專利名稱：一種可注射性心肌組織工程產(chǎn)品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于多糖-多肽微球支架的可 注射性心肌組織工程產(chǎn)品及其制備方法。
背景技術(shù)：
以生物材料攜帶細(xì)胞和生長因子的心肌組織工程策略可以有效地調(diào)控心梗微環(huán) 境，從而進(jìn)一步提高細(xì)胞的滯留率和存活率，是一種新型的有效的治療心肌梗死的手段。其 中，生物材料起非常關(guān)鍵的作用，理想的心肌組織工程生物材料應(yīng)該具有調(diào)控心梗微環(huán)境、 抗凋亡、促進(jìn)血管生長等多重功能，同時(shí)還應(yīng)該具有合適的可注射行為、空間結(jié)構(gòu)和力學(xué)強(qiáng)度。殼聚糖是自然界唯一的陽離子多糖，具有良好的生物相容性和組織相容性，同時(shí) 具有抗氧化能力可以清除心肌梗塞微環(huán)境中的活性氧自由基，其抗氧化性能隨著殼聚糖分 子量的增加而降低，但是殼聚糖分子量的降低使其在制備生物材料時(shí)成型困難且力學(xué)性能 下降，因此對高分子量的殼聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾以提高其抗氧化能力是制備心肌組織工程生 物材料的必要步驟。另一方面，傳統(tǒng)的可注射性心肌組織工程水凝膠材料，雖然能夠有效地 提高細(xì)胞的滯留率和存活率，對心肌損傷的修復(fù)有明顯效果。但是細(xì)胞在水凝膠中生長空 間有限、養(yǎng)分和代謝物傳遞困難，限制了在心肌組織工程中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌組織工程
女口
廣 PFt ο本發(fā)明的目的還在于提供一種基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌組織工 程產(chǎn)品的制備方法。一種基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌組織工程產(chǎn)品，其特征在于，該產(chǎn) 品包括心肌細(xì)胞、殼聚糖-多肽和卡拉膠微球。其特征在于，所述卡拉膠微球的粒徑為30-200 μ m。一種基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌組織工程產(chǎn)品的制備方法，其特征 在于，按照如下步驟進(jìn)行一種基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌組織工程產(chǎn)品的制備方法，其特征 在于，按照如下步驟進(jìn)行(1)殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備 (a)稱取一定量殼聚糖將其溶于1 % -3 %的乙酸中，制備成質(zhì)量濃度為1 % -5 %殼 聚糖的乙酸，攪拌直至全部溶解。(b)稱取l_4g功能性多肽溶與20ml去離子水腫，加入2_嗎啉乙磺酸水合物攪拌 活化半小時(shí)，然后將其加入到50ml殼聚糖溶液中混勻。(c)加入碳化二亞胺和羥基琥珀酰亞胺并攪拌1-4小時(shí)，然后將其置于透析袋中透析72小時(shí)。(d)將其放入低溫冰箱中預(yù)凍12-48小時(shí)，然后冷凍干燥，獲得殼聚糖-多肽復(fù)合 物。(2)殼聚糖-多肽微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取l_4g殼聚糖-多肽復(fù)合物溶于2%的醋酸中制得殼聚糖-多肽。(b)將20_50ml液體石蠟，乙酸乙酯和span-80混合均勻。(c)在100-2000r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將10_40ml殼聚糖-多肽溶液滴加到液體 石蠟，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入一定量的2. 5%戊二醛，100-2000r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪 拌1-5小時(shí)。(e)靜置2-4小時(shí)后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空干 燥，即可得到殼聚糖-多肽微球。(f) Co60 滅菌備用。(3)卡拉膠微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取l_4g卡拉膠溶于去離子水中獲得濃度為0. 2_4%的卡拉膠。(b)將適量的液體石蠟，乙酸乙酯和span-80混合均勻。(c)在100-2000r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將20_50ml卡拉膠溶液滴加到液體石蠟，乙 酸乙酯和span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入2-10ml 0. IM的氯化鈣，100-2000r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪 拌1-5小時(shí)。(e)靜置1-4小時(shí)后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空干 燥，即可得到卡拉膠微球。(f) Co60 滅菌備用。(4)可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體的制備(a)將0. l_2g殼聚糖-多肽微球分散到含有血清的IOml培養(yǎng)液中，然后利用該培 養(yǎng)液接種心肌細(xì)胞，待細(xì)胞在微球上粘附后，離心，棄去上清液，備用。 (b)將卡拉膠微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，攪拌，獲得一定卡拉膠微球濃度的 懸濁液，備用。(c)將粘附有細(xì)胞的殼聚糖-多肽微球按照一定的比例加入到卡拉膠微球懸液 中，快速攪拌，獲得可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體。所述功能性多肽為谷胱甘肽或谷氨酰胺-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸五 肽。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的微球支架具有調(diào)控心梗微環(huán)境的能力，同時(shí)具有利 于心肌細(xì)胞貼附和生長的空間結(jié)構(gòu)，便于養(yǎng)分和代謝物的傳遞，是一種新型的心肌組織工 程用支架材料。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。