一種mgf或其e肽修飾的組織工程支架材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料及其制備方法。以通過靜電紡絲技術(shù)制作PLLA或PCL或PLLA/PCL納米纖維支架作為基質(zhì)，利用肝素(2)和交聯(lián)分子Di-NH2-PEG將信號(hào)分子MGF或MGF-Ct24E交聯(lián)到納米纖維支架上，得到MGF或MGF-Ct24E修飾的組織工程支架材料。該發(fā)明利用MGF或MGF-Ct24E可促進(jìn)骨再生、血管再生修復(fù)功能，具有良好的生物相容性，可復(fù)合干細(xì)胞也可直接應(yīng)用于組織修復(fù)，而且工藝簡單可行，可重復(fù)性好。
【專利說明】一種MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組織工程支架材料及其制備方法，特別是一種MGF或其E肽修飾的納米纖維修復(fù)支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程學(xué)方法是目前修復(fù)組織缺損的常用方法，選擇有效的生長因子是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。力生長因子(Mechano-growth factor, MGF)是一種應(yīng)力敏感型生長因子，是生長因子-1 (Insulin-like growth factorl, IGF-1)的選擇性剪切變體,在受應(yīng)力刺激或損傷的骨骼和肌肉等組織內(nèi)均高表達(dá)。MGF可促進(jìn)多種細(xì)胞增殖和存活，參與損傷肌肉的修復(fù)和再生，并具有神經(jīng)保護(hù)作用(Aperghis M, Johnson IP, Cannon J, Yang SY, GoldspinkG.Different levels of neuroprotection by two insulin-like growth factor—Isplice variants.Brain Res.2004; 1009 (1-2): 213-8.) 0 MGF 治療心肌梗死，能夠降低永久缺血損傷面積和增加存活面積。利用力生長因子治療心臟受損的羊，可恢復(fù)心肌功能，使梗死區(qū)域得到控制(Carpenter V，Matthews K, Devlin G，Stuart Sj Jensen Jj ConaglenJ，Jeanplong F，Goldspink P，Yang SY，Goldspink G，Bass J，McMahon C.Mechano-growthfactor reduces loss of cardiac function in acute myocardial infarction.HeartLung Circ.2008; 17 (I): 33-9.)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) MGF 羧基端 E 結(jié)構(gòu)域 24 肽(MGF_Ct24E)(酪氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸-脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-賴氨酸-甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-組氨酸-賴氨酸)也具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活以及骨修復(fù)的功能，可以促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)胞外基質(zhì)，強(qiáng)化細(xì)胞外圍機(jī)制的功能，有望在應(yīng)力不足的情況下補(bǔ)償力學(xué)刺激的作用，因此MGF及MGF-Ct24E可作為組織工程一種理想生長因子。利用靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維基質(zhì)，可使用多種材料，設(shè)備簡單，成本低廉。所得納米纖維基質(zhì)結(jié)構(gòu)與組織細(xì)胞外基質(zhì)相似，能夠?yàn)榧?xì)胞(包括干細(xì)胞)的黏附和生長提供有利的微環(huán)境。結(jié)合力生長因子和靜電紡絲技術(shù)優(yōu)勢，有望提供更為理想的組織工程支架。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是構(gòu)建一種交聯(lián)MGF或MGF_Ct24E修飾的組織工程納米纖維支架，目的是在滿足一般組織工程納米纖維支架要求基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用MGF或MGF-Ct24E促進(jìn)組織修復(fù)，特別是骨、肌肉和血管等組織的修復(fù)。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的MGF或MGF_Ct24E修飾的組織工程支架材料由聚L-乳酸(Poly L-1actic acid, PLLA)或聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone, PCL)或 PLLA/PCL納米纖維支架和MGF或MGF-Ct24E構(gòu)成；其特征在于，利用靜電紡絲技術(shù)制備PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架,通過肝素和交聯(lián)分子聚乙二醇雙胺(Poly (ethylene glycol)bis (amine), D1-NH2-PEG)將生長因子MGF或其E肽交聯(lián)到納米纖維支架上，形成MGF或MGF-Ct24E修飾的組織工程支架材料，以促進(jìn)細(xì)胞粘附增殖和分化，促進(jìn)組織修復(fù)。[0005]本發(fā)明中，PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架可采用常規(guī)的靜電紡絲的方法制備，靜電紡絲過程中可根據(jù)需要調(diào)節(jié)滾筒轉(zhuǎn)速、電壓強(qiáng)度和注射速度等參數(shù)，獲得各向同性或平行的納米纖維支架，也可獲得內(nèi)層納米纖維平行排列而外層納米纖維各向同性的納米纖維支架。PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架中纖維直徑控制在0.1-1 μ m,具有三維微孔結(jié)構(gòu)和良好的聯(lián)通性。
