專利名稱：一種含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取物、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取物制備方法，本發(fā)明還包括本發(fā)明的提取物在鎮(zhèn)痛方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
吳茱萸堿(evodiamine, EV0)和吳茱萸次堿(rutaecarpine, RUT)是中藥吳茱萸的主要活性成分，其具有降壓、舒血管、抗過敏、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。EVO和RUT的VR1激動(dòng)作用，可促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)(CGRP、P物質(zhì)等)的合成和釋放，試驗(yàn)證實(shí)高劑量的EVO能使小鼠離體回腸神經(jīng)元脫敏發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，推測(cè)EVO的鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與辣椒素類似，通過與外周感覺神經(jīng)傳入纖維上的VR1結(jié)合，激活與之偶聯(lián)的膜離子通道，使Ca2+通道開放，胞質(zhì)中Ca2+濃度升高，興奮感覺神經(jīng)，促進(jìn)神經(jīng)元及其纖維釋放神經(jīng)遞質(zhì)，進(jìn)而使其從外周和中樞神經(jīng)細(xì)胞中逐漸耗竭排空，阻斷疼痛的傳導(dǎo)，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。除了上述的鎮(zhèn)痛機(jī)制，EVO與RUT還能下調(diào)環(huán)氧合酶_2 (C0X-2)的表達(dá)或者抑制C0X-2的活性，抑制炎性介質(zhì)的釋放，緩解炎性疼痛。因此，EVO與RUT可能是ー類針對(duì)多靶點(diǎn)的鎮(zhèn)痛藥物。中國(guó)專利CN 1931271A專利提供了一種吳茱萸提取物及其制備方法、藥物組合物和用途，但其制備方法不包含且不能推斷出本發(fā)明提取物的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供ー種含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取物制備方法。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取物具有鎮(zhèn)痛作用，為此，本發(fā)明提供ー種含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取物的醫(yī)藥新用途。本發(fā)明的含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿比例在
1-10 :1-5范圍內(nèi)。上述比例優(yōu)選提取物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的比例為I. 3 1-1.8 I。本發(fā)明的含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取物純度在50%以上。本發(fā)明提取物從天然藥物例如蕓香科植物吳茱萸、疏毛吳茱萸和石虎等或其炮制品中提取獲得。EVO和RUT是ー類極度難溶的化合物，幾乎不溶于水和多數(shù)有機(jī)溶剤，ロ服吸收困難，我們的研究表明灌胃給予SD大鼠500mg kg—1的EVO単體，血藥濃度峰值(Cmax)為49. 0± 19. Ong !!!じ1，生物利用度僅為0.1% o灌胃給予SD大鼠40mgぜ的RUT単體，血藥濃度值低于最低檢測(cè)限(2ng じ1)。而在Wistar品系的大鼠(自發(fā)性高血壓大鼠)連續(xù)18天灌胃給予40mg *kg_1的RUT單體,最后一次給藥后30min的血藥濃度僅為2. 4±3ng じ1。因而，尋找更有效的EVO和RUT給藥形式具有重要意義。本研究室發(fā)現(xiàn)特定比例的提取物較化學(xué)合成単體能明顯改善EVO和RUT的吸收，増加二者的生物利用度，且呈現(xiàn)純度依賴性。本發(fā)明的提取物優(yōu)選制備方法如下
