)致患者M(jìn)性的問(wèn)題,從而降低這種治療形式的有效性和/或限制對(duì)其 的需求。因此,仍需要治療2型糖尿病的有效方法,特別是不需要頻繁(例 如,每天)注射的治療方法。US 2005/0256197和US 2005/0152850涉及用于促進(jìn)受試者(例如,患 有糖尿病的受試者)中的代謝控制(例如葡萄糖)的方法,其包括,特別 是通過(guò)4吏用抗炎劑,例如抗炎性酮咯酸含漱液(ketorolac oral rinse),減少 受試者齦縫液中的IL-ip水平,從而減少循環(huán)TNF水平。肥胖是高度流行的慢性疾病,其不僅與社會(huì)歧視有關(guān),還與減少的壽 命和眾多醫(yī)學(xué)問(wèn)題有關(guān),所述醫(yī)學(xué)問(wèn)題包括不良心理t艮,皮膚病學(xué)病癥 例如感染、靜脈曲張、運(yùn)動(dòng)不耐性、糖尿病、胰島素抗性、高血壓、高膽 固醇血癥和冠心病(Rissanen等人,British Medical Journal, 301: 835-837, 1990)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人中,肥胖與胰島素抗性和糖尿病高度相關(guān)。事實(shí)上, 肥胖和糖尿病抗性(其中后者一般伴隨高胰島素血癥或高血糖癥,或兩者) 是2型糖尿病的標(biāo)志。此外,2型糖尿病與冠狀動(dòng)脈疾病的2或4倍風(fēng)險(xiǎn) 相關(guān)。盡管對(duì)這些嚴(yán)重健康問(wèn)題研究了數(shù)十年,但肥胖和胰島素抗性的病 因仍是未知的。胰島素抗性與眾多疾病狀態(tài)和病癥相關(guān),并且存在于約30-40%的非 糖尿病個(gè)體中。這些疾病狀態(tài)和病癥包括但不限于,前驅(qū)糖尿病和代謝綜合征(也稱(chēng)為胰島素抗性綜合征)。前驅(qū)糖尿病是特征在于葡萄糖耐量降 低(IGT)或空腹葡萄糖受損(IFG)的異常葡萄糖耐量狀態(tài)。具有前驅(qū) 糖尿病的患者是胰島素抵抗的,并且處于將來(lái)#成顯性2型糖尿病的高 風(fēng)險(xiǎn)中。代謝綜合征是相關(guān)的一簇性狀,其包括但不限于,高胰島素血癥、 異常葡萄糖耐量、肥胖、脂肪重分布至腹部或上身區(qū)室、高血壓、異常纖維蛋白溶解(dysfibrinolysis)和血脂異常(特征在于高甘油三酯、低HDL-膽 固醇和小而密的LDL顆粒)。胰島素抗性已與所有這些性狀聯(lián)系在一起, 提示代謝綜合征和胰島素抗性彼此緊密相關(guān)。代謝綜合征的確診是將來(lái)發(fā) 生2型糖尿病以及加速的動(dòng)脈粥樣硬化(導(dǎo)致心臟病發(fā)作、中風(fēng)和外周血 管疾病)的強(qiáng)大危險(xiǎn)因素。炎性細(xì)胞因子,包括IL-1,已顯示在脂肪組織 內(nèi)介導(dǎo)炎癥,這看起來(lái)涉及脂肪細(xì)胞的胰島素抗性(Trayhurn等人,Br. J. Nutr. 92: 347-355, 2004; Wisse, J. Am. Soc. Nephrol. 15: 2792-2800, 2004; Fantuzzi, J. Allergy Clin. Immunol. 115: 911-919, 2005; Matsuzawa, FEBS Lett. 580: 2917-2921, 2006; Greenberg等人,Eur J. Clin. Invest 32 Suppl.3: 24-34, 2002; Jager等人,Endocrinology 148: 241-251, 2007)。 脂肪細(xì)胞是貯存脂肪且分泌脂動(dòng)素(adipokine)(即,細(xì)胞因子的一個(gè)亞組) 的細(xì)胞,并且是脂肪組織的主要組分。巨噬細(xì)胞,作為炎癥細(xì)胞和炎性細(xì) 胞因子(IL-1、 TNF -a和IL-6)的主要生產(chǎn)者,也存在于脂肪組織內(nèi), 特別是與肥胖相關(guān)的發(fā)炎脂肪組織(Kern等人,Diabetes 52: 1779-1785, 2003 )。先前已知TNF-a和IL-6使脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素刺激脫敏(即,胰 島素抗性)。因?yàn)榕c目前治療相關(guān)的問(wèn)題,需要治療2型糖尿病和其他疾病適應(yīng)癥 例如本文公開(kāi)的那些適應(yīng)癥的新療法,以替換或補(bǔ)充現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)方法。本 發(fā)明提供用于治療2型糖尿病的方法。此夕卜,本發(fā)明還提供用于治療肥胖、 高血糖癥、高胰島素血癥、1型糖尿病、胰島素抗性以及特征在于胰島素 抗性的疾病狀態(tài)和病癥的方法。本文/>開(kāi)的方法包括例如,施用抗IL-ip 抗體或其片段。用抗體,特別是顯示高親和力的抗體,直接靶向IL-ip配 體的方法,提供了超過(guò)其他潛在治療方法,例如IL-ip受體拮抗劑(例如, IL-lRa、阿那白滯素、Kineret )的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)基于IL-1受體拮抗劑的療法 的挑戰(zhàn)是需要此種治療劑占據(jù)大量的受體,而這是一個(gè)艱巨的任務(wù),因?yàn)?這些受體廣泛地表達(dá)在除紅細(xì)胞外的所有細(xì)胞上(Dinarello, Curr. Opin. Pharmacol. 4: 378-385, 2004)。在大多數(shù)免疫介導(dǎo)疾病,例如本文公開(kāi) 的疾病中,體液中可測(cè)量的或與活化細(xì)胞相關(guān)的IL-ip細(xì)胞因子量相對(duì)較較好的策略,特別 是當(dāng)施用具有高親和力的IL-ip抗體時(shí)。 發(fā)明概述;^/>開(kāi)涉及用于治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的2型糖尿病、肥胖、高血糖癥、高胰島素血癥、胰島素生成減少、l型糖尿病、胰島素抗性和/或特 征在于胰島素抗性的疾病狀態(tài)和病癥的方法。此種方法可以用于治療患有如下疾病或有罹患如下疾病的風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物(例如,人)受試者糖尿 病、肥胖、高血糖癥、高胰島素血癥、胰島素生成減少、胰島素抗性和/ 或特征在于胰島素抗性的疾病狀態(tài)和病癥。該方法也可以用于風(fēng)險(xiǎn)受試者 中預(yù)防2型糖尿病、l型糖尿病、肥胖、高血糖癥、高胰島素血癥、胰島 素生成減少、胰島素抗性以及特征在于胰島素抗性的疾病狀態(tài)和病癥的發(fā) 生。在一個(gè)方面,本發(fā)明涉及在人中治療選自下述的疾病或病癥的方法 2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減少、l型糖尿 病和胰島素抗性,該方法包括給人施用抗IL-1(5抗體或其片段。在一個(gè)優(yōu) 選實(shí)施方案中,疾病或病癥選自2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、 肥胖、胰島素生成減少和胰島素抗性。優(yōu)選地,疾病或病癥是2型糖尿病、 肥胖、胰島素生成減少或胰島素抗性。更優(yōu)選地,疾病或病癥是2型糖尿 病、肥胖或胰島素抗性。最優(yōu)選地,疾病或病癥是2型糖尿病。在一個(gè)實(shí) 施方案中,該方法不增加心血管疾病或病癥。在某些實(shí)施方案中,抗體或 片段用于治療同一患者(例如,人受試者)中的2種或更多種上述疾病或病癥。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供通過(guò)施用抗IL-ip抗體或片段用于治療或 預(yù)防疾病或病癥的方法,其中疾病或病癥是前驅(qū)糖尿病、血脂異常、高脂 血癥、高血壓、代謝綜合征或病態(tài)行為(sickness behavior)。在另外一個(gè)方 面,該方法在人中減少或預(yù)防選自下述的與2型糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥或病 癥視網(wǎng)膜病、腎衰竭、心血管疾病和傷口愈合,該方法包括給人施用抗 IL-ip抗體或其片段。在某些實(shí)施方案中,抗體或片段用于治療同一患者(例如,人受試者)中的2種或更多種上述疾病或病癥。在另一個(gè)實(shí)施方 案中,抗體或片段用于治療可能起因于2型糖尿病以外的病癥的腎衰竭(例 如,腎疾病)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中,抗體或片段用于在顯示升高水平 的C反應(yīng)蛋白(CRP)的受試者中減少CRP的水平。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供用于在治療或預(yù)防如本文公開(kāi)的疾病或病 癥中使用的IL-ip抗體或其抗體片段。在一個(gè)進(jìn)一步的方面,本發(fā)明提供 IL-ip抗體或其抗體片段,用于在治療或預(yù)防選自下述的疾病或病癥中使 用2型糖尿病、肥胖、胰島素生成減少和胰島素抗性。在另外一個(gè)方面, 本發(fā)明提供IL-ip抗體或其抗體片段,用于在治療或預(yù)防2型糖尿病中使 用。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供包含IL-ip抗體或其抗體片段和任選地至 少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物,用于在治療或預(yù)防如本文公 開(kāi)的疾病或病癥中使用。在一個(gè)進(jìn)一步的方面,本發(fā)明提供包含IL-1J5抗 體或其抗體片段和任選地至少 一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物, 用于在治療或預(yù)防選自下述的疾病或病癥中使用2型糖尿病、肥胖、胰 島素生成減少和胰島素抗性。在另外一個(gè)方面,本發(fā)明提供包含IL-ip抗 體或其抗體片段和任選地至少 一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物, 用于在治療或預(yù)防2型糖尿病中使用。在本發(fā)明的方法中使用的抗IL-ip抗體或抗體片段一般以高親和力與 IL-ip結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中,抗體或抗體片段與IL-ip結(jié)合,解離常 數(shù)為約10nM或更少、約5nM或更少、約lnM或更少、約500pM或更 少、約250pM或更少、約100pM或更少、約50pM或更少、或約25 pM 或更少。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,抗體或抗體片段與人IL-ip結(jié)合,解 離常數(shù)為約100pM或更少、約50pM或更少、約10pM或更少、約5pM 或更少、約3 pM或更少、約1 pM或更少、約0.75 pM或更少、約0.5 pM 或更少、約0,3pM或更少、約0.2pM或更少、或約0.1pM或更少。在特 別優(yōu)選的實(shí)施方案中,抗體或抗體片段與人IL-ip結(jié)合,解離常數(shù)為約IO pM或更少。頁(yè)在本發(fā)明的另一個(gè)方面,抗IL-ip抗體或抗體片段是中和抗體。在另 一個(gè)方面,抗IL-1卩抗體或抗體片段與IL-ip表位結(jié)合,從而使得結(jié)合的 抗體或片段基本上允許IL-1(5與IL-1受體I (IL-1RI)結(jié)合。在另一個(gè)方 面,抗IL-lj5抗體或抗體片段與IL-ip結(jié)合,但基本上不阻止結(jié)合的IL-1卩 與IL-1受體I (IL-1RI)結(jié)合。在另一個(gè)方面,抗體或抗體片段與IL-la、 IL-lR或IL-lRa的結(jié)合不可檢測(cè)。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面,抗體或抗體 片段與序列ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE ( SEQ ID NO: 1)中包 含的表位結(jié)合。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面,抗體或抗體片段與IL-lj5中包 含Glu64的表位結(jié)合。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面,抗體或抗體片段與IL-ip N末端的氨基酸l-34結(jié)合。優(yōu)選地,抗體或抗體片段是人工程化的、人源 化的或人的。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療表現(xiàn)出任何上述疾病或病癥(例如, l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少、胰島素抗性)的癥狀、或有發(fā)展出任何上述疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)的人的 方法,該方法包括在一個(gè)或多個(gè)劑量中向人施用抗IL-ip抗體或其片段。在本發(fā)明的另一個(gè)方面,提供用于在人中治療選自下述的疾病或病癥 的方法l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島 素生成減少和胰島素抗性,該方法包括給人施用抗IL-ip抗體或其片段, 其中在施用IL-ip抗體或抗體片段的初始劑量后施用一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑 量。在一個(gè)實(shí)施方案中,施用抗體或抗體片段的初始劑量后施用2個(gè)或更 多個(gè)后續(xù)劑量。在另一個(gè)實(shí)施方案中,施用抗體或抗體片段的初始劑量后 施用 一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量,其中所述一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量在量上約等于或 小于初始劑量。在另一個(gè)實(shí)施方案中,施用抗體或抗體片段的初始劑量后 施用 一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量,其中至少一個(gè)后續(xù)劑量在量上超過(guò)初始劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中,施用2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè) 或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、 或11個(gè)或更多個(gè)后續(xù)劑量的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中,初始劑量和一個(gè) 或多個(gè)后續(xù)劑量之每一個(gè)的施用彼此分開(kāi),間隔至少約2周、至少約3周、至少約1個(gè)月、至少約2個(gè)月、至少約3個(gè)月、至少約4個(gè)月、至少約5 個(gè)月、至少約6個(gè)月、至少約7個(gè)月、至少約8個(gè)月、至少約9個(gè)月、至 少約10個(gè)月、至少約ll個(gè)月、或至少約12個(gè)月。在另一個(gè)實(shí)施方案中,抗體或片段以一個(gè)或多個(gè)劑量施用,所述劑量 為5mg/kg或更少的抗體或片段、3mg/kg或更少的抗體或片段、2 mg/kg 或更少的抗體或片段、1 mg/kg或更少的抗體或片段、0.75 mg/kg或更少 的抗體或片段、0.5 mg/kg或更少的抗體或片段、0.3 mg/kg或更少的抗體 或片段、0.1 mg/kg或更少的抗體或片段、或0.03 mg/kg或更少的抗體或 片段。優(yōu)選地,在每一個(gè)上述實(shí)施方案中,抗體或片段以一個(gè)或多個(gè)劑量 施用,所述劑量為至少0.01 mg/kg抗體或片段、至少0.03 mg/kg抗體或片 段、至少0.05mg/kg抗體或片段、或至少0.09mg/kg抗體或片段。上述劑 量指mg (抗體或片段)/kg (待治療個(gè)體的重量)。在另 一個(gè)實(shí)施方案中,抗體或片段的初始劑量和一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量 各自為約0.01 mg/kg -約10 mg/kg抗體、約0.05 -約5 mg/kg抗體、約0.05 mg/kg -約3 mg/kg抗體、約0.1 mg/kg誦約3 mg/kg抗體、約0.1 mg/kg -約 1 mg/kg抗體、約0.1 mg/kg -約0.5 mg/kg抗體、約0.3 mg/kg -約5 mg/kg 抗體、約0.3 mg/kg-約3 mg/kg抗體、約0.3 mg/kg-約1 mg/kg抗體、約 0.5 mg/kg -約5 mg/kg抗體、約0.5 mg/kg -約3 mg/kg抗體、約0.5 mg/kg -約1 mg/kg抗體、約1 mg/kg -約5 mg/kg抗體、或約1 mg/kg -約3 mg/kg 抗體。在某些實(shí)施方案中,施用2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5 個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、IO個(gè)或更 多、或ll個(gè)或更多個(gè)后續(xù)劑量的抗體。上述劑量指mg(抗體或片段)/kg (待治療個(gè)體的重量)。在下文中如果提及劑量,那么這同樣應(yīng)用。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供在人中治療選自下述的疾病或病癥的方 法l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生 成減少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-1卩抗體或 其片段,方式是約5mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量,和多個(gè)在量 上約等于或小于該初始劑量的抗體或片段的后續(xù)劑量,其中后續(xù)劑量通過(guò)至少2周的時(shí)間間隔分開(kāi)。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段,方式是約3 mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量,和多個(gè)在量上約 等于或小于該初始劑量的抗體或片段的后續(xù)劑量,其中后續(xù)劑量通過(guò)至少 2周的時(shí)間間隔分開(kāi)。在另 一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-1(J抗體或其片 段,方式是約1 mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量,和多個(gè)在量上約 等于或小于該初始劑量的抗體或片段的后續(xù)劑量,其中后續(xù)劑量通過(guò)至少 2周的時(shí)間間隔分開(kāi)。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段,方式是約0.5 mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量,和多個(gè)在量上 約等于或小于該初始劑量的抗體或片段的后續(xù)劑量,其中后續(xù)劑量通過(guò)至 少2周的時(shí)間間隔分開(kāi)。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段,方式是約0,3 mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量,和多個(gè)在量上 約等于或小于該初始劑量的抗體或片段的后續(xù)劑量,其中后續(xù)劑量通過(guò)至 少2周的時(shí)間間隔分開(kāi)。在另 一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片段,方式是約O.l mg/kg或更少的抗體或片段的初始劑量,和多個(gè)在量上 約等于或小于該初始劑量的抗體或片段的后續(xù)劑量,其中后續(xù)劑量通過(guò)至 少2周的時(shí)間間隔分開(kāi)。優(yōu)選地,在抗體或片段以初始劑量和多個(gè)后續(xù)劑量的方式進(jìn)行施用的 上述實(shí)施方案中,抗體或片段的劑量是至少0.01 mg/kg抗體或片段、至少 0.03 mg/kg抗體或片段、至少0.05 mg/kg抗體或片段、或至少0.09 mg/kg 抗體或片段。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面中,抗體或片段以固定劑量施用,與劑量/ 受試者重量比無(wú)關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中,抗體或片段以一個(gè)或多個(gè)固定劑 量施用,所述固定劑量為1000mg或更少的抗體或片段、750mg或更少的 抗體或片段、500 mg或更少的抗體或片段、250mg或更少的抗體或片段、 100mg或更少的抗體或片段、或約25mg或更少的抗體或片段。