[0006]本發(fā)明還提供所述的MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料的制備方法，具體步驟如下:
[0007]I)利用靜電紡絲技術(shù)制備PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架；
[0008]2)將步驟I)得到的PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡在70-75%的乙醇溶液中殺菌，然后使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline, PBS)沖洗3遍,每遍5min，再浸泡在0.01N NaOH中IOmin以增加表面反應(yīng)羧基基團(tuán)；
[0009]3)先用PBS沖洗PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架3遍，每遍5min，再使用蒸餾水沖洗PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架3遍，每遍5min ；[0010]4)配制20mg/mLl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride crystalline, EDC)和 lOmg/mL N-輕基硫代玻拍酸亞胺(N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt, sulfo-NHS)的溶液備用；
[0011]5)將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于步驟4)得到的溶液中30min，再用PBS沖洗3遍,每遍5min ；
[0012]6)配制含 20mg/mL EDCU0mg/mL sulfo-NHS 和 20mg/mL 聚乙二醇雙胺 D1-NH2-PEG的溶液備用；
[0013]7)將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于步驟6)得到的溶液中30min，再用PBS沖洗3遍,每遍5min ；
[0014]8)配制含 100mg/mL EDC 和 50mg/mL sulfo-NHS 的溶液備用；
[0015]9)配制25mg/mL肝素的溶液備用；
[0016]10)將步驟8)和步驟9)得到的溶液按照1:4的比例混合，充分混勻，使用IN NaOH將混合溶液的PH調(diào)整為7 ；
[0017]11)將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于步驟10)得到的溶液中3_4h，用PBS沖洗3遍,每遍5min ；
[0018]12)配制質(zhì)量濃度為1%的甘氨酸溶液備用；
[0019]13)將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于步驟12)得到的溶液中30min，用PBS沖洗3遍,每遍5min ；
[0020]14)配制濃度為 lOO-lOOOng/mL MGF 或 MGF_Ct24E 溶液備用；
[0021]15)將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于步驟14)得到的溶液中12h，用PBS沖洗3遍,每遍5min。
[0022]優(yōu)選地，步驟I)所述的PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架制備方法，是以六氟異丙醇為溶劑配制質(zhì)量濃度為8-20%的PLLA、PCL或PLLA/PCL溶液，以磁力攪拌器充分?jǐn)嚢韬髠溆?。?-4mL上述溶液于醫(yī)用注射器中，靜電紡絲滾筒接收器上包裹一層錫紙，調(diào)節(jié)滾筒轉(zhuǎn)速為20-800r/min、電壓強(qiáng)度為5_15kV，以0.5_2mL/h的注射速度將PLLA、PCL或PLLA/PCL溶液電紡到滾筒接收器的錫紙上，獲得PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維薄膜，將薄膜從錫紙上取下靜置24h得到PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架備用。
[0023]優(yōu)選地，步驟I)所述的PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架制備成纖維直徑為0.3-0.5 μ m，孔隙率為 80%-95%。
[0024]優(yōu)選地，步驟4)、6)、8)和9)所述的溶液以pH為5.5、濃度為0.5mol/L的2_(N_嗎啉代)乙磺酸溶液作為溶劑。
[0025]優(yōu)選地，步驟12)所述的甘氨酸溶液以PBS作為溶劑。
[0026]優(yōu)選地，步驟14)所述的MGF或MGF_Ct24E溶液以PBS作為溶劑。
[0027]優(yōu)選地，步驟15)所述的浸泡過程在4°C條件下進(jìn)行。
