專利名稱：孵化液酶及其用途的制作方法
孵化液酶及其用途本發(fā)明涉及得自魚孵化液的卵殼溶解素(choriolysin)和強(qiáng)酸性蛋白質(zhì)(VAP)單獨(dú)或組合地在針對(duì)皮膚的各種美容和醫(yī)療應(yīng)用中的用途。本發(fā)明還涉及針對(duì)這些用途加以描述的強(qiáng)酸性蛋白質(zhì)。皮膚是人體更脆弱的器官中的一種。盡管很少危及生命，但是皮膚疾病或狀況能夠讓人不舒服并可能造成慢性失能。另外，由于皮膚是清晰可見的，所以皮膚疾病和狀況能夠?qū)е庐a(chǎn)生心理壓力。因此，一直存在有效治療皮膚狀況和疾病的需求。皮膚形成人體的最大器官，占個(gè)人重量的約12 16%。作為外部世界和我們身體內(nèi)受控環(huán)境之間的屏障和調(diào)節(jié)勢(shì)力兩者執(zhí)行許多至關(guān)重要的作用。皮膚由3層即表皮、真皮和皮下層構(gòu)成。表皮是皮膚的最外部的上皮層。其充當(dāng)物理屏障，防止從身體失水，并防止物質(zhì)和有機(jī)體進(jìn)入身體內(nèi)。其厚度隨身體位置而變化。 表皮由復(fù)層鱗狀上皮構(gòu)成，即其由平坦的細(xì)胞層構(gòu)成。皮膚、頭發(fā)和指甲是角質(zhì)化的，意思是其具有由稱作角蛋白的蛋白質(zhì)構(gòu)成的死亡的、硬化的疏水表面。表皮因?yàn)槠渑c角化細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞外脂類內(nèi)容物而不具有滲透性，尤其是在表皮的中層(透明層)中。粘膜(例如食道、口咽腔、生殖器等的粘膜)主要是非角質(zhì)化的且是潮濕的。表皮具有三種類型的細(xì)胞，即角化細(xì)胞(皮膚細(xì)胞)、黑素細(xì)胞(產(chǎn)生色素的細(xì)胞)和朗氏細(xì)胞(免疫細(xì)胞)。梅克爾細(xì)胞是第四種，不占優(yōu)勢(shì)的表皮細(xì)胞。角化細(xì)胞隨著向外移動(dòng)而成熟并隨角蛋白的累積而分化。其最終脫落或擦落。它們形成四個(gè)或五個(gè)明顯不同的層，從最淺表到最深處為(i)具有無(wú)細(xì)胞核的死的、干透的硬細(xì)胞的角質(zhì)層；(ii)具有含有嗜堿性顆粒的細(xì)胞并通過(guò)薄的透明層而與角質(zhì)層向外隔開的顆粒層；(iii)刺狀層(多刺、刺狀或棘細(xì)胞層)，其中細(xì)胞隨著向上移動(dòng)變得越來(lái)越扁平j(luò)P(iv)具有柱狀(長(zhǎng))再生細(xì)胞的基底層。緊挨在表皮下面的是基膜，其為位于表皮和真皮之間的特殊結(jié)構(gòu)。真皮是皮膚的纖維連接組織或支持層。主要纖維是交織的膠原纖維和彈性蛋白。下皮層是緊接在真皮和表皮下面的脂肪層。也將其稱作皮下組織、真皮或膜。所述下皮層主要由脂肪細(xì)胞、神經(jīng)和血管構(gòu)成。在皮膚的下層顆粒層中產(chǎn)生新的上皮皮膚細(xì)胞。細(xì)胞隨時(shí)間遷移到皮膚表面并變?yōu)楦嵝浴Ｔ谄?0天的遷移期間，其死亡并變得角蛋白飽和。角蛋白和相關(guān)的脂類是重要的，因?yàn)槠浔Ｗo(hù)皮膚防御外部因素。生病、受傷、環(huán)境因素、年齡、激素水平、藥物治療、外敷或攝入材料、遺傳狀況或各種其他因素可導(dǎo)致皮膚的功能異常，導(dǎo)致不規(guī)律或異常。這些不規(guī)律或異常中的一部分可以單純是美容性質(zhì)的，如皮膚干燥、皺紋或色素沉著改變，或可以更嚴(yán)重地導(dǎo)致疼痛或不適，如濕疹和牛皮癬。皮膚干燥是一種最普通的皮膚狀況或異常。盡管某些個(gè)體更易于受到皮膚干燥的影響，但是所述狀況能夠影響任何人，而與年齡、性別或皮膚類型無(wú)關(guān)。當(dāng)皮膚外層(具有透明層的角質(zhì)層)的水耗盡時(shí)，發(fā)生皮膚干燥。當(dāng)這層被良好保濕時(shí)，其通過(guò)皮膚的失水最小并有助于抵御刺激物、過(guò)敏原和細(xì)菌。然而，當(dāng)角質(zhì)層干透時(shí)，其保護(hù)功能下降。