以下實(shí)施所用的主要原料殼聚糖(脫乙酰度95%分子量20萬)、多肽為固相合成產(chǎn)品，純度大于99%，卡拉膠為kappa型，分子量約為20萬，其余原料均為化學(xué)純；實(shí)施 例所用心肌細(xì)胞由中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)捐贈。實(shí)施例1(1)殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備(a)配制質(zhì)量百分比濃度為的乙酸50ml，稱取Ig殼聚糖-多肽復(fù)合物溶入其 中磁力攪拌20min使其充分溶解，配制的質(zhì)量濃度為2%的殼聚糖-多肽。(b)稱取0. 2g的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-天 冬氨酸五肽)，溶于IOml去離子水中，然后再向其中加入2-嗎啉乙磺酸水合物(MES) (MES 的最終濃度為0. 1M)，然后將其加入殼聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物 0.5g，(其中EDC和NHS的比例為1 1)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將其置于透析袋中透析72小 時(shí)，置入低溫冰箱中預(yù)凍12小時(shí)以上，然后冷凍干燥，獲得殼聚糖-多肽復(fù)合物。(2)殼聚糖-多肽微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取Ig的殼聚糖-多肽復(fù)合物溶于50ml的2%的醋酸中制得殼聚糖-多 肽。(b)將30ml液體石蠟、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在500r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將2g殼聚糖-多肽滴加到液體石蠟、乙酸乙酯和 span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)。形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入2ml的2. 5%戊二醛，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5小 時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水一次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到殼聚糖-多肽微球。(f) Co60 滅菌備用。(3)卡拉膠微球的制備(a)稱取0. 5g卡拉膠溶于49. 5g去離子水中獲得濃度為的卡拉膠50ml。(b)將30ml液體石蠟，30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在500r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將30ml卡拉膠溶液滴加到液體石蠟，乙酸乙酯和 span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)。形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入IOml的0. IM的氯化鈣，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5 小時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到卡拉膠微球。(4)可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體的制備(a)將0. 3g的殼聚糖_多肽微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，然后在其中種植 1 X IO6心肌細(xì)胞，待細(xì)胞在微球上粘附后，離心，棄去上清液，備用。(b)將卡拉膠微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，攪拌，獲得30mg/ml卡拉膠微球濃 度的懸濁液10ml，備用。(c)將粘附有細(xì)胞的殼聚糖-多肽微球按照加入到卡拉膠微球懸液中，快速攪拌， 獲得可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體。實(shí)施例2
(1)殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備(a)配制質(zhì)量百分比濃度為的乙酸50ml，稱取Ig殼聚糖-多肽復(fù)合物溶入其 中磁力攪拌20min使其充分溶解，配制的質(zhì)量濃度為2%的殼聚糖-多肽。(b)稱取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-天 冬氨酸五肽)，溶于IOml去離子水中，然后再向其中加入2-嗎啉乙磺酸水合物(MES) (MES 的最終濃度為0. 1M)，然后將其加入殼聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物 0.5g，(其中EDC和NHS的比例為1 1)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將其置于透析袋中透析72小 時(shí)，置入低溫冰箱中預(yù)凍12小時(shí)以上，然后冷凍干燥，獲得殼聚糖-多肽復(fù)合物。(2)殼聚糖-多肽微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取Ig的殼聚糖-多肽復(fù)合物溶于50ml的2%的醋酸中制得殼聚糖-多 肽。(b)將30ml液體石蠟、30ml乙酸乙酯和40mlspan_80混合均勻，100ml。(c)在lOOOr/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將2g殼聚糖-多肽滴加到液體石蠟、乙酸乙酯 和span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)。形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入2ml的2. 5%戊二醛，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5小 時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水一次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到殼聚糖-多肽微球。(f) Co60 滅菌備用。(3)卡拉膠微球的制備(a)準(zhǔn)確稱0. 