[0028]綜上所述，本發(fā)明的MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料是在靜電紡絲技術(shù)制備PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架上利用肝素和D1-NH2-PEG交聯(lián)MGF或MGF_Ct24E獲得的。與現(xiàn)有的組織工程支架材料相比，交聯(lián)了 MGF或MGF-Ct24E的納米纖維支架可促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖和分化，促進(jìn)骨、肌肉、血管等組織的修復(fù)，這也是本發(fā)明提出的關(guān)鍵。本發(fā)明提供的MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料具有良好的生物相容性，以MGF或其E肽作為生長因子，利用它在細(xì)胞粘附、增殖和分化上的促進(jìn)作用，加速組織修復(fù)速度和質(zhì)量。同時(shí)，將MGF或其E肽固定于材料表面，有利于保持蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性。本發(fā)明提供的MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料可不預(yù)種種子細(xì)胞，直接用于組織缺損部位；也可以先復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等種子細(xì)胞，再植入組織缺損部位。用于制備MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料的納米纖維支架可選擇不同材料，只要滿足所要修復(fù)的要求即可。為簡潔起見，本發(fā)明主要以PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架為例加以闡述，其他材料也可以米用相同的原理。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是本發(fā)明提供的MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料的MGF交聯(lián)示意圖；
[0030]圖2是本發(fā)明提供的MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料的MGF_Ct24E交聯(lián)示意圖；
[0031]圖3是本發(fā)明提供的修飾的組織工程支架材料的掃描電子顯微鏡圖；
[0032]其中:1、MGF;2、肝素；3、D1-NH2-PEG ;4、納米纖維；5、MGF_Ct24E。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0034]圖1和圖2分別為本發(fā)明提供的MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料的MGF和MGF-Ct24E交聯(lián)示意圖。采用常規(guī)的靜電紡絲的方法制備PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架，通過肝素2和交聯(lián)分子D1-NH2-PEG將生長因子MGF或MGF_Ct24E交聯(lián)到PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架里納米纖維4上。
[0035]以六氟異丙醇為溶劑配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8-20%的PLLA、PCL或PLLA/PCL溶液，置于磁力攪拌器中攪拌均勻。使用IOmL規(guī)格醫(yī)用注射器吸取3-4mL PLLA、PCL或PLLA/PCL溶液，然后將該注射器安裝于注射泵中。根據(jù)滾筒接收器的大小裁減一塊矩形錫紙，固定于滾筒收集器表面上，開啟滾筒使其轉(zhuǎn)動(dòng)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為20-800r/min。開啟高壓電源，調(diào)節(jié)電壓強(qiáng)度為5-15kV。設(shè)置PLLA、PCL或PLLA/PCL溶液的注射速度為0.5_2mL/h，使得溶液在靜電場中噴出細(xì)絲，沉積在滾動(dòng)的滾筒收集器上，輕輕地將沉積在錫紙上的納米纖維薄膜取下，靜置24h，得到PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架。圖3為本發(fā)明提供的MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料的掃描電子顯微鏡圖。靜電紡絲過程中可根據(jù)需要調(diào)節(jié)滾筒轉(zhuǎn)速、電壓強(qiáng)度和注射速度等參數(shù)，使納米纖維支架中納米纖維4為各向同性或平行，或者內(nèi)層納米纖維4平行排列而外層納米纖維4各向同性。
[0036]將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架裁減為0.5_5cmX0.5_5cm矩形薄膜，先浸泡在70-75%的乙醇溶液中以殺滅細(xì)菌，再使用PBS沖洗3遍，每遍5min，然后將上述支架浸泡在0.01N NaOH中IOmin以增加表面反應(yīng)羧基基團(tuán)。使用PBS沖洗3遍，每遍5min，隨后使用蒸餾水沖洗3遍，每遍5min。以pH為5.5、濃度為0.5mol/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸溶液作為溶劑配置20mg/mL EDC和10mg/mL sulfo-NHS的溶液，將上述PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于此溶液中30min，再使用PBS沖洗3遍，每遍5min。以pH為5.5、濃度為0.5mol/L的2-0-嗎啉代)乙磺酸溶液作為溶劑配制20mg/mL EDCUOmg/mL sulfo-NHS和20mg/mL D1-NH2-PEG的溶液，將納米纖維浸泡于上述溶液中30min，使用PBS沖洗3遍，每遍5min。以pH為5.5、濃度為0.5mol/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸溶液作為溶劑分別配制含100mg/mL EDC和50mg/mL sulfo-NHS的溶液以及含25mg/mL肝素2的溶液。將上述兩種溶液按照1:4的比例混合，于搖床上搖晃30min充分混勻，用IN NaOH將上述混合溶液的pH調(diào)整為7。將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于上述混合溶液中3_4h，使用PBS沖洗3遍，每遍5min。配制質(zhì)量濃度為1%的甘氨酸溶液，將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維浸泡于上述溶液中30min,使用PBS沖洗3遍,每遍5min。配制濃度為500ng/mL MGF或MGF-Ct24E溶液，將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維浸泡于此溶液中12h，使用PBS沖洗3遍，每遍5min，得到MGF或MGF_Ct24E修飾的PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架。