這使得失水更多，導(dǎo)致皮膚易于受到環(huán)境因素的影響。在正常條件下，角質(zhì)層具有109^30%的水含量。這種水使得皮膚柔軟、平滑并具有柔性質(zhì)地。所述水來(lái)自大氣、皮膚的下層和汗。由皮膚腺產(chǎn)生的油和由皮膚細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪物質(zhì)充當(dāng)天然的保濕劑，使得角質(zhì)層封在水中。身體通過(guò)蒸發(fā)從皮膚表面連續(xù)損失水。在正常條件下，損失速率緩慢，且水可充分更替。當(dāng)失水超過(guò)水的更替且角質(zhì)層的水含量低于10% 時(shí)，發(fā)生皮膚干燥的特征性跡象和癥狀。非常期望改善或消除皮膚干燥的保濕劑。盡管在本領(lǐng)域內(nèi)已知許多保濕劑，但是仍需要有效且溫和的天然產(chǎn)品。另一種普遍的皮膚異常或狀況是皮膚的角質(zhì)層過(guò)量。這可能是由角質(zhì)層蛻皮失敗或由過(guò)量的角蛋白沉積在角質(zhì)層中造成的。當(dāng)皮膚磨蝕的天然過(guò)程變得不順利時(shí)會(huì)造成前一種狀況，使得皮膚具有干燥且粗糙的特性。良性過(guò)度增生型疾病包括表皮松懈性角化過(guò)度癥(或皮膚皸裂)和毛囊角化癥。一種普遍的良性過(guò)度增生型狀況是在傷疤周圍的外圍過(guò)度增生和/或形成瘢痕疙瘩。其他過(guò)度增生型狀況是雞眼、老繭、過(guò)度角化的疣(尤其是尋常撫(veruca vulgaris))、魚鱗癖和掌妬角化。當(dāng)前的治療涉及剝落或在極端情況下的外科手術(shù)。通常通過(guò)軟化角質(zhì)層并將增厚的皮膚除去來(lái)治療角化過(guò)度癥。還可使用剝落來(lái)除去損傷的表皮細(xì)胞，例如從出現(xiàn)色素沉著紊亂如肝斑的表皮上除去表皮細(xì)胞。剝落除去表皮的外層以顯示下面更新的皮膚細(xì)胞。可以通過(guò)物理手段(例如磨皮)或通過(guò)化學(xué)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)剝落。化學(xué)剝落劑包括含有水楊酸、乙醇酸、水果酶、檸檬酸或蘋果酸的磨砂劑且可由皮膚病醫(yī)生以高濃度使用、或在非處方產(chǎn)品中以較低濃度應(yīng)用?；瘜W(xué)剝落可涉及使用含有a-羥基酸(AHA)或￠-羥基酸(BHA)的產(chǎn)品、或使得在細(xì)胞連接處將細(xì)胞保持在一起的膠狀物質(zhì)松散的酶，使其易于除去。人們治療痤瘡?fù)扑]使用這種剝落。剝落的最大劣勢(shì)是用于實(shí)現(xiàn)所述剝落的一些產(chǎn)品和方法的價(jià)格高。剝落將導(dǎo)致皮膚開始時(shí)有些變紅。在接近化學(xué)剝落結(jié)束時(shí)，皮膚將受凍，在皮膚表面上顏色從亮白色變?yōu)榛疑Ｒ虼似谕麑?duì)皮膚更溫和的更有效的方法。由此仍需要適用于皮膚保濕和/或用于剝落皮膚角質(zhì)層的治療?，F(xiàn)在已經(jīng)意外發(fā)現(xiàn)，在魚孵化液中發(fā)現(xiàn)的某些分子是非常有效的保濕劑和剝落齊U，即卵殼溶解素和新鑒定類別的強(qiáng)酸性蛋白質(zhì)(VAP)。魚胚的孵化至少部分由所謂的孵化酶卵殼溶解素實(shí)現(xiàn)。卵殼溶解素是在魚孵化液中發(fā)現(xiàn)的一種金屬蛋白酶并發(fā)現(xiàn)通常有兩種形式，即高卵殼裂解酶(卵殼溶解素H，HCE)和低卵殼裂解酶(卵殼溶解素L，LCE)，它們?cè)谀承┙Y(jié)構(gòu)和催化特性方面類似且屬于蝦紅素族，但具有明顯不同的底物偏好。在鮭魚中，LCE與其他魚種的已知卵殼溶解素相比相對(duì)不平常且可出于在下文描述的目的而加以應(yīng)用。在下面的SEQ ID No. I中提出了鮭魚LCE的序列。如上所述，通過(guò)在80%丙酮中從其他組分中沉淀并通過(guò)對(duì)離心的沉淀團(tuán)進(jìn)行蒸發(fā)以除去丙酮，現(xiàn)在已經(jīng)在魚孵化液中鑒定了一類強(qiáng)酸性蛋白質(zhì)(VAP)，如實(shí)施例中所述。