5克的卡拉膠溶于49. 5克去離子水中獲得濃度為1 %的卡拉膠 50ml。(b)將適量的液體石蠟、乙酸乙酯和span-80混合均勻，IOOml0(c)在lOOOr/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將30ml卡拉膠溶膠滴加到液體石蠟、乙酸乙酯 和span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入IOml的0. IM的氯化鈣，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5 小時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到卡拉膠微球。(f) Co60 滅菌備用。(4)可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體的制備(a)將0. 3g的殼聚糖_多肽微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，然后在其中種植 1 X IO6心肌細(xì)胞，待細(xì)胞在微球上粘附后，離心，棄去上清液，備用。(b)將卡拉膠微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，攪拌，獲得30mg/ml卡拉膠微球濃 度的懸濁液10ml，備用。(c)將粘附有細(xì)胞的殼聚糖-多肽微球按照加入到卡拉膠微球懸液中，快速攪拌， 獲得可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體。實(shí)施例3(1)殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備
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(a)配制質(zhì)量百分比濃度為的乙酸50ml，稱取Ig殼聚糖-多肽復(fù)合物溶入其 中磁力攪拌20min使其充分溶解，配制的質(zhì)量濃度為2%的殼聚糖-多肽。(b)稱取0. 5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-天 冬氨酸五肽)，溶于IOml去離子水中，然后再向其中加入2-嗎啉乙磺酸水合物(MES) (MES 的最終濃度為0. 1M)，然后將其加入殼聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物 0.5g，(其中EDC和NHS的比例為1 1)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將其置于透析袋中透析72小 時(shí)，置入低溫冰箱中預(yù)凍12小時(shí)以上，然后冷凍干燥，獲得殼聚糖-多肽復(fù)合物。(2)殼聚糖-多肽微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取Ig的殼聚糖-多肽復(fù)合物溶于50ml的2%的醋酸中制得殼聚糖-多 肽。(b)將30ml液體石蠟、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在500r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將2g殼聚糖-多肽滴加到液體石蠟，乙酸乙酯和 span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入2ml的2. 5%戊二醛，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5小 時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水一次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到殼聚糖-多肽微球。(f) Co60 滅菌備用。(3)卡拉膠微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取一定量的卡拉膠溶于去離子水中獲得濃度為的卡拉膠50ml。(b)將30ml液體石蠟，30ml乙酸乙酯和40mlspan_80混合均勻，100ml。(c)在500r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將30ml卡拉膠溶膠滴加到液體石蠟，乙酸乙酯和 span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入IOml的0. IM的氯化鈣，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5 小時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到卡拉膠微球。(f) Co60 滅菌備用。(4)可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體的制備(a)將0. 3g的殼聚糖_多肽微球分散到含有血清的20ml培養(yǎng)液中，然后在其中種 植1 X IO6心肌細(xì)胞，待細(xì)胞在微球上粘附后，離心，棄去上清液，備用。(b)將卡拉膠微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，攪拌，獲得30mg/ml卡拉膠微球濃 度的懸濁液10ml，備用。(C)將粘附有細(xì)胞的殼聚糖-多肽微球按照加入到卡拉膠微球懸液中，快速攪拌， 獲得可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體。實(shí)施例4(1)殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備(a)配制質(zhì)量百分比濃度為的乙酸50ml，稱取Ig殼聚糖-多肽復(fù)合物溶入其 中磁力攪拌20min使其充分溶解，配制的質(zhì)量濃度為2%的殼聚糖-多肽。