在另一個(gè) 實(shí)施方案中,抗體或片段以一個(gè)或多個(gè)固定劑量進(jìn)行施用,所述固定劑量 為至少約1 mg抗體或片段、至少約5mg抗體或片段、或至少約10mg抗 體或片段。在某些實(shí)施方案中,固定劑量是約1 mg-約10 mg、約1 mg-約25 mg、 約10 mg-約25 mg、約10 mg-約50 mg、約10 mg-約100 mg、約25 mg-約50 mg、約25 mg-約100 mg、約50 mg-約100 mg、約50 mg-約150 mg、 約100 mg-約150 mg、約100 mg-約200 mg、約150 mg-約200 mg、約150 mg-約250 mg、約200 mg-約250 mg、約200 mg-約300 mg、約250 mg-約300 mg、約250 mg-約500 mg、約300 mg-約400 mg、約400 mg-約500 mg、約400 mg-約600 mg、約500 mg-約750 mg、約600 mg-約750 mg、 約700 mg-約800 mg、約750 mg-約1000 mg。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,固 定劑量選自約1 mg-約10 mg、約1 mg-約25 mg、約10 mg-約25 mg、約 10 mg畫(huà)約100 mg、約25 mg-約50 mg、約50 mg-約100 mg、約100 mg-約150mg、約150 mg-約200 mg、約200 mg-約250 mg。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段,其中施用抗體或抗體片段的初始劑量后施用一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量,且 其中在用所述初始劑量和一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量的治療過(guò)禾呈中,對(duì)于兩次施 用之間大于約1周和小于約6個(gè)月的時(shí)間段,所述抗體或抗體片段在人中 的血漿濃度^L允許減少至低于約0.1 ug/mL的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中, 對(duì)于兩次施用之間大于約l周和小于5個(gè)月、約4個(gè)月、約3個(gè)月、約2 個(gè)月、約1個(gè)月、約3周、或約2周的時(shí)間段,所述抗體或抗體片段的血 漿濃度被允i午減少至4氐于約0.07 ug/mL、約0.05 ug/mL、約0.03 ug/mL或 約0.01 ug/mL的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中,這些血漿值指從利用本發(fā)明的 抗體或片段治療的個(gè)體中獲得的值。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述個(gè)體可以是 患有下文提及的疾病之一例如2型糖尿病的患者。本發(fā)明考慮依照本文方法使用的抗IL-ip抗體或片段可以以任何上述 劑量、后續(xù)施用次數(shù)、和兩次施用間的給藥間隔進(jìn)行施用,并且任何所公 開(kāi)的劑量、后續(xù)施用次數(shù)和兩次施用間的給藥間隔可以在備選方案中彼此 組合,以調(diào)節(jié)治療益處。在某些實(shí)施方案中, 一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量在量上 約等于或小于施用的第一個(gè)劑量。在另一個(gè)實(shí)施方案中, 一個(gè)或多個(gè)后續(xù) 劑量在量上約大于施用的第一個(gè)劑量。優(yōu)選地,抗IL-1(3抗體或片段通過(guò) 皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行施用。本發(fā)明考慮,對(duì)于抗體或片段的每個(gè) 劑量,可以在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)^f亍施用。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供使用抗IL-1|5抗體或抗體片段治療或預(yù)防人的疾病或病癥的方法,其中疾病或病癥是2型糖尿病,其中抗體或片段的劑量足以實(shí)現(xiàn)血紅蛋白Alc的至少0.5、至少1.0、至少1.5、至少2.0、至少2.5、或至少3.0個(gè)百分點(diǎn)的改善。在一個(gè)實(shí)施方案中,這些參數(shù)值指從利用本發(fā)明的抗體或片段治療的個(gè)體中獲得的值。在一個(gè)實(shí)施方案中, 此個(gè)體可以是患有下文提及的疾病之一例如2型糖尿病的患者。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,該血紅蛋白Alc的改善足以符合用于批準(zhǔn)治 療2型糖尿病的治療劑的管理指南。用于測(cè)定血紅蛋白Alc的試驗(yàn)方法是 本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明考慮,足以實(shí)現(xiàn)血紅蛋白Alc改善的抗體或片段的給藥可以包括任何上述劑量、后續(xù)施用次數(shù)、和兩次施用間的給藥間 隔,以及本文描述的抗體或片段的劑量、后續(xù)施用次數(shù)和施用間的給藥間隔的任何組合。此外,血紅蛋白Alc的改善可以在最初施用抗體或片段的 一個(gè)或多個(gè)劑量后的至少約l個(gè)月、約2個(gè)月、約3個(gè)月、約4個(gè)月、或 約5個(gè)月、和優(yōu)選地約6個(gè)月或更長(zhǎng)、約7個(gè)月或更長(zhǎng)、約8個(gè)月或更長(zhǎng)、 約9個(gè)月或更長(zhǎng)、約10個(gè)月或更長(zhǎng)、約11個(gè)月或更長(zhǎng)、或約12個(gè)月或更 長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)上出現(xiàn)。在用于治療或預(yù)防2型糖尿病的上述方法的另一個(gè)方面,該方法足以 實(shí)現(xiàn)至少一個(gè)下述改變空腹血糖水平的下降、胰島素抗性的下降、高胰 島素血癥的減少、葡萄糖耐量的改善、C反應(yīng)肽(CRP)的減少、胰島素 生成增加和高血糖癥的減少、對(duì)糖尿病藥物需求的減少、BMI的降低、葡 萄糖/胰島素C肽AUC的改變、尿葡萄糖水平的降低、急性期反應(yīng)物的減 少、血清脂質(zhì)的減少以及就心血管風(fēng)險(xiǎn)而言的脂質(zhì)譜的改善。用于測(cè)定任 何上述改變的試驗(yàn)方法是本領(lǐng)域眾所周知的。此外,本發(fā)明還考慮,上述 改變之一可以在最初施用抗體或片段的一個(gè)或多個(gè)劑量后的至少約1個(gè) 月、約2個(gè)月、約3個(gè)月、約4個(gè)月、或約5個(gè)月、和優(yōu)選地至少約6個(gè) 月或更長(zhǎng)、約7個(gè)月或更長(zhǎng)、約8個(gè)月或更長(zhǎng)、約9個(gè)月或更長(zhǎng)、約10 個(gè)月或更長(zhǎng)、約ll個(gè)月或更長(zhǎng)、或約12個(gè)月或更長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)上出現(xiàn)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面,本文提供的方法減少或預(yù)防選自下述的與2 型糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥或病癥視網(wǎng)膜病、腎衰竭、心血管疾病和傷口愈 合,該方法包括給人施用抗IL-ip抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中,并 發(fā)癥或病癥是心血管疾病,其中所述心血管疾病是動(dòng)脈粥樣硬化或外周血 管疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中,并發(fā)癥或病癥是傷口愈合,其中所述傷口 愈合病癥是糖尿病性潰瘍。在另一個(gè)方面,該方法預(yù)防或延遲終末期腎疾 病或糖尿病神經(jīng)病變。在一個(gè)實(shí)施方案中,抗IL-ip抗體或片段與用于該 疾病、病癥或并發(fā)癥的至少一種其他醫(yī)學(xué)上公認(rèn)的治療進(jìn)行組合施用。在 另一個(gè)實(shí)施方案中,減少或中斷所述用于該疾病、病癥或并發(fā)癥的至少一 種其他醫(yī)學(xué)上公認(rèn)的治療 而以恒定給藥方案維持用抗IL-ip抗體或片段的治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中,減少或中斷所述用于該疾病、病癥或并發(fā)癥的至少一種其他醫(yī)學(xué)上公認(rèn)的治療,并且減少用抗IL-ip抗體或片段的 治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中,減少或中斷所述用于該疾病、病癥或并發(fā)癥 的至少一種其他醫(yī)學(xué)上公認(rèn)的治療,并且增加用抗IL-l卩抗體或片段的治 療。在另外一個(gè)實(shí)施方案中,維持所述用于該疾病、病癥或并發(fā)癥的至少 一種其他醫(yī)學(xué)上公認(rèn)的治療,并且減少或中斷用抗IL-ip抗體或片段的治 療。在另外一個(gè)實(shí)施方案中,減少或中斷所述用于該疾病、病癥或并發(fā)癥 的至少 一種其他醫(yī)學(xué)上公認(rèn)的治療以及用抗IL-1 p抗體或片段的治療。在本發(fā)明的另一個(gè)方面,提供在受試者中減少C反應(yīng)蛋白的量的方法, 該方法包括給受試者施用抗IL-ip抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中,抗 體或抗體片段以一個(gè)或多個(gè)劑量進(jìn)行施用,所述劑量為1 mg/kg或更少的 抗體或片段、0.75mg/kg或更少的抗體或片段、0.5mg/kg或更少的抗體或 片段、0.3 mg/kg或更少的抗體或片段、0.1 mg/kg或更少的抗體或片段、 或0.03mg/kg或更少的抗體或片段。優(yōu)選地,抗體或片段以一個(gè)或多個(gè)劑 量進(jìn)行施用,所述劑量為至少0.01 mg/kg抗體或片段、至少0.03 mg/kg抗 體或片段、至少0.05 mg/kg抗體或片段、或至少0.09 mg/kg抗體或片段。 在另一個(gè)實(shí)施方案中,不依賴(lài)于劑量/受試者重量比,抗體或片段以一個(gè)或 多個(gè)固定劑量施用,所述固定劑量為500 mg或更少的抗體或片段、250 mg 或更少的抗體或片段、100mg或更少的抗體或片段、或約25mg或更少的 抗體或片段。優(yōu)選地,抗體或片段以一個(gè)或多個(gè)固定劑量進(jìn)行施用,所述 固定劑量為至少約lmg抗體或片段、至少約5mg抗體或片段、或至少約 10mg抗體或片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中,抗體或抗體片段與IL-ip結(jié)合, 解離常數(shù)為約500pM或更少、250pM或更少、約100pM或更少、約50 pM或更少、或約25pM或更少、約10pM或更少、約5pM或更少、約 3pM或更少、約lpM或更少、約0.75pM或更少、約0.5pM或更少、 約0,3pM或更少、約0.2pM或更少、或約O.lpM或更少。在另一個(gè)實(shí)施 方案中,施用初始劑量后為施用一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量(它們彼此通過(guò)至少 約2周、至少約3周、至少約1個(gè)月、至少約2個(gè)月、至少約3個(gè)月、至少約4個(gè)月、至少約5個(gè)月、至少約6個(gè)月、至少約7個(gè)月、至少約8個(gè) 月、至少約9個(gè)月、至少約10個(gè)月、至少約11個(gè)月、或至少約12個(gè)月的 間隔而分開(kāi))。在另一個(gè)實(shí)施方案中,提供在受試者中減少C反應(yīng)蛋白的 量的所述方法,其中受試者患有腎疾病(例如,慢性腎疾病、腎衰竭)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中,受試者患有2型糖尿病、l型糖尿病、肥胖、高血 糖癥、高胰島素血癥、胰島素生成減少、胰島素抗性以及特征在于胰島素 抗性的疾病狀態(tài)和病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中,受試者患有疾病或病癥一 —前驅(qū)糖尿病、血脂異常、高脂血癥、高血壓、代謝綜合征或病態(tài)行為。 上述劑量指mg (抗體或片段)/kg (待治療個(gè)體的重量)。具有上述解離 常數(shù)的抗體或片段的施用可以依照任何上述劑量和給藥間隔(當(dāng)施用2個(gè) 或更多個(gè)劑量時(shí))來(lái)進(jìn)行。在另一個(gè)方面,本文提供的方法與至少一種另外的治療方法聯(lián)合,所 述另外的治療方法包括施用至少 一種包含除IL-1 p抗體或片段外的活性劑 的藥物組合物。在另外一個(gè)方面,本發(fā)明方法阻止或延遲對(duì)至少一種另外 的治療方法的需求,所述另外的治療方法包括施用至少一種包含除IL-ip 抗體或片段外的活性劑的藥物組合物。在另外一個(gè)方面,本發(fā)明方法減少 至少一種另外的治療方法的量、頻率或持續(xù)時(shí)間,所述另外的治療方法包 括施用至少一種包含除IL-lp抗體或片段外的活性劑的藥物組合物。在一 個(gè)實(shí)施方案中,所述至少一種包含除IL-lj5抗體或片段外的活性劑的藥物 組合物選自磺酰脲類(lèi)、氯茴苯酸類(lèi)、雙胍類(lèi)、a-葡糖普酶抑制劑類(lèi)、瘞 唑烷二酮類(lèi)、胰高血糖素樣肽和胰島素。在另一個(gè)實(shí)施方案中,活性劑是 磺酰脲類(lèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,活性劑是氯茴苯酸(meglitiiiide)類(lèi)。在另 一個(gè)實(shí)施方案中,活性劑是雙胍類(lèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,活性劑是a-葡 糖苷酶抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中,活性劑是瘞唑烷二酮類(lèi)。在另一個(gè) 實(shí)施方案中,活性劑是胰高血糖素樣肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中,活性劑是 胰島素。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述至少一種包含活性劑的藥物組合物包 含2種活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中,該2種活性劑是磺酰脲類(lèi)和雙胍類(lèi)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中,該2種活性劑是噻唑烷二酮類(lèi)和雙胍類(lèi)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中,維持用該至少一種活性劑的治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中, 減少或中斷用該至少 一 種活性劑的治療,而以恒定給藥方案維持用抗IL-lp抗體或片段的治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中,減少或中斷用該至少一 種活性劑的治療,并且減少用抗IL-ip抗體或片段的治療。在另一個(gè)實(shí)施 方案中,減少或中斷用該至少一種活性劑的治療,而增加用抗IL-ip抗體 或片段的治療。在另外一個(gè)實(shí)施方案中,維持用該至少一種活性劑的治療, 并且減少或中斷用抗IL-ip抗體或片段的治療。在另外一個(gè)實(shí)施方案中, 減少或中新用該至少 一種活性劑的治療和用抗IL-1 (3抗體或片段的治療。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段,其中施用抗體或抗體片段的初始劑量后施用一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量,其 中在用所述初始劑量和一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量的治療過(guò)程中,所述抗體或抗 體片段在人中的血漿濃度維持在下述水平至少約0.03 ug/mL、至少約0.05 ug/mL、至少約0.08 ug/mL、至少約0.1 ug/mL、至少約0.15 ug/mL、至 少約0.2 ug/mL、至少約0.25 ug/mL、至少約0.3 ug/mL、至少約0.4 ug/mL、 至少約0.5 ug/mL、至少約0.6 ug/mL、至少約0.8 ug/mL、至少約1 ug/mL、 至少約1.5ug/mL、至少約2ug/mL、至少約3ug/mL、至少約4ug/mL、 或至少約5ug/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中,這些血漿值指針對(duì)用依照本發(fā)明 的抗體或片段治療的個(gè)體獲得的值。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述個(gè)體可以是 患有下文提及的疾病之一例如2型糖尿病的患者。在另 一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段,其中給Aife用抗IL-ip抗體或其片段導(dǎo)致選自下述的一種或多種基因 產(chǎn)物的生產(chǎn)減少痩素(leptin)、抵抗素(resistin)、內(nèi)脂素(visfatin)、 RANTES、 IL-6、 MCP畫(huà)1、 PAI-1、?;碳さ鞍踪|(zhì)、SAA3、 Pentraxin-3、 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子、IL-1RA、 IL-12、 IL-8和TNF-a。在一個(gè)實(shí)施方案中,給人施用抗IL-ip抗體或其片段導(dǎo)致選自下述的一種或多種基因產(chǎn) 物的生產(chǎn)減少瘦素、抵抗素和內(nèi)脂素。在另一個(gè)實(shí)施方案中,給人施用 抗IL-1 p抗體或其片段導(dǎo)致選自下述的一種或多種基因產(chǎn)物的生產(chǎn)減少 MCP-1、 RANTES、 IL-6、 TNF-a和Pentraxin-3。在另外一個(gè)實(shí)施方案中, 所述一種或多種基因產(chǎn)物的生產(chǎn)減少來(lái)自脂肪組織。在另外一個(gè)實(shí)施方案中,在AJDL液中檢測(cè)所述減少。在另 一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段,其中給A^用抗IL-ip抗體或其片段導(dǎo)致脂連蛋白生產(chǎn)的增加。在一 個(gè)實(shí)施方案中,所述脂連蛋白生產(chǎn)的增加來(lái)自脂肪組織。在另外一個(gè)實(shí)施 方案中,在Ajk液中檢測(cè)所述增加。在另 一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段,其中在測(cè)量IL-ip誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的人全血IL-l(5抑制試驗(yàn)中,抗體 或其片段具有比IL-ip受體拮抗劑低的ICso。在一個(gè)實(shí)施方案中,在測(cè)量 IL-lj3誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的人全血IL-ip抑制試驗(yàn)中,抗體或片段具有低于 IL-lp受體拮抗劑的ICso的約卯。/q、 80%、 70%、 60%、 50%的1<:5()。在 一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中,在測(cè)量IL-lp誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的人全血IL-1(5 抑制試驗(yàn)中,抗體或片段具有低于IL-ip受體拮抗劑的ICso的約40。/。、 30 % 、 20 % 、 10 %的IC5q。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,在測(cè)量IL-ip誘導(dǎo)的IL-8 生產(chǎn)的人全血IL-ip抑制試驗(yàn)中,抗體或片段具有低于IL-ip受體拮抗劑 的ICso的約8。/。、 5%、 4%、 3%、 2%、 1%的1<:5。。