在孵化期間通過(guò)孵化酶使得聚合和交聯(lián)的卵殼發(fā)生蛋白水解性裂解，可產(chǎn)生這些VAP，且所述VAP是在卵子發(fā)生期間并入絨毛膜中的組分的片段如卵殼前體蛋白(choriogenin) H和L,下面進(jìn)行更詳細(xì)地說(shuō)明。本文中稱作VAP的卵殼前體蛋白質(zhì)的這些片段在孵化期間釋放入卵周液中，變?yōu)榉趸旱慕M分。VAP可以呈現(xiàn)多種形式。當(dāng)通過(guò)等電位聚焦進(jìn)行分析時(shí)(參見實(shí)施例)，VAP I、II和III (如下所述)分別出現(xiàn)在至少2、6和3異構(gòu)體中。我們?cè)诖斯_了已經(jīng)鑒定的并具有下面描述的奇特性質(zhì)的三種VAP。通過(guò)如實(shí)施例中所述的質(zhì)譜分析確定了這些VAP的序列并示于SEQ ID Nos. 2 4中。本文中提及的VAP I、II和III分別具有在SEQ ID Nos. 2、3和4中列出的序列。VAP I是117個(gè)氨基酸大小并具有約15. 5kDa的分子量和約3. 5的pi。這種VAP是439個(gè)氨基酸的57kDa卵殼蛋白質(zhì)(也稱作放射帶蛋白質(zhì)，SEQ ID No. 5)的片段?；蛘?，VAP I可得自包括467氨基酸殘基(SEQ ID No. 8)的同源放射帶蛋白質(zhì)。VAP II是261個(gè)氨基酸大小并具有約35kDa的分子量和約4.0的pi。這種VAP 是524個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)、即68kDa卵殼前體蛋白的片段(SEQ ID No. 6)。VAP III是224個(gè)氨基酸大小并具有約29kDa的分子量和約5. 2的pi。這種VAP是438個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)、即57kDa卵殼前體蛋白L的片段(SEQ ID No. 7)。如實(shí)施例和上述中所示，各種VAP可存在各種異構(gòu)體中。由此，在本發(fā)明的第一方面中提供一種多肽，其由以下所構(gòu)成(i)在SEQ ID No. 2^4中任一個(gè)所展示的氨基酸序列或與所述序列至少50%同一的序列、或任何所述序列的一部分；以及任選(ii)在(i)的氨基酸序列的N和/或C端的側(cè)翼氨基酸序列，其長(zhǎng)度為1 100氨基酸。本文中所指的“多肽”是具有優(yōu)選50、100、150、200或250個(gè)以上殘基和/或400、300,200或100個(gè)以下殘基或選自其中的范圍的分子。本文中所指的“部分”優(yōu)選包含其所來(lái)源的序列的至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多個(gè)氨基酸。所述部分可得
自所述序列的中心或N-端或C-端部分。在優(yōu)選方面中，所述部分由其所來(lái)源的全長(zhǎng)度序列中除去、優(yōu)選從N-端除去至少1、2、3、4或5個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。本文中所指的“側(cè)翼序列”是通過(guò)一般的肽鍵連接在中心氨基酸序列的末端N或C端處以形成連續(xù)氨基酸序列的氨基酸序列(按下文中所述進(jìn)行功能等同的修飾除外)。側(cè)翼序列可存在于中心氨基酸序列的N或C末端或存在于兩端上。所述側(cè)翼序列可短至I個(gè)氨基酸或長(zhǎng)至100個(gè)氨基酸，優(yōu)選廣50(或5 100或10飛0)，如1 25，例如I飛個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。當(dāng)側(cè)翼序列存在于N和C兩個(gè)末端時(shí)，其可以是相同或不同的序列且可以具有相同或不同的長(zhǎng)度。