A、藥材提取將吳茱萸屬原料(藥材或炮制品)用こ醇溶液(含體積百分含量(下同)60% -90%的こ醇)、こ醇、甲醇等有機(jī)溶劑提取，得到提取液。B、分段水 沉將上述提取液或濃縮后的提取液加入水后使醇的濃度下降并不低于33%，后離心取沉淀；C、精制將B所得的沉淀用醇重結(jié)晶，離心收集沉淀干燥后，即得不同純度的吳茱萸堿和吳茱萸次堿的組合物。本發(fā)明的提取物可用于鎮(zhèn)痛，治療的疼痛包括糖尿病性神經(jīng)疼痛、腰背痛、慢性肌肉骨骼痛、骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，但不限于此。本發(fā)明提取物的制備方法エ藝簡(jiǎn)單可控，成本低；可通過控制エ藝因素制備不同純度提取物；生產(chǎn)過程無污染，具有良好的生產(chǎn)和開發(fā)價(jià)值。


圖I是不同劑量吳茱萸提取物乳膏對(duì)不同時(shí)相小鼠舔后足累計(jì)時(shí)間的影響(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，n = 8)，*P < 0. 05 ;#P < 0. Olv. s 空白基質(zhì)組；圖2是大鼠ロ服三種純度吳茱萸提取物后EVO的藥時(shí)曲線(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，n =6)；圖3是大鼠ロ服三種純度吳茱萸提取物后RUT的藥時(shí)曲線(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，n =6)；圖4是大鼠ロ服六種比例混合物后EVO的藥時(shí)曲線(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，n = 6)；圖5是大鼠ロ服六種比例混合物后RUT的藥時(shí)曲線(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，n = 6)；
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)ー步說明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取物的制備A、提取(A)將吳茱萸屬原料(蕓香科植物吳茱萸的干燥近成熟果實(shí))按原料與60%こ醇溶液的體積分?jǐn)?shù)比為I : 10-12向原料中加入60%こ醇溶液，然后將兩者的混合物熱至70-100°C，保溫3小時(shí)后，濾渣取液。(B)按所述吳茱萸屬原料與60%こ醇溶液的體積分?jǐn)?shù)比為I : 8-10向A步(A)濾出的渣中加入60%こ醇溶液，并將兩者混合物加熱至70-100°C，保溫3小時(shí)后，濾渣取液。(C)按所述吳茱萸屬原料與60%こ醇溶液的體積分?jǐn)?shù)比為I : 8-10向A步⑶濾出的渣中加入60%こ醇溶液，并將兩者混合物加熱至70-100°C，保溫3小時(shí)后，濾渣取液。將分別通過所述各A步(A)、(B)、(C)制取的液體混合一起后減壓濃縮，直至其中重量與所述原料重量之比為I : 1-10為止。B、分段水沉濃縮后的提取物離心收集沉淀，按沉淀與90%こ醇重量比為I : 15-20向沉淀中加90%こ醇溶解，再次提取。將提取液離心棄去沉淀，按上清液與水的體積分?jǐn)?shù)比為I 0.5向上清液中加入水稀釋こ醇液，使こ醇終濃度為60%，離心棄去沉淀；按上清液與水的體積分?jǐn)?shù)比為I : 0. 3向上清液中加入水稀釋こ醇液，使こ醇終濃度為45%，離心取沉淀(a);按上清液與水的體積分?jǐn)?shù)比為I : 0. 3向上清液中加入水稀釋こ醇液，使こ醇終濃度為33%，離心取沉淀(b);按上清液與水的體積分?jǐn)?shù)比為I : 0.3向上清液中加入水稀釋こ醇液，使こ醇終濃度為25%，離心取沉淀(c)。C、精制將B所得的沉淀(a，b，c)分別用1_10倍量的甲醇重結(jié)晶，離心收集沉淀干燥后，即得三種純度的吳茱萸提取物，高、中、低純度分別為80%、49%和16%，EV0和RUT的比例為 I. 3 I。
實(shí)施例2不同純度提取物的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)比較將實(shí)施例I方法獲得的高、中、低純度吳茱萸提取物分別混懸于0. 5% CMC-Na溶液中，制成混懸液。18只健康SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，不禁水，灌胃給予高、中、低純度吳茱萸提取物混懸液，劑量為40mg kg-1 (EVO)，3Img kg-1 (RUT)。分別在灌胃后0. 25,0. 5、0. 75、1、1. 5、2、2. 5、3、4h于眼眶后靜脈叢取血0. 5ml，置于肝素抗凝的塑料離心管中，血樣即刻采用液液萃取法處理，進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖2、3。