在一個(gè)實(shí)施方案中, IL-ip受體拮抗劑是阿那白滯素(即Kineret )。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片等人,Nature Med, 9: 47-52 (2003 )(引入作 為參考)描述的試驗(yàn),與對(duì)照抗體比較,抗體或其片段在小鼠中體內(nèi)抑制 IL-ip刺激的IL-6釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中,與對(duì)照抗體比較,抗體或片 段在小鼠中針對(duì)IL-ip刺激的IL-6釋放提供至少約10% 、 20% 、 30% 、 40%、 50%的體內(nèi)抑制。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中,與對(duì)照抗體比較, 抗體或片段在小鼠中針對(duì)IL-ip刺激的IL-6釋放提供至少約60 % 、 70 % 、 80%、 90%、 95%的體內(nèi)抑制。在一個(gè)實(shí)施方案中,對(duì)照抗體是同種型對(duì) 照抗體。在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供治療人的選自下述的疾病或病癥的方法 l型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、胰島素生成減 少和胰島素抗性,該方法包括給人施用治療有效量的抗IL-ip抗體或其片 段,其中,與未使用抗體的對(duì)照比較,抗體或其片段抑制人全血中表皮葡 萄球菌(S似/7/^/ococcws e盧Vfer附/flfc)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方 案中,與對(duì)照比較,抗體或片段針對(duì)人全血中表皮葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞因 子生產(chǎn)提供高至少約10%、 20%、 30%、 40%、或50%的抑制。在一個(gè)進(jìn) 一步的實(shí)施方案中,與對(duì)照比較,抗體或片段針對(duì)人全血中表皮葡萄球菌 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生產(chǎn)提供高至少約60%、 70%、 80%、卯%、 95%的抑制。 在一個(gè)實(shí)施方案中,抑制的細(xì)胞因子是IL-1(J、 IL-la、 IL-6、 IL-8、 IL-lRa、 TNFa或畫(huà)y。在另一個(gè)方面,本發(fā)明公開(kāi)了抗IL-1(5抗體或其片段在制備組合物中 的用途,所述組合物用于治療1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰 島素血癥、肥胖、胰島素生成減少和胰島素抗性,其中,在測(cè)量IL-ip誘 導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)的人全血IL-lj3抑制試驗(yàn)中,所述抗體或其片段具有比IL-1卩 受體拮抗劑低的ic5()。在一個(gè)實(shí)施方案中,IL-ip受體拮抗劑是阿那白滯 素(即Kineret )。在本發(fā)明的另一個(gè)方面,考慮了 IL-ip抗體或結(jié)合片段在制備藥物中 的用途,所述藥物用于治療或預(yù)防如本文7〉開(kāi)的疾病或病癥。在任何此類(lèi) 用途中,藥物可以與4吏用第二活性劑的治療進(jìn)行協(xié)調(diào)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,考慮本發(fā)明抗體的協(xié)同組合用于制備藥物的用途,所述藥物 用于治療顯示出有發(fā)生如本文公開(kāi)的疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)或癥狀的患者,其 中藥物與使用第二活性劑的治療相協(xié)調(diào)。在另外一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中,提 供了這樣的組合物,其中第二活性劑是另一抗體、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或
胰島素??紤]任何上述用途的實(shí)施方案,其中藥物中的IL-ip結(jié)合抗體或 片段的量為在有效減少達(dá)到療效所需的第二活性劑劑量的劑量上。
在本發(fā)明的另外一個(gè)方面,提供產(chǎn)品,其包含容器、在容器內(nèi)包含抗 IL-lp抗體或其片段的組合物、和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),所述說(shuō)明書(shū)包含有關(guān)根據(jù) 本發(fā)明的上述方法給需要治療的人施用抗體或片段的說(shuō)明。在一個(gè)實(shí)施方 案中,容器進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。在一個(gè)相 關(guān)實(shí)施方案中,容器內(nèi)的組合物進(jìn)一步包含第二活性劑。在另外一個(gè)相關(guān) 實(shí)施方案中,提供了這樣的組合物,其中第二活性劑是另一種抗體、生長(zhǎng) 因子、細(xì)胞因子或胰島素。
本發(fā)明還考慮試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中,試劑盒包含包裝在容器例 如小瓶或瓶中的治療或預(yù)防有效量的抗IL-ip抗體或片段,并且進(jìn)一步包 含與容器附著或與容器包裝在一起的標(biāo)簽,所述標(biāo)簽描述容器的內(nèi)容物并 且提供關(guān)于容器內(nèi)容物根據(jù)本發(fā)明的上述方法用于治療或預(yù)防疾病或病 癥的指示和/或說(shuō)明。在一個(gè)實(shí)施方案中,容器進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的 載體、賦形劑或稀釋劑。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中,容器進(jìn)一步包含第二活 性劑。在另外一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中,第二活性劑包含另一種抗體、生長(zhǎng)因 子、細(xì)胞因子或胰島素。
在一個(gè)實(shí)施方案中,產(chǎn)品、試劑盒或藥物用于治療或預(yù)防人的疾病或 病癥,所述疾病或病癥選自1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖癥、高胰島 素血癥、肥胖、胰島素生成減少和胰島素抗性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中, 疾病或病癥選自2型糖尿病、肥胖和胰島素抗性。在另一個(gè)實(shí)施方案中, 產(chǎn)品的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)和試劑盒的標(biāo)簽上的說(shuō)明包含根據(jù)任何上述劑量、后續(xù) 施用次數(shù)、和施用間給藥間隔、以及本文描述的劑量、后續(xù)施用次數(shù)和施 用間給藥間隔的任何組合來(lái)使用抗體或片段的說(shuō)明。在另外一個(gè)實(shí)施方案中,試劑盒或產(chǎn)品的容器是預(yù)裝注射器。
應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)本說(shuō)明書(shū)提及利用具有某種性質(zhì)(例如Kd值或IC幼值) 的抗體或其片段的治療方法時(shí),這也意味著涉及此種抗體或其片段在制備 用于這些方法的藥物中的用途。此外,本發(fā)明還涵蓋具有這些性質(zhì)的抗體 或其片段,以及包含這些抗體或其片段的藥物組合物,用于在下文討論的 治療方法中。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示命名為AB7的抗體和Kineret⑧在體外IL-ip抑制實(shí)驗(yàn)中的結(jié) 果,所述結(jié)果涉及IL-1誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)。
圖2顯示命名為AB5和AB7的抗體在體內(nèi)IL-ip抑制實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果, 所述結(jié)果涉及IL-1刺激的IL-6釋放。
圖2B顯示命名為AB7的抗體在體內(nèi)IL-ip抑制實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果(該結(jié) 果涉及IL-1刺激的IL-6釋放),并且比較了對(duì)人IL-ip的抑制(圖A ) 和對(duì)小鼠IL-1|5的抑制(圖B )。
圖3顯示在大鼠中施用0.1、 1或10 mg/kg抗IL-lp抗體后的血清濃度。
圖4顯示在食蟹猴(Cynomolgus monkey)中施用0.3或3 mg/kg抗 IL-ip抗體后的血清濃度。
圖5模建在0.1、0.3、 1或3 mg/kg的5個(gè)每月劑量后食蟹猴中抗IL-ip 抗體的血漿濃度分布曲線。
圖6的表格顯示由抗IL-ip抗體處理導(dǎo)致的、人全血中表皮葡萄球菌 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生產(chǎn)的減少。
圖7的曲線圖顯示施用0.01 mg/kg抗體劑量后AB7在人中的藥代動(dòng) 力學(xué)。
圖8的曲線圖顯示在人中施用0.01 mg/kg劑量的AB7后對(duì)減少CRP 水平的作用。
圖9的曲線圖顯示在人中施用0.03 mg/kg劑量的AB7后對(duì)減少CRP水平的作用。
圖10的曲線圖顯示來(lái)自0.01和0.03 mg/kg劑量組的安慰劑對(duì)照中 CRP的水平。
圖11模建在人中以28天的間隔施用各種劑量的抗體(與AB7具有相 似性質(zhì))后對(duì)CRP水平的影響。
圖12顯示在2型糖尿病的膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中AB7的作用。
發(fā)明詳述
IL-ip是由多種不同細(xì)胞類(lèi)型(包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)分泌的促 炎細(xì)胞因子。當(dāng)作為炎癥反應(yīng)的一部^#放時(shí),IL-ip導(dǎo)致一系列生物效 應(yīng),這主要通過(guò)i秀導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)來(lái)介導(dǎo),所述其他炎癥介質(zhì)例如促腎上 腺皮質(zhì)激素、血小板因子-4、前列腺素E2 (PGE2) 、 IL-6和IL-8。 IL-ip 通過(guò)激活I(lǐng)L-1受體(其存在于幾乎所有細(xì)胞類(lèi)型上),誘導(dǎo)局部的和全身 的炎癥效應(yīng)。
細(xì)胞因子的白介素-1 (IL-1)家族已4皮提示牽涉幾種疾病狀態(tài),例如 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、 膿毒性休克、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、移植物抗宿主病、動(dòng) 脈粥樣硬化、成人T細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性硬化癥、中風(fēng)和 阿爾茨海默氏病。IL-1家族成員包括IL-la、 IL-1(5和IL-lRa。盡管由其 與IL-1受體(IL-1R1和IL-1R2 )結(jié)合的能力而相關(guān)聯(lián),但這些細(xì)胞因子 的每一種都是不同的,由不同基因表達(dá)且具有不同的一級(jí)^Ju^列。此 外,這些細(xì)胞因子的生理活性可以彼此區(qū)分。
破壞IL-1受體信號(hào)的化合物已作為治療IL-1介導(dǎo)的疾病例如某些上 述疾病的治療劑進(jìn)行研究。這些化合物包括重組IL-lRa (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA)、 IL國(guó)1受體"陷阱,,肽(Regeneron Inc., Tarrytown, NY)、以及動(dòng)物衍生的IL-ip抗體和重組IL-ip抗體及其片段。
如上所述,IL-1受體拮抗劑(IL-lRa)多肽已被提出用于治療2型糖 尿病(WO 2004/002512 ),但仍需要治療2型糖尿病的有效方法,特別是不需要每日重復(fù)注射的那些。基于IL-1受體拮抗劑的治療所面對(duì)的另一個(gè) 挑戰(zhàn)是需要此種治療劑占據(jù)大量受體,這是一個(gè)艱巨的任務(wù),因?yàn)檫@些受 體廣泛地表達(dá)在除紅細(xì)胞外的所有細(xì)胞上(Dinarello, Curr. Opin. Pharmacol. 4: 378-385, 2004)。在大多數(shù)免疫介導(dǎo)的疾病例如本文^>開(kāi) 的疾病中,在體液中可測(cè)量的或與活化細(xì)胞相關(guān)的IL-ip細(xì)胞因子的量相 對(duì)較低。因此,直接靶向IL-l卩配體的治療和/或預(yù)防方法是較好的策略, 特別是當(dāng)施用具有高親和力的IL-1(3抗體時(shí)。
本發(fā)明提供4吏用IL-ip特異性抗體或其片段治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中 的2型糖尿病、l型糖尿病、肥胖、高血糖癥、高胰島素血癥、胰島素生 成減少、胰島素抗性和/或特征在于胰島素抗性的疾病狀態(tài)和病癥的方法和 相關(guān)產(chǎn)品。
如下文實(shí)施例l中所示,已驚奇地發(fā)現(xiàn)此種抗體(例如,具有高親和 力)可以是比IL-Ra (例如,Kineret )強(qiáng)有力得多的IL-1途徑抑制劑, 并且如下文實(shí)施例9中所示,提供了以比其他藥物(例如重組IL-lRa)所 必需的劑量和/或施用頻率更低的劑量和/或更低的施用頻率來(lái)達(dá)到療效的 機(jī)會(huì)。
如本文所描述的利用IL-l(J抗體或片段的此種方法可以包括治療患有 2型糖尿病、l型糖尿病、肥胖、高血糖癥、高胰島素血癥、胰島素生成減 少(decreased insulin production)、低胰島素血癥、胰島素抗性和/或特征在 于胰島素抗性的疾病狀態(tài)和病癥的受試者。該方法還可以包括預(yù)防2型糖 尿病、1型糖尿病、肥胖、高血糖癥、高胰島素血癥、胰島素生成減少、 胰島素抗性和/或特征在于胰島素抗性的疾病狀態(tài)和病癥的發(fā)生,或預(yù)防其 在風(fēng)險(xiǎn)受試者中的發(fā)生。如本文所使用的,高胰島素血癥指由于胰島素抗 性所致的相對(duì)的高血液胰島素。
抗體、人源〗t抗體和人工程化抗體
本發(fā)明的IL-1 (例如,IL-ip)結(jié)合抗體可以以下述形式提供多克 隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、重組抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、 全人抗體、單鏈抗體和/或雙特異性抗體,以及通過(guò)已知技術(shù)提供的片段,包括其變體和衍生物,所述技術(shù)包括但不限于,切割、肽合成或重組技 術(shù)。
抗體一般包含2條重鏈多肽和2條輕鏈多肽,但也考慮具有1條重鏈 和1條輕鏈的單結(jié)構(gòu)域抗體、和缺乏輕鏈的重鏈抗體?;谥劓満愣ńY(jié)構(gòu) 域的M酸序列,存在5種類(lèi)型的重鏈,稱(chēng)為a、 S、 s、 y和P。這些不同 類(lèi)型的重鏈分別產(chǎn)生5類(lèi)抗體,IgA (包括IgA!和IgAz) 、 IgD、 IgE、 IgG 和IgM,包括4個(gè)IgG亞類(lèi),即lg&、 IgG2、 IgG3和IgG"基于恒定結(jié) 構(gòu)域的M酸序列,還存在2種類(lèi)型的輕鏈,稱(chēng)為kappa ( k )或lambda
(k)。全長(zhǎng)抗體包括恒定結(jié)構(gòu)域和可變結(jié)構(gòu)域。恒定結(jié)構(gòu)域無(wú)需存在于抗 體的抗原結(jié)合片段中。本文公開(kāi)的抗體的抗原結(jié)合片段可以包括Fab、 Fab,、 F (ab') 2和F (v)抗體片段。如下文更詳細(xì)地討論的,IL-ip結(jié)合 片段包括可以結(jié)合IL-ip的抗體片段和抗原結(jié)合多肽。
抗體的重鏈和輕鏈序列,或其抗原結(jié)合片段,均包括具有3個(gè)互補(bǔ)決 定區(qū)(CDRs)以及非CDR構(gòu)架區(qū)(FRs)的可變區(qū)。除非另有說(shuō)明,如 本文所使用的,術(shù)語(yǔ)"重鏈"和"輕鏈"分別意指重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。 重鏈CDRs在本文中稱(chēng)為CDR-H1、 CDR-H2和CDR-H3。輕鏈CDRs在 本文中稱(chēng)為CDR-L1、 CDR-L2和CDR-L3??贵w序列中的可變區(qū)和CDRs 可以通過(guò)下述進(jìn)行鑒定(i)根據(jù)本領(lǐng)域中已開(kāi)發(fā)的一般法則,或(ii) 將序列相對(duì)已知可變區(qū)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。用于鑒定這些區(qū)域的方法在 Kontermann和Dubel,編輯,Antibody Engineering, Springer, New York, NY , 2001,和Dinarello等人,Current Protocols in Immunology , John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000中得到描述??贵w序列數(shù)據(jù)庫(kù)在下述 中得到描述,并且可以通過(guò)下述獲得www.bioinf.org.uk/abs的"The Kabatman"數(shù)據(jù)庫(kù)(由A.C. Martin在the Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England維護(hù)), 和www.vbase2.org的VBASE2,嗦口在Retter等人,Nucl. Acids Res., 33
(Database issue) : D671-D674 (2005)中描述的。"Kabatman"數(shù)據(jù)庫(kù) 網(wǎng)站也包括用于筌定CDRs的一般經(jīng)驗(yàn)法則。除非另有說(shuō)明,如本文所使用的,術(shù)語(yǔ)"CDR,,如Kabat等人,Sequences of Immunological Interest, 第5版,U.S. Department of Health and Human Services, 1991中進(jìn)行定 義。
多克隆抗體優(yōu)選通過(guò)相關(guān)抗原和佐劑的多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip) 注射而在動(dòng)物中產(chǎn)生。改善的抗體應(yīng)答可以通過(guò)使用雙官能劑或衍生劑使 相關(guān)抗原與蛋白質(zhì)綴合來(lái)獲得,所述蛋白質(zhì)在待免疫的物種中是免疫原性 的,例如鑰孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶 抑制劑,所述雙官能劑或矛汴生劑為例如馬來(lái)酰亞氨基苯甲,基琥珀酰亞 胺酯(通過(guò)半胱氨酸殘基綴合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴(lài)氨酸殘基)、 戊二醛、琥珀酸酐或本領(lǐng)域已知的其他試劑。
動(dòng)物針對(duì)抗原、免疫原性綴合物或衍生物進(jìn)行免疫接種,方式是使例 如100照或5照蛋白質(zhì)或綴合物(分別對(duì)于兔或小鼠)與3體積的弗氏 完全佐劑組合,且在多個(gè)位點(diǎn)處皮內(nèi)注射該溶液。1個(gè)月后,動(dòng)物通過(guò)在 多個(gè)位點(diǎn)處皮下注射,用在弗氏完全佐劑中的1/5至{分?jǐn)?shù)(1/10) }原始量 的肽或綴合物加強(qiáng)。在加強(qiáng)注射后7-14天時(shí),動(dòng)物進(jìn)行采血并且就抗體滴 度測(cè)定血清。動(dòng)物加強(qiáng)免疫直至滴度達(dá)到平臺(tái)。優(yōu)選地,動(dòng)物用相同抗原 但與不同蛋白質(zhì)和/或通過(guò)不同交聯(lián)劑綴合的綴合物進(jìn)行加強(qiáng)。綴合物還可 以在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合物進(jìn)行制備。此外,聚集試劑例如 明礬適宜用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