所述側(cè)翼序列可得自所研究的VAP是片段的天然序列或在可比部分中與所述天然序列的同一性小于80、70、60或50% (參見例如分別在SEQ ID No. 5 7中提供的相對(duì)于SEQ ID No. 2 4的天然序列，和SEQ ID No. 8，其提供了關(guān)于SEQ ID No. 2的別種天然序列)。優(yōu)選地，在上述部分(i)中的所述序列與所比較的序列(SEQ ID No. 2 8)至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99% 同一。通過(guò)使用SWISS-PR0T蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù),利用例如具有可變pamfactor以及設(shè)定為12.0的間隙產(chǎn)生懲罰和設(shè)定為4.0的間隙延伸懲罰和2個(gè)氨基酸的窗口的FASTApep-cmp，可確定序列的同一性。優(yōu)選地，在所述序列的全長(zhǎng)上進(jìn)行所述比較，但可在更小的比較窗口、如小于200、100或50個(gè)連續(xù)氨基酸上進(jìn)行所述比較。優(yōu)選地，這種序列同一性相關(guān)多肽與所述SEQ ID Nos.中所展示的多肽的功能等同。這種功能等同的多肽可采用如下所述的衍生物形式。類似地，可在不影響如下所述的多肽的序列的條件下對(duì)具有SEQ ID Nos.中列出的序列的多肽進(jìn)行修飾。此外，如本文中所述的“部分” 可以是功能等同的。優(yōu)選地，這些部分滿足本文中所述的同一性(相對(duì)于可比區(qū)域)條件。包括部分的本發(fā)明的優(yōu)選多肽和包括上述側(cè)翼序列的多肽優(yōu)選為酸性，例如具有3 5. 5、優(yōu)選3. 5^5. 2的pi。如本文中所指的，為了實(shí)現(xiàn)“功能等同”，所述多肽相對(duì)于母體分子(即所述多肽例如通過(guò)氨基酸取代從該分子中衍生的分子)，可在發(fā)揮醫(yī)療或美容功能方面可以顯示功效有些下降，但優(yōu)選同樣有效或更有效。由此，功能等同涉及可有效治療狀況或疾病或從美容上改善本文中所指的狀況和/或外觀，即減輕患者的一種或多種癥狀，例如下文中所述的皮膚的外觀、質(zhì)地、厚度或水分含量。對(duì)此的檢驗(yàn)可以例如通過(guò)執(zhí)行實(shí)施實(shí)施例中所指的分析，將衍生多肽與其起源多肽的效果以定性或定量方式進(jìn)行比較。在可能有定量結(jié)果的情況中，衍生物為母體多肽的功效的至少30、50、70或90%。與天然存在的蛋白質(zhì)有關(guān)的或其衍生的功能等同的蛋白質(zhì)，在不破壞分子功能的條件下，可以通過(guò)一次或多次(例如2 20，優(yōu)選2 10)氨基酸取代、添加和/或刪除對(duì)天然氨基酸序列進(jìn)行修飾(條件是其滿足上面提到的序列同一性要求)而得到。這種蛋白質(zhì)由“功能等同的核酸分子”編碼，所述功能等同的核酸分子通過(guò)一個(gè)或多個(gè)堿基的適當(dāng)取代、添加和/或刪除產(chǎn)生。優(yōu)選的功能等價(jià)物是“添加”變體，其中產(chǎn)生的氨基和/或羧基末端融合蛋白質(zhì)或多肽包含稠合到母體多肽上的另外的蛋白質(zhì)或多肽。如上所述，添加至中心多肽上時(shí)形成連續(xù)氨基酸序列的任何序列限于如上所述的側(cè)翼序列。此外，優(yōu)選的功能等價(jià)物是“刪除”或“截?cái)唷弊凅w，其中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽中已經(jīng)從中心多肽上除去了氨基和/或羧基末端殘基。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，從氨基末端除去殘基，其中除去至少1、2、3、4或5個(gè)氨基酸殘基。這種功能等價(jià)物是如上所述的部分。