組織工程皮膚及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種組織工程皮膚，包括種子細(xì)胞和脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)，種子細(xì)胞與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)形成皮膚附屬器，種子細(xì)胞通過3D打印機(jī)按正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列平鋪打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)正面的相應(yīng)位置中。本發(fā)明還公開了上述組織工程皮膚的制備方法。本發(fā)明提供了完善的組織工程皮膚，可以供在手術(shù)室內(nèi)短時(shí)間內(nèi)快速構(gòu)建組織工程皮膚(完成手術(shù))。同時(shí)，由于本發(fā)明的組織工程皮膚既有種子細(xì)胞，又有真皮基質(zhì)，而種子細(xì)胞為基底層細(xì)胞，具有類多能干細(xì)胞活性，擁有多能分化功能，按正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列打印在相應(yīng)的位置中，容易形成皮膚附屬器，不僅術(shù)后愈合率加快，而且有利于恢復(fù)皮膚功能。
【專利說明】組織工程皮膚及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程皮膚【技術(shù)領(lǐng)域】，還涉及組織工程皮膚的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]創(chuàng)面是機(jī)體由于內(nèi)在或外在的因素導(dǎo)致皮膚完整性喪失，其修復(fù)一直以來是臨床中的主要問題，臨床上按時(shí)間可劃分為急性創(chuàng)面及慢性創(chuàng)面。急性創(chuàng)面包括燒傷、創(chuàng)傷等重大疾病或者瘢痕、皮膚色素性疾病、良惡性腫瘤等手術(shù)切除后形成的皮膚缺損；而慢性創(chuàng)面包括外傷性潰瘍、糖尿病性潰瘍、血管性潰瘍、壓力性潰瘍、放射性潰瘍、腫瘤性潰瘍、瘢痕性潰瘍等等。近年來，慢性創(chuàng)面的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其病程長，難愈合，植皮成活率低，植皮后皮膚功能喪失，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降。據(jù)報(bào)道，全世界約有I %的人遭受到難愈性創(chuàng)面的困擾，5%左右的醫(yī)療費(fèi)用被用于創(chuàng)面修復(fù)。據(jù)美國創(chuàng)面愈合協(xié)會(huì)資料顯示，超過60%的慢性創(chuàng)面經(jīng)半年的治療后仍無法完全愈合，每年的醫(yī)療費(fèi)極高。歐洲每年投入慢性創(chuàng)面治療的費(fèi)用則占衛(wèi)生健康財(cái)政支出的2%，同時(shí)，創(chuàng)面修復(fù)后因瘢痕增生而修復(fù)的醫(yī)療費(fèi)用也高達(dá)120億美元，而且，這些費(fèi)用每年仍在增加。
[0003]但是，無論是傳統(tǒng)的皮片移植、皮瓣移植、郵票皮移植、微粒皮移植、網(wǎng)狀皮移植、復(fù)合皮移植等，還是新興的組織工程皮膚(是指將真皮成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)替代物混合制成人工皮膚，或單純使用多孔的細(xì)胞外基質(zhì)替代真皮植入創(chuàng)面，上面移植上皮細(xì)胞覆蓋或待自身上皮覆蓋取代病損的皮膚)，目前都未能有效的解決創(chuàng)面修復(fù)的難題。上述手術(shù)方法中使用的皮片、皮瓣、郵票皮、微粒皮、網(wǎng)狀皮、復(fù)合皮等皮膚在術(shù)后都存在以下缺陷:重大疾病燒傷患者康復(fù)后瘢痕增生、汗腺缺失、皮膚失去原有的功能，慢性創(chuàng)面患者遷延不愈(輕者極大消耗醫(yī)療資源，重者并發(fā)感染、膿毒血癥等嚴(yán)重危害生命)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種組織工程皮膚，可以解決上述現(xiàn)有技術(shù)問題中的至少一個(gè)。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述組織工程皮膚的構(gòu)建方法，可以解決上述現(xiàn)有技術(shù)問題中的至少一個(gè)。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種組織工程皮膚，包括種子細(xì)胞和脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)，種子細(xì)胞與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)形成皮膚附屬器，種子細(xì)胞通過3D打印機(jī)按正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列平鋪打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)正面的相應(yīng)位置中。
[0007]種子細(xì)胞可以來源于自體皮片或通過人工培養(yǎng)得到。