單克隆抗體指得自基本上均質(zhì)的一群抗體的抗體。單克隆抗體一般是 高度特異性的,并且可以針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn),與一般包括針對(duì)不同決定簇 (表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品不同。除了其特異性外, 單克隆抗體還是有利的,因?yàn)樗鼈冇删|(zhì)培養(yǎng)物合成,不被具有不同特異 性和特征的其他免疫球蛋白污染。
待依照本發(fā)明^^用的單克隆抗體可以通過(guò)首先由Kohler等人, (Nature, 256: 495-7, 1975)描述的雜交瘤方法進(jìn)行制備,或可以通過(guò) 重組DNA方法(參見(jiàn)例如,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567)進(jìn)行制備。單克隆抗 體還可以4吏用例如Clackson等人,(Nature 352: 624-628, 1991 )和Marks等人,(J. Mol Biol. 222: 581-597, 1991)中描述的技術(shù),從噬菌體抗體 文庫(kù)中分離。
在雜交瘤方法中,小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物例如倉(cāng)鼠或短尾猴如本 文所述進(jìn)行免疫,以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生將與用于免疫的蛋白質(zhì)特異性結(jié) 合的抗體的淋巴細(xì)胞??商娲?,淋巴細(xì)胞可以在體外進(jìn)行免疫。隨后使 用合適的融合劑例如聚乙二醇使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,以形成雜交 瘤細(xì)胞(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第59-KB 頁(yè) (Academic Press, 1986))。
將由此制備的雜交瘤細(xì)胞接種且生長(zhǎng)在合適的培養(yǎng)基中,所述培養(yǎng)基 優(yōu)選包含抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例 如,如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥(niǎo)噤呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT 或HPRT),那么用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和 胸苷(HAT培養(yǎng)基),所述物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是這樣的細(xì)胞,其能有效地發(fā)生融合、支持所選擇 的抗體生產(chǎn)細(xì)胞穩(wěn)定地高水平生產(chǎn)抗體,并且對(duì)培養(yǎng)基敏感。人骨髓瘤和 小鼠-人雜交骨髓瘤(heteromyeloma )細(xì)胞系也已得到描述,用于產(chǎn)生人 單克隆抗體(Kozbor, J. Immunol, 133: 3001 ( 1984) ; Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63 頁(yè)(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。示例性鼠類(lèi)骨髓瘤系包 括可從Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA獲 得的、衍生自M0P-21和M.011小鼠腫瘤的那些,以及可從美國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心,Rockville, Md. USA獲得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。
就抗抗原的單克隆抗體的生產(chǎn),分析其中雜交瘤細(xì)胞正在生長(zhǎng)的培養(yǎng) 基。優(yōu)選地,由雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過(guò)免疫沉淀 或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定,例如放射性免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián) 免疫吸附測(cè)定(ELISA )。單克隆抗體的結(jié)合親和力可以例如通過(guò)Scatchard 分析(Munson等人,Anal. Biochem., 107: 220 (1980))進(jìn)行測(cè)定。
鑒定了產(chǎn)生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后,這些克隆可以通過(guò)有P艮稀釋操作進(jìn)行亞克隆,并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行
生長(zhǎng)(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第59-103 頁(yè)(Academic Press, 1986 ))。用于這個(gè)用途的合適培養(yǎng)基包括例如DMEM 或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外,雜交瘤細(xì)胞可以在體內(nèi)作為動(dòng)物中的腹水腫 瘤進(jìn)行生長(zhǎng)。由亞克隆分泌的單克隆抗體可以通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化操 作適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基、腹水液或血清中分離,所述操作例如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
進(jìn)一步考慮本發(fā)明的抗體可以以本領(lǐng)域眾所周知和本文描述的抗體 的較小抗原結(jié)合片段進(jìn)行使用。
本發(fā)明涵蓋包括2條全長(zhǎng)重鏈和2條全長(zhǎng)輕鏈的IL-1 (例如,IL-ip) 結(jié)合抗體??商娲?,IL-p結(jié)合抗體可以是保留對(duì)于IL-lJ5的結(jié)合活性的 構(gòu)建體,例如單鏈抗體或"微型"抗體。此種構(gòu)建體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的 方法進(jìn)行制備,例如PCR介導(dǎo)的單鏈抗體克隆和裝配用于在大腸桿菌中 表達(dá)(如 Antibody Engineering , The practical approach series , J. McCafferty, H. R. Hoogenboom, and D. J. Chiswell,編輯,Oxford University Press, 1996中描述的)。在這個(gè)類(lèi)型的構(gòu)建體中,抗體分子的 重和輕鏈可變部分由cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得到的擴(kuò)增子隨后可以例 如在第二個(gè)PCR步驟中通過(guò)接頭DNA進(jìn)行裝配,所述接頭DNA編碼由 氨基酸Gly和Ser組成的柔性蛋白質(zhì)接頭。這個(gè)接頭允許可變重和輕鏈部 分以這樣的方式折疊,該方式使得抗體結(jié)合袋重新產(chǎn)生,并且以通常與親 本全長(zhǎng)二聚免疫球蛋白分子相當(dāng)?shù)挠H和力結(jié)合抗原。
本發(fā)明的IL-1 (例如,IL-ip)結(jié)合抗體和片段包括本文公開(kāi)的示例 性抗體、片段和序列的變體。變體包括包含一個(gè)或多個(gè)氨基^列置換、 缺失和/或添加的肽和多肽,其具有與本文公開(kāi)的一種或多種示例性抗體、 片段和序列相同或基本上相同的表位結(jié)合親和力和特異性。因此,變體包 括包含對(duì)本文z〉開(kāi)的示例性抗體、片段和序列的一個(gè)或多個(gè)M酸序列置 換、缺失和/或添加的肽和多肽,其中此種置換、缺失和/或添加不引起表 位結(jié)合的親和力和特異性的實(shí)質(zhì)改變。例如,抗體或片段的變體可由對(duì)于抗體或片段的一個(gè)或多個(gè)改變而引起,其中該改變的抗體或片段具有與起 始序列相同或基本上相同的表位結(jié)合親和力和特異性。變體可以是天然存 在的,例如等位基因變體或剪接變體,或可以是人工構(gòu)建的。變體可以由
編碼所述變體的相應(yīng)核酸分子進(jìn)行制備。本發(fā)明抗體和IL-1(3結(jié)合片段的 變體可以在輕和/或重鏈M酸序列中具有變化,所述變化可以是天然發(fā)生 的或可以通過(guò)使用重組DNA技術(shù)在體外改造天然序列而引入。天然存在 的變體包括"體細(xì)胞"變體,其在抗外源抗原的抗體應(yīng)答的產(chǎn)生過(guò)程中在體 內(nèi)在相應(yīng)胚系(germ line )核苷^列中產(chǎn)生。
IL-1 (例如,IL-ip)結(jié)合抗體和結(jié)合片段的變體也可以通過(guò)誘變技術(shù) 進(jìn)行制備。例如,氨基酸改變可以在整個(gè)抗體編碼區(qū)隨機(jī)地引入,并且所 得到的變體可以就對(duì)于IL-ip的結(jié)合親和力或其它性質(zhì)進(jìn)行篩選。可替代 地,氨基酸改變可以在IL-ip抗體的所選擇區(qū)域中引入,例如在輕和/或重 鏈CDRs中,和/或在構(gòu)架區(qū)中引入,并且所得到的抗體可以就與IL-ip的 結(jié)合或某些其他活性進(jìn)行篩選。氨基酸改變包括在CDR中的一個(gè)或多個(gè) 氨基酸置換,從單氨基酸差異到在給定CDR例如CDR3內(nèi)引入多個(gè)M 酸變更。在另一種方法中,CDR內(nèi)的每個(gè)殘基對(duì)IL-1(5結(jié)合的貢獻(xiàn)可以通 過(guò)用丙氨酸置換在該CDR內(nèi)的至少一個(gè)殘基進(jìn)行評(píng)估。Lewis等人 (1995) , Mol. Immunol. 32: 1065-72。對(duì)于與IL-ip的結(jié)合并非最佳的 殘基隨后可以加以改變,以便確定更優(yōu)化的序列。本發(fā)明也涵蓋通過(guò)插入 氨基酸以增加CDR例如CDR3的大小而產(chǎn)生的變體。例如,大多數(shù)輕鏈 CDR3序列長(zhǎng)9個(gè)氨基酸??贵w中短于9個(gè)殘基的輕鏈序列可以通過(guò)插入 合適的氨基酸以增加該CDR的長(zhǎng)度,來(lái)優(yōu)化與IL-ip的結(jié)合。
變體還可以通過(guò)輕或重鏈的"鏈改組,,進(jìn)行制備。Marks等人(1992 ), Biotechnology 10: 779-83。單條輕(或重)鏈可以與具有重(或輕)鏈庫(kù) (repertoire)的文庫(kù)組合,并且所得到的群體就所需活性例如與IL-1卩的結(jié) 合進(jìn)行篩選。與使用既包含重鏈庫(kù)又包含輕鏈庫(kù)的文庫(kù)時(shí)的可能情況相 比,這允許篩選與單條輕鏈(或重鏈)組合的更多不同重鏈(或輕鏈)樣本。
本發(fā)明的IL-1 (例如,IL-ip)結(jié)合抗體和片段涵蓋本文公開(kāi)的示例性抗體、片段和序列的衍生物。衍生物包括已進(jìn)行化學(xué)修飾的多肽或肽、 或其變體、片段或衍生物。例子包括一個(gè)或多個(gè)聚合物,例如水溶性聚合
物、N聯(lián)或O聯(lián)碳水化合物、糖、磷酸和/或其他此種分子的共價(jià)附著。 在附著的分子的類(lèi)型或位置方面,衍生物以不同于天然存在的或起始的肽 或多肽的方式被《務(wù)飾。衍生物還包括天然存在于肽或多肽上的一個(gè)或多個(gè) 化學(xué)基團(tuán)的缺失。
本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體和片段可以是雙特異性的。雙特異性抗體或 片段可以具有幾種構(gòu)型。例如,雙特異性抗體可以類(lèi)似單個(gè)抗體(或抗體 片段),但具有2個(gè)不同抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))。雙特異性抗體可以通 過(guò)化學(xué)技術(shù)(Kranz等人(1981) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 5807)、 通過(guò)"多瘤,,(polydoma )4支術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,474,893)或通過(guò)重組DNA 技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。本發(fā)明的雙特異性抗體可以具有對(duì)于至少2種不同表位的結(jié) 合特異性,其中至少一種是IL-ip的表位。IL-ip結(jié)合抗體和片段也可以 是雜抗體(heteroantibody )。雜抗體是連接在一起的2種或更多種抗體或 抗體結(jié)合片段(Fab),每種抗體或片段具有不同特異性。
繞過(guò)單克隆抗體產(chǎn)生的、用于制備抗體分子的抗原結(jié)合區(qū)域的重組 DNA形式的技術(shù)可以考慮用于本發(fā)明IL-1 (例如,IL-lp)結(jié)合抗體和片 段。將DNA克隆到細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)。適合于實(shí)踐本發(fā)明的此種技術(shù)的一 個(gè)例子,使用具有前導(dǎo)序列的噬菌體k載體系統(tǒng),所述前導(dǎo)序列引^達(dá) 的Fab蛋白質(zhì)移動(dòng)到周質(zhì)間隙(在細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間)或分泌???以快速產(chǎn)生大量功能性Fab片段,并就其與IL-ip的結(jié)合進(jìn)行篩選。此種 IL-ip結(jié)合劑(對(duì)于IL-ip多肽具有特異性的Fab片段)尤其包括在本發(fā) 明的IL-ip結(jié)合抗體和片段內(nèi)。
本發(fā)明IL-1 (例如,IL-ip)結(jié)合抗體和片段可以是人源化或人工程 化抗體。如本文所使用的,人源化抗體或其抗原結(jié)合片段是重組多肽,其 包含來(lái)自非人抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的部分和人抗體的構(gòu)架和/或恒定區(qū)的 部分。人工程化抗體或抗體片段是已通過(guò)在特定位置處修改(例如,缺失、 插入或置換)氛基酸而被改造的非人(例如,小鼠)抗體,其中所述JtJ^酸的修改導(dǎo)致減少或消除該修飾抗體在人中的任何可檢測(cè)免疫原性。
人源化抗體包括嵌合抗體和CDR移植抗體。嵌合抗體是包括與人恒 定區(qū)連接的非人抗體可變區(qū)的抗體。因此,在嵌合抗體中,可變區(qū)大部分 是非人的,并且恒定區(qū)是人的。嵌合抗體和用于制備其的方法在Morrison 等人,Proc. Natl. Acad. Scl USA, 81: 6841-6855 (1984) , Boulianne等 人,Nature, 312: 643-646 (1984),和PCT申請(qǐng)公開(kāi)WO 86/01533中 得到描述。盡管,它們可以比小鼠單克隆抗體更少免疫原性,但嵌合抗體 的施用已與針對(duì)抗體的非人部分的人抗小鼠抗體應(yīng)答(HAMA)關(guān)^來(lái)。 嵌合抗體也可以通過(guò)將來(lái)自具有合適抗原結(jié)合特異性的小鼠抗體分子的 基因與來(lái)自具有合適生物活性的人抗體分子的基因剪接在一起來(lái)產(chǎn)生,所
述生物活性例如激活人補(bǔ)體和介導(dǎo)ADCC的能力。Morrison等人(1984 ), Proc.Natl. Acad. Scl, 81: 6851; Neuberger等人(1984 ) , Nature, 312: 604。 一個(gè)例子是將Fc區(qū)替換為不同同種型的Fc區(qū)。
CDR移植抗體是包括與來(lái)自人"受體,,抗體的構(gòu)架區(qū)連接的來(lái)自非人 "供體"抗體的CDRs的抗體。 一般地,CDR移植抗體包括比嵌合抗體更多 的人抗體序列,因?yàn)樗鼈儼▉?lái)自人抗體的恒定區(qū)序列和可變區(qū)(構(gòu)架) 序列。因此,例如,本發(fā)明的CDR移植人源化抗體可以包含重鏈,所述 重鏈包含來(lái)自人抗體的構(gòu)架區(qū)(例如,人抗體的FR-1、 FR-2或FR-3)的 連續(xù)氨基酸序列(例如,約5個(gè)或更多、10個(gè)或更多、或甚至15個(gè)或更 多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基),或任選地,人抗體的整個(gè)構(gòu)架區(qū)的大多數(shù)或全部。 CDR移植抗體和用于制備其的方法在Jones等人,Nature, 321: 522-525 (1986 ) , Riechmann等人,Nature, 332: 323-327 (1988 ),和Verhoeyen 等人,Science, 239: 1534-1536 (1988))中得到描述??梢杂糜诋a(chǎn)生人 源化抗體的方法也在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567、 5,721,367、 5,837,243和 6,180,377中得到描述。CDR移植抗體被認(rèn)為比嵌合抗體較不可能誘導(dǎo)針 對(duì)非人抗體部分的免疫反應(yīng)。然而,已報(bào)告來(lái)自供體抗體的構(gòu)架序列是供 體抗體的結(jié)合親和力和/或特異性所需的,推測(cè)這是因?yàn)檫@些構(gòu)架序列影響 供體抗體的抗原結(jié)合部分的折疊。因此,當(dāng)供體非人CDR序列被移植到無(wú)關(guān)人構(gòu)建序列上時(shí),在某些情況下,相對(duì)于最初非人供體抗體,所得到
的CDR移植抗體可能顯示結(jié)合親合力的喪失。參見(jiàn)例如,Riechmann等 人,Nature, 332: 323-327 (1988),和Verhoeyen等人,Science, 239: 1534-1536 (1988 )。
人工程化抗體包括例如"鑲嵌"抗體和4吏用 HUMAN ENGINEERINGtm技木(美國(guó)專(zhuān)利5,869,619 )制備的抗體。HUMAN ENGINEERINGTM技術(shù)是商購(gòu)可得的,并且涉及改變非人抗體或抗體片 段,例如小鼠或嵌合抗體或抗體片段,方式是對(duì)抗體的氨基酸序列進(jìn)行特 異改變,以便產(chǎn)生在人中具有減少的免疫原性、然而仍保留原始非人抗體 的所需結(jié)合性質(zhì)的修飾抗體。 一般地,該技術(shù)涉及將非人(例如,小鼠) 抗體的氨基酸殘基分類(lèi)為"低風(fēng)險(xiǎn)"、"中等風(fēng)險(xiǎn)"或"高風(fēng)險(xiǎn)"殘基。分類(lèi)使 用總體風(fēng)險(xiǎn)/回報(bào)計(jì)算來(lái)進(jìn)行,該計(jì)算評(píng)估相對(duì)于置換將影響所得抗體的折 疊和/或抗原結(jié)合性質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn),進(jìn)行該具體置換的預(yù)期益處(例如,在人中 的免疫原性)。因此,低風(fēng)險(xiǎn)位置是預(yù)期在該處的置換是有利的位置,因 為預(yù)期這將減少免疫原性而不顯著影響抗原結(jié)合性質(zhì)。中等風(fēng)險(xiǎn)位置是預(yù) 期在該處的置換可減少免疫原性但有較大可能影響蛋白質(zhì)折疊和/或抗原 結(jié)合的位置。高風(fēng)險(xiǎn)位置包含最可能參與正確折疊或抗原結(jié)合的殘基。一 般地,非人抗體中的低風(fēng)險(xiǎn)位置用人殘基進(jìn)行置換,高風(fēng)險(xiǎn)位置很少置換, 和有時(shí),但不是不受限制地,在中等風(fēng)險(xiǎn)位置處進(jìn)行人源化置換。在非人 抗體可變區(qū)序列中具有脯氨酸的位置通常分類(lèi)為至少中等風(fēng)險(xiǎn)位置。
在非人(例如,小鼠)抗體序列的給定低或中等風(fēng)險(xiǎn)位置處置換的特 定人氨基酸殘基可以通過(guò)下述進(jìn)行選擇使來(lái)自非人抗體的可變區(qū)的氨基 酸序列與特定或共有人抗體序列的相應(yīng)區(qū)域比對(duì)。根據(jù)該比對(duì),在非人抗 體序列的低或中等風(fēng)險(xiǎn)位置處的氨基酸殘基可以置換為人抗體序列中的 相應(yīng)殘基。用于制備人工程化蛋白質(zhì)的技術(shù)在Studnicka等人,Protein Engineering, 7: 805-814( 1994 ),美國(guó)專(zhuān)利5,766,886、 5,770,196、 5,821,123 和5,869,619、和PCT申請(qǐng)公開(kāi)WO 93/11794中更詳細(xì)地進(jìn)行描述。