尤其優(yōu)選的功能等價(jià)變體是天然生物變種(例如在物種內(nèi)或在不同種屬如植物、動(dòng)物或細(xì)菌中的等位基因變體或地理變種，尤其是魚，特別是源自鮭(Salmonidae)科，尤其是鮭魚(salmo)和大馬哈魚(Oncorhynchus)亞科)和使用已知技術(shù)制備的衍生物。例如，編碼功能等價(jià)蛋白質(zhì)的核酸分子可以通過(guò)化學(xué)合成或使用包括刪除、隨機(jī)誘變或酶裂解和/或核酸連接的位已知點(diǎn)定向誘變技術(shù)以重組的形式產(chǎn)生。本發(fā)明還提供由核苷酸序列構(gòu)成的核酸分子，所述核苷酸序列僅對(duì)所述多肽或其互補(bǔ)序列進(jìn)行編碼。在優(yōu)選方面中，本發(fā)明由此提供一種核酸分子，所述核酸分子由以下所構(gòu)成(i) SEQ ID Nos. 10 12中任一個(gè)所展示的核苷酸序列；與所述序列至少50%同一的序列；或在室溫下在6XSSC/50%甲酰胺的非嚴(yán)緊結(jié)合條件和在高度嚴(yán)緊的條件如2XSSC、65°C下進(jìn)行洗滌仍與所述序列雜交的序列，其中SSC=O. 15M的NaCl、0. 015M檸檬酸鈉、pH 7. 2 ;或與任何上述序列互補(bǔ)的序列；或其一部分，以及任選(ii)在(i)的氨基酸序列的N和/或C端的長(zhǎng)度為f 100氨基酸的側(cè)翼氨基酸序列，或其互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，所述核酸分子對(duì)上文中所述的多肽進(jìn)行編碼。本文中所指的“核酸分子”是具有優(yōu)選150、300、450、600或750個(gè)以上堿基和/或1200,900,600或300個(gè)以下堿基或從其選擇的范圍的分子。如上所指的“部分”優(yōu)選包含其所來(lái)源的序列的至少90、120、150、180、210、240、270、300、450或600個(gè)核苷酸堿基。優(yōu)選地，所述部分對(duì)如上所述的N-末端、中心或C-末端的肽進(jìn)行編碼。在優(yōu)選方面中，所述部分由其所來(lái)源的全長(zhǎng)度序列除去、優(yōu)選從5’端除去至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14或15個(gè)堿基而構(gòu)成。如本文中所指的，“側(cè)翼序列”是指通過(guò)一般的磷酸二酯鍵連接在中心核苷酸序列的末端5’或3’端處以形成連續(xù)核苷酸序列的核苷酸序列(在如下所述功能等價(jià)物中進(jìn)行修飾的除外)。側(cè)翼序列可存在于中心核苷酸序列的5’或3’末端上或可以存在于兩端上?！に鰝?cè)翼序列可短至I個(gè)核苷酸或可長(zhǎng)至300個(gè)核苷酸，優(yōu)選f 150(或15 300或3(Tl50)，例如廣75，如f 15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。當(dāng)側(cè)翼序列存在于5’和3’兩個(gè)末端時(shí)，其可具有相同或不同的序列且可具有相同或不同的長(zhǎng)度。所述側(cè)翼序列可源自對(duì)所研究的VAP編碼序列是其片段的天然序列或在可比部分中與所述天然編碼序列的同一性小于80、70、60或50%(參見例如分別相對(duì)于SEQ ID Nos. 10 12在SEQ ID Nos. 13 15中提供的天然序列，和SEQID No. 16，其提供了關(guān)于SEQ ID No. 10的別種天然序列)。優(yōu)選地，在上述部分(i)中的所述序列與所比較的序列(SEQ ID No.l(Tl6)至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99% 同一。通過(guò)例如使用GCG軟件包,使用缺省值和可變pamfactor、間隙產(chǎn)生懲罰設(shè)定為12. 0和間隙延伸懲罰設(shè)定為4. 0以及6個(gè)核苷酸窗口的條件下，進(jìn)行FASTA Search，可確定序列的同一性。