[0008]脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)是指通過生物工程將同種皮表皮祛除，真皮經(jīng)脫細(xì)胞處理后，僅保留真皮的細(xì)胞外基質(zhì)形態(tài)與結(jié)構(gòu)(為一個(gè)網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu))。脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)在市場(chǎng)上有售，如:北京桀亞萊福生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)。
[0009]皮膚附屬器是指:毛發(fā)、汗腺、皮脂腺和/或指(趾)甲。
[0010]皮膚的解剖結(jié)構(gòu)也即是皮膚的構(gòu)造。從解剖學(xué)上講，皮膚由表皮層、真皮層和皮下組織組成，其中，表皮層包括基底層、有棘層、顆粒層、透明層和角質(zhì)層。
[0011]本發(fā)明的組織工程皮膚具有下述優(yōu)點(diǎn):
[0012]1、本發(fā)明提供了完善的組織工程皮膚，以供在手術(shù)室內(nèi)短時(shí)間內(nèi)快速構(gòu)建組織工程皮膚(完成手術(shù))。
[0013]2、本發(fā)明的組織工程皮膚既有種子細(xì)胞，又有真皮基質(zhì)，是一個(gè)完整的組織工程皮膚結(jié)構(gòu)。種子細(xì)胞為基底層細(xì)胞，具有類多能干細(xì)胞活性，擁有多能分化功能，構(gòu)建成的組織工程皮膚可以恢復(fù)皮膚功能。
[0014]3、種子細(xì)胞是利用3D技術(shù)打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)中，并且按正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列打印在相應(yīng)的位置中，形成皮膚附屬器，不僅術(shù)后愈合率加快，而且有利于恢復(fù)皮膚功能。
[0015]在一些實(shí)施方式中，自體皮片與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的面積之比小于1:80。由此，種子細(xì)胞與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)能更加容易形成皮膚附屬器
[0016]在一些實(shí)施方式中，種子細(xì)胞通過下述方法制備得到:先取自體皮片，將皮片置于37攝氏度左右的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的胰蛋白酶-水溶液中消化15~20分鐘，取出皮片，放入乳酸鈉林格氏液(是一種等張靜脈注射液，市場(chǎng)上有售)中，中和胰蛋白酶，撕下皮片的表皮，在皮片基底層上刮削基底層細(xì)胞，用乳酸鈉林格氏液沖洗收集刮下的基底層細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。通過這種方法得到的細(xì)胞懸液，富含基底細(xì)胞、朗格罕斯細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮干細(xì)胞 等豐富的活性細(xì)胞群落，有助于恢復(fù)皮膚功能。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，還提供了一種組織工程皮膚的制備方法，包括以下步驟:
[0018](I)先取自體皮片，將皮片置于胰蛋白酶-水溶液中消化15~20分鐘，取出皮片，放入乳酸鈉林格氏液中，中和胰蛋白酶，撕下皮片的表皮，在皮片基底層上刮削基底層細(xì)胞，用乳酸鈉林格氏液沖洗收集刮下的基底層細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；
[0019](2)把上述制備的細(xì)胞懸液裝入3D打印機(jī)的墨盒或噴頭中，通過與3D打印機(jī)連接的計(jì)算機(jī)按照正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列控制細(xì)胞懸液的沉積位置，在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)上平鋪打印。
[0020]控制細(xì)胞懸液的沉積位置，是指將種子細(xì)胞按照指定的程序/部位打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)中，通過計(jì)算機(jī)編程，按照正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列將脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)編排為若干個(gè)孔位，將種子細(xì)胞打印在相應(yīng)的孔位上，即與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)形成相應(yīng)的皮膚附屬器或?qū)崿F(xiàn)相應(yīng)的皮膚功能。控制細(xì)胞懸液的沉積位置的主要目的是為了重建正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)，比如，需要獲得用于人體小腿、為了彌補(bǔ)缺少的汗腺這個(gè)皮膚附屬器的組織工程皮膚，則需要將種子細(xì)胞打印在“汗腺”這個(gè)孔位上，以便于種子細(xì)胞與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)形成汗腺這個(gè)皮膚附屬器。