[0037]本發(fā)明提供的MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料是利用肝素和D1-NH2-PEG將MGF或其E肽交聯(lián)到靜電紡絲技術(shù)制備的PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架上獲得的。利用MGF或其E肽對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和分化的多種促進(jìn)功能，加速組織修復(fù)速度和質(zhì)量。制備方法簡單且成本低，相比以`往的組織工程支架材料有明顯的優(yōu)勢。
【權(quán)利要求】
1.一種MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料，由聚L-乳酸(Poly L-1acticacid, PLLA)或聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone, PCL)或PLLA/PCL納米纖維支架和力生長因子(Mechno-growth factor, MGF)或其 E 肽(MGF_Ct24E)構(gòu)成，其特征在于:所述 PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架由靜電紡絲技術(shù)制備，通過肝素和交聯(lián)分子聚乙二醇雙胺(Poly (ethylene glycol) bis (amine), D1-NH2-PEG)將生長因子 MGF 或 MGF_Ct24E 交聯(lián)到納米纖維支架上。
2.如權(quán)利要求1所述的一種MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料，其特征在于:所述PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架中納米纖維(4)為各向同性或平行，或者內(nèi)層納米纖維(4)平行排列而外層納米纖維(4)各向同性。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的MGF或其E肽修飾的組織工程支架材料的制備方法，包括下述步驟: I)利用靜電紡絲技術(shù)制備PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架；2)將步驟I)得到的PLLA, PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡在70-75%的乙醇溶液中殺菌，然后使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline, PBS)沖洗 3 遍,每遍 5min,再浸泡于 0.01N NaOH 中IOmin以增加表面反應(yīng)羧基基團(tuán)； 3)用PBS沖洗PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架3遍，每遍5min，再用蒸餾水沖洗PLLA> PCL或PLLA/PCL納米纖維支架3遍,每遍5min ； 4)配制20mg/mLl-(3_二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(N-(3-Dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride crystalline, EDC)和 lOmg/mL N-羥基硫代玻拍酸亞胺(N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt, sulfo-NHS)的溶液備用； 5)將PLLA、PCL或P`LLA/PCL納米纖維支架浸泡于步驟4)得到的溶液中30min，再用PBS沖洗3遍,每遍5min ； 6)配制含20mg/mL EDCU0mg/mL sulfo-NHS 和 20mg/mLD1-NH2-PEG 的溶液備用； 7)將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于步驟6)得到的溶液中30min，再用PBS沖洗3遍,每遍5min ； 8)配制含100mg/mL EDC 和 50mg/mL sulfo-NHS 的溶液備用； 9)配制25mg/mL肝素⑵的溶液備用； 10)將步驟8)和步驟9)得到的溶液按照1:4的比例混合，充分混勻，使用INNaOH將混合溶液的PH調(diào)整為7 ； II)將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于步驟10)得到的溶液中3_4h，用PBS沖洗3遍,每遍5min ； 12)配制質(zhì)量濃度為1%的甘氨酸溶液備用； 13)將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于步驟12)得到的溶液中30min，用PBS沖洗3遍,每遍5min ； 14)配制濃度為lOO-lOOOng/mLMGF或MGF_Ct24E溶液備用； 15)將PLLA、PCL或PLLA/PCL納米纖維支架浸泡于步驟14)得到的溶液中12h，用PBS沖洗3遍,每遍5min。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:步驟15)所述的浸泡過程在4°C條件下進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】A61L27/22GK103520769SQ201310397044
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】呂永鋼, 林崇文, 鄒楊 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)