專利名稱：一種心肌細(xì)胞的中藥保存液及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種心肌細(xì)胞保存液及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心肌梗死后，心肌細(xì)胞永久性丟失。且成熟心肌不可再生，不可能通過分裂增殖來彌補(bǔ)病理性細(xì)胞數(shù)量減少。雖然近來有研究證實(shí)在心肌梗死后梗死區(qū)邊緣有少量心肌細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，但這種分裂十分微弱，根本不足以代償有臨床意義的壞死心肌?，F(xiàn)有治療手段也無法促使心肌再生。近年來有研究使用細(xì)胞移植至受損心臟替代壞死心肌，修復(fù)心肌結(jié)構(gòu)和功能，該技術(shù)稱之為“心肌再生”或“細(xì)胞心肌成形術(shù)” (cellular cardiomyoplasty,CCM)。心肌重塑是梗死后心功能持續(xù)惡化的核心機(jī)制，很多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植能阻止心肌重塑。Mangi等移植攜帶Akt基因的大鼠MSCs，發(fā)現(xiàn)心肌重塑被抑制、心功能改善，移植細(xì)胞占據(jù)80% 90%的瘢痕，有完全正常的收縮和舒張功能。他們認(rèn)為心功能改善機(jī)制是CCM可以抑制心肌內(nèi)炎癥和病理性肥厚、減少膠原沉積。Kudo等。。發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞移植的獲益機(jī)制主要是減少心肌梗死面積和抑制纖維化。Chachques等.結(jié)扎羊兩支冠脈，將骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(skeletal myoblasts, SMs)和VEGF注射至梗死中心和周邊，3個(gè)月后細(xì)胞移植抑制了左室擴(kuò)大。Olivares等發(fā)現(xiàn)MSCs移植后梗死心臟的心室?guī)缀涡螤畹靡院芎玫谋３?。川彎?Ligustrazine)來源于傘形科植物川彎的干燥根莖,為批嗪類生物堿。川芎辛香行散，溫通血脈，上行頭顛，下走血海，功能活血行氣，祛風(fēng)止痛，被前人譽(yù)為血中之氣藥?，F(xiàn)代研究表明川芎嗪有解 痙、降低血管阻力和強(qiáng)烈抑制血小板聚集的作用，對(duì)已聚集的血小板有解聚作用，能明顯降低全血粘度；還能增加冠脈流量、有改善心肌供氧、降低心肌耗氧的作用，治療缺血性腦血管及冠心病效果良好，還可以治療偏頭痛和重癥肺心病。川芎嗪的分子量為136.20，分子式=C8H12N2,金氏等發(fā)現(xiàn)東J11芎能使SOD活性和MDA含量明顯恢復(fù)，證實(shí)了東)11芎能夠穩(wěn)定細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)，抵抗細(xì)胞膜和膜性結(jié)構(gòu)受自由基攻擊，最終達(dá)到清除自由基的目的，對(duì)缺氧缺糖心肌起保護(hù)作用。梁氏等在實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)川芎嗪預(yù)處理對(duì)整體動(dòng)物缺血再灌注損傷的保護(hù)作用后，用體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞觀察了川芎嗪預(yù)處理對(duì)低氧/再給氧損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明川芎嗪預(yù)處理對(duì)體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞低氧/再給氧所致?lián)p傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與提高心肌細(xì)胞抗氧化酶活性，清除氧自由基有關(guān)。目前大多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和醫(yī)學(xué)研究均取得積極結(jié)果，很多實(shí)驗(yàn)就細(xì)胞移植途徑作出有意義的探索，但符合應(yīng)用要求、安全高效的給入途徑研究甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種心肌細(xì)胞保存液及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的心肌細(xì)胞保存液，含有川芎嗪、N2添加劑、B27添加劑。所述川芎嗪濃度為10_6mOl/L-10_8mOl/L ;所述N2添加劑百分濃度為1% (質(zhì)量百分含量)；所述B27添加劑百分濃度為I % (質(zhì)量百分含量)。本發(fā)明提供的心肌細(xì)胞保存液，是優(yōu)選為是將10_6mOl/L-10_8mOl/L川芎嗪、I %的N2添加劑(質(zhì)量百分含量)、1%的B27添加劑(質(zhì)量百分含量)，添加入9%生理鹽水。所述川芎嗪可以以液體的形式加入，也可以以干粉的形式加入。