優(yōu)選地，這種序列同一性相關(guān)或雜交的核酸分子與在所述SEQ ID Nos.中所展示的核酸分子的功能等同。這種功能等同的核酸分子可采取如下所示出的衍生物形式且如果它們編碼的多肽根據(jù)上述試驗(yàn)被認(rèn)為是功能等價(jià)的，則認(rèn)為所述核酸分子是功能等價(jià)物。優(yōu)選的功能等價(jià)物是對(duì)上述優(yōu)選多肽進(jìn)行編碼的那些，例如對(duì)在與本文中所述的特定分子不同的屬或物種中發(fā)現(xiàn)的多肽進(jìn)行編碼的核酸分子。此外，如本文中所述的“部分”可以是功能等價(jià)物。優(yōu)選這些部分滿足本文中所述的同一性(相對(duì)于可比區(qū)域)或雜交條件。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸分子、包括部分和包含上述側(cè)翼序列的核苷酸序列優(yōu)選對(duì)如上所述的酸性多肽進(jìn)行編碼。本發(fā)明的并用于本發(fā)明的用途的核酸分子可以為單或雙鏈的DNA、cDNA或RNA，優(yōu)選DNA，且包括簡(jiǎn)并的、基本與上述同一和雜交的序列。然而，理想地，所述分子為DNA或cDNA。本發(fā)明的或用于本發(fā)明的用途的多肽包括在不影響多肽序列的條件下進(jìn)行修飾的那些多肽，例如通過(guò)化學(xué)修飾，包括通過(guò)去糖基化或糖基化。通過(guò)在不影響功能性的條件下對(duì)多肽進(jìn)行合成/分離后修飾，如特殊殘基的特定糖基化、甲基化等，可制備這類多肽。本發(fā)明的或用于本發(fā)明用途的多肽也可采取肽模擬物的形式，所述肽模擬物可被認(rèn)為是衍生物，其中保持了多肽的功能特征，但以不同的背景、例如非肽結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)。已經(jīng)成功開發(fā)了這種肽模擬物并用于其他特殊醫(yī)療應(yīng)用中。通過(guò)各種工藝可產(chǎn)生肽模擬物，尤其是非肽分子，所述工藝包括基于構(gòu)象的藥物設(shè)計(jì)、篩分、集中的文庫(kù)設(shè)計(jì)和經(jīng)典藥物化學(xué)。不僅可使用非天然氨基酸或其他有機(jī)結(jié)構(gòu)單元的低聚物，還可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法使用碳水化合物、雜環(huán)或大環(huán)化合物或任何有機(jī)分子，所述有機(jī)分子包含可提供分子靜電表面的結(jié)構(gòu)元素和構(gòu)象，所述分子靜電表面模擬肽的3維構(gòu)象的相同性質(zhì)。由此，所述肽模擬物可能與肽主鏈很少或不類似。肽模擬物可包含完全合成的非肽形式(例如基于具有合適取代基的碳水化合物主鏈)或可保留肽作為其基礎(chǔ)的一種或多種元素，例如通過(guò)衍生一種或多種氨基酸或利用替代的非肽成分代替一個(gè)或多個(gè)氨基酸。肽狀模板包括假肽和環(huán)肽?？蓪?duì)于肽功能被認(rèn)為是冗余的結(jié)構(gòu)元素最少化到僅保持骨架功能、或在適當(dāng)時(shí)除去。當(dāng)肽模擬物保留一種或多種肽元素、即一種以上氨基酸時(shí)，這樣的氨基酸可利用 其非標(biāo)準(zhǔn)的或結(jié)構(gòu)類似物代替。保留在序列中的氨基酸還可衍生或修飾(例如標(biāo)記、糖基化或甲基化)，只要保留了本發(fā)明的或用于本發(fā)明用途的多肽的功能性質(zhì)即可。將肽模擬物稱作“衍生自”特定的多肽序列。這是指，參考限定的多肽序列，對(duì)肽模擬物進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得其保留肽的功能必需的結(jié)構(gòu)特征。其可以為多肽的特殊側(cè)鏈、或所述結(jié)構(gòu)的氫鍵電位。通過(guò)非肽成分或一種或多種氨基酸殘基可提供這樣的特征，或?qū)B接多肽的所述氨基酸殘基的鍵進(jìn)行修飾以提高多肽的特定功能如穩(wěn)定性或蛋白酶抗性，同時(shí)保留了多肽的功能必需的結(jié)構(gòu)特征。可使用的非標(biāo)準(zhǔn)的或結(jié)構(gòu)類似的氨基酸的實(shí)例是D氨基酸、酰胺等排體(例如N-甲基酰胺、反向-翻轉(zhuǎn)酰胺、硫酰胺、硫酯、磷酸酯、酮亞甲基、羥基亞甲基、氟代乙烯基、(E)-乙烯基、亞甲基氨基、亞甲基硫基或鏈烷)、L-N甲基氨基酸、D-a甲基氨基酸、D-N-甲基氨基酸。非常規(guī)的氨基酸的實(shí)例列于表I中。表I