"鑲嵌"抗體是非人或人源化(例如,嵌合或CDR移植抗體)抗體,其已經(jīng)經(jīng)過(guò)改造以替換某些暴露于溶劑的氨基酸殘基,以便進(jìn)一步減少其 免疫原性或增強(qiáng)其功能。因?yàn)橥茰y(cè)嵌合抗體的表面殘基較不可能影響正確 的抗體折疊但較可能引發(fā)免疫反應(yīng),所以嵌合抗體的鑲嵌可以包括例如, 鑒定嵌合抗體的非人構(gòu)架區(qū)中暴露于溶劑的殘基,和用來(lái)自人構(gòu)架區(qū)的相 應(yīng)表面殘基替換它們中的至少 一個(gè)。鑲嵌可以通過(guò)任何合適的工程技術(shù)來(lái)
完成,包括上述HUMAN ENGINEERINGTM技術(shù)的使用。
在一個(gè)不同方法中,可以通過(guò)使CDR移植抗體"去人源化,,來(lái)恢復(fù)結(jié) 合親合力。去人源化可以包括使來(lái)自供體抗體的構(gòu)架區(qū)的殘基回到CDR 移植抗體,從而恢復(fù)正確折疊。類(lèi)似的"去人源化"可以通過(guò)下述來(lái)達(dá)到 (i)在"受體"抗體中包括"供體"構(gòu)架區(qū)的部分,或(ii)將"供體"抗體構(gòu) 架區(qū)的部分(連同移植的供體CDRs)移植到受體抗體內(nèi)。
關(guān)于抗體、人源化抗體、人工程化抗體和用于其制備的方法的進(jìn)一步 討論,參見(jiàn)Kontermann and Dubel,編輯,Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001。
示例性人源化或人工程化抗體包括IgG、 IgM、 IgE、 IgA和IgD抗體。 本發(fā)明抗體可以^1任何類(lèi)型(IgG、 IgA、 IgM、 IgE、 IgD等)或同種型, 并且可以包括k或k輕鏈。例如,人抗體可以包含IgG重鏈或確定的片段, 例如至少一種同種型,IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4。作為進(jìn)一步例子,本 發(fā)明抗體或片段可以包含IgGl重鏈和IgGl輕鏈。
本發(fā)明抗體和片段可以是人抗體(例如結(jié)合IL-ip多肽且由如下核酸 序列編碼的抗體,所述核 列是人胚系免疫球蛋白核 列的天然體細(xì) 胞變體),及其片段、合成變體、衍生物和融合物。此種抗體可以通過(guò)本 領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)產(chǎn)生,例如通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物(例如,轉(zhuǎn)基 因小鼠),其中在該哺乳動(dòng)物染色體中天然的免疫球蛋白庫(kù)已被人V基因 替換。此種哺乳動(dòng)物表現(xiàn)出以正常方式實(shí)現(xiàn)人胚系抗體基因的VDJ重組和 體細(xì)胞高變,從而產(chǎn)生具有全人序列的高親和力抗體。
針對(duì)靶蛋白質(zhì)的人抗體也可以使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生,所述轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物不具有內(nèi)源免疫球蛋白生產(chǎn),且經(jīng)改造而包含人免疫球蛋白基因座。例如,W0 98/24893/^開(kāi)了具有人Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其中由于內(nèi)源重 和輕鏈基因座的失活,該動(dòng)物不產(chǎn)生功能性?xún)?nèi)源免疫球蛋白。WO 91/00卯6 還公開(kāi)了能夠產(chǎn)生針對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因非靈長(zhǎng)類(lèi)哺乳動(dòng)物宿 主,其中抗體具有靈長(zhǎng)類(lèi)恒定區(qū)和/或可變區(qū),且其中內(nèi)源免疫球蛋白編碼 基因座被置換或失活。WO 96/30498和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,091,001公開(kāi)了使用 Cre/Lox系統(tǒng)修飾哺乳動(dòng)物中的免疫球蛋白基因座,以便例如替換恒定或 可變區(qū)的全部或部分,從而形成修飾的抗體分子。WO 94/02602公開(kāi)了具 有滅活的內(nèi)源Ig基因座和功能性人Ig基因座的非人哺乳動(dòng)物宿主。美國(guó) 專(zhuān)利號(hào)5,939,598公開(kāi)了制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法,其中該小鼠缺乏內(nèi)源重 鏈,且表達(dá)包含一個(gè)或多個(gè)異種恒定區(qū)的外源免疫球蛋白基因座。還參見(jiàn), 美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,114,598、 6,657,103和6,833,268。
使用上文描述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,可以產(chǎn)生針對(duì)所選擇的抗原分子的免疫 應(yīng)答,可以從動(dòng)物中取出抗體生產(chǎn)細(xì)胞,且用于產(chǎn)生分泌人單克隆抗體的 雜交瘤。免疫接種方案、佐劑等是本領(lǐng)域已知的,并且可以在例如轉(zhuǎn)基因 小鼠的免疫接種中使用,如WO 96/33735中所述的。這個(gè)出版物公開(kāi)了針 對(duì)各種抗原分子的單克隆抗體,所述抗原分子包括IL-6、 IL-8、 TNFa、 人CD4、 L選擇蛋白、gp39和破傷風(fēng)毒素。單克隆抗體可以就抑制或中和 相應(yīng)蛋白質(zhì)的生物活性或生理效應(yīng)的能力進(jìn)行測(cè)試。WO 96/33735公開(kāi)了 針對(duì)IL-8的單克隆抗體,其衍生自用IL-8免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫細(xì)胞、 阻斷IL-8誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞功能。對(duì)用于免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的抗原具有特 異性的人單克隆抗體也7>開(kāi)于WO 96/34096和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?20030194404;以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0030031667中。
用于制備單克隆抗體的另外轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,770,429 和Fishwild等人(Nat. Biotechnol. 14: 845-851, 1996 )中描述的Medarex HuMAb-MOUSE ,其包含來(lái)自未重排人抗體基因的編碼人抗體的重和輕 鏈的基因序列。對(duì)HuMAb-MOUSE⑧的免疫使得能夠產(chǎn)生針對(duì)靶蛋白質(zhì) 的全人單克隆抗體。
此外,Ishida等人(Cloning Stem Cells. 4: 91-102, 2002)描述了TransChromo Mouse (TCMOUSETM),其包含兆堿基大小的人DNA區(qū) 段,并且摻入完整的人免疫球蛋白(hlg)基因座。TCMOUSEtm具有hlg 的全多樣庫(kù),包括IgGs的所有亞類(lèi)(IgGl-G4)。用各種人抗原免疫接種 TC MOUSETM產(chǎn)生包含人抗體的抗體應(yīng)答。
還參見(jiàn)Jakobovits等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551( 1993 ); Jakobovits等人,Nature, 362: 255-258 (1993) ; Bruggermaim等人, Year in Immunol., 7: 33 (1993);和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,591,669、美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5,589,369、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,807;和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20020199213。美國(guó) 專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20030092125描述了用于使動(dòng)物的免疫應(yīng)答偏向所需表位的方 法。人抗體也可以通過(guò)體外活化的B細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5,567,610和5,229,275 )。
人抗體也可以通過(guò)抗體展示文庫(kù)的體外篩選來(lái)產(chǎn)生。參見(jiàn) Hoogenboom等人(1991) , J. Mol. Biol. 227: 381;和Marks等人(1991), J. Mol . Biol. 222: 581。各種包含抗體的噬菌體展示文庫(kù)已得到描述,并 且可以容易地制備。文庫(kù)可以包含各種各樣的人抗體序列,例如人Fab、 Fv和scFv片段,可以針對(duì)合適靶篩選這些序列。噬菌體展示文庫(kù)可以包 含非抗體的肽或蛋白質(zhì),可以篩選該肽或蛋白質(zhì)以鑒定IL-ip的選擇性結(jié) 合劑。
用于制備重組人抗體基因庫(kù)的技術(shù)的發(fā)展和用于將所編碼抗體片段 展示在絲狀噬菌體表面上的技術(shù)的發(fā)展,已提供了直接制備人抗體的手 段。通過(guò)噬菌體技術(shù)產(chǎn)生的抗體以抗原結(jié)合片段——通常為Fv或Fab片 段——的形式在細(xì)菌中產(chǎn)生,且因此缺乏效應(yīng)子功能。效應(yīng)子功能可以通 過(guò)2種策略之一而引入這些片段可以被改造成完全抗體用于在哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中表達(dá),或改造成具有能夠觸發(fā)效應(yīng)子功能的第二結(jié)合位點(diǎn)的雙特異 性抗體片段。
本發(fā)明考慮用于產(chǎn)生靼特異性抗體或其抗原結(jié)合部分的方法,其包括 下述步驟在噬菌體上合成人抗體文庫(kù)、用靶蛋白質(zhì)或其部分篩選文庫(kù)、 分離結(jié)合靶的噬菌體、且由噬菌體獲得抗體。例如,用于制備在噬菌體展示技術(shù)中使用的抗體文庫(kù)的一種方法包括下述步驟用耙抗原或其抗原性 部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人動(dòng)物,以產(chǎn)生免疫應(yīng)答,從免疫 接種的動(dòng)物中提取抗體生產(chǎn)細(xì)胞;從提取的細(xì)胞中分離RNA,將RNA逆 轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA,使用引物擴(kuò)增cDNA,且將cDNA插入噬菌體展示載 體內(nèi),從而使得抗體在噬菌體上表達(dá)。本發(fā)明的重組靶特異性抗體可以以 這種方式獲得。
噬菌體展示方法通過(guò)在絲狀噬菌體表面上展示抗體庫(kù),且隨后通過(guò)與 所選抗原的結(jié)合來(lái)選擇噬菌體,從而模擬免疫選擇。 一種此種技術(shù)在WO 99/10494中描述,其描述了使用此種方法分離針對(duì)MPL和msk受體的高 親和力和功能性拮抗性抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)篩選重組組合抗體文 庫(kù),優(yōu)選地scFv噬菌體展示文庫(kù)進(jìn)行分離,其中所述文庫(kù)可以使用由衍生 自人淋巴細(xì)胞的mRNA制備的人Vl和Vh cDNA來(lái)制備。用于制備和篩 選此種文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,969,108。存 在用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫(kù)的商購(gòu)可得試劑盒(例如,Pharmacia Recombinant Phage Antibody System ,目錄號(hào)27-9400-01;和Stratagene SurfZAP.TM. phage display kit,目錄號(hào)240612 )。還存在其他方法和試 劑可以用于產(chǎn)生且篩選抗體展示文庫(kù)(參見(jiàn)例如,Ladner等人美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5,223,409; Kang等人PCT公開(kāi)號(hào)WO 92/18619; Dower等人PCT公開(kāi) 號(hào)WO 91/17271; Winter等人PCT公開(kāi)號(hào)WO 92/20791; Markland等人 PCT公開(kāi)號(hào)WO 92/15679; Breitling等人PCT公開(kāi)號(hào)WO 93/01288; McCafferty等人PCT公開(kāi)號(hào)WO 92/01047; Garrard等人PCT公開(kāi)號(hào) WO 92/09690; Fuchs等人(1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay等 人(1992 ) Hum. Antibod, Hybridomas 3: 81-85; Huse等人(1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty等人,Nature (1990 ) 348: 552-554; Griffiths 等人(1993 )EMBO J 12: 725-734; Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson等人(1991) Nature 352: 624-628; Gram等人(1992 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad等人(1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom等人(1991 )Nuc Acid Res 19:4133-4137;和Barbas等人(1991 )Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982。 在一個(gè)實(shí)施方案中,為了分離具有所需特征的靶抗原特異性人抗體,
篩選人VH和VL文庫(kù),以選擇具有所需特異性的抗體片段。在這種方法中
^使用的抗體文庫(kù)優(yōu)選是如本文和本領(lǐng)域所述制備且篩選的scFv文庫(kù) (McCafferty等人,PCT公開(kāi)號(hào)WO 92/01047, McCafferty等人,(Nature 348: 552-554, 19卯);和Griffiths等人,(EMBOJ12: 725-734, 1993)。 scFv抗體文庫(kù)優(yōu)選使用靶蛋白質(zhì)作為抗原進(jìn)行篩選。
可替代地,抗體的Fd片段(VH-CH1)和輕鏈(VL-CL )通過(guò)PCR分 別進(jìn)行克隆,并且在組合噬菌體展示文庫(kù)中隨機(jī)重組,隨后可以就與特定 抗原的結(jié)合進(jìn)行選擇。這些Fab片段在噬菌體表面上表達(dá),即與編碼其的 基因物理連接。因此,通過(guò)抗原結(jié)合來(lái)選擇Fab可以導(dǎo)致對(duì)Fab編碼序列 的共選擇,隨后可以擴(kuò)增該序列。通過(guò)數(shù)輪抗原結(jié)合和再擴(kuò)增(稱(chēng)為淘選 的程序),可以富集且最終分離對(duì)于抗原特異的Fab。
在1994年,描述了稱(chēng)為"引導(dǎo)選擇"的用于抗體人源化的方法。引導(dǎo)選 擇將噬菌體展示技術(shù)的力量用于小鼠單克隆抗體的人源化(參見(jiàn)Jespers,
L. S.等人,Bio/Technology 12, 899-903 ( 1994))。為此,小鼠單克隆抗 體的Fd片段可以與人輕鏈文庫(kù)組合展示,并且所得到的雜交Fab文庫(kù)隨 后可以用抗原進(jìn)行選擇。小鼠Fd片段從而提供了引導(dǎo)選擇的模板。隨后, 使所選擇的人輕鏈與人Fd片段文庫(kù)組合。對(duì)所得到的文庫(kù)的選擇產(chǎn)生全 人Fab。
用于從噬菌體展示文庫(kù)獲得人抗體的多種方法已得到描述(參見(jiàn)例 如,Hoogenboom等人,J. Mol.Biol., 227: 381 ( 1991) ; Marks等人, J. Mol.Biol, 222: 581-597 (1991);美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,565,332和5,573,卯5; Clackson, T.,和Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994))。特 別地,對(duì)衍生自噬菌體展示文庫(kù)的抗體的體外選擇和進(jìn)化已成為有力工具 (參見(jiàn)Burton, D.R.,和BarbasIII, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994) ; Winter, G.等人,Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); 美國(guó)專(zhuān)利/>開(kāi)號(hào)20020004215和WO 92/01047;美國(guó)專(zhuān)利>^開(kāi)號(hào)20030190317;以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,054,287和5,877,293。
Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187- 193 (2002 ),和2003年3月6日z〉開(kāi) 的美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20030044772描述了通過(guò)Capture Lift用于篩選噬菌體 表達(dá)的抗體文庫(kù)或其他結(jié)合分子的方法,Capture Lift是一種涉及將候選 結(jié)合分子固定在固相載體上的方法。
Fv片段通過(guò)如下方式展示在噬菌體表面上使作為噬菌體蛋白質(zhì)融合 物(例如,具有M13基因III)表達(dá)的一條鏈與作為可溶片段表達(dá)的互補(bǔ) 鏈結(jié)合??紤]噬菌體可以是絲狀噬菌體,例如I類(lèi)噬菌體之一fd、 M13、 fl、 Ifl、 lke、 ZJ/Z、 Ff,和II類(lèi)噬菌體之一Xf、 PH和PB。噬菌體可 以是M13或fd或其衍生物。
一旦逸捧了起始人Vl和Vh區(qū)段,可以執(zhí)行"混合和匹配"實(shí)驗(yàn),以選 擇優(yōu)選的V!7VH對(duì)組合,其中就靶的結(jié)合來(lái)篩選起始選擇的V^和VH區(qū)段 的不同對(duì)。此外,為了進(jìn)一步改善抗體的質(zhì)量,可以在類(lèi)似于在天然免疫 應(yīng)答過(guò)程中負(fù)責(zé)抗體的親和力成熟的體內(nèi)體細(xì)胞突變過(guò)程的程序中;隨機(jī) 突變優(yōu)選的Vl/Vh對(duì)的和VH區(qū)段,優(yōu)選在VH和/或VL的CDR1 、CDR2 或CDR3區(qū)之任何一個(gè)中突變,。這種體外親和力成熟可以通過(guò)使用PCR 引物擴(kuò)增Vl和VH區(qū)來(lái)完成,所述PCR引物分別與VHCDR1、 CDR2和 CDR3,或VlCDR1、 CDR2和CDR3互補(bǔ),所述引物已在某些位置處摻 加了 4種核苷酸堿基的隨機(jī)混合物,從而使得所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物編碼隨 機(jī)突變已引入Vh和/或VL CDR3區(qū)內(nèi)的Vl和Vh區(qū)段。這些隨機(jī)突變的 VL和VH區(qū)段可以就與靶抗原的結(jié)合進(jìn)行再篩選。