本發(fā)明提供的心肌細(xì)胞保存液用于保存心肌細(xì)胞，在12小時(shí)以內(nèi)細(xì)胞存活率為85%以上，甚至達(dá)到95%以上。所述心肌細(xì)胞保存液可用于保存心肌細(xì)胞，特別是離體的心肌細(xì)胞，優(yōu)選為離體的人心肌細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)一種保存心肌細(xì)胞的方法，是將心肌細(xì)胞懸浮于所述心肌細(xì)胞保存液，4-8°C保存12小時(shí)以下(如4-6°C保存12小時(shí)或6_8°C保存12小時(shí))；所述心肌細(xì)胞和所述心肌細(xì)胞保存液的配比為6 X 105-7 X IO5個(gè)心肌細(xì)胞活細(xì)胞:lmL心肌細(xì)胞保存液(如6 X 105-6.8 X IO5個(gè)心肌細(xì)胞活細(xì)胞:ImL心肌細(xì)胞保存液，或6.8 X 105-7 X IO5個(gè)心肌細(xì)胞活細(xì)胞=ImL心肌細(xì)胞保存液)。所述心肌細(xì)胞可為離體的心肌細(xì)胞，優(yōu)選為離體的人心肌細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)一種治療心腦血管疾病的藥物，是將心肌細(xì)胞懸浮于所述心肌細(xì)胞保存液得到的細(xì)胞懸液；所述心肌細(xì)胞和所述心肌細(xì)胞保存液的配比為6X 105-7X 105個(gè)心肌細(xì)胞活細(xì)胞=ImL心肌細(xì)胞保存液(如6X 105-6.8X IO5個(gè)心肌細(xì)胞活細(xì)胞:lmL心肌細(xì)胞保存液，或6.8 X 105-7 X IO5個(gè)心肌細(xì)胞活細(xì)胞:ImL心肌細(xì)胞保存液)。所述心肌細(xì)胞可為離體的心肌細(xì)胞，優(yōu)選為離體的人心肌細(xì)胞。本發(fā)明提供的心肌細(xì)胞保存液具有穩(wěn)定性高、療效好、安全性高、無毒副作用、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，適應(yīng)臨床大 規(guī)模使用，應(yīng)用前景廣闊的特點(diǎn)。本發(fā)明提供的藥物可分化成有功能的心肌細(xì)胞，具有再生修復(fù)實(shí)質(zhì)器官和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的雙向作用，可以提高心肌功能、改善心臟的微環(huán)境。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、心肌細(xì)胞保存液的制備所述川芎嗪購自上海源葉生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為YY90188 ;N2添加劑購自于invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為17502048 ；B27添加劑購自于invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為 17504-044。所述川芎嗪在所述分化培養(yǎng)基中的濃度為10_6mOl/L-10_8mOl/L ;所述N2添加劑在所述分化培養(yǎng)基中的百分濃度為0.3-1% (質(zhì)量百分含量)；所述B27添加劑在所述分化培養(yǎng)基中的百分濃度為0.3-1% (質(zhì)量百分含量)。心肌細(xì)胞保存液I的制備方法:將10_6mol/L川芎嗪，0.3% N2添加劑，0.3% B27添加劑融入9 %生理鹽水。
心肌細(xì)胞保存液II的制備方法:將107moI/L川芎嗪，0.6% N2添加劑，0.6% B27添加劑融入9 %生理鹽水。心肌細(xì)胞保存液III的制備方法:將10_8mol/L川芎嗪，1% N2添加劑，1% B27添加劑融入9%生理鹽水。實(shí)施例2、人心肌細(xì)胞的細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)D-hank’ S平衡鹽液緩沖液:溶劑為水，含有如下溶質(zhì):0.8 %的NaCl、0.04 %的KCl、0.006% 的 Na2HPO1.H2O 和 0.006% 的 KH2PO1 ； %均為質(zhì)量百分含量。1、將I瓶人心肌細(xì)胞用IOml D_hank’ S平衡鹽液緩沖液清洗兩次。2、收集細(xì)胞，用胰酶37°C條件下消化6分鐘(5_7分鐘均可);消化過程中在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，用手掌輕輕拍打培養(yǎng)瓶確保人心肌細(xì)胞完全消化。3、終止消化，然后每瓶中加入IOml D_hank’S平衡鹽液緩沖液，反復(fù)吹打使細(xì)胞懸浮，得到細(xì)胞懸液。4、將細(xì)胞懸液進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，方法如下:將細(xì)胞懸液和0.4%臺(tái)盼蘭溶液等體積混合，輕輕混勻；1分鐘后，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞；活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。5、將細(xì)胞懸液移入離心管中，以2000rpm的離心速度離心lOmin，離心結(jié)束，棄上