(b)稱取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-天 冬氨酸五肽)，溶于IOml去離子水中，然后再向其中加入2-嗎啉乙磺酸水合物(MES) (MES 的最終濃度為0. 1M)，然后將其加入殼聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物 0.5g，(其中EDC和NHS的比例為1 1)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將其置于透析袋中透析72小 時(shí)，置入低溫冰箱中預(yù)凍12小時(shí)以上，然后冷凍干燥，獲得殼聚糖-多肽復(fù)合物。(2)殼聚糖-多肽微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取Ig的殼聚糖-多肽復(fù)合物溶于50ml的2%的醋酸中制得殼聚糖-多 肽。(b)將30ml液體石蠟，30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在lOOOr/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將2g殼聚糖-多肽滴加到液體石蠟，乙酸乙酯 和span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)。形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入2ml的2. 5%戊二醛，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5小 時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水一次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到殼聚糖-多肽微球。(f) Co60 滅菌備用。(3)卡拉膠微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取一定量的卡拉膠溶于去離子水中獲得濃度為的卡拉膠50ml。(b)將30ml液體石蠟、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在lOOOr/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將30ml卡拉膠溶膠滴加到液體石蠟、乙酸乙酯 和span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入IOml的0. IM的氯化鈣，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5 小時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到卡拉膠微球。(f) Co60 滅菌備用。(4)可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體的制備(a)將0. 3g的殼聚糖-多肽微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，然后在其中種植 1 X IO6心肌細(xì)胞，待細(xì)胞在微球上粘附后，離心，棄去上清液，備用。(b)將卡拉膠微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，攪拌，獲得30mg/ml卡拉膠微球濃 度的懸濁液10ml，備用。(c)將粘附有細(xì)胞的殼聚糖-多肽微球按照加入到卡拉膠微球懸液中，快速攪拌， 獲得可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體。實(shí)施例5(1)殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備(a)配制質(zhì)量百分比濃度為的乙酸50ml，稱取Ig殼聚糖-多肽復(fù)合物溶入其 中磁力攪拌20min使其充分溶解，配制的質(zhì)量濃度為2%的殼聚糖-多肽。(b)稱取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-天 冬氨酸五肽)，溶于IOml去離子水中，然后再向其中加入2-嗎啉乙磺酸水合物(MES) (MES的最終濃度為0. 1M)，然后將其加入殼聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物 0.5g，(其中EDC和NHS的比例為1 1)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將其置于透析袋中透析72小 時(shí)，置入低溫冰箱中預(yù)凍12小時(shí)以上，然后冷凍干燥，獲得殼聚糖-多肽復(fù)合物。(2)殼聚糖-多肽微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取Ig的殼聚糖-多肽復(fù)合物溶于50ml的2%的醋酸中制得殼聚糖-多 肽。(b)將30ml液體石蠟，30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在500r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將2g殼聚糖-多肽滴加到液體石蠟，乙酸乙酯和 span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入2ml的2. 5%戊二醛，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5小 時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水一次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到殼聚糖-多肽微球。(f) Co60 滅菌備用。(3)卡拉膠微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取一定量的卡拉膠溶于去離子水中獲得濃度為的卡拉膠50ml。(b)將30ml液體石蠟、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在500r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將30ml卡拉膠溶膠滴加到液體石蠟、乙酸乙酯和 span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入IOml的0. IM的氯化鈣，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5 小時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到卡拉膠微球。(f) Co60 滅菌備用。(4)可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體的制備(a)將0. 5g的殼聚糖_多肽微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，然后在其中種植 1 X IO6心肌細(xì)胞，待細(xì)胞在微球上粘附后，離心，棄去上清液，備用。(b)將卡拉膠微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，攪拌，獲得30mg/ml卡拉膠微球濃 度的懸濁液10ml，備用。