[0021 ] 打印的方式可以采用噴墨細(xì)胞打印、噴射細(xì)胞打印、激光細(xì)胞打印或聲控細(xì)胞打印的方式。打印有兩步，第一步是將種子細(xì)胞打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的支架中，第二步是將種子細(xì)胞打印(噴灑)在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的表面。打印后，用生物膠(如Biolnk，指由成百上千個(gè)活細(xì)胞所構(gòu)成的物質(zhì)，名為生物墨水的材料)將種子細(xì)胞固定在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)上。
[0022]本發(fā)明的制備方法具有快速、精準(zhǔn)、效果好等優(yōu)點(diǎn)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0023]下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0024]先取自體皮片，將皮片置于37攝氏度左右的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%左右的胰蛋白酶-水溶液中，消化15~20分鐘。
[0025]取出皮片，放入乳酸鈉林格氏液(是一種等張靜脈注射液，市場(chǎng)上有售)中，中和膜蛋白酶。
[0026]撕下皮片的表皮，在皮片基底層上刮削基底層細(xì)胞，用乳酸鈉林格氏液沖洗收集刮下的基底層細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，即種子細(xì)胞。
[0027]除此之外，還可以通過人工培養(yǎng)的方式得到種子細(xì)胞。
[0028]把上述制備的細(xì)胞懸液裝入3D打印機(jī)的墨盒或噴頭中，通過與3D打印機(jī)連接的計(jì)算機(jī)按照正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列控制細(xì)胞懸液的沉積位置，在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)上平鋪打印。
[0029]控制細(xì)胞懸液的沉積位置，是指將種子細(xì)胞按照指定的程序/部位打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)中，通過計(jì)算機(jī)編程，按照正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列將脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)編排為若干個(gè)孔位，將種子細(xì)胞打印在相應(yīng)的孔位上，即與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)形成相應(yīng)的皮膚附屬器或?qū)崿F(xiàn)相應(yīng)的皮膚功能?？刂萍?xì)胞懸液的沉積位置的主要目的是為了重建正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)，比如，需要獲得用于人體小腿、為了彌補(bǔ)缺少的汗腺這個(gè)皮膚附屬器的組織工程皮膚，則需要將種子細(xì)胞打印在“汗腺”這個(gè)孔位上，以便于種子細(xì)胞與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)形成汗腺這個(gè)皮膚附屬器。
[0030]打印時(shí)，按供受比(也即自體皮片與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的面積之比)小于1:80的比例進(jìn)行打印，也就是說，Icm2自體皮片中獲得的種子細(xì)胞，最多可以打印在SOcm2的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)上。
[0031 ] 打印的方式可以采用噴墨細(xì)胞打印、噴射細(xì)胞打印、激光細(xì)胞打印或聲控細(xì)胞打印的方式。打印有兩步，第一步是將種子細(xì)胞打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的支架中，第二步是將種子細(xì)胞打印(噴灑)在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的表面。打印后，用生物膠將種子細(xì)胞固定在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)上。生物膠是指由成百上千個(gè)活細(xì)胞所構(gòu)成的物質(zhì)，名為生物墨水的材料，如:BioInk。
[0032]通過上述的方法，即可得到一種組織工程皮膚，此時(shí)，種子細(xì)胞與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)形成皮膚附屬器。