從重組免疫球蛋白展示文庫(kù)中篩選和分離靶特異性抗體后,編碼所選 擇抗體的核酸可以從展示包(display package)(例如,自喧菌體基因組) 中回收,并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)亞克隆到其他表達(dá)載體內(nèi)。需要時(shí), 核酸可以進(jìn)一步處理,以產(chǎn)生本發(fā)明的其他抗體形式,如下文所述。為了 表達(dá)通過(guò)篩選組合文庫(kù)而分離的重組人抗體,將編碼抗體的DNA克隆到重組表達(dá)載體內(nèi),且引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi),如本文所述。
考慮噬菌體展示方法可以在細(xì)菌或宿主細(xì)胞的增變林中進(jìn)行。增變林
是具有遺傳缺陷的宿主細(xì)胞,其造成在其內(nèi)復(fù)制的DNA相對(duì)于親本DNA 發(fā)生突變。示例增變菌林是NR9046mutD5和NR9046 mut Tl。
還考慮噬菌體展示方法可以使用輔助噬菌體來(lái)進(jìn)行。這是用于感染包 含缺陷噬菌體基因組的細(xì)胞且功能在于彌補(bǔ)該缺陷的噬菌體。缺陷噬菌體 基因組可以是其中某些功能編碼基因序列被去除的噬菌?;蚴删w。輔助 噬菌體的例子是M13K07、 M13K07基因IH編號(hào)3;和展示或編碼與衣殼 蛋白融合的結(jié)合分子的噬菌體。
抗體也可以經(jīng)由噬菌體展示篩選方法來(lái)產(chǎn)生,其中使用如WO 92/01047中公開(kāi)的分層雙重組合方法(hierarchical dual combinatorial approach),其中包含H或L鏈克隆的單菌落用于感染一個(gè)完整的文庫(kù), 所述文庫(kù)由編碼另一條鏈(L或H)的克隆組成,并且所得到的雙鏈特異 性結(jié)合成員依照噬菌體展示技術(shù)例如本文描述的那些進(jìn)行選擇。這種技術(shù) 也公開(kāi)于Marks等人,(Bio/Technology , 10: 779-783, 1992)中。
用于在酵母和微生物細(xì)胞表面上展示肽的方法也已用于鑒定抗原特 異性抗體。參見(jiàn)例如,美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,699,658??贵w文庫(kù)可以與酵母蛋白質(zhì) 例如凝集素附著,有效地模擬在免疫系統(tǒng)中抗體經(jīng)由B細(xì)胞的細(xì)胞表面展 示。
除噬菌體展示方法外,抗體可以使用核糖體mRNA展示方法和孩支生物 細(xì)胞展示方法進(jìn)行分離。使用核糖體展示進(jìn)行的多肽選擇在Hanes等人, (Proc. Natl Acad Sci USA, 94: 4937-4942, 1997)以及授予Kawasaki 的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,643,768和5,658,754中得到描述。核糖體展示也用于抗體 的快速大M^莫突變分析。選擇性誘變方法也提供了產(chǎn)生具有改善活性的抗 體的方法,所述抗體可以使用核糖體展示技術(shù)進(jìn)行選擇。
IL-1 (例如IL-1IJ)結(jié)合抗體和片段可以包含這樣的一個(gè)或多個(gè)部分, 其不結(jié)合IL-ljJ而是負(fù)責(zé)其他功能,例如循環(huán)半衰期、直接細(xì)胞毒性效應(yīng)、 可檢測(cè)標(biāo)記、或激活接受者的內(nèi)源補(bǔ)體級(jí)聯(lián)或內(nèi)源細(xì)胞毒性??贵w或片段可以包含全部或部分恒定區(qū),并且可以具有任何同種型,包括IgA(例如, IgAl或IgA2) 、 IgD、 IgE、 IgG (例如IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4)、 或IgM。除了或代替包含恒定區(qū),本發(fā)明的抗原結(jié)合化合物可以包括附加 表位、清道夫受體(salvage receptor)表位、用于診斷或純化用途的標(biāo)簽 部分、或細(xì)胞毒性部分例如放射性核素或毒素。
本發(fā)明抗體和片段的恒定區(qū)(當(dāng)存在時(shí))可以是yl、 y2、 y3、 "、 n、 卩2或3或s類(lèi)型,優(yōu)選Y類(lèi)型,更優(yōu)選y類(lèi)型,而人輕鏈的恒定部分可以 是K或x類(lèi)型(其包括M、、和^亞型),但優(yōu)選K類(lèi)型。
變體還包括包含經(jīng)修飾的Fc區(qū)的抗體或片段,其中經(jīng)修飾的Fc區(qū)包 含相對(duì)于野生型Fc區(qū)的至少一個(gè)M酸修飾。變體Fc區(qū)可以相對(duì)于包含 野生型Fc區(qū)的可比較分子進(jìn)行設(shè)計(jì),以便以更多或更小的親和力結(jié)合Fc 受體。
例如,本發(fā)明IL-ip結(jié)合抗體和片段可以包含經(jīng)修飾的Fc區(qū)。Fc區(qū) 指與如下IgGC末端結(jié)構(gòu)域同源的、天然存在的或合成的多肽,所述結(jié)構(gòu) 域在IgG的木瓜蛋白酶消化后產(chǎn)生。IgG Fc具有約50 kD的分子量。在本 發(fā)明抗體和片段中,可以使用整個(gè)Fc區(qū),或僅半衰期增強(qiáng)部分。此外, 氨基一列中的許多修飾是可接受的,因?yàn)樘烊换钚圆⒎窃谒星闆r下都 是必需或期望的。
需要時(shí),F(xiàn)c區(qū)可以進(jìn)行突變,以抑制其固定補(bǔ)體和以高親和力結(jié)合 Fc受體的能力。對(duì)于鼠類(lèi)IgGFc, Ala殘基置換Glu 318、 Lys 320和Lys 322使得蛋白質(zhì)無(wú)法指導(dǎo)ADCC。 Glu置換Leu 235抑制蛋白質(zhì)以高親和 力結(jié)合Fc受體的能力。關(guān)于人IgG的各種突變是已知的(參見(jiàn)例如, Morrison等人,1994, The Immunologist 2: 119 124和Brekke等人,1994, The Immunologist 2: 125 )。
在某些實(shí)施方案中,提供了具有經(jīng)修飾的Fc區(qū)的本發(fā)明抗體或片段, 其中天然存在的Fc區(qū)進(jìn)行修飾以增加抗體或片段在生物環(huán)境中的半衰期, 例如血清半衰期或通過(guò)體外試驗(yàn)測(cè)量的半衰期。用于改變IgG Fc區(qū)的最初 形式的方法在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,998,253中得到描述。在某些實(shí)施方案中,可能希望修飾抗體或片段以便增加其血清半衰
期,例如給抗體片段添加分子例如PEG或其他水溶性聚合物,包括多糖 聚合物,以增加半衰期。這也可以例如通過(guò)將清道夫受體結(jié)合表位摻入抗 體片段內(nèi)(例如,通過(guò)抗體片段中合適區(qū)域的突變,或通過(guò)將該表位摻入 肽標(biāo)簽內(nèi)(例如借助于DNA或肽合成),1^將肽標(biāo)簽融合在抗體片段 的任一末端或中間)來(lái)達(dá)到(參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)號(hào)W096/32478)。清道夫受 體結(jié)合表位指負(fù)責(zé)增加IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的IgG分子(例如, IgG,、 IgG2、 IgG3或IgG4) Fc區(qū)的表位。
清道夫受體結(jié)合表位可以包括這樣的區(qū)域,其中來(lái)自Fc結(jié)構(gòu)域的1 個(gè)或2個(gè)環(huán)的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移至抗體片段的類(lèi)似位置 上。更加優(yōu)選地,轉(zhuǎn)移來(lái)自Fc結(jié)構(gòu)域的1個(gè)或2個(gè)環(huán)的3個(gè)或更多個(gè)氨 基酸殘基。更加優(yōu)選地,表位取自Fc區(qū)(例如,IgG的Fc區(qū))的CH2 結(jié)構(gòu)域,且轉(zhuǎn)移至抗體的CH1、 CH3或VH區(qū)或超過(guò)一個(gè)此種區(qū)域上。可 替代地,表位取自Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域,且轉(zhuǎn)移至抗體片段的Cl區(qū)或VL 區(qū)或兩者。還參見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)WO 97/34631和WO 96/32478,其描述了 Fc 變體及其與清道夫受體的相互作用。
在Fc受體結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的殘基的突變可以導(dǎo)致改變的效應(yīng)子功能,例 如改變的ADCC或CDC活性,或改變的半衰期。潛在突變包括一個(gè)或多 個(gè)殘基的插入、缺失或置換,包括用丙氨酸置換、保守置換、非保守置換、 或用來(lái)自不同IgG亞類(lèi)的相同位置處的相應(yīng)氨基酸殘基替換(例如,IgGl 殘基用在那個(gè)位置處的相應(yīng)IgG2殘基替換)。例如,已報(bào)告與原始嵌合 IgG4比較,使IgG4中的M酸位置241的絲氨酸突變成脯氨酸(在IgGl 和IgG2中的該位置處發(fā)現(xiàn)的殘基)導(dǎo)致同質(zhì)抗體的產(chǎn)生,以及延長(zhǎng)的血 清半衰期和改善的組織分布(Angal等人,Mol Immunol. 30: 105-8, 1993 )。
抗體片段是完整全長(zhǎng)抗體的部分,例如完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變 區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、 Fab'、 F (ab') 2和Fv片段;雙鏈抗體 (diabody);線性抗體;單鏈抗體分子(例如,scFv);多特異性抗體片段 例如雙特異性、三特異性和多特異性抗體(例如,雙鏈抗體、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody));」錄型抗體(minibody);螯合重組抗體 (chelating recombinant antibody); 三體(tribody)或雙體(bibody); 胞內(nèi)抗 體;納米抗體;小模塊免疫藥物(small modular immunopharmaceuticals, SMIP) 、 adnectins、結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白;駝源化抗體 (camelized antibody);含V冊(cè)的抗體;和由抗體片段形成的任何其他多肽。 本發(fā)明包括包含任何前述重或輕鏈序列且結(jié)合IL-ip的IL-ip結(jié)合抗 體片段。如本文所使用的,術(shù)語(yǔ)片段指抗體的任何3個(gè)或更多個(gè)連續(xù)M 酸(例如,4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、8個(gè)或更多、或甚至IO 個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸),并且涵蓋Fab、 Fab'、 F ( ab') 2和F (v)片 段、或單個(gè)輕或重鏈可變區(qū)或其部分。IL-1(J結(jié)合片段包括例如Fab、 Fab'、 F ( ab') 2、 Fv和scFv。這些片段缺乏完整抗體的Fc片段,從循環(huán)中更快 速地被清除,并且可以具有比完整抗體更少的非特異性組織結(jié)合。參見(jiàn) Wahl等人(1983) , J.Nucl.Med., 24: 316-25。這些片段可以使用眾所 周知的方法由完整抗體產(chǎn)生,例如通過(guò)用酶例如木瓜蛋白酶(以產(chǎn)生Fab 片段)或胃蛋白酶(以產(chǎn)生F Ub') 2片段)的蛋白酶解切割。
用于測(cè)定IL-1(J與IL-1受體I型(IL-1R1)的結(jié)合的體外和基于細(xì)胞 的測(cè)定試驗(yàn)是本領(lǐng)域充分描述的,包括在與IL-ip或IL-1R1結(jié)合的分子
(例如抗體、拮抗劑或其他抑制劑)存在下進(jìn)行測(cè)定的試驗(yàn)。(參見(jiàn)例如 Evans等人,(1995) , J, Biol. Chem. 270: 11477-11483; Vigers等人,
(2000) , J. Biol. Chem. 275: 36927-36933; Yanofsky等人,(1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7381-7386; Fredericks等人,(2004 ), Protein Eng, Des. Sel. 17: 95-106; Slack等人,(1993 ) , J. Biol. Chem. 268: 2513-2524; Smith等人,(2003) , Immunity 18: 87-96; Vigers等人,
(1997) , Nature 386: 1卯畫(huà)194; Ruggiero等人,(1997),丄Immunol. 158: 3881-3887; Guo等人,(1995 ) , J. Biol. Chem. 270: 27562-27568; Svenson等人,(1995), Eur. J. Immunol. 25: 2842-2850; Arend等人,
(1994) , J. Immunol. 153: 4766-4774)。用于此種測(cè)定試驗(yàn)的重組IL-1 受體I型(包括人IL-1受體I型),可從各種商業(yè)來(lái)源容易地獲得(參見(jiàn)例如R&D Systems, SIGMA) 。 IL-1受體I型也可以從使用本領(lǐng)域已知 的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)染技術(shù)引入合適宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)構(gòu)建體或載體 表達(dá)。表達(dá)的IL-1受體I型隨后可以分離且純化用于在結(jié)合測(cè)定中使用, 或可替代地直接以細(xì)胞結(jié)合形式使用。
例如,IL-1 p與IL-1受體I型的結(jié)合可以通過(guò)下述進(jìn)行測(cè)定固定IL-1 p 結(jié)合抗體、使IL-ip與固定抗體接觸且測(cè)定IL-ip是否與抗體結(jié)合,使可 溶形式的IL-IRI與結(jié)合的IL-ip/抗體復(fù)合物接觸,并且測(cè)定可溶IL-IRI 是否與復(fù)合物結(jié)合。該方案也可以包括在與IL-ip接觸前使可溶IL-IRI 與固定抗體接觸,以證實(shí)可溶IL-IRI不與固定抗體結(jié)合。這個(gè)方案可以使 用用于結(jié)合相互作用的動(dòng)力學(xué)分析的Biacore⑧儀器來(lái)進(jìn)行。此種方案也可 以用于測(cè)定抗體或其他分子是否允許或阻斷IL-ip與IL-1受體I型的結(jié)合。
對(duì)于其他IL-ip/IL-lRI結(jié)合測(cè)定試驗(yàn),對(duì)IL-lp與IL-1受體I型的結(jié) 合的允許或阻斷可以通過(guò)下述確定比較在IL-ip抗體或其IL-lj5結(jié)合片 段存在或不存在下比較IL-ip與IL-IRI的結(jié)合。在該試驗(yàn)的讀出中阻斷被 鑒定為與包含相應(yīng)緩沖劑或稀釋劑但不包含IL-ip抗體或其IL-ip結(jié)合 片段的對(duì)照樣品比較,在抗IL-ip抗體或其IL-ip結(jié)合片段存在下IL-l卩 與IL-1受體I型結(jié)合的指定減少。該試驗(yàn)讀出可以定性地呈現(xiàn)為指示阻斷 的存在或不存在,或可以定量地呈現(xiàn)為指示由于抗體或片段的存在所致的 結(jié)合減少的百分比或倍數(shù)。
可替代地或另外地,當(dāng)IL-ip結(jié)合抗體或IL-ip結(jié)合片段基本上阻斷 IL-ip與IL-IRI結(jié)合時(shí),與在不存在抗體或片段的情況下相同濃度的IL-lj5 和IL-IRI的結(jié)合比較,IL-ip與IL-IRI的結(jié)合減少至少10倍、可替代地 至少約20倍、可替代地至少約50倍、可替代地至少約100倍、可替代地 至少約1000倍、可替^地至少約10000倍或更多。作為另一個(gè)例子,當(dāng) IL-ip結(jié)合抗體或IL-ip結(jié)合片段基本上允許IL-1|5與IL-IRI結(jié)合時(shí),IL-l(J 與IL-IRI的結(jié)合是在不存在抗體或片段的情況下相同濃度的IL-ip和 IL-IRI的結(jié)合的至少約90 % 、可替代地至少約95% 、可替代地至少約99 %、可替代地至少約99.9%、可替代地至少約99.99%、可替代地至少約99.999%、可替代地至少約99.9999%、可替代地基本上相同。
在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明可以包括IL-ip結(jié)合抗體或IL-ip結(jié)合片 段,其與本文公開(kāi)的一種或多種示例性抗體結(jié)合相同的表位或基本上相同 的表位??商娲鼗蛄硗獾兀揑L-ip結(jié)合抗體或IL-l(5結(jié)合片段與具有 美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/472813中描述的AB7可變區(qū)序列(序列在下文顯示)的抗 體竟?fàn)幗Y(jié)合??商娲鼗蛄硗獾?,本發(fā)明包括IL-ip結(jié)合抗體和片段,其 結(jié)合氨基紗列ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE ( SEQ ID NO: 1) 中包含的表位,命名為AB5和AB7的抗體(美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/472813 )所結(jié) 合的表位。如本文考慮的,可以使用本領(lǐng)域幾種已知方法中的任何一種容 易地測(cè)定IL-ip結(jié)合抗體或片段是否與一種或多種示例性抗體,例如命名 為AB7的抗體結(jié)合相同的表位或基本上相同的表位。
例如,由IL-ip結(jié)合抗體或片段結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基(表位)可以 使用肽陣列進(jìn)行測(cè)定,例如PepSpotTM肽陣列(JPT P叩tide Technologies, Berlin, Germany),其中在膜上直接合成跨越整個(gè)IL-1(5氨基酸序列的 一系列12個(gè)氨基酸的掃描肽,每種肽與前一種肽重疊11個(gè)氨基酸。攜帶 肽的膜隨后用抗體在室溫下例如以2 ng/ml的濃度探測(cè)2小時(shí),以針對(duì)所 述抗體獲取表位結(jié)合信息??贵w與膜結(jié)合肽的結(jié)合可以使用二級(jí)HRP綴 合的山羊抗人(或適當(dāng)時(shí),小鼠)抗體,隨后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL) 進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)應(yīng)于成熟IL-ip蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基或序列并且對(duì)于抗 體結(jié)合具有正評(píng)分的肽點(diǎn),指示由該特定抗體結(jié)合的表位。
可替代地或另外地,可以執(zhí)行抗體竟?fàn)帉?shí)驗(yàn),并且此種測(cè)定試驗(yàn)是本 領(lǐng)域眾所周知的。例如,為了測(cè)定抗體或片段是否與如下肽序列中包含的 表位結(jié)合,所述肽序列包含對(duì)應(yīng)于成熟IL-ip蛋白質(zhì)的殘基83-105的M 酸ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE ( SEQ ID NO: 1),可以將未知
(例如,AB7)進(jìn)行比較。結(jié)合竟?fàn)帨y(cè)定可以例如使用用于結(jié)合相互作用 的動(dòng)力學(xué)分^f的813(:0^@儀器或通過(guò)ELISA來(lái)進(jìn)^f亍。在此種測(cè)定中,未知 表位特異性的抗體就其與已知比較抗體(例如,AB7)竟?fàn)幗Y(jié)合的能力進(jìn)行評(píng)估。與特定表位的竟?fàn)幗Y(jié)合通過(guò)已知抗體(例如,AB7)與該IL-ip 表位的結(jié)合減少至少約50%,或至少約70%、或至少約80%、或至少約 90%、或至少約95%、或至少約99%或約100%來(lái)確定,并且可以指示與 基本上相同的表位結(jié)合。
鑒于本公開(kāi)中鑒定了示例性抗體的IL-ip結(jié)合區(qū)域和/或這些公開(kāi)抗體 所識(shí)別的表位,可以考慮產(chǎn)生具有相似結(jié)合特征和治療或i貪斷用途的其它 抗體,其是與本/〉開(kāi)的實(shí)施方案平行的實(shí)施方案。