權(quán)利要求
1.藥物或美容組合物，其包含 i)包括SEQ ID No. I所示氨基酸序列、或者與所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分的多肽； (ii)包括SEQID No. 2所示氨基酸序列、或者與所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分的多肽； (iii)包括SEQID No. 3所示氨基酸序列、或者與所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分的多肽； (iv)包括SEQID No. 4所示氨基酸序列、或者與所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分的多肽； (V)編碼以上(i)至(iv)中任一項(xiàng)所示多肽的一種或多種核酸分子或者其互補(bǔ)序列， 和一種或多種藥用或美容用賦形劑和/或稀釋劑。
2.如權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述(V)的核酸分子包括SEQID Nos. 9-12中任一個(gè)所示的核苷酸序列、或者與所述序列至少50%同一的序列、或者在6XSSC/50%甲酰胺和室溫的非嚴(yán)緊結(jié)合條件下以及在高度嚴(yán)緊的洗滌條件下與所述序列雜交的序列、或者與任何上述序列互補(bǔ)的序列、或者任何所述序列中的一部分。
3.如權(quán)利要求I或2所述的組合物，其中所述組合物包含一種以上所述多肽和/或其編碼序列，優(yōu)選(ii)至(iv)各項(xiàng)所述的多肽。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中(ii)至(iv)所示的各種所述多肽當(dāng)存在時(shí)由以下構(gòu)成 (a)SEQ ID Nos. 2-4中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列、或者與所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分，和任選 (b)在(i)中氨基酸序列的N和/或C末端的側(cè)翼氨基酸序列，其長(zhǎng)度為I至100個(gè)氨基酸， 并且其中編碼(ii )至(iv)所示多肽的各種所述核酸序列由僅編碼所述多肽的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列構(gòu)成。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其用于治療。
6.使動(dòng)物皮膚剝落和/或保濕的美容或非美容方法，其中向所述動(dòng)物施用權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的多肽、核酸分子或藥物組合物。
7.如權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的多肽、核酸分子或藥物組合物，其用于使動(dòng)物皮膚剝落和/或保濕。
8.治療或預(yù)防動(dòng)物皮膚的狀況或疾病的美容或非美容方法，其中所述皮膚異常干燥、皮膚的角質(zhì)層異常增厚或者皮膚有色素沉著癥，其中向所述動(dòng)物施用權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所所述的多肽、核酸分子或藥物組合物。