清，獲得人心肌細(xì)胞。實(shí)施例3、實(shí)施例1制備 的心肌細(xì)胞保存液的應(yīng)用將實(shí)施例2中的人心肌細(xì)胞分別重懸于實(shí)施例1制備的四種心肌細(xì)胞保存液，配比均為6.8 X IO5個(gè)人心肌細(xì)胞活細(xì)胞:1ml心肌細(xì)胞保存液，4°C保存12小時(shí)后取樣(細(xì)胞懸液)測(cè)定細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率測(cè)定方法:將0.5ml細(xì)胞懸液與0.5ml 0.2%臺(tái)盼蘭溶液混合，得到混合液；吸取10微升混合液，滴加在蓋片邊緣，使混合液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間；靜置I分鐘；隨機(jī)選取幾個(gè)視野，共計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞(計(jì)數(shù)著色細(xì)胞數(shù)目，即死細(xì)胞數(shù)目)，細(xì)胞存活率=(300-死細(xì)胞數(shù)目)/300 X 100% ;重復(fù)計(jì)數(shù)5次，結(jié)果取5次計(jì)數(shù)的平均值。共進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值，見表I。表I實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種心肌細(xì)胞保存液，所述川芎嗪濃度為10_6mOl/L-10_8mOl/L ;所述N2添加劑百分濃度為1% (質(zhì)量百分含量)；所述B27添加劑百分濃度為1% (質(zhì)量百分含量)。
2.按權(quán)利要求1所述的心肌細(xì)胞保存液，其特征在于:所述川芎嗪濃度為IO-6Hiol/L-108mol/L，所述N2添加劑百分濃度為1% (質(zhì)量百分含量)，所述B27添加劑百分濃度為1% (質(zhì)量百分含量)，是用9%生理鹽水溶液配制成的。
3.權(quán)利要求1或2所述的心肌細(xì)胞保存液在保存心肌細(xì)胞中的應(yīng)用。
4.按權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述心肌細(xì)胞為離體的心肌細(xì)胞。
5.按權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述心肌細(xì)胞為人心肌細(xì)胞。
6.一種保存心肌細(xì)胞的方法，是將心肌細(xì)胞懸浮于權(quán)利要求1或2所述的心肌細(xì)胞保存液，4-8°C保存12小時(shí)以下；所述心肌細(xì)胞和所述心肌細(xì)胞保存液的配比為6X 105-7X IO5個(gè)心肌細(xì)胞活細(xì)胞:lmL心肌細(xì)胞保存液。
7.按權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述心肌細(xì)胞為離體的心肌細(xì)胞。
8.按權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述心肌細(xì)胞為人心肌細(xì)胞。
9.一種治療糖尿病的藥物，是將心肌細(xì)胞懸浮于權(quán)利要求1或2所述心肌細(xì)胞保存液得到的細(xì)胞懸液；所述心肌細(xì)胞和所述心肌細(xì)胞保存液的配比為6X105-7X IO5個(gè)心肌細(xì)胞活細(xì)胞=ImL心肌細(xì)胞保存液。
10.按權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于:所述心肌細(xì)胞為離體的心肌細(xì)胞，優(yōu)選為離體的人心 肌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種心肌細(xì)胞保存液及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的心肌細(xì)胞保存液，10-6mol/L-10-8mol/L的川芎嗪濃度、1％(質(zhì)量百分含量)的N2添加劑和1％(質(zhì)量百分含量)所述B27添加劑是用9％生理鹽水溶液配制成的。本發(fā)明提供的心肌細(xì)胞保存液用于保存心肌細(xì)胞，在12小時(shí)以內(nèi)細(xì)胞存活率為89％以上，甚至達(dá)到97％以上。本發(fā)明公開的心肌細(xì)胞保存液具有穩(wěn)定性高、療效好、安全性高、無毒副作用、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，適應(yīng)臨床大規(guī)模使用，應(yīng)用前景廣闊的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K35/24GK103081893SQ20111034594
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者田杰 申請(qǐng)人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細(xì)胞科技有限公司