抗體的抗原結(jié)合片段包括保留與抗原特異性結(jié)合的能力(一般通過(guò)保 留抗體的抗原結(jié)合部分)的片段。已經(jīng)充分確立了抗體的抗原結(jié)合功能可 以通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)實(shí)現(xiàn)??乖Y(jié)^P分的例子包括(i) Fab片段, 其為由VL、 VH、 CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段;(ii) F ( ab, ) 2片 段,其為包含在鉸鏈區(qū)處由二硫橋連接的2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段;(iii) Fd片段,其為VH和CH1結(jié)構(gòu)域;(iv) Fv片段,其為抗體單臂的VL 和VH結(jié)構(gòu)域,(v)dAb片段(Ward等人,(1989 )Nature 341: 544-546), 其為VH結(jié)構(gòu)域;和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。單鏈抗體也包含 在術(shù)語(yǔ)抗體的抗原結(jié)合部分內(nèi)。本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體和片段也涵蓋單 價(jià)或多價(jià)、或者單體或多聚體(例如,四聚體)、含或不含支架(例如, 蛋白質(zhì)或碳水化合物支架)的CDR衍生的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體或片段可以是較大免疫粘附分子的部分,通 過(guò)抗體或抗體部分與一個(gè)或多個(gè)其他蛋白質(zhì)或肽的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而 形成。此種免疫粘附分子的例子包括使用鏈霉親和素核心區(qū)以構(gòu)成四聚體 scFv分子(Kipriyanov, S. M.等人(1995 ) Human Antibodies and Hybridomas6: 93-101),和使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C末端多組氨 酸標(biāo)簽以構(gòu)成二價(jià)和生物素化的scFv分子(Kipriyanov, S. M.等人(1994 ) Mol. Immunol. 31: 1047-1058)。包含抗體和片段的免疫粘附分子可以使 用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)來(lái)獲得,如本文所述。優(yōu)選的抗原結(jié)合部分是完整 結(jié)構(gòu)域或完整結(jié)構(gòu)域?qū)Α?br>
本發(fā)明的IL-1卩結(jié)合抗體和片段也涵蓋由VH結(jié)構(gòu)域組成的結(jié)構(gòu)域抗
51體(dAb)片段(Ward等人,Nature 341: 544-546, 1989)。本發(fā)明的 IL-ip結(jié)合抗體和片段也涵蓋雙鏈抗體,它是二價(jià)抗體,其中Vh和V^結(jié) 構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá),但使用的接頭太短而不允許相同鏈上的2個(gè)結(jié) 構(gòu)域之間發(fā)生配對(duì),從而迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì), 產(chǎn)生2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)例如,EP 404,097; WO 93/11161; Holliger 等人,Proc. Natl. Acad. Sci, USA 90: 6444-6448, 1993,和Poljak等人, Structure 2: 1121-1123, 1994)。雙鏈抗體可以是雙特異性或單特異性的。
本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體和片段也涵蓋與IL-ip結(jié)合的單鏈抗體片段 (scFv) 。 scFv包含與抗體輕鏈可變區(qū)(VL)可操作地連接的抗體重鏈可 變區(qū)(VH),其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)一起或各自地形成結(jié)合IL-ip 的結(jié)合位點(diǎn)。scFv可以包含在M末端處的VH區(qū)和在氛基末端處的 區(qū)??商娲?,scFv可以包含在氨基末端處的VL區(qū)和在貌基末端處的VH 區(qū)。此外,盡管Fv片段的2個(gè)結(jié)構(gòu)域V!^和Vu由分開(kāi)的基因編碼,但它 們可以使用重組方法通過(guò)合成接頭而連接,所述合成接頭使得它們能夠被 制備成單條多肽鏈,其中Vl和Vh區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱(chēng)為單鏈Fv (scFv);參見(jiàn)例如Bird等人(1988) Science 242: 423-426;和Huston 等人(1988 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 )。
scFv可以任選地進(jìn)一步包含在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的多肽 接頭。此種多肽接頭一般包含1-50個(gè)氨基酸,可替代地3-12個(gè)氨基酸, 可替代地2個(gè)氨基酸。用于連接scFv中的重和輕鏈的接頭肽的例子包括5 氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 2)。其他例子包括這個(gè) 序列的一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)重復(fù)(例如,包含Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ( SEQ ID NO: 2)的2-4個(gè)重復(fù)的多肽),以產(chǎn)生接頭。
本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體和片段也涵蓋重鏈抗體(HCAb)。在駝?lì)?動(dòng)物(camelids)(駱驅(qū)(camel)、單峰駝(dromedary)和美洲乾(llama); Hamers-Casterman等人,1993 Nature 363:446; Nguyen等人,1998 J. Mol. Biol. 275: 413 )、慈狀鯊(Nuttall等人,Mol Immunol. 38: 313-26, 2001 )、 護(hù)士篁(Greenberg等人,Nature 374: 168-73, 1995; Roux等人,1998 Proc,Nat. Acad. Sci. USA 95: 11804 )和科氏兔銀鮫(Nguyen等人,"Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation," 2002 Immunogenetics 54 (1 ) : 39-47)的某些免疫球蛋白同種型中發(fā)現(xiàn)常規(guī)抗 體H2L2結(jié)構(gòu)的例外。這些抗體看起來(lái)可以?xún)H使用重鏈可變區(qū)形成抗原結(jié)合 區(qū)域,因?yàn)檫@些功能抗體是僅重鏈的二聚體(稱(chēng)為"重鏈抗體"或 "HCAbs")。因此,本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體和片段的某些實(shí)施方案可以 是與IL-ip特異性結(jié)合的重鏈抗體。例如,IgG類(lèi)的且缺乏輕鏈的重鏈抗 體由駝科(camelidae)動(dòng)物產(chǎn)生,所述駝科動(dòng)物包括駱駝、單峰駝和美洲 駝(Hamers陽(yáng)Casterman等人,Nature 363: 446-448 ( 1993) ) 。 HCAbs 具有約95 kDa而不是常規(guī)IgG抗體的約160 kDa的分子量。它們的結(jié)合 結(jié)構(gòu)域僅由重鏈可變結(jié)構(gòu)域組成,通常稱(chēng)為VHH以使其與常規(guī)VH區(qū)分。 Muyldermans等人,J. Mol. Recognit. 12: 131-140 (1999 )。重鏈抗體的 可變結(jié)構(gòu)域有的稱(chēng)為納米抗體(Cortez-Retamozo等人,Cancer Research 64: 2853-57, 2004)。納米抗體文庫(kù)可以如Conrath等人,(Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001 )中所述由免疫接種的單峰駝產(chǎn)生 或使用重組方法來(lái)產(chǎn)生。
因?yàn)椴淮嬖诘谝粋€(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)(由于缺失剪接共有信號(hào)故在 mRNA加工過(guò)程中被剪接掉),所以可變結(jié)構(gòu)域(VHH)之后緊接為鉸鏈 區(qū)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域(Nguyen等人,Mol Immunol. 36: 515-524 (1999 ); Woolven等人,Immunogenetics 50: 98-101 ( 1999))。駝科V冊(cè)據(jù)才艮告 與IgG2和IgG3恒定區(qū)重組,所述IgG2和IgG3恒定區(qū)包含鉸鏈、CH2 和CH3結(jié)構(gòu)域且缺乏CH1結(jié)構(gòu)域(Hamers-Casterman等人,同上引文)。 例如,美洲駝IgGl是常規(guī)(H2L2)抗體同種型,其中VH與包含鉸鏈、 CH1、 CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)重組,而美洲駝IgG2和IgG3是僅重 鏈的同種型,其缺乏CH1結(jié)構(gòu)域且不包含輕鏈。
盡管HCAbs缺乏輕鏈,但它們具有抗原結(jié)合庫(kù)(repereoire) 。 HCAbs 的遺傳產(chǎn)生機(jī)制在Nguyen等人Adv. Immunol 79: 261-296 (2001)和 Nguyen等人,Immunogenetics 54: 39-47 (2002)中得到綜述。篁魚(yú),包括護(hù)士置,顯示相似的含抗原受體的單個(gè)單體V結(jié)構(gòu)域。Irving等人,J. Immunol. Methods 248: 31-45 (2001) ; Roux等人,Pro" Natl. Acad. Sci. USA 95: 11804 (1998)。
Vhh包含小的完整抗原結(jié)合片段(例如,約15 kDa, 118-136個(gè)殘基 的片段)。已發(fā)現(xiàn)駝科V冊(cè)結(jié)構(gòu)域以高親和力與抗原結(jié)合(Desmyter等人, J. Biol Chem. 276: 26285-卯,2001 ),其中V冊(cè)親和力一般在納摩爾范圍 內(nèi),并且可與Fab和scFv片段的親和力相當(dāng)。V冊(cè)是高度可溶的且比Fab 和scFv片段的相應(yīng)衍生物更穩(wěn)定。VH片段相對(duì)難以以可溶形式產(chǎn)生,但 當(dāng)構(gòu)架殘基改變成更vhh樣時(shí),可以獲得可溶性和特異性結(jié)合的改善。(參 見(jiàn)例如,Reichman等人,J Immunol Methods 1999, 231: 25-38.) 。 V冊(cè) 攜帶使得其更親水且阻止與BiP (免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白質(zhì))長(zhǎng)期相互 作用的氛基酸置換,正常在折疊和裝配過(guò)程中Bip將在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中與 H鏈結(jié)合,直至它被L鏈替換。因?yàn)関hh增加的親水性,所以改善了從 ER中的分泌。
功能性vhh可以通過(guò)蛋白酶解切割所免疫的駝?lì)悇?dòng)物的HCAb,通過(guò) 從所免疫的駝?lì)悇?dòng)物的B細(xì)胞(導(dǎo)致重組VHH)、或從天然的或合成的文庫(kù) 中直接克隆V冊(cè)基因,而獲得。具有所需抗原特異性的V冊(cè)也可以通過(guò)謹(jǐn) 菌體展示技術(shù)來(lái)獲得。與Fabs或scFvs比較,在噬菌體展示中使用VHH 更筒單且更有效,因?yàn)閮H需要克隆且表達(dá)l個(gè)結(jié)構(gòu)域以獲得功能抗原結(jié)合 片段。Muyldermans, Biotechnol. 74: 277-302 (2001 ); Ghahroudi等人, FEBS Lett. 414: 521-526 (1997 );和van der Linden等人,J. Biotechnol. 80: 261-270 (2000)。用于產(chǎn)生具有駝科重鏈的抗體的方法也在美國(guó)專(zhuān)利 申請(qǐng)?zhí)?0050136049和20050037421中得到描述。
核糖體展示方法可以用于鑒定且分離具有所需結(jié)合活性和親和力的 scFv和/或V冊(cè)分子。Irving等人,J. Immunol. Methods 248: 31國(guó)45( 2001 )。 核糖體展示和選擇具有產(chǎn)生和展示大型文庫(kù)(1014)的潛力。
其他實(shí)施方案提供通過(guò)駝源化過(guò)程產(chǎn)生的V冊(cè)樣分子,在該過(guò)程中修
飾非駝科VH,例如人V冊(cè),以改善其溶解性且阻止非特異性結(jié)合。這通過(guò)用V冊(cè)樣殘基替換Vh的VL側(cè)上的殘基來(lái)達(dá)到,從而模擬更可溶的V冊(cè)
片段。當(dāng)在體內(nèi)施用于患者時(shí),駝源化VH片段,特別U于人構(gòu)架的那
些,預(yù)期顯示出大大減少的免疫應(yīng)答,并且因此預(yù)期具有用于治療應(yīng)用的
顯著優(yōu)點(diǎn)。Davies等人,F(xiàn)EBS Lett. 339: 285-290 (1994); Davies等人, Protein Eng. 9: 531-537 (1996) ; Tanha等人,J. Biol. Chem. 276: 24774-24780 (2001) 和Riechmaim等人,Immunol. Methods 231: 25-38 (1999)。
廣泛多樣的表達(dá)系統(tǒng)可用于產(chǎn)生IL-l卩片段,包括Fab片段、scFv和 VHH。例如,原核和真核起源的表達(dá)系統(tǒng)可以用于大M^莫生產(chǎn)抗體片段和 抗體融合蛋白。特別有利的是允許將大量抗體片段分泌到培養(yǎng)基中的表達(dá) 系統(tǒng)。
雙特異性Fab-scFv ("雙體,,)和三特異性Fab- ( scFv) (2 )("三體,,) 的產(chǎn)生在Schoonjans等人(J Immunol. 165: 7050-57, 2000 )和Willems 等人(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786: 161-76, 2003 ) 中得到描述。對(duì)于雙體或三體,使scFv分子與VL-CL (L)和VH-CI^ (Fd)鏈中的一個(gè)或兩個(gè)融合,例如為了產(chǎn)生三體,使2個(gè)scFvs與Fab 的C末端融合,而在雙體中,使l個(gè)scFv與Fab的C末端融合。由經(jīng)由 肽接頭(無(wú)鉸鏈)或經(jīng)由IgG鉸鏈與CH3融合scFv組成的"微型抗體"已 在Olafsen等人,Protein Eng Des Sel. 2004 Apr; 17(4): 315-23中得到 描述。
胞內(nèi)抗體是顯示細(xì)胞內(nèi)表達(dá)且可以操作細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能的單鏈抗 體(Biocca等人,EMBOJ.9: 101-108, 1990; Colby等人,Proc Natl Acad Sci USA. 101: 17616-21, 2004)。包含如下細(xì)胞信號(hào)序列的胞內(nèi)抗體可以 如Mhashilkar等人(EMBO J 14: 1542-51, 1995 )和Wheeler等人(FASEB J. 17: 1733-5.2003)中所述產(chǎn)生,所述細(xì)胞信號(hào)序列使抗體構(gòu)建體保留在 細(xì)胞內(nèi)區(qū)域中。穿膜抗體(transbody)是可穿過(guò)細(xì)胞的抗體,其中蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD )與單鏈可變片段(scFv)抗體融合。Heng等人,(Med Hypotheses. 64: 1105-8, 2005)。本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體和片段也涵蓋這樣的抗體,其為SMIPs或?qū)?于靶蛋白質(zhì)特異的結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白。這些構(gòu)建體是包含與 免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域融合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽,所述免疫球蛋白結(jié) 構(gòu)域是執(zhí)行抗體效應(yīng)子功能所需的。參見(jiàn)例如,WO03/041600、美國(guó)專(zhuān)利 申請(qǐng)20030133939和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20030118592。
本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體和片段也涵蓋免疫粘附素。一個(gè)或多個(gè)CDRs 可以共價(jià)或非共價(jià)地?fù)饺敕肿觾?nèi),以使其成為免疫粘附素。免疫粘附素可 以摻入CDR (s)作為較大多肽鏈的部分,可以使CDR (s)與另一條多 肽鏈共價(jià)連接,或可以非共價(jià)摻入CDR (s)。本文公開(kāi)的CDRs允許免 疫粘附素與IL-lp特異性結(jié)合。
本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體和片段也涵蓋抗體模擬物,其包含在有機(jī)或 分子支架(例如蛋白質(zhì)或碳7K化合物支架)上構(gòu)建的一個(gè)或多個(gè)IL-ip結(jié) 合部分。具有相對(duì)限定的三維結(jié)構(gòu)、通常稱(chēng)為蛋白質(zhì)支架的蛋白質(zhì),可以 用作試劑用于^L計(jì)抗體模擬物。這些支架一般包含一個(gè)或多個(gè)易接受特異 的或隨機(jī)的序列變異的區(qū)域,通常對(duì)此類(lèi)序列隨機(jī)化以產(chǎn)生蛋白質(zhì)文庫(kù), 由其中可以選擇出期望的產(chǎn)物。例如,抗體模擬物可以包含具有免疫球蛋 白樣結(jié)構(gòu)域的嵌合非免疫球蛋白結(jié)合多肽,所述多肽包含具有2個(gè)或更多 個(gè)溶劑暴露環(huán)的支架,所述溶劑暴露環(huán)含有插入每個(gè)環(huán)內(nèi)的來(lái)自親本抗體 的不同CDR,并對(duì)親本抗體所結(jié)合的配體顯示出選擇性結(jié)合活性。已提出
(Tramontano等人,J. Mol. Recognit. 7: 9, 1994; McConnell和Hoess, J. Mol. Biol. 250: 460, 1995)。其他蛋白質(zhì)已作為構(gòu)架進(jìn)4亍測(cè)試,并且 已用于在a螺旋表面上(Nord等人,Nat. Biotechnol. 15: 772, 1997; Nord 等人,Protein Eng. 8: 601 , 1995 ),在a螺旋束的a螺旋之間的環(huán)上(Ku 和Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552, 1995),和在由二石克橋 約束的環(huán)上,例如小蛋白酶抑制劑的那些環(huán)上(Markland等人, Biochemistry 35: 8045, 1996; Markland等人,Biochemistry 35: 8058, 1996; Rottgen和Collins, Gene 164: 243, 1995; Wang等人,J. Biol. Chem.270: 12250, 1995)展示隨機(jī)化的殘基。關(guān)于將支架用于抗體模擬物的方 法公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利5,770,380以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0171116 、 2004/0266993和2005/0038229中。