9.如權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的多肽、核酸分子或藥物組合物，其用于治療或預(yù)防動(dòng)物皮膚的狀況或疾病的美容或非美容方法，其中所述皮膚異常干燥、皮膚的角質(zhì)層異常增厚或者皮膚有色素沉著癥。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法、多肽、核酸分子或藥物組合物，其中待治療或預(yù)防的皮膚狀況或疾病是濕疹、接觸性皮炎、牛皮癬、魚鱗癬或痤瘡。
11.如權(quán)利要求8或9所述的方法、多肽、核酸分子或藥物組合物，其中待治療或預(yù)防的皮膚狀況或疾病是硬繭、雞眼、疣或黃褐斑。
12.多肽，其由以下構(gòu)成 (i)SEQID Nos. 2-4中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列、或者與所述序列至少50%同一的序列、或者任何所述序列中的一部分；和任選 (ii)在(i)中氨基酸序列的N和/或C端的長(zhǎng)度為I至100個(gè)氨基酸的側(cè)翼氨基酸序列。
13.核酸分子，其由僅編碼權(quán)利要求12所述的多肽的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成。
14.核酸分子，其由以下構(gòu)成 (i)SEQID Nos. 10-12中任一項(xiàng)所不的核苷酸序列、與所述序列至少50%同一的序列、或者在6XSSC/50%甲酰胺和室溫的非嚴(yán)緊結(jié)合條件下以及在高度嚴(yán)緊的洗滌條件下與所述序列雜交的序列、或者與任何前述序列互補(bǔ)的序列、或者其一部分；和任選 (ii)在(i)中核苷酸序列的5'或3'端的長(zhǎng)度為I至300個(gè)核苷酸的側(cè)翼核苷酸序列， 或者其互補(bǔ)序列。
15.載體,優(yōu)選表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求13或14所述的核酸分子。
16.制備權(quán)利要求15所述重組核酸分子的方法，其包括將權(quán)利要求13或14所述的核苷酸序列插入到載體核酸中。
17.制備權(quán)利要求12所述多肽的方法，其包括，在表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求13或14所述核酸分子的宿主細(xì)胞，并回收由此產(chǎn)生的所述分子。
18.用權(quán)利要求17的方法制備的多肽。
19.含有權(quán)利要求12所述多肽的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞相對(duì)于天然細(xì)胞，已經(jīng)通過(guò)表達(dá)編碼的核酸物質(zhì)而修飾。
20.從孵化液中分離權(quán)利要求12所述是一種或多種多肽的方法，其至少包括以下步驟 a)將卵懸浮在最少體積的水中； b)引起所述卵的同步、快速孵化； c)過(guò)濾孵化的卵,從而獲得孵化液； d)向所述孵化液中加入丙酮至終濃度為80%v/v； e)將所述液體進(jìn)行低速離心，其中所述VAP存在于由此形成的沉淀團(tuán)中；和任選 f)分離存在于步驟e)的沉淀團(tuán)中的多肽，從而分離各個(gè)多肽。
21.用權(quán)利要求20的方法所制備的VAP。
全文摘要
本發(fā)明涉及來(lái)自魚孵化液的各種多肽、其編碼核酸序列、包含所述多肽和核酸分子的藥物組合物及其在對(duì)于皮膚的各種醫(yī)療或美容應(yīng)用中的用途，尤其是用于保濕皮膚和/或用于剝離皮膚的角質(zhì)層以治療或預(yù)防動(dòng)物的皮膚疾病或狀況。
文檔編號(hào)A61K8/66GK102724954SQ201080054198
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者漢斯·克里斯蒂安·萊倫, 貝恩特·沃瑟爾 申請(qǐng)人:阿克生物科技公司