[0033]上述的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)是指通過生物工程將同種皮表皮祛除，真皮經(jīng)脫細(xì)胞處理后，僅保留真皮的細(xì)胞外基質(zhì)形態(tài)與結(jié)構(gòu)(為一個(gè)網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu))。脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)在市場(chǎng)上有售，如:北京桀亞萊福生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)的脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)。
[0034]上述的皮膚附屬器是指:毛發(fā)、汗腺、皮脂腺和/或指(趾)甲。
[0035]上述的皮膚的解剖結(jié)構(gòu)是指皮膚的構(gòu)造。從解剖學(xué)上講，皮膚由表皮層、真皮層和皮下組織組成，其中，表皮層包括基底層、有棘層、顆粒層、透明層和角質(zhì)層。
[0036]本發(fā)明的組織工程皮膚具有下述優(yōu)點(diǎn):
[0037]1、本發(fā)明提供了完善的組織工程皮膚，以供在手術(shù)室內(nèi)短時(shí)間內(nèi)快速構(gòu)建組織工程皮膚(完成手術(shù))。[0038]2、本發(fā)明的組織工程皮膚既有種子細(xì)胞，又有真皮基質(zhì)，是一個(gè)完整的組織工程皮膚結(jié)構(gòu)。種子細(xì)胞為基底層細(xì)胞，具有類多能干細(xì)胞活性，擁有多能分化功能，構(gòu)建成的組織工程皮膚可以恢復(fù)皮膚功能。
[0039]3、種子細(xì)胞是利用3D技術(shù)打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)中，并且按正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列打印在相應(yīng)的位置中，形成皮膚附屬器，不僅術(shù)后愈合率加快，而且有利于恢復(fù)皮膚功能。
[0040]以上 所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.組織工程皮膚，其特征在于，包括種子細(xì)胞和脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)，所述的種子細(xì)胞與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)形成皮膚附屬器，所述的種子細(xì)胞通過3D打印機(jī)按正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列平鋪打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)正面的相應(yīng)位置中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程皮膚，其特征在于，所述的種子細(xì)胞來源于自體皮片或通過人工培養(yǎng)得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組織工程皮膚，其特征在于，所述自體皮片與脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的面積之比小于1:80。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的組織工程皮膚，其特征在于，所述種子細(xì)胞通過下述方法制備得到:先取自體皮片，將皮片置于胰蛋白酶-水溶液中消化15~20分鐘，取出皮片，放入乳酸鈉林格氏液中，中和胰蛋白酶，撕下皮片的表皮，在皮片基底層上刮削基底層細(xì)胞，用乳酸鈉林格氏液沖洗收集刮下的基底層細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
5.權(quán)利要求4所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)先取自體皮片，將皮片置于胰蛋白酶-水溶液中消化15~20分鐘，取出皮片，放入乳酸鈉林格氏液中，中和胰蛋白酶，撕下皮片的表皮，在皮片基底層上刮削基底層細(xì)胞，用乳酸鈉林格氏 液沖洗收集刮下的基底層細(xì)胞制成細(xì)胞懸液； (2)把上述制備的細(xì)胞懸液裝入3D打印機(jī)的墨盒或噴頭中，通過與3D打印機(jī)連接的計(jì)算機(jī)按照正常皮膚的解剖結(jié)構(gòu)排列控制細(xì)胞懸液的沉積位置，在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)上平鋪打印。
6.權(quán)利要求5所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，所述的打印包括兩步，第一步是將種子細(xì)胞打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的支架中，第二步是將種子細(xì)胞打印在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)的的表面。
7.權(quán)利要求6所述的組織工程皮膚的制備方法，其特征在于，還包括以下步驟: 打印完成后，用生物膠將種子細(xì)胞固定在脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)上。
【文檔編號(hào)】A61L27/38GK104013999SQ201410259459
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】朱家源, 唐冰, 胡志成 申請(qǐng)人:朱家源