高純度組中EVO的Cmax是中純度組的2. I倍，低純度組的3. 8倍，而高純度組中RUT的Cmax是中純度組的2. 3倍，低純度組的9. 4倍。統(tǒng)計(jì)分析后，三組EVO和RUT的Cmax差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 01)。EVO和RUT的AUCch4也隨純度的提高而升高，低純度組明顯低于高、中純度組(P < 0. 01)。提示提取物中雜質(zhì)可能延緩或阻礙EVO和RUT的吸收，其阻礙作用強(qiáng)弱與雜質(zhì)含量可能存在依賴關(guān)系。提取物的純度與其體內(nèi)吸收的情況成正比，純度越高，吸收越好，進(jìn)而藥效越強(qiáng)。實(shí)施例3不同比例EVO和RUT的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)比較為證實(shí)EVO和RUT比例對(duì)藥物體內(nèi)吸收的影響，將EVO和RUT的化學(xué)合成品以20 I、10 1、5 I、I I、I 5的比例混合，并分別混懸于0. 5% CMC-Naこ醇溶液中，制成混懸液。30只健康SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，不禁水，灌胃給予上述混懸液。分別在灌胃后0. 25,0. 5,0. 75、I、I. 5、2、2. 5、3、4h于眼眶后靜脈叢取血0. 5ml，置于肝素抗凝的塑料離心管中，血樣即刻采用液液萃取法處理，進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖4、5。采用CMC-Naこ醇溶液增加藥物的吸收以體現(xiàn)EVO和RUT比例對(duì)大鼠在體吸收的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，EV0/RUT比例在10 : I I : 5之間的吸收強(qiáng)于20 : I或I : 10，推測(cè)原因可能為適宜的比例有助于EVO和RUT以無定形的晶型存在，而無定型藥物常具有較高的溶解度和生物利用度。10 : I I : 5的EV0/RUT比例接近天然藥物中兩者的天然比例。本發(fā)明的提取物具有鎮(zhèn)痛作用，以下通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明本發(fā)明的醫(yī)藥用途。實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)手段，含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的組合物使用本發(fā)明實(shí)施例I方法得到。藥理學(xué)試驗(yàn)觀察了本組合物治療三種不同原因引起的疼痛模型的藥理學(xué)效應(yīng)。(I)吳茱萸提取物用于治療福爾馬林誘導(dǎo)的小鼠疼痛本實(shí)驗(yàn)取昆明小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為空白基質(zhì)組、扶他林乳膠陽(yáng)性對(duì)照組、辣椒堿軟膏陽(yáng)性對(duì)照組、受試藥(吳茱萸提取物乳膏)低、中、高劑量乳膏組6個(gè)組，右后足均勻涂布上述藥物，給藥120min后各鼠右后足筋膜下注射2. 5%福爾馬林生理鹽水溶液20yL，觀察I相(0-5min)，II相(20_35min)小鼠舔后足累積時(shí)間作為評(píng)估治療疼痛指標(biāo)，比較各組間差異。實(shí)驗(yàn)選用扶他林乳膠和辣椒堿軟膏兩種陽(yáng)性藥，其中，扶他林乳膠(諾華制藥，I. 16%)通過抑制COX的活性發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛作用，而辣椒堿軟膏(長(zhǎng)春普華制藥，0. 025% )則能激動(dòng)辣椒素受體使感覺神經(jīng)脫敏來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，兩種市售藥物的鎮(zhèn)痛機(jī)制與受試藥相同，因而選擇上述兩種市售外用制劑作為陽(yáng)性對(duì)照。其中低、中、高劑量乳膏選用本發(fā)明的組合物制備方法，獲得的提取物吳茱萸堿和吳茱萸次堿比例為I. 8 1，含量為71.0%。低、中、高劑量乳膏含藥量分別為0. 1^.0.2%和 0. 4%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)分析軟件，以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，結(jié)果見圖I。
結(jié)果顯示，與空白基質(zhì)對(duì)照組比較，0. 1% -0.4%的吳茱萸提取物乳膏及0.025%辣椒堿軟膏陽(yáng)性組小鼠在給藥后5min內(nèi)舔后足累計(jì)時(shí)間顯著減少，提示藥物對(duì)福爾馬林所致的C型纖維過度放電引起的疼痛有良好的改善作用。高劑量乳膏與扶他林乳膠還能顯著降低20-35min內(nèi)舔后足累計(jì)時(shí)間，表明提取物乳膏還對(duì)炎性疼痛有效?？傃灾茉囁帉?duì)該模型兩相疼痛均有顯著治療作用，并且其效應(yīng)具有劑量依賴性。(2)吳茱萸提取物用于熱刺激疼痛模型治療取雌性昆明小鼠，隨機(jī)分成空白基質(zhì)組、扶他林乳膠陽(yáng)性對(duì)照組、辣椒堿軟膏陽(yáng)性對(duì)照組、受試藥低、中、高劑量乳膏組6個(gè)組，置于55±0. 5°C恒溫池中，以小鼠舔后足為疼痛反應(yīng)指標(biāo)，記錄產(chǎn)生反應(yīng)的潛伏期。選取基礎(chǔ)痛閾在5-25s之間的小鼠(從將小鼠置于熱板上至小鼠開始舔后足的時(shí)間作為基礎(chǔ)痛閾)，右腳均勻涂布相同量的上述藥物，測(cè)量用藥后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠痛閾，比較各組間差異。其中低、中、高劑量乳膏選用本發(fā)明的組合物制備方法，獲得的提取物吳茱萸堿和吳茱萸次堿比例為I. 8 1，含量為71.0%。低、中、高劑量乳膏含藥量分別為0. 1^.0.2%和 0. 4%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)分析軟件，以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，結(jié)果見表I。表I不同劑量吳茱萸提取物乳膏對(duì)熱刺激痛閾值的影響(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，n = 6)
權(quán)利要求
1.一種含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取物，該提取物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的比例在1-10 1-5范圍內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取物，其特征在于吳茱萸堿和吳茱萸次堿的比例為I.3 1—1.8 I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或者2所述的提取物，其特征在于含茱萸堿和吳茱萸次堿的純度在50%以上。
4.制備權(quán)利要求I至3所述提取物的方法， A、藥材提取 將吳茱萸屬原料用體積百分濃度為60% -90%乙醇溶液、乙醇或甲醇溶劑提取，得到提取液； B、分段水沉 將上述提取液或濃縮后的提取液中加入水使醇的濃度降低但大于33%，離心后取沉淀； C、精制 將B所得的沉淀用醇重結(jié)晶，離心收集沉淀干燥后，即得含吳茱萸堿和吳茱萸次堿的組合物。
5.權(quán)利要求I至3所述的組合物在制備治療鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所說的用途，其特征在于所說的鎮(zhèn)痛是包括糖尿病性神經(jīng)疼痛、腰背痛、慢性肌肉骨骼痛、骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有吳茱萸堿EVO和吳茱萸次堿RUT的提取物、制備方法，本發(fā)明還包括本發(fā)明提取物的醫(yī)藥用途。本發(fā)明提供的含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的比例在1-10∶1-5范圍內(nèi)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)特定比例的提取物較化學(xué)合成單體能明顯改善EVO和RUT的吸收，增加二者的生物利用度，且呈現(xiàn)純度依賴性。本發(fā)明的提取物可用于鎮(zhèn)痛。
文檔編號(hào)A61K36/756GK102755425SQ20111011116
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者丁勁松, 周應(yīng)軍, 徐世希, 羅芳梅, 胡長(zhǎng)平, 陳菲 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙晶易醫(yī)藥科技有限公司