(c)將粘附有細(xì)胞的殼聚糖-多肽微球按照加入到卡拉膠微球懸液中，快速攪拌， 獲得可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體。實(shí)施例6(1)殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備(a)配制質(zhì)量百分比濃度為的乙酸50ml，稱取Ig殼聚糖-多肽復(fù)合物溶入其 中磁力攪拌20min使其充分溶解，配制的質(zhì)量濃度為2%的殼聚糖-多肽。(b)稱取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-天 冬氨酸五肽)，溶于IOml去離子水中，然后再向其中加入2-嗎啉乙磺酸水合物(MES) (MES 的最終濃度為0. 1M)，然后將其加入殼聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物 0.5g，(其中EDC和NHS的比例為1 1)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將其置于透析袋中透析72小
10時(shí)，置入低溫冰箱中預(yù)凍12小時(shí)以上，然后冷凍干燥，獲得殼聚糖-多肽復(fù)合物。
(2)殼聚糖-多肽微球的制備 (a)準(zhǔn)確稱取Ig的殼聚糖-多肽復(fù)合物溶于50ml的2%的醋酸中制得殼聚糖-多 肽。(b)將30ml液體石蠟，30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在500r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將2g殼聚糖-多肽滴加到液體石蠟，乙酸乙酯和 span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)。形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入2ml的2. 5%戊二醛，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5小 時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水一次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到殼聚糖-多肽微球。(f) Co60 滅菌備用。(3)卡拉膠微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取一定量的卡拉膠溶于去離子水中獲得濃度為的卡拉膠50ml。(b)將30ml液體石蠟、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在500r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將30ml卡拉膠溶膠滴加到液體石蠟、乙酸乙酯和 span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入IOml的0. IM的氯化鈣，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5 小時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到卡拉膠微球。(f) Co60 滅菌備用。(4)可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體的制備(a)將0. 5g的殼聚糖_多肽微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，然后在其中種植 1 X IO6心肌細(xì)胞，待細(xì)胞在微球上粘附后，離心，棄去上清液，備用。(b)將卡拉膠微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，攪拌，獲得30mg/ml卡拉膠微球濃 度的懸濁液10ml，備用。(c)將粘附有細(xì)胞的殼聚糖-多肽微球按照加入到卡拉膠微球懸液中，快速攪拌， 獲得可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體。實(shí)施例7(1)殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備(a)配制質(zhì)量百分比濃度為的乙酸50ml，稱取Ig殼聚糖-多肽復(fù)合物溶入其 中磁力攪拌20min使其充分溶解，配制的質(zhì)量濃度為2%的殼聚糖-多肽。(b)稱取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-組氨酸-精氨酸-谷氨酸-天 冬氨酸五肽)，溶于IOml去離子水中，然后再向其中加入2-嗎啉乙磺酸水合物(MES) (MES 的最終濃度為0. 1M)，然后將其加入殼聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物 0.5g，(其中EDC和NHS的比例為1 1)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將其置于透析袋中透析72小 時(shí)，置入低溫冰箱中預(yù)凍12小時(shí)以上，然后冷凍干燥，獲得殼聚糖-多肽復(fù)合物。(2)殼聚糖-多肽微球的制備
(a)準(zhǔn)確稱取Ig的殼聚糖-多肽復(fù)合物溶于50ml的2%的醋酸中制得殼聚糖-多 肽。(b)將30ml液體石蠟、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在500r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將一定量的殼聚糖-多肽滴加到液體石蠟、乙酸 乙酯和span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入2ml的2. 5%戊二醛，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5小 時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水一次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到殼聚糖-多肽微球。(f) Co60 滅菌備用。(3)卡拉膠微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取一定量的卡拉膠溶于去離子水中獲得濃度為的卡拉膠50ml。(b)將30ml液體石蠟、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均勻，100ml。