依照本發(fā)明使用的優(yōu)選IL-lj3抗體或抗體片段一般以高親和力與人 IL-ip結(jié)合(例如,如用BIACORE測(cè)定的),例如對(duì)于IL-ip具有平衡 結(jié)合解離常數(shù)(KD)為約10nM或更少、約5nM或更少、約lnM或更 少、約500pM或更少,或更優(yōu)選約250pM或更少、約100pM或更少、 約50pM或更少、約25pM或更少、約10pM或更少、約5pM或更少、 約3 pM或更少、約1 pM或更少、約0.75 pM或更少、約0.5 pM或更少、 或約0.3 pM或更少。
如通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)定的,本發(fā)明的抗體或片段可 以例如以約10nM或更少,約5nM或更少、約2nM或更少、約1 nM或 更少、約0.75 nM或更少、約0.5 nM或更少、約0.4 nM或更少、約0.3 nM 或更少、或甚至約0.2 nM或更少的ICsn與IL-1卩結(jié)合。優(yōu)選地,本發(fā)明 的抗體或抗體片段不與除IL-1外的任何靶交叉反應(yīng)。例如,本發(fā)明抗體和 片段可以與IL-ip結(jié)合,但不與IL-la可檢測(cè)地結(jié)合,或相對(duì)于其與IL-la 的結(jié)合,其與IL-ip的結(jié)合具有高至少約100倍(例如,至少約150倍、 至少約200倍、或甚至至少約250倍)的選擇性。在某些實(shí)施方案中,與 在未施用本發(fā)明的抗體或片段的IL-ip刺激的動(dòng)物中的血清IL-6水平比 較,根據(jù)本發(fā)明使用的抗體或片段可以使動(dòng)物中IL-ip誘導(dǎo)的血清IL-6表 達(dá)受到至少50% (例如,至少60%、至少70%、或甚至至少80%)的抑 制??贵w可以結(jié)合IL-ip,但允許或基本上允許結(jié)合的IL-ip配體與IL-1 受體I型(IL-RI)結(jié)合。與阻斷或基本上干擾IL-ip與IL-1RI結(jié)合的許 多已知IL-ip結(jié)合抗體不同,命名為AB5和AB7 (美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/472813 ) 的抗體與IL-ip配體選擇性結(jié)合,但允許結(jié)合的IL-ip配體與IL-1RI結(jié)合。 例如,命名為AB7的抗體與IL-ip表位結(jié)合,但仍允許結(jié)合的IL-ip與 IL-1RI結(jié)合。在某些實(shí)施方案中,抗體可以減少結(jié)合的IL-ip與IL-1RI 的相互作用的親和力。因此,在一個(gè)相關(guān)方面,本發(fā)明提供了具有至少一個(gè)上述特征的IL-ip結(jié)合抗體或IL-ip結(jié)合抗體片段的用途。如本文所述, 本發(fā)明的任何前述抗體、抗體片段或多肽都可以是人源化的或人工程化 的。
本領(lǐng)域已知的各種IL-1 (例如,IL-ip)抗體和片段可以根據(jù)本文提 供的方法使用,包括例如下述專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)中描述的抗體或使用下述專(zhuān) 利和專(zhuān)利申請(qǐng)中描述的方法獲得的抗體US4,935,343; US 2003/0026806; US 2003/0124617; WO 2006/081139; WO 03/034984; WO 95/01997; WO 02/16436; WO 03/010282; WO 03/073982、 WO 2004/072116、 WO 2004/067568、 EP 0 267 611 Bl、 EP 0 364 778 Bl和美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/472813。 作為非限制性例子,抗體AB5和AB7 (美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/472813、 WO2007/002261 )可以依照本發(fā)明來(lái)使用。AB5和AB7的可變區(qū)序列如 下
AB5
輕^
PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEOEDIATYFCLOGKMLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 3)
有下劃線的序列描述(從左到右)CDR1、 2和3。 重鏈
LVTVSS (SEQIDNO:4)
有下劃線的序列描述(從左到右)CDR1、 2和3。
AB7 輕^
PSRFSGSGSGTDYTLTISSLOOEDFATYFCLOGKMLPWTFGOGTKLEIK (SEQ ID NO: 5)
有下劃線的序列描述(從左到右)CDR1、 2和3。,鏈
OVOLOESGPGLVKPSOTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIROPSGKGLEWLAHIWWD
TLVTVSS (SEQ ID NO: 6)
有下劃線的序列描述(從左到右)CDR1、 2和3。
本文描述的抗體和抗體片段可以通過(guò)任何合適的方法進(jìn)^f亍制備。用于 制備此種抗體和抗體片段的合適方法是本領(lǐng)域已知的。用于制備抗體和抗 體片段的其他方法如本文所描述的作為本發(fā)明的部分。如本文所描述的, 本發(fā)明的抗體、抗體片段或多肽可以分離或純化至任何程度。如本文所<吏 用的,分離的化合物是已從其天然環(huán)境中取出的化合物。純化的化合物是 在純度方面已增加的化合物,從而與其(i)在其天然環(huán)境中時(shí)或(ii)當(dāng) 在實(shí)驗(yàn)室條件下最初合成和/或擴(kuò)增時(shí)比較,該化合物以更純的形式存在, 其中"純度"是相對(duì)術(shù)語(yǔ),不一定指"絕對(duì)純度,,。
藥物組合物
根據(jù)本發(fā)明4吏用的IL-1 (例如,IL-ip)結(jié)合抗體和抗體片段可以配 制在組合物,特別是藥物組合物中,用于在本文的方法中使用。此種組合 物包含與合適載體混合的治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體或 抗體片段,所述載體例如藥學(xué)上可接受的試劑。 一般地,為了給動(dòng)物施用, 在配制于藥物組合物中之前,充分純化本發(fā)明的IL-ip結(jié)合抗體和抗體片 段。
藥學(xué)上可接受的試劑包括載體、賦形劑、稀釋劑、抗氧化劑、防腐劑、 著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填充劑、增量劑(bulking agent)、緩沖劑、遞送媒介物、張力劑、共溶劑、濕潤(rùn)劑、M劑、緩沖 試劑、抗微生物劑和表面活性劑。
中性緩沖鹽水或與白蛋白混合的鹽7JC是示例性合適的栽體。藥物組合 物可以包括抗氧化劑例如抗壞血酸;低分子量多肽;蛋白質(zhì),例如血清白 蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮;M酸例如 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴(lài)氨酸;單糖、二糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑例如EDTA;糖醇例如甘露 糖醇或山梨糖醇;成鹽抗衡離子例如鈉;和/或非離子型表面活性劑例如 Tween、普流尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG)。此外,例如,合適 的張力增強(qiáng)劑包括堿金屬卣化物(優(yōu)選氯化鈉或鉀)、甘露糖醇、山梨糖 醇等。合適的防腐劑包括勤L氯銨、疏柳汞、苯乙醇、對(duì)羥基苯甲酸曱酯、 對(duì)羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。過(guò)氧化氫也可以用作防腐劑。合 適的共溶劑包括甘油、丙二醇和PEG。合適的*劑包括咖啡因、聚乙烯 吡咯烷酮、P-環(huán)糊精或羥丙基-P-環(huán)糊精。合適的表面活性劑或濕潤(rùn)劑包括 脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯80、氣基丁三醇、卵磷脂、 膽固醇、tyloxapal等。緩沖劑可以是常規(guī)緩沖劑例如乙酸鹽、硼酸鹽、檸 檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或Tris-HCl。乙酸鹽緩沖液可以是約pH 4-5.5, 和Tris緩沖液可以是約pH 7-8.5。另外的藥學(xué)試劑在Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A. R. Geimaro,編輯,Mack Publishing Company, 1990中闡述。
組合物可以是液體形式或凍干或冷凍干燥形式,并且可以包括一種或 多種冷凍防護(hù)劑、賦形劑、表面活性劑、高分子量結(jié)構(gòu)添加劑和/或增量劑 (參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6,685,940、 6,566,329和6,372,716)。在一個(gè)實(shí)施方 案中,包括冷凍防護(hù)劑,其為非還原糖例如蔗糖、乳糖或海藻糖。 一般包 括的冷凍防護(hù)劑的量使得在重構(gòu)后所得到的制劑將是等滲的,盡管高滲或 略微低滲的制劑也可以是合適的。此外,冷凍防護(hù)劑的量應(yīng)足以阻止蛋白 質(zhì)在凍干后不可接受量的降解和/或聚集。在凍干前制劑中對(duì)于糖(例如, 蔗糖、乳糖、海藻糖)而言示例性冷凍防護(hù)劑濃度是約10 mM -約400 mM。在另一個(gè)實(shí)施方案中,包括表面活性劑,例如非離子型表面活性劑 和離子型表面活性劑,例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯 80 );泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188 );聚(乙二醇)苯基醚(例如Triton ); 十二烷1^L酸鈉(SDS);月桂^^克酸鈉;辛M苷鈉;月桂基-、肉豆蔻 基-、亞油基-或硬脂基-磺基甜菜堿;月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-或硬脂 基-肌氨酸;亞油基-、肉豆蔻基-或鯨蠟基-甜菜堿;月桂酰氨基丙基-、椰油酰M丙基-、亞油酰M丙基-、肉豆蔻酰氨基丙基-、棕櫚酰M丙基國(guó)
或異硬脂酰M丙基-甜菜堿(例如月桂酰M丙基);肉豆蔻酰氨基丙基 -、棕櫚酰氨基丙基-或異硬脂酰氨基丙基-二甲胺;曱基椰油?;;撬徕c
或甲基油基-?;撬岫c;和MONAQUATtm系列(Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.)、聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例 如普流尼克、PF68等)??梢源嬖谟陬A(yù)凍千制劑中的表面活性劑的示例性 量是約0.001-0.5 % 。高分子量結(jié)構(gòu)添加劑(例如充填劑、粘合劑)可以包 括例如阿拉伯樹(shù)膠、白蛋白、海藻酸、磷酸釣(二代)、纖維素、羧甲基 纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖 維素、孩史晶纖維素、葡聚糖、糊精、dextrates、蔗糖、tylose、預(yù)糊化淀粉、 硫酸鉤、直鏈淀粉、甘氨酸、膨潤(rùn)土、麥芽糖、山梨糖醇、乙基纖維素、 磷酸氫二鈉、磷酸二鈉、焦亞硫酸二鈉、聚乙烯醇、明膠、葡萄糖、瓜爾 膠、液體葡萄糖、可壓縮糖、硅酸鎂鋁、麥芽糖糊精、聚氧化乙烯、聚曱 基丙烯酸酯、聚維酮、海藻酸鈉、黃蓍膠微晶纖維素、淀粉和玉米醇溶蛋 白。高分子量結(jié)構(gòu)添加劑的示例性濃度為0.1重量%-10重量%。在其他實(shí) 施方案中,可以包括增量劑(例如,甘露糖醇、甘氨酸)。
組合物可以適合于腸胃外施用。示例性組合物適合于通過(guò)技術(shù)人員可 用的任何途徑注射或輸注到動(dòng)物體內(nèi),例如關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、 腹膜內(nèi)、腦內(nèi)(腦實(shí)質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌內(nèi)、目艮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、損傷內(nèi)、直 腸內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)口和吸入途徑。腸胃外制劑一般將是無(wú)菌、無(wú)致熱原、等 滲的水溶液,任選包含藥學(xué)上可接受的防腐劑。
非水溶劑的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如歉脫油、和可注 射有機(jī)酯例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳狀液或懸浮液, 包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡 萄糖和氯化鈉、乳酸g氏液或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)媒介物包括液體和營(yíng) 養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑,例如基于林格氏葡萄糖的那些,等。也可以存 在防腐劑和其他添加劑,例如,抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣 體等。 一般參見(jiàn),引入本文作為參考的Remington's PharmaceuticalScience,第16版,Mack編輯,1980。
本文描述的藥物組合物可以配制用于以這樣的方式控制或持續(xù)遞送, 所述方式在特定局部環(huán)境中提供局部濃度的產(chǎn)物(例如,快速濃注(bolus )、 貯庫(kù)(depot)效應(yīng))的持續(xù)釋放和/或增加的穩(wěn)定性或半衰期。本發(fā)明考 慮,在某些實(shí)施方案中,此種組合物在初始貯存物中可以包括顯著更大量 的抗體或片段,而依照;$^>開(kāi)內(nèi)容實(shí)際上在任何時(shí)間點(diǎn)上釋放且可用的抗 體或片段的有效量是比初始貯存物低得多的量。組合物可以包括本發(fā)明的 IL-ip結(jié)合抗體、抗體片段、核酸或載體與聚合化合物(例如聚乳酸、聚 乙醇酸等)顆粒制品、以及試劑例如生物可降解基質(zhì)、可注射孩i球體、微 嚢顆粒、微嚢、生物可蝕解顆粒珠、脂質(zhì)體和可#^遞送裝置(提供活性 劑的控制或持續(xù)釋放)的制劑,隨后該制劑可以以貯庫(kù)型注射劑的形式遞 送。用于配制此種持續(xù)或控制遞送手段的技術(shù)是已知的,并且各種聚合物 已得到開(kāi)發(fā)和用于藥物的控制釋方文和遞送。此種聚合物一般是生物可降解 和生物相容的。聚合物水凝膠,包括由對(duì)映體聚合物或多肽區(qū)段的^而 形成的聚合物水凝膠,以及具有溫度或pH敏感性質(zhì)的水凝膠,由于在捕 獲生物活性蛋白質(zhì)試劑(例如抗體)時(shí)涉及的溫和水性條件,而可能是用 于提供藥物貯庫(kù)效應(yīng)所期望的。參見(jiàn)例如,在PCT申請(qǐng)公開(kāi)WO 93/15722 中用于遞送藥物組合物的控制釋放多孔聚合物微粒的描述。
用于這個(gè)用途的合適材料包括聚乳酸(參見(jiàn)例如,美國(guó)專(zhuān)利 3,773,919)、聚(a-羥基羧酸)聚合物,例如聚-D- (-) -3-羥丁酸(EP 133,988A) 、 L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人, Biopolymers, 22: 547-556( 1983 ))、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(Langer 等人,J. Biomed. Mater.Res., 15: 167-277 ( 1981 ),和Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982))、乙烯乙酸乙烯酯、或聚-D (-)-3-羥丁酸。 其他生物可降解聚合物包括聚(內(nèi)酯)、聚(縮醛)、聚(原酸酯)和聚 (原碳酸酯)。持續(xù)釋放組合物還可以包括脂質(zhì)體,其可以通過(guò)本領(lǐng)域已 知的數(shù)種方法中的任何一種進(jìn)行制4<參見(jiàn)例如,Eppstein等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-92 (1985))。載體自身或其降解產(chǎn)物在耙組織中應(yīng)是無(wú)毒的,并且不應(yīng)使病癥進(jìn)一步惡化。這可以通過(guò)在耙病癥的動(dòng) 物模型中的常規(guī)篩選進(jìn)行測(cè)定,或者如果此種模型不可得的話,在正常動(dòng) 物中測(cè)定。
用于持續(xù)釋放的重組蛋白質(zhì)的微嚢化已用人生長(zhǎng)激素(rhGH)、干 擾素-(rhlFN—)、白介素-2和MNrgpl20成功地進(jìn)行。Johnson等人, Nat.Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993) ; Hora等人,Bio/Technologv. 8: 755-758 (19卯);Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, 編輯,(Plenum Press: New York, 1995),第439-462頁(yè);WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399;和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,654,010。這些蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放制劑4吏用 聚丙交酯共乙交酯(PLGA)聚合物(由于其生物相容性和廣泛范圍的生 物可降解性質(zhì))進(jìn)行開(kāi)發(fā)。PLGA的降解產(chǎn)物——乳酸和乙醇酸可以在人 體內(nèi)被快速清除。此外,這種聚合物的降解度可以取決于其分子量和組成。 Lewis , "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (編輯),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems ( Marcel Dekker: New York, 1990 ), 第1-41 頁(yè)。持續(xù)釋放組合物的另外例子包括例如EP 58,481 A,美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 3,887,699, EP 158,277A,加拿大專(zhuān)利號(hào)1176565, U. Sidman等人, Biopolymers 22, 547 [1983], R. Langer等人,Chem. Tech. 12, 98 [1982, Sinha等人,J. Control. Release 90, 261 [2003], Zhu等人,Nat. Biotechnol. 18, 24 [2000,和Dai等人,Colloids Surf B Biointerfaces 41 , 117 [2005。
生物粘附聚合物也預(yù)期用于在本發(fā)明的組合物中使用或與本發(fā)明的 組合物一起使用。生物粘附劑是能夠與生物基底長(zhǎng)時(shí)間粘附的合成和天然 存在的材料。例如,卡波姆和聚卡波非是聚(丙烯酸)的合成交聯(lián)衍生物。 基于天然存在物質(zhì)的生物粘附遞送系統(tǒng)包括例如透明質(zhì)酸,也稱(chēng)為乙酰透 明質(zhì)酸。透明質(zhì)^A由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺殘基組成的天然存在的粘多糖。透明質(zhì)酸存在于脊推動(dòng)物的細(xì)胞外組織基質(zhì)中,包括在結(jié)締 組織中,以及在滑液以及眼的玻璃體液和房水中。透明質(zhì)酸的酯化衍生物 已用于產(chǎn)生微球體用于在遞送中使用,所述微球體是生物相容和生物可降
解的(參見(jiàn)例如,Cortivo等人,Biomaterials( 1991 )12: 727- 730; European
發(fā)明者A·索林格, D·埃里瓦, P·J·斯加儂, R·J·鮑爾 申請(qǐng)人:愛(ài)克索馬技術(shù)有限公司