(c)在500r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將30ml卡拉膠溶膠滴加到液體石蠟、乙酸乙酯和 span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入IOml的0. IM的氯化鈣，500r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌1_5 小時(shí)。(e)靜置一定的時(shí)間后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空 干燥，即可得到卡拉膠微球。(f) Co60 滅菌備用。(4)可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體的制備(a)將0. Ig的殼聚糖-多肽微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，然后在其中種植 1 X IO6心肌細(xì)胞，待細(xì)胞在微球上粘附后，離心，棄去上清液，備用。(b)將卡拉膠微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，攪拌，獲得30mg/ml卡拉膠微球濃 度的懸濁液10ml，備用。(c)將粘附有細(xì)胞的殼聚糖-多肽微球按照加入到卡拉膠微球懸液中，快速攪拌， 獲得可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體。
權(quán)利要求
1.一種基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌組織工程產(chǎn)品，其特征在于，該產(chǎn)品 包括心肌細(xì)胞、殼聚糖-多肽和卡拉膠微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1一種基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌組織工程產(chǎn)品，其特 征在于，所述卡拉膠微球的粒徑為30-200 μ m。
3.一種基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌組織工程產(chǎn)品的制備方法，其特征在 于，按照如下步驟進(jìn)行(1)殼聚糖-多肽復(fù)合物的制備(a)稱取一定量殼聚糖將其溶于1% -3 %的乙酸中，制備成質(zhì)量濃度為1 % -5 %殼聚糖 的乙酸，攪拌直至全部溶解。(b)稱取l_4g功能性多肽溶與20ml去離子水腫，加入2-嗎啉乙磺酸水合物攪拌活化 半小時(shí)，然后將其加入到50ml殼聚糖溶液中混勻。(c)加入碳化二亞胺和羥基琥珀酰亞胺并攪拌1-4小時(shí)，然后將其置于透析袋中透析 72小時(shí)。(d)將其放入低溫冰箱中預(yù)凍12-48小時(shí)，然后冷凍干燥，獲得殼聚糖-多肽復(fù)合物。(2)殼聚糖-多肽微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取l_4g殼聚糖-多肽復(fù)合物溶于2%的醋酸中制得殼聚糖-多肽。(b)將20-50ml液體石蠟，乙酸乙酯和span-80混合均勻。(c)在100-2000r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將10_40ml殼聚糖-多肽溶液滴加到液體石蠟， 乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入一定量的2.5%戊二醛，100-2000r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌 1-5小時(shí)。(e)靜置2-4小時(shí)后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空干燥，即 可得到殼聚糖-多肽微球。(f)Co60滅菌備用。(3)卡拉膠微球的制備(a)準(zhǔn)確稱取1-4卡拉膠溶于去離子水中獲得濃度為0.2-4%的卡拉膠。(b)將適量的液體石蠟，乙酸乙酯和span-80混合均勻。(c)在100-2000r/min轉(zhuǎn)速條件下緩慢將20_50ml卡拉膠溶液滴加到液體石蠟，乙酸乙 酯和span-80的混合液中，并持續(xù)攪拌1_2小時(shí)，形成均一的乳液。(d)在乳液中緩慢加入2-10ml0. IM的氯化鈣，100-2000r/min轉(zhuǎn)速條件下持續(xù)攪拌 1-5小時(shí)。(e)靜置1-4小時(shí)后，離心，用甲醇、石油醚洗滌、去離子水依次洗滌數(shù)次，真空干燥，即 可得到卡拉膠微球。(f)Co60滅菌備用。(4)可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體的制備(a)將0.5-2g殼聚糖-多肽微球分散到含有血清的IOml培養(yǎng)液中，然后利用該培養(yǎng)液 接種心肌細(xì)胞，待細(xì)胞在微球上粘附后，離心，棄去上清液，備用。(b)將卡拉膠微球分散到含有血清的培養(yǎng)液中，攪拌，獲得一定卡拉膠微球濃度的懸濁 液，備用。(c)將粘附有細(xì)胞的殼聚糖-多肽微球按照一定的比例加入到卡拉膠微球懸液中，快 速攪拌，獲得可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌組織工程產(chǎn)品 的制備方法，其特征在于，所述功能性多肽為谷胱甘肽或谷氨酰胺-組氨酸-精氨酸-谷氨 酸-天冬氨酸五肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于組織工程產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域的一種基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌組織工程產(chǎn)品及其制備方法。本發(fā)明的心肌組織工程產(chǎn)品包括心肌細(xì)胞、殼聚糖-多肽和卡拉膠微球。本發(fā)明通過微乳液法分別制備殼聚糖-多肽陽離子微球和卡拉膠陰離子微球，通過靜電自組裝的方式形成可注射性的多孔微球支架，然后將心肌細(xì)胞種植在殼聚糖多肽微球表面，和卡拉膠微球混合形成可注射性微球支架-細(xì)胞復(fù)合體。該微球支架具有調(diào)控心梗微環(huán)境的能力，同時(shí)具有利于心肌細(xì)胞貼附和生長的空間結(jié)構(gòu)，便于養(yǎng)分和代謝物的傳遞，是一種新型的心肌組織工程用支架材料。
文檔編號A61L31/04GK102133433SQ20111005642
公開日2011年7月27日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者劉志強(qiáng), 周瑾, 李俊杰, 楊桂